Summary
Dit protocol beschrijft een robuuste methode voor het gebruik van high-throughput instellingen om de antibacteriële werkzaamheid van bacteriofaag cocktails te screenen.
Abstract
Bacteriële pathogenen dagen wereldwijd voortdurend voedselveiligheidssystemen uit. Met toenemende zorgen over de opkomst van hitte- en ontsmettingsresistente bacteriën, zijn nieuwe antibacteriële middelen dringend nodig. Een op bacteriofaag gebaseerde biocontrolestrategie is het therapeutisch gebruik van fagen om bacteriële pathogenen in agrarische omgevingen te beheersen. Faagbiocontrole wordt steeds meer geaccepteerd als een duurzame technologie, effectief in het ontsmetten van door voedsel overgedragen pathogenen. Om effectieve biocontroleresultaten te garanderen, is systematische screening van faagcombinaties tegen gerichte bacteriën onder vereiste omgevingsomstandigheden van cruciaal belang. Antibacteriële werkzaamheid van faagcocktails kan worden beïnvloed door faaggeslachten en -combinatie, gerichte bacteriestammen, de veelheid van infectie, temperatuur en tijd. Om een faagcocktail met superieure werkzaamheid te formuleren, was de voorgestelde methode om systematisch de effectiviteit van individuele fagen en faagcocktails te evalueren bij het doden van door voedsel overgedragen bacteriële pathogenen onder gerichte omstandigheden. De bacteriële dodende werkzaamheid werd gemonitord door optische dichtheid te meten bij de gewenste temperaturen en duur. Superieure faageffectiviteit werd bepaald door volledige remming van bacteriegroei. De voorgestelde methode is een robuuste, evidence-based benadering om het formuleren van faagcocktails met superieure antibacteriële werkzaamheid te vergemakkelijken.
Introduction
Bacteriofagen (fagen) zijn virussen die van nature bacteriële cellen binnendringen, het bacteriële metabolisme verstoren en lysis van de bacterie veroorzaken. In tegenstelling tot conventionele antimicrobiële stoffen (bijv. Antibiotica), zijn faaggastheerspectrums relatief smal, kunnen ze alleen een gerichte reeks bacteriesoorten of -stammen infecteren en moeten ze dus neveneffecten op microbiota minimaliseren die de gezondheid van mens en dier ten goede komen. Met de opkomst van antimicrobiële resistentie (AMR) leiden fagen en hun derivaten tot alternatieve antimicrobiële stoffen om bacteriële infectieziekten te bestrijden, waaronder AMR-bacteriële infecties bij mens en dier1,2. Fagen hebben het therapeutisch potentieel bevestigd tegen >20 bacteriële pathogenen die oppervlakkige infecties en infecties van de bovenste luchtwegen en het maagdarmkanaal van de mens veroorzaken3.
In agrarische omgevingen is een op faag gebaseerde biocontrolestrategie het therapeutische gebruik van fagen om bacteriële pathogenen te beheersen. Faagbiocontrole wordt goed geaccepteerd als een groene technologie, effectief in het ontsmetten van door voedsel overgedragen pathogenen (bijv. Shiga-toxine producerende Escherichia coli (STEC), Salmonella en Listeria) in verschillende voedingsmiddelen4,5. Bovendien kunnen fagen worden gebruikt als ontsmettingsmiddelen om voedselverwerkingsoppervlakken en dierenhuiden te desinfecteren, die kunnen worden geïntegreerd in conventionele antimicrobiële systemen (bijv. Chemicaliën, stoom en pasteurisatie van heet water) om de gewenste resultaten te verbeteren en de milieueffecten te verminderen. Ook het gebruik van fagen om zoönotische bacteriën bij dieren te verminderen is veelbelovend1. Er is echter behoefte aan het aanpakken van de technische uitdagingen om de resultaten van de faagbiocontrolebenadering te verbeteren die in de volksmond wordt toegepast in diverse voedselproductiesystemen. De belangrijkste uitdaging is de verminderde effectiviteit van fagen als gevolg van de ontwikkeling van bacterieresistente mutanten5 en veranderingen in de bacteriële fysiologie als gevolg van blootstelling aan omgevingsstressoren6.
