Summary
在该协议中,通过将 Spodoptera frugiperda(Sf9) 昆虫细胞与杆状病毒(BV)-AAV2-绿色荧光蛋白(GFP)或治疗基因和BV-AAV2-rep-cap感染的Sf9细胞在悬浮培养物中共同培养来产生AAV2载体。使用洗涤剂从细胞中释放AAV颗粒,澄清,通过亲和柱色谱纯化,并通过切向流过滤浓缩。
Abstract
腺相关病毒(AAV)是基因治疗应用的有前途的载体。在这里,AAV2载体是通过在无血清悬浮培养物中共培养 Spodoptera frugiperda(Sf9) 细胞与感染杆状病毒(BV)-AAV2-GFP(或治疗基因)和BV-AAV2-rep-cap的Sf9细胞共培养产生的。细胞在轨道振荡器或Wave生物反应器的烧瓶中培养。为了释放AAV颗粒,将生产者细胞裂解在含有洗涤剂的缓冲液中,随后通过低速离心和过滤进行澄清。使用AVB Sepharose柱色谱法从细胞裂解物中纯化AAV颗粒,其结合AAV颗粒。用PBS洗涤结合的颗粒以除去污染物,并使用柠檬酸钠缓冲液在pH 3.0下从树脂中洗脱。酸性洗脱液用碱性Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)中和,用磷酸盐缓冲盐水(PBS)稀释,并用切向流动过滤(TFF)进一步浓缩。该协议描述了小规模的临床前载体生产与用于人类基因治疗应用的大规模临床级AAV制造相容。
Introduction
腺相关病毒(AAV)是非包膜的人类细小病毒,含有4.6 kb的单链DNA。对于基因治疗应用,AAV载体比其他病毒载体具有几个优点1,2,3,4。AAV自然是复制无能的,因此,需要帮助病毒和主机进行复制。AAV不会引起任何疾病,并且在受感染的宿主3,5中具有低免疫原性。AAV可以感染静止和主动分裂的细胞,并且可以持续作为表观体而不整合到宿主细胞的基因组中(AAV很少整合到宿主基因组中)1,3。这些特性使AAV成为基因治疗应用的理想工具。
为了生成AAV基因转移载体,在两个内部末端重复序列(ITR)之间克隆转基因盒,包括治疗基因,这两个重复序列通常来自AAV血清型2。从5'ITR到3'ITR的最大尺寸,包括转基因序列,为4.6 kb6。不同的衣壳可能具有不同的细胞或组织向性。因此,应根据拟用AAV载体靶向的组织或细胞类型选择衣壳7。
重组AAV载体通常在哺乳动物细胞系中产生,例如人胚胎肾细胞,HEK293通过AAV基因转移载体,AAV rep-cap和辅助病毒质粒2,3的瞬时转染。然而,通过贴壁HEK293细胞的瞬时转染进行大规模AAV生产存在一些局限性。首先,需要大量的电池堆或滚瓶。其次,需要高质量的质粒DNA和转染试剂,这增加了制造成本。最后,当使用贴壁HEK293细胞时,血清经常需要最佳生产,使下游处理1,2,3复杂化。AAV制造的替代方法涉及使用昆虫细胞系,Spodoptera frugiperda(Sf9)细胞,以及称为重组Autographa californica多衣壳核多肝病病毒(AcMNPV或杆状病毒)的昆虫病毒8,9,10。Sf9细胞在无血清悬浮培养物中生长,易于放大,并且与当前大规模的良好生产规范(cGMP)生产兼容,不需要质粒或转染试剂。此外,使用Sf9-杆状病毒系统的AAV生产成本低于使用质粒瞬时转染到HEK293细胞的成本11。
原来的rAAV生产系统使用杆状病毒-Sf9细胞,使用三种杆状病毒:一种是含有基因转移盒的杆状病毒,第二种是含有重复基因的杆状病毒,第三种杆状病毒含有血清型特异性衣壳基因12、13。然而,含有重复构建体的杆状病毒在多轮传代时遗传不稳定,这阻止了杆状病毒在大规模AAV生产中的扩增。为了解决这个问题,开发了一种新型的rAAV载体系统,其中包含两种杆状病毒(TwoBac):一种含有AAV基因转移盒的杆状病毒和另一种含有AAV重集基因的杆状病毒,它们在遗传上比原始系统更稳定,并且由于使用TwoBac而不是三个14,因此更方便产生rAAV。 15.OneBac系统使用单个杆状病毒中的AAV基因转移盒和rep-cap基因,由于使用一种杆状病毒而不是使用TwoBac或ThreeBac2,16,17,因此更方便地产生rAAV。在我们的研究中,TwoBac系统用于优化。
用于AAV生产的杆状病毒系统也有局限性:杆状病毒颗粒在无血清培养基11中长期储存不稳定,如果杆状病毒滴度低,则需要大量的杆状病毒上清液,这可能在AAV生产过程中对Sf9细胞的生长产生毒性(个人观察)。使用无滴度感染细胞保存和放大(TIPS)细胞或杆状病毒感染的昆虫细胞(BIIC)为AAV生产提供了一个很好的选择,其中制备杆状病毒感染的Sf9细胞,冷冻保存,随后用于感染新鲜的Sf9细胞。另一个优点是冷冻保存后Sf9细胞中杆状病毒(BV)的稳定性增加10,11。
产生两种类型的TIPS细胞以实现AAV的产生:第一种是通过感染具有BV-AAV2-GFP或治疗基因的Sf9细胞,第二种是通过具有BV-AAV2-rep-cap的Sf9细胞感染的。TIPS细胞被冷冻保存在小型和即用型等分试样中。AAV载体通过共培养产生杆状病毒和新鲜Sf9细胞的TIPS细胞,在置于轨道振荡器或Wave生物反应器的烧瓶中以无血清悬浮培养物产生。Sf9细胞被携带AAV2-GFP载体和重复帽序列以产生AAV的杆状病毒感染。四到五天后,当AAV产量最高时,用洗涤剂裂解生产细胞以释放AAV颗粒。随后通过低速离心和过滤澄清细胞裂解物。AAV颗粒通过AVB琼脂糖柱色谱法从裂解物中纯化。最后,使用TFF浓缩AAV载体。该协议描述了AAV的小规模生产,可用于研究和临床前研究。然而,这些方法是可扩展的,并且与制造用于基因治疗应用的临床级AAV载体兼容。
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Protocol
有关概述该协议的插图,请参见图 1。
1. 杆状病毒感染的TIPS细胞的产生
- 解冻一小瓶Sf9细胞,并立即将其接种在50 mL昆虫细胞培养基中。在轨道振荡器培养箱中以125rpm和28°C在圆底烧瓶中培养Sf9细胞,带有松散的盖子以交换空气8,9。在含有200mL培养基的1L烧瓶中繁殖细胞,以获得足够的细胞用于TIPS细胞的产生。
- 在两个烧瓶中以2×106 个细胞/ mL加入50 mL Sf9细胞:用0.5mL杆状病毒(BV)-AAV2-GFP(或治疗基因)感染一个Sf9细胞瓶,另一个用0.5mL BV-AAV2-rep-cap感染另一个细胞瓶。
注:AAV载体质粒由Robert M. Kotin博士(NIH)慷慨提供。从Bacmid DNA(Bac-to-Bac系统)中产生杆状病毒已经在8,9中进行了描述。杆状病毒在传代过程中的稳定性是rAAV放大生产的关键问题。最好使用杆状病毒的较低通道数(最多为4号通道)。在TIPS细胞生产过程中,通过使用流式细胞术检查杆状病毒感染效率,根据经验确定杆状病毒上清液的最佳体积(图2)。 - 通过在受感染的Sf9细胞中染色杆状病毒gp64,在感染后3-4天监测杆状病毒感染,如下所示。
- 用0.5μg小鼠抗杆状病毒gp64抗体(1:200)染色2×105 个Sf9细胞(未感染和杆状病毒感染的细胞),该抗体含有荧光染料,在环境温度下在100μL封闭缓冲液中30分钟。
- 用1mL PBS洗涤细胞以除去抗体,并将染色的细胞重悬于含有0.5%牛血清白蛋白的300μLPBS中。
- 使用流式细胞术分析杆状病毒gp64在细胞上的表达(图2)。
注:根据经验确定流式细胞术采集和分析的门控策略。总共获得10,000个单活细胞。杆状病毒gp64在Sf9细胞表面的表达提示杆状病毒感染。3-4天后,大多数Sf9细胞感染杆状病毒,如杆状病毒gp64表达所证明的那样(图2)。