Om het risico op faagresistentie te minimaliseren, worden faagcocktails (d.w.z. een combinatie van meerdere fagen) voorgesteld en hebben ze de biologische controlepotentie in landbouw- en aquacultuuromgevingen verbeterd7. Uit verschillende studies is echter gebleken dat faagcocktails niet altijd een betere effectiviteit boden dan de toediening van een enkele faag. Een cocktail van 3 T4-achtige fagen had bijvoorbeeld een smaller gastheerbereik tegen E. coli-stammen8. Bovendien had AKFV33, een lid van het Tequintavirus, een grotere werkzaamheid dan een cocktail van vier fagen bij het verwijderen van E. coli O157 uit rundvlees, ondanks de toegepaste incubatietemperaturen4. Onlangs is gemeld dat de effectiviteit van individuele fagen de werkzaamheid van faagcocktails voor de controle van O1579 niet voorspelt, omdat interacties tussen meerdere fagen de werkzaamheid kunnen veranderen. Het belangrijkste is dat tal van factoren, zoals faaggeslachten en -combinaties, gerichte stammen en MOIs, en incubatietemperaturen en -tijden, van invloed kunnen zijn op interacties tussen fagen. Daarom is het zorgvuldig screenen van combinaties van fagen tegen specifieke bacteriën om faagsynergie of -facilitering te beoordelen, of op zijn minst om minimaal faagantagonisme onder specifieke omgevingsomstandigheden te garanderen, van vitaal belang voor optimale resultaten. Hier wordt een methode beschreven om systematisch de werkzaamheid van verschillende faagcombinaties tegen door voedsel overgedragen pathogenen onder verschillende omgevingsomstandigheden te beoordelen. Het voordeel van deze aanpak is om screening mogelijk te maken van alle mogelijke biotische en abiotische factoren waarvan wordt voorspeld dat ze de antibacteriële werkzaamheid van fagen in natuurlijke omgevingen beïnvloeden. In het protocol worden STEC O157 en hun infecterende fagen als voorbeeld gebruikt.
Protocol
1. Bereiding van buffer en reagentia
- Maak 500 ml tryptische sojabouillon (TSB) (15 g TSB-poeder en 500 ml ultrapuur water) en autoclaaf.
OPMERKING: Dit kan tot 3 maanden bij kamertemperatuur worden bewaard of bij 4 °C gedurende maximaal 6 maanden. - Maak 500 ml tryptische soja-agar (TSA) (20 g TSA-poeder en 500 ml ultrapuur water) en autoclaaf.
OPMERKING: Dit kan maximaal 3 maanden bij 4 °C worden bewaard. - Maak 500 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS; 4 g NaCl, 0,1 g KCl, 0,77 g Na2HPO4 en 0,12 g KH2PO4, 500 ml ultrapuur water), meet en stel de pH in op 7,2 ± 0,2 bij 25 °C en autoclaaf.
OPMERKING: Dit kan maximaal 6 maanden bij 4 °C worden bewaard. - Maak 200 ml 1 M MgSO4 (49,294 g en 200 ml ultrapuur water) en steriliseer via een polyethersulfonfilter van 0,22 μm.
- Maak 500 ml TSB met 10 mM MgSO4 (mTSB; 15 g TSB-poeder, 500 ml ultrapuur water en 5 ml 1 M MgSO4) en autoclaaf; laat de geautoclaveerde media afkoelen tot kamertemperatuur. Pas de aseptische techniek toe. Breng met behulp van een serologische pipet voorzichtig 5,0 ml van 1 M MgSO4 over; draai zachtjes om te mengen.
2. Bereiding van bacteriekweek
- Om bacteriële onderzoekslaboratoriumkweek (BRLC) te bereiden, verwijdert u de injectieflacon(s) met glycerolvoorraad uit de diepvriesinventaris en brengt u deze over naar het laboratorium.
- Gebruik een wegwerpinentingslus of gelijkwaardig, dompel in de injectieflacon, verwijder een schraapsel van entmateriaal (bevroren slush) en strijk op een TSA-plaat of gelijkwaardig in een biologische veiligheidskast van niveau II. Incubeer de plaat bij 37 ± 2 °C gedurende 15−18 uur.
- Zak de voorbereide BRLC-platen in zakken en bewaar bij 4 °C.
OPMERKING: Algemene vervaltermijn voor BRLC: 14 dagen bij 4 °C na generatie. - Ent een enkele kolonie van elke E. coli O157-stam uit de te testen BRLC-platen in 10 ml TSB en incubeer statisch bij 37 °C gedurende 18 uur om 9 log10 KVE/ml te bereiken.
- Bereid een seriële verdunning van de nachtculturen (de volgende ochtend), elke E. coli O157-stam met mTSB die 10 mM MgSO4 bevat om 4-5 log10 CFU /ml (of een ander gewenst entniveau) te bereiken.
- Meng een gelijk volume van een nachtkweek van elke stam om 4-5 log10 CFU / ml in totaal (of naar wens) te bereiken om het bacteriële mengsel te bereiden.
- Plaats de verdunde bacteriekweek onmiddellijk op 4 °C voor afwachtend gebruik.
- Verdun de entcultuur 10- of 100-voudig en plaat 0,1 ml aliquots van deze verdunningen op de TSA-platen om de geïsoleerde kolonies te verkrijgen.
3. Voorbereiding van faagbewerkingsoplossingen
- Vermeerderingsvoorraden met hoge titer voor elke te screenen faag (≥108 PFU/ml) volgens de standaardmethoden4.
OPMERKING: De algemene vervaltermijn voor de faagvoorraden is 3 maanden in een plastic fles bij 4 °C na de generatie. - Om de gewenste titer van bijvoorbeeld ~108 PFU/ml voor lysiskinetiek te bereiken, verdunt u individuele faagpreparaten met mTSB die 10 mM MgSO4 bevat. Bereid faagcocktails door gelijke volumes van elke werkvoorraad te mengen met dezelfde titer in alle mogelijke combinaties.
4. Bereiding van in-vitro lysiskinetiek voor individuele faag- en faagcocktails
- Bereid seriële 10-voudige verdunningen van elke fagen in kolommen 1-8 in steriele 96-well microplaten om de microplaattest op te zetten.
OPMERKING: Vier fagen tegen één bacteriestam kunnen in tweevoud worden getest, in aangrenzende kolommen, op elke plaat. De overige vier kolommen zijn voor controles, die zonder faag zijn, evenals mTSB blanco (figuur 1). - Plaats 180 μL mTSB in putten van kolom 1 tot en met 12 van de 96-well microplaat.
- Voeg 20 μL verdunde individuele fagen of faagcocktails (~ 108 PFU / ml) toe aan putjes 1-8 van de bovenste rij van de microplaat (rij A).
- Voeg voor de faagvrije en blanco controle 20 μL mTSB toe aan de bovenste put van de kolommen 9, 10 en 11.
- Verdun met een 12-kanaals pipet de plaat. Breng 20 μL over van rij naar rij. Meng de putinhoud door zachte, herhaalde aspiratie, uitwerping (minstens vijf keer) en het veranderen van de uiteinden tussen verdunningen. Verwijder 20 μL uit de laatste rij (rij H).
OPMERKING: Het gebruik van tips met filters wordt aanbevolen om kruisbesmetting te voorkomen. - Stel een reservoir in voor elke spanning, gebruik 1 ml pipet om 2-3 ml van de verdunde cultuur in het reservoir over te brengen. Gebruik voor de kolommen 1-10 een meerkanaalspipet om 20 μL van de verdunde bacteriecultuur aan elke put toe te voegen. Wissel tips tussen elke toevoeging.
- Dek de microplaat af en incubeer deze onder de gewenste omstandigheden (bv. 37 °C gedurende 10 uur of 22 °C gedurende 22 uur).
- Verwijder met 2 uur of andere gewenste intervallen de microplaten uit de incubator.