- 当细胞随着直径的增加而存活80%-90%时(图3),收获细胞并在1mL昆虫培养基中冷冻保存1×107 个细胞,其中补充有10%胎牛血清和10%二甲基亚砜在-80°C的慢速冷冻容器中。 第二天,将含有TIPS细胞的管转移到液氮冰箱中长期储存。
注意:按照生物安全级别2(BSL-2)的标准无菌实验室技术在生物安全柜中进行细胞培养。
2. AAV载体的生产
- 第1天:将Sf9细胞与杆状病毒感染的TIPS细胞共同培养
- 在28°C下以1×106个细胞/mL在含有400mL昆虫细胞培养基的几个2L烧瓶中培养并培养幼稚的Sf9细胞,该培养箱是AAV生产所需的。3-4天后,细胞密度增加到5×106-6×106个细胞/mL。
注意:CO2 和湿度不是Sf9细胞生长的重要因素。 - 将Sf9细胞接种在摇瓶或生物反应器中,如下所示。
- 在轨道振荡器培养箱中的烧瓶中产生AAV:使用移液管或蠕动泵以2×106 个细胞/ mL无菌方式将400 mL Sf9培养物接种到2 L烧瓶中。将轨道式振动器设置为125 rpm和28°C。
注意:使用蠕动泵或标准移液器,具体取决于AAV生产的规模。 - 生物反应器中的AAV生产:使用蠕动泵以2×106 个细胞/ mL将1 L Sf9培养物无菌接种到10 L生物反应器袋中。将袋子装入生物反应器装置,在28°C下培养。 在0.1 psi下向生物反应器袋中加入40%的氧气。以20°角设置生物反应器单元,并以25 rpm的速度摇动袋子。
- 在轨道振荡器培养箱中的烧瓶中产生AAV:使用移液管或蠕动泵以2×106 个细胞/ mL无菌方式将400 mL Sf9培养物接种到2 L烧瓶中。将轨道式振动器设置为125 rpm和28°C。
- 解冻每个BV-AAV2-GFP(或治疗基因)和BV-AAV2-rep-cap TIPS细胞的一小瓶。用20mL昆虫培养基稀释细胞,并使用台盼蓝对细胞进行活力计数。相对于在摇摇瓶或生物反应器中培养的朴素Sf9细胞,以1:10,000的比例接种两个TIPS细胞。
注意:由于低温保存,TIPS细胞的存活率降低,当使用台盼蓝染色确定细胞活力时,回收率约为50%。在大规模rAAV生产之前,进行试点实验以经验确定TIPS细胞和朴素Sf9细胞的比例。
- 在28°C下以1×106个细胞/mL在含有400mL昆虫细胞培养基的几个2L烧瓶中培养并培养幼稚的Sf9细胞,该培养箱是AAV生产所需的。3-4天后,细胞密度增加到5×106-6×106个细胞/mL。
- 第2天:培养监测
- 收获1 mL Sf9无菌培养物。用台盼蓝染料染色,以分析细胞计数,活力和形态。
- 第3天:培养监测和喂养
- 收获1 mL Sf9培养物并分析细胞计数,活力和形态。如步骤1.3所述,在染色Sf9细胞后检查杆状病毒感染的状态。
注意:细胞直径增加和细胞病变作用是杆状病毒感染的指示。直径的增加先于细胞活力的降低,这些参数用于确定AAV生产过程中的细胞收获时间。根据经验确定最佳时间点。 - 用新鲜的昆虫培养基以1:5的比例无菌喂养Sf9培养物。
- 收获1 mL Sf9培养物并分析细胞计数,活力和形态。如步骤1.3所述,在染色Sf9细胞后检查杆状病毒感染的状态。
- 第4天:文化监测
- 收获1 mL Sf9培养物并分析细胞计数,活力和形态。断开生物反应器袋的氧气供应。
- 第5天:养殖监测和收获
- 收获1 mL Sf9培养物并分析细胞计数,活力和形态。当Sf9细胞活力降至50%左右时,收获培养基和细胞(图4)。
- 在4°C下以2100×g旋转细胞悬浮液15分钟。 收集上清液和细胞沉淀,并将它们储存在-80°C。
3. 细胞裂解和AAV释放