5. Bepaling van de optische dichtheid
- Onderzoek naar optische dichtheid bij 600 nm (OD600nm) met behulp van een microplaatlezer.
OPMERKING: Het wordt geadviseerd om het testprotocol in het programma in te stellen en op te slaan voordat de testplaat wordt voorbereid. - Schakel de microplaatlezer in en open het programma.
- Selecteer de eenvoudige modus in het venster Opstartopties en selecteer Een nieuw protocol maken in Taakbeheer (aanvullende afbeelding 1a,b).
- Kies in het venster Type plaat selecteren de optie 96 Putplaat in de vervolgkeuzelijst (aanvullende afbeelding 2).
- Selecteer Absorptie voor detectiemethode, de optie Eindpunt/kinetiek voor leestype en Monochromators voor het type optica. Klik op OK (aanvullende figuur 3).
- Voer bij Leesstap 600 nm in voor golflengten en selecteer Normaal voor leessnelheid. Klik op OK (aanvullende figuur 4).
- Om de temperatuur voor de test in te stellen, klikt u op het selectievakje Incubate en selecteert u Incubator Aan. Voer de gewenste temperatuur in het vak Temperatuur in. Klik op OK. Als u condensatie op het plaatdeksel tijdens de incubatie wilt voorkomen, stelt u een temperatuurgradiënt in door een waarde (1-3) in te voeren in het vak Verloop . Klik op OK (aanvullende figuur 5a).
OPMERKING: Klik op het selectievakje Voorverwarmen voordat u doorgaat met de volgende stap voor de incubatietemperatuur van 37 °C. Deze stap is niet vereist voor de testconditie bij 22 °C (RT). - Klik vervolgens op het selectievakje Kinetic om de Kinetic Setup te openen. Stel de looptijd in op 10 uur voor 37 °C incubatie of 22 uur voor RT. Voer 2 uur in voor het leesinterval. Klik op OK (aanvullende figuur 5b).
- Klik op het selectievakje Schudden in het venster Procedure om indien nodig de schudconditie in te stellen voor elke kinetische aflezing (aanvullende figuur 6a).
- Selecteer Lineair voor Schudmodi en wijzig De duur in 30 s. Stel de lineaire frequentiewaarde in op 731 cpm (2 mm) en klik vervolgens op OK (aanvullende figuur 6b).
- Klik in het dialoogvenster Protocolsamenvatting op Plaatindeling en selecteer Blanco's, Assay Controls en Samples. Klik op Volgende (aanvullende figuur 7).
OPMERKING: Voer 1 in bij Aantal verschillende besturingstypen voor negatief besturingselement. - Nadat u de instellingen voor elk puttype hebt gedefinieerd, klikt u op Voltooien.
- Selecteer een bron-id in de interface aan de linkerkant en wijs deze vervolgens toe aan de matrix die wordt weergegeven in de lay-out van de plaat. Klik op OK (aanvullende figuur 8).
- Klik op de knop Leesplaat en sla het protocol op als een .prt-bestand en klik op Opslaan (aanvullende afbeelding 9).
- Plaats de plaat en klik op OK.
- Zodra het experiment is voltooid, slaat u het experiment op als xpt-bestand en klikt u op Opslaan (aanvullende afbeelding 10).
- Exporteer gegevens naar Excel door op de knop Ja in het berichtvenster te klikken voor verdere analyse (aanvullende afbeelding 11).
- Klik op de selectie Ja/Nee opslaan en het selectievakje Niet opnieuw vragen om de voorkeur op te slaan.
6. Data-analyse
- Herhaal ten minste twee onafhankelijke experimenten zoals hierboven beschreven. Verzamel de resultaten van alle onafhankelijke onderzoeken. Bereken het gemiddelde en de standaarddeviatie van de OD600 van elke met faag behandelde en -vrije cultuur.
- Voer vierkantswortels uit van de OD-waarden bij 600 nm en analyseer ze met behulp van een geschikt statistisch model voor elke bacteriestam en temperatuur.
OPMERKING: Voor SAS-software zijn het MIXED-model en de kleinste kwadraten om te differentiëren middelen (P < 0,05) geselecteerd. Wijs voor elke stam panelen A−G toe aan elke faagbehandeling waarvan de algehele anti-O157-werkzaamheid in de loop van de tijd en MOI's verschilden (P < 0,05). - Definieer superieure faageffectiviteit op basis van OD600nm-waarde ≤ 0,01 wat overeenkomt met geen detecteerbare bacteriegroei (detectiegrens: 300 CFU / ml).
- Analyseer effecten van tijd, incubatietemperatuur, E. coli O157-stammen, MOI's en faagtypen op faageffectiviteit met behulp van een geschikt statistisch model.
OPMERKING: Gebruik voor SAS-software GLIMMIX met willekeurige metingen. - Bereken odds ratio's om superieure werkzaamheid te vergelijken voor verschillende omgevings- en biologische factoren van belang.
- Analyseer effecten van tijd, incubatietemperatuur, E. coli O157-stammen, MOI's en faagtypen op faageffectiviteit met behulp van een geschikt statistisch model.
Representative Results
Volgens het protocol werd een vergelijking van de anti-O157 faageffectiviteit met verschillende faagcombinaties, temperaturen, tijden en MOIs uitgevoerd. Effecten van incubatietemperatuur en -tijden, MOI's, fagen en bacteriestammen die worden gebruikt op het verbeteren van de werkzaamheid van anti-E. coli O157 wordt weergegeven in tabel 1 (odds ratio tabel)9. Het percentage (%) optische troebelheidsmeting ≤ 0,01 werd door elk faagpreparaat onder elke experimentele voorwaarde geanalyseerd. Op basis van deze analyse werd de anti-O157 faageffectiviteit gemaximaliseerd na 14, 16 of 18 uur incubatie bij 22 °C (P < 0,001) en MOI = 1000 (P < 0,001), waarbij respectievelijk 75% en 89% van de groei van de met faag behandelde cultuur volledig werd geremd. Over het algemeen was van de 11 faagpreparaten een cocktail van T1, T4 en rV5 het meest effectief (P < 0,05) tegen O157. Bovendien varieerde de gevoeligheid voor fagen over incubatietemperaturen, tijden, MOI's en fagen die werden getest, waarbij O157-stammen die werden getest met stam CO281-31N het meest gevoelig (P < 0,001) en 3081 (P < 0,001) het minst gevoelig voor fagen.
Om de faagdodende kinetiek van elke geteste bacteriestam te begrijpen, werd de OD600-waarde uitgezet tegen elke bemonsteringstijd, MOI's en faagbehandeling bij elke incubatietemperatuur. Representatieve resultaten van de werkzaamheid van fagen tegen E. coli O157 3081 bij 37 °C zijn weergegeven in figuur 2. Er wordt voor gezorgd dat de groeicurve van faagvrije controlecultuur normaal is voordat de remming van de groeicurve van met faag behandelde cultuur wordt beoordeeld. Volgens figuur 2 remde de opname van T4 de bacteriegroei volledig bij 37 °C, op elk bemonsteringstijdstip bij een MOI zo laag als 1. Om te overzicht te geven hoe faag de bacteriegroei in de loop van de tijd bij verschillende temperaturen remde, ongeacht MOI's, werd de gemiddelde OD600nm-waarde van alle MOI's (MOI > 0) uitgezet tegen elke bemonsteringstijd en faagbehandeling (figuur 3). In vergelijking met 37 °C was de werkzaamheid van bepaalde faagdodende stoffen, bijvoorbeeld fagen T4 en T1 + T4, verbeterd bij 22 °C. Een andere benadering om de algehele anti-O157-effectiviteit bij fagen samen te vatten en te vergelijken, wordt weergegeven in tabel 2 en tabel 39. De OD600-waarde werd gemiddeld van elke bemonsteringstijd en MOI en rangschikte de faagefficiëntie van hoogste (A) naar laagste (F: 37 °C en D: 22 °C). Deze tabel vergemakkelijkt de identificatie van de beste faagbehandeling. Voor stam 3081 waren fagen T4 en T5 + T4 (panel A) bijvoorbeeld de meest effectieve behandeling bij 37 °C, terwijl naast faag T4 fagen T1 + T4, T1 + T4 + rV5 en 4 faagcocktails (paneel A) de meest effectieve behandeling waren bij 22 °C.