- 解冻AAV生产者细胞沉淀。向细胞沉淀中加入100mL细胞裂解缓冲液(20mM Tris-HCl pH 8.0,150mM氯化钠,0.5%Triton-X-100),剧烈混合,并在环境温度下孵育30分钟以释放AAV颗粒。
- 在4°C下以2100×g离心30分钟,并将细胞裂解物转移到新容器中。 解冻后混合细胞裂解物和细胞培养物上清液。
- 向细胞裂解物中加入20 U / mL核酸酶和10 mM MgCl2 以消化DNA和RNA。在37°C下孵育2-4小时。
- 使用泵通过0.8μm和0.2μm聚醚砜双过滤系统过滤裂解物。
- 将澄清的细胞裂解物储存在4°C过夜或立即纯化AAV。
4. 使用亲和柱色谱系统纯化AAV载体
- 通过以50 mL / min的流速依次用无菌水,1 N氢氧化钠,水和磷酸盐缓冲盐水(PBS,pH 7.4)洗涤样品和缓冲管路来制备色谱仪。
- 将 AVB 琼脂糖色谱柱 (10.0 mL) 安装到色谱系统中,并以 5 mL/min 的流速运行 100 mL PBS。
注意:根据AAV生产的规模,使用较低或较高体积的AVB Sepharose柱,并按照色谱柱或树脂制造商的建议设置流速(见 材料表)。 - 为了收集柱直通溶液,洗涤缓冲液和含有AAV颗粒的洗脱缓冲液的馏分,将管插入色谱仪的馏分收集器槽中。
- 用PBS以5.0 mL/min的流速平衡色谱柱。
- 使用配备样品泵的色谱机将含有AAV颗粒的过滤细胞裂解物加载到色谱柱上。以每分钟3.0 mL的流速运行样品。
- 以 3.0 mL/min 的流速通过 AVB 琼脂糖柱运行 PBS,直到紫外线 (UV) 吸光度曲线 (280 nm) 返回基线并变得稳定。
- 用50 mM柠檬酸钠(pH 3.0)缓冲液以3.0 mL / min的流速从色谱柱中洗脱AAV颗粒(图5)。
注意:当AAV颗粒与树脂解离并通过紫外线检测器时,可以在色谱图上看到蛋白质的洗脱峰。 - 立即用五分之一体积的500mM Tris-HCl(pH 8.0)稀释AAV上清液,将含有上清液的AAV的pH值提高到约pH 5.5,以防止pH介导的降解与酸性洗脱缓冲液。此外,用PBS稀释AAV上清液10倍以完全中和pH值。
注意:中和rAAV溶液后,pH值约为5.5。中和AAV后,用PBS(pH 7.4)稀释rAAV溶液10倍,使AAV处于生理缓冲液中。 - 储存1 mL每个柱的径通样品,洗涤缓冲液和100μL洗脱的AAV上清液,以评估靶细胞感染的AAV的存在。
- 用100 mL柠檬酸(pH 2.1)和100 mL PBS(pH7.4)以5.0 mL / min的流速清洁AVB Sepharose柱。以5.0 mL / min的流速用20%乙醇冲洗色谱柱,并储存在4°C。
- 按照第4.1节所述,使用柱离线位置清洁色谱仪的管道。最后,用200 mL 20%乙醇以50.0 mL / min的流速冲洗色谱系统,并储存在20%乙醇中。
5. 使用切向流过滤(TFF)对AAV载体进行浓缩和渗滤
- 设置配备聚砜膜盒(100 kDa分子量截止值)的TFF系统以浓缩AAV。
- 将TFF模块与200 mL PBS平衡10分钟。
- 通过控制泵的流量来加载AAV样品,直到样品减小到所需的体积,同时保持跨膜压力在2-3 psi。
- 本研究中使用的 100 mL PBS 透析滞留物,或根据经验定义支持 AAV 长期稳定性的替代缓冲液。
- 将AAV样品浓缩至所需体积后,收集AAV样品,通过0.2μm聚醚砜过滤器过滤,等分试样,然后将其储存在-80°C。
6.将AAV样品感染到靶细胞中,以评估AAV在纯化步骤中的存在
- 在感染前一天,将7 x 104 HT1080 细胞接种在24孔板中,加入500μLDulbecco改性鹰培养基(DMEM),补充1%L-谷氨酰胺,1%丙酮酸钠和10%胎牛血清(FBS)。将细胞在37°C和5%CO2的培养箱中培养。