Dit protocol stelde ons ook in staat om de faageffectiviteit te vergelijken met verschillende bacteriestammen en faagbereiding aan te passen. Bij het selecteren van fagen, bij 37 °C, exclusief stam 3081, had faag T1 + T4 + rV5 bijvoorbeeld de meest significante effectiviteit tegen alle andere stammen, ongeacht hun faagtype. Bij 22 °C was de 4-faagcocktail het meest effectief tegen alle geteste stammen. De beste MOI's resulteerden in volledige lysis (OD600 ≤ 0,01), wat een potentiële superieure werkzaamheid onder experimentele omstandigheden rechtvaardigde (tabel 2 en tabel 3).
Figuur 1: Voorgestelde lay-out van 96-well microplate assay. Seriële 10-voudige verdunningen van elke faag worden bereid in kolommen 1-8 van steriele 96-well microplaten. Vier fagen tegen één bacteriestam kunnen in tweevoud, in aangrenzende kolommen, op elke plaat worden getest. De overige kolommen zijn voor besturingselementen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Groeicurven van E. coli O157 stam 3081 bij 37 °C behandeld en niet behandeld met fagen bij elke MOI. De gegevens zijn samengesteld uit twee onafhankelijke onderzoeken. Staven vertonen standaarddeviatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Groeicurven van E. coli O157 stam 3081 stammen. (A) Groeicurven bij 37 °C. (B) Groeicurven bij 22 °C. Elke curve vertegenwoordigt individuele en gemengde culturen, behandeld en niet behandeld met fagen over MOI's. De gegevens zijn samengesteld uit twee onafhankelijke onderzoeken. Balken geven de standaardfout van het gemiddelde weer (met toestemming overgenomen van Reference9 ). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: Odds ratio's waarin de waarschijnlijkheid van superieure faageffectiviteit wordt vergeleken met E. coli O157 bij incubatietemperaturen, incubatietijden, MOI's, fagen en stammen van E. coli O157 (aangepast van Reference9 met toestemming). Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 2: Totale faageffectiviteit tegen E. coli O157 bij 37 °C (aangepast van Reference9 met toestemming). Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 3: Totale faageffectiviteit tegen E. coli O157 bij 22 °C (aangepast van Reference9 met toestemming). Klik hier om deze tabel te downloaden.
Aanvullende figuren 1-11: Momentopnamen van de werking en procedures van de microplaatlezer. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussion
Dit protocol beschreef een robuuste aanpak voor het systemisch evalueren van faageffectiviteit tegen door voedsel overgedragen pathogenen, waaronder STEC9 en Salmonella10. Een cruciale stap is bij het verdunnen van de nachtelijke kweek van bacteriën, het gebruik van voorgekoeld medium en het manipuleren van de verdunning met een ijsemmer worden aanbevolen om potentiële bacteriegroei te minimaliseren. Bovendien werd faagverdunning bereid voordat de bacteriekweek werd verdund. De opsommingsstap 2.8 gaf werkelijke aantallen bacteriële entmateriaal voor de berekening van de uiteindelijke toegepaste MOI. Voor faagbereiding worden over het algemeen ruwe faaglysaten bereid door filterfaag geïnfecteerd in 4-6 uur bacteriële cultuur gebruikt. De kritieke stap in verband met faaginfectie is altijd om faagwerkvoorraden te gebruiken die binnen 3 maanden zijn voorbereid. Uiterst nauwkeurig pipetteren (vooral bij gebruik van een meerkanaalspipet) en uniformiteit van aanpak zijn ook essentieel om vergelijkbare en interpreteerbare resultaten te verkrijgen. Gemodificeerde TSB aangevuld met 10 mM Mg2+ werd gebruikt om fagen, bacteriekweek en basismedium te verdunnen om adsorptie en infectie van fagen te optimaliseren.
Aangezien bacteriën zich vermenigvuldigen tijdens de logfase, zelfs onder de temperatuur van de incubator, wordt het aanbevolen om verdunde nachtkweek te gebruiken in plaats van log-fasecultuur, om potentiële bacteriegroei te minimaliseren.
Het voorgestelde protocol heeft beperkingen. Ten eerste, omdat microplaat slechts 200 μL kan bevatten, kan langdurige incubatie aanzienlijke verdamping veroorzaken en wordt dit niet aanbevolen. In dit geval is de test mogelijk niet geschikt voor langzaam groeiende bacteriën. Ten tweede was het voorgestelde protocol niet in staat om de versterking van fagen te controleren. Ten derde kon dit protocol de ontwikkeling van faagresistentie in de loop van de tijd niet volgen, een kritische factor die de uitkomst van faagbehandeling bepaalt11,12. Vervolgexperimenten zijn nodig om de verdere prestaties van de meest invloedrijke cocktail in de screening te beoordelen bij het voorkomen van de opkomst van antifaagmutanten in een uitgebreid bouillonkweeksysteem en andere biologische matrices.
In tegenstelling tot conventionele antimicrobiële stoffen beïnvloedt de biologische aard van fagen de complexiteit van biocontrole en therapeutisch gebruik in praktische omgevingen. Conventioneel gezien is de rationele selectie van faagcocktails voornamelijk gebaseerd op lytische activiteit en het gastheerbereik van fagen. Faagkandidaten met de sterkste lytische activiteit en een breedste gastheerbereik worden vaak aanbevolen13,14. Op basis van de huidige studie vergemakkelijkten fagen zoals rV5 en T1, hoewel alleen niet zo virulent als T4 en T5, de algehele biocontrole-uitkomst aanzienlijk in combinatie met T4 en / of T5. Om een superieure werkzaamheid van faagcocktails te bereiken, wordt daarom systemische screening van antibacteriële activiteit van potentiële faagcombinaties tegen gerichte gastheerstammen onder de gewenste omgevingsomstandigheden aanbevolen. Bovendien kan de bepaling van receptoren voor faagkandidaten en de opname van fagen met verschillende receptoren concurrentie voor gastheeraanhechting voorkomen, een snelle ontwikkeling van antifaagmutanten dwarsbomen en de biocontroleresultaten verbeteren13.
Deze methode maakte een nauwkeurige kwantificering van faaglysiskinetiek in een high-throughput formaat mogelijk. Bovendien maakte het systematische evaluatie van verschillende biologische en omgevingsfactoren op de antibacteriële werkzaamheid van een assortiment fagen mogelijk, waardoor de formulering van faagcocktails met geoptimaliseerde resultaten werd vergemakkelijkt. De toekomstige toepassingen en ontwikkeling van de methode worden verondersteld om in situ de werkzaamheid van elk fagen in faagcocktails te monitoren door fluorescentie-etikettering van fagen. Naast het voorgestelde protocol zou het begrijpen van genetische determinanten die synergetische en gefaciliteerde effecten tussen fagen bevorderen bij het co-infecteren van één gastheer, de formulering van geschikte faagcocktails met superieure werkzaamheid vergemakkelijken.