- 在感染前对细胞进行计数。在色谱柱运行前加入稀释的未纯化AAV散装样品、柱运行样品、洗涤缓冲液和洗脱的纯化AAV样品。
注意:用血细胞计数器计数台盼蓝染细胞。根据经验确定AAV样品的稀释因子和体积(μL)。AAV滴度越高,需要的稀释度就越高。确保在柱运行前将未纯化的散装样品的杆状病毒颗粒,柱运行样品,洗涤缓冲液在感染靶细胞之前在50°C下热灭活50分钟,以确定AAV的感染性滴度。 - 感染后两天,使用流式细胞仪分析细胞中的蛋白表达(例如,GFP或治疗基因)。
- 使用感染时的细胞数量,稀释因子和GFP +细胞的百分比计算AAV的感染性滴度,公式为:(细胞总数x百分比GFP +细胞x稀释因子)/AAV体积(毫升)。
注意:例如,细胞数为1×105,GFP+细胞的百分比为3.4%,稀释因子为100,加入的AAV体积为2μL。AAV 的滴度为 1.7 x 108 个感染单位 (IU)/mL。25 mL洗脱馏分中纯化的AAV颗粒的总量为4.3 x 109 个感染单位(IU)/ mL(图6)。初始未纯化的AAV颗粒总数为1.09 x 1010 IU / mL,纯化的AAV颗粒为4.3 x 109 IU / mL。因此,回收百分比为39.4%。GFP +细胞的百分比应在1%-30%之间,当用于计算AAV的感染滴度时,对应于线性范围。如果更浓缩的AAV载体颗粒感染到靶细胞中;AAV颗粒的多个拷贝有可能感染单个细胞,该细胞将显示为载体的单个拷贝。因此,稀释AAV载体上清液以获得靶细胞中1%-30%的载体感染。如果AAV载体没有报告基因,则用含有荧光染料的抗体对AAV载体表达的转基因或治疗基因进行染色,该抗体可以使用流式细胞仪进行检测和定量。并非所有AAV血清型都能有效地感染HT1080细胞。因此,要对其他AAV血清型进行感染性测定,请使用不同的细胞系。在HT1080细胞上纯化前和纯化后滴定AAV2-GFP颗粒,并通过流式细胞术测量GFP表达。通过将纯化的AAV颗粒数与纯化的AAV颗粒数乘以100的比率计算回收率(%)。
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Representative Results
这里展示了使用Sf9昆虫细胞系统生产和纯化AAV载体的工艺开发的代表性结果。该方法包括将Sf9细胞与杆状病毒感染的TIPS细胞共培养,用生长培养基喂养细胞,收获和裂解生产细胞以释放AAV颗粒,用核酸酶处理澄清细胞裂解物,离心和过滤,使用AVB Sepharose亲和色谱法纯化AAV,并用TFF浓缩(图1)。
TIPS细胞通过感染BV-AAV2-GFP或治疗基因和BV-AAV2-rep-cap分别进入Sf9细胞而产生。由于多轮感染,大多数Sf9细胞在3-4天内感染杆状病毒,由杆状病毒糖蛋白gp64表达(图2)和细胞直径增加(图3)证明。TIPS细胞在感染后3-4天收获并冷冻保存。Sf9细胞与在培养基中分泌杆状病毒颗粒的TIPS细胞共培养,这些颗粒感染幼稚的Sf9细胞。杆状病毒具有复制能力;因此,感染细胞的数量通过多次圆形感染而迅速增加,新产生的杆状病毒颗粒被分泌到培养基8,9中。细胞显示出直径增加,细胞病变效应,大约一半的细胞在感染后5天内死亡,这是AAV生产完成的迹象(图4)。
AAV生产者细胞通过低速离心收获,用含有洗涤剂的缓冲液裂解,将AAV释放到细胞裂解物中。然后用核酸酶处理以消化DNA和RNA以降低粘度,通过0.8μm和0.2μm膜过滤,然后纯化和浓缩。使用色谱系统将细胞裂解物加载到AVB Sepharose柱上。AVB Sepharose树脂由于其与衣壳蛋白的亲和力而结合AAV2颗粒。洗涤缓冲液通过AVB Sepharose柱以去除未结合和松散结合的材料,直到紫外线(UV)吸光度曲线(280nm)在基线处变得稳定。