Disclosures
De auteurs verklaren dat het onderzoek werd uitgevoerd in afwezigheid van commerciële of financiële relaties die kunnen worden opgevat als een potentieel belangenconflict.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd ondersteund door de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC Discovery Grant, RGPIN-2019-04384), de Canada Foundation for Innovation (Project # 38710) en Major Innovation Fund, Alberta. Wij danken Dr. John Kastelic voor het redigeren van het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Essential supplies, reagents, and equipment | |||
| Inoculating loops | VWR | 12000-806 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | 1374361 | MgSO4.7H2O |
| Petri Dishes with Clear Lid | Fisher | FB0875713 | Diameter: 100 mm, sterile |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Fisher | 10010023 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014382 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-300XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014405 | |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-20XLS+ | METTLER TOLEDO | 17013808 | |
| Pipet-Lite Pipette, Unv. SL-20XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014412 | |
| Pipette Tips RT LTS 1000µL FL 768A/8-low retention | METTLER TOLEDO | 30389213 | |
| Pipette Tips SR LTS 20µL F 960A/5 | METTLER TOLEDO | 17005860 | |
| Pipette Tips SR LTS 300µL 768A/4 | METTLER TOLEDO | 17005867 | no filter |
| Reservoir | METTLER TOLEDO | 89094-662 | |
| Sterile, clear, 96-well flat-bottom polystyrene microplates with lids | Fisher | 168055 | |
| Tryptic soy agar (TSA) | Sigma | 105458-0500 | |
| Tryptic soy broth (TSB) | Sigma | 105459-0500 | |
| T-Shaped Cell Spreaders | VWR | 76299-566 | |
| Instruments | |||
| Analog Vortex Mixer | Fisher | 02-215-414 | |
| Compact Microbiological Incubators | Fisher | 50125590H | |
| Magnetic Stirrer Hotplates | FIsher | 13-889-335 | |
| Polygon Stir Bars | FIsher | 14-512-125 | length: 20 mm |
| Synergy Neo2 Hybrid Multi-Mode Reader | Fisher | BTNEO2M | |
| Software | |||
| SAS | SAS Institute | 9.4 |
References
- Carvalho, C., Costa, A. R., Silva, F., Oliveira, A. Bacteriophages and their derivatives for the treatment and control of food-producing animal infections. Critical Reviews in Microbiology. 43 (5), 583-601 (2017).
- Czaplewski, L., et al. Alternatives to antibiotics-a pipeline portfolio review. The Lancet. Infectious Diseases. 16 (2), 239-251 (2016).
- Cisek, A. A., Dabrowska, I., Gregorczyk, K. P., Wyzewski, Z. Phage therapy in bacterial infections treatment: one hundred years after the discovery of bacteriophages. Current Microbiology. 74 (2), 277-283 (2017).
- Liu, H., et al. Control of Escherichia coli O157 on beef at 37, 22 and 4°C by T5-, T1-, T4-and O1-like bacteriophages. Food Microbiology. 51, 69-73 (2015).
- Moye, Z. D., Woolston, J., Sulakvelidze, A. Bacteriophage applications for food production and processing. Viruses. 10 (4), (2018).
- Ly-Chatain, M. H. The factors affecting effectiveness of treatment in phages therapy. Frontiers in Microbiololgy. 5, 51 (2014).
- Dy, R. L., Rigano, L. A., Fineran, P. C. Phage-based biocontrol strategies and their application in agriculture and aquaculture. Biochemical Society Transactions. 46 (6), 1605-1613 (2018).
- Bourdin, G., et al. Coverage of diarrhoea-associated Escherichia coli isolates from different origins with two types of phage cocktails. Microbial Biotechnology. 7 (2), 165-176 (2014).
- Niu, Y. D., Liu, H., Johnson, R. P., McAllister, T. A., Stanford, K. Efficacy of individual bacteriophages does not predict efficacy of bacteriophage cocktails for control of Escherichia coli O157. Frontiers in Microbiololgy. 12, 616712 (2021).
- Niu, Y. D., Liu, H., Johnson, R. P., McAllister, T. A., Stanford, K. Effect of a bacteriophage T5virus on growth of Shiga toxigenic Escherichia coli and Salmonella strains in individual and mixed cultures. Virology Journal. 17, 3 (2020).
- Brüssow, H. What is needed for phage therapy to become a reality in Western medicine. Virology. 434 (2), 138-142 (2012).
- Chan, B. K., Abedon, S. T., Loc-Carrillo, C. Phage cocktails and the future of phage therapy. Future Microbiology. 8 (6), 769-783 (2013).
- Nikolich, M. P., Filippov, A. A. Bacteriophage therapy: developments and directions. Antibiotics. 9 (3), Basel, Switzerland. 135 (2020).
- Niu, Y. D., et al. Host range and lytic capability of four bacteriophages against bovine and clinical human isolates of Shiga toxin-producing Escherichia coli O157:H7. Journal of Applied Microbiology. 107 (2), 646-656 (2009).