由于AAV颗粒与AVB Sepharose强结合,因此在洗涤过程中没有检测到大量AAV2颗粒。AAV颗粒用酸性缓冲液(pH 3.0)洗脱,其解离AAV颗粒与AVB琼脂糖树脂之间的相互作用。为了防止酸性溶液介导的AAV的pH降解,用碱性缓冲液(pH 8.0)中和洗脱剂。当用对应于AAV级分的酸性缓冲液洗脱时,可以看到蛋白质的峰值(图5和图6)。纯化的AAV用PBS稀释10倍,浓缩和缓冲液与TFF系统交换。在本例中,细胞裂解物(560 mL)中的总AAV颗粒为1.1×1014载体基因组(vg),AVB琼脂糖色谱纯化(25 mL)后为4.1×1013 vg,用TFF(25 mL)浓缩后为2.4 x 1013 vg。纯化的AAV样品在SDS-PAGE和银染色后显示出三种不同的衣壳蛋白VP1,VP2和VP3(图7)。
图 1:AAV 矢量生产和纯化的示意图。请单击此处查看此图的放大图。
图2:Sf9细胞中杆状病毒gp64表达的流式细胞术分析。 用含有荧光染料的小鼠抗杆状病毒gp64抗体染色杆状病毒感染的Sf9细胞,该抗体通过流式细胞术检测。(A) 未感染的Sf9细胞。(B)杆状病毒感染的Sf9细胞在大多数细胞中显示出gp64表达。 请点击此处查看此图的放大版本。
图3:杆状病毒感染的Sf9(TIPS)细胞的形态。 杆状病毒被感染到Sf9细胞中以产生TIPS细胞。(A) 未感染的Sf9细胞。(B) 杆状病毒感染的 Sf9 (TIPS) 细胞。单元格以 200 倍放大倍率显示。 请点击此处查看此图的放大版本。
图4:杆状病毒感染的Sf9细胞在AAV生产过程中的形态。 TIPS细胞分泌杆状病毒,在AAV产生过程中感染共培养的幼稚Sf9细胞。(A) 未感染的Sf9细胞。(B)杆状病毒感染的Sf9细胞显示出直径增加。感染后五天,几乎一半的细胞死亡(台盼蓝染色后在倒相显微镜下可视化)。红色箭头表示活细胞,蓝色箭头表示死细胞。单元格以 200 倍放大倍率显示。 请点击此处查看此图的放大版本。
图5:使用AVB琼脂糖柱层析法纯化AAV。 色谱图显示蛋白质样品在柱上加载,洗涤和洗脱期间在280nm处的吸光度。色谱图已经过修改,以适应图中。 请点击此处查看此图的放大版本。
图6:在装载到柱上,洗涤和洗脱过程中流出的传染性AAV颗粒的数量。 将总共560 mL AAV样品上样到10 mL AVB Sepharose柱上。柱上量的馏分体积为50 mL,柱洗为50 mL,洗脱为25 mL。在用柱运行样品感染HT1080细胞后测量AAV滴度,同时加载柱,洗涤和洗脱,以研究纯化每一步是否存在AAV。总纯化AAV产量为4.3×109 个感染单位。每个菱形符号代表每个分数中AAV的感染单位(IU)。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 7.SDS-PAGE和纯AAV载体的银染色显示衣壳蛋白。 还原的AAV样品在SDS-PAGE上运行,并进行银染色。可见三个不同的AAV衣壳蛋白条带,VP1,VP2和VP3。 请点击此处查看此图的放大版本。
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Discussion
该协议中用于AAV载体生产,纯化和浓缩过程开发的参数可应用于基因治疗应用的AAV载体的小型和大规模制造。整个上游和下游过程可以在与当前良好生产规范(cGMP)兼容的封闭系统中执行。Sf9-杆状病毒系统的主要优点是可扩展性,能够以可承受的成本进行大规模的GMP级AAV生产。该系统不需要昂贵的质粒和转染试剂,而使用HEK293细胞生产AAV则需要这些质粒和转染试剂。据报道,HEK293细胞和Sf9细胞都产生相似质量的AAV载体(Eric D. Horowitz,ASGCT 2018,摘要#100)。主要挑战是,该系统需要产生杆状病毒和TIPS细胞,这需要大量的时间和精力。
在该协议中,使用两种类型的TIPS细胞(TwoBac系统):一个含有具有AAV基因转移盒的杆状病毒的TIPS细胞和另一个含有AAV-rep-cap的TIPS细胞。OneBac系统2、16、17可以在单个杆状病毒中产生含有AAV基因转移盒和重复帽基因的TIPS细胞。OneBac系统提供了一种替代方法,仅使用一组TIPS单元而不是TwoBac系统中所述的两个单元来生成rAAV,这将进一步简化协议。
该协议描述了Sf9细胞中的AAV生产。重要的是要优化杆状病毒感染的TIPS细胞与产生幼稚Sf9细胞的比例,以获得良好的AAV产量。如果该比率次优,则AAV的产量将降低11。例如,如果由于TIPS和生产者细胞的次优比例而产生比生产者细胞中更多的含有基因转移载体的AAV ITR,则所有可用的基因转移载体将无法获得足够的衣壳来产生完整的AAV颗粒。另一方面,如果在生产者细胞中产生的衣壳比AAV基因转移载体多,则所有衣壳都不会获得含有导致空AAV颗粒的基因转移载体的AAV ITR。
随着细胞的繁殖,培养基的营养物质被耗尽,代谢废物积聚。因此,在TIPS细胞和Sf9细胞共培养2天后,将20%新鲜生长培养基补充到细胞培养物中可以显着增加AAV滴度(Amine A. Kamen,加拿大国家研究委员会,个人通讯)。
AAV颗粒的纯度是实现靶细胞有效转导而没有任何细胞毒性的关键因素,用于体外和体内研究3,5。因此,重要的是要包括一个色谱步骤,该步骤可以选择性地纯化AAV颗粒并消除杂质,例如宿主细胞蛋白和碎片,基因组和杆状病毒DNA以及聚集和片段化的载体。在将AAV上清液加载到AVB Sepharose柱上时,检查流通样品是否存在可能通过色谱柱而不与树脂结合的AAV颗粒至关重要。如果是这种情况,(1)较低的运行速度导致更长的停留时间对于结合AAV颗粒是必要的,(2)应减少加载到色谱柱上的样品量,和/或(3)AVB Sepharose的体积应增加,以便色谱柱的结合能力永远不会超过AAV颗粒的数量。AVB Sepharose树脂以高流速结合AAV颗粒的能力以及高亲和力和容量对于减少纯化时间非常重要。AVB Sepharose的主要局限性在于它结合AAV血清型1,2和5的衣壳。因此,应测试不同的色谱树脂并将其用于纯化其他AAV血清型18。本文所述的下游纯化方案也可用于纯化HEK 293细胞中产生的AAV。
该协议可以从细胞裂解物中纯化AAV,但不能去除空颗粒。一些文章描述了可以区分纯化的AAV库存19,20中的空AAV颗粒与全AAV颗粒的方法。但是,我们认为,AAV生产应该在上游工艺水平上进行优化,以最大限度地减少空颗粒的产生。如果AAV基因转移载体与生产者细胞中衣壳产生的比例不是最佳的,则可能会产生更多的空颗粒。
除了结合完整的AAV颗粒外,AVB Sepharose培养基还结合可以使用TFF去除的片段AAV颗粒或衣壳蛋白。通过包括柱层析下游的TFF步骤,从AAV样品中消除了大多数低分子量颗粒。此外,TFF用于进行缓冲液交换/渗滤和浓缩AAV10,21。
虽然用氯化铯或碘沙醇梯度超速离心AAV裂解物是小规模和临床前级AAV纯化的首选方法,但该方法不可扩展,不太适合AAV21,22的大规模纯化。
综上所述,该方案用于AAV的生产和纯化的工艺开发,对于重组AAV的小规模临床前和大规模制造,用于遗传性遗传疾病的基因治疗。
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Disclosures
作者声明没有利益冲突。
Acknowledgments
我们要感谢Robert M. Kotin博士(国家心脏,血液和肺部研究所,NIH)慷慨地为我们提供了AAV质粒,并感谢Danielle Steele和Rebecca Ernst(辛辛那提儿童医院)的技术援助。这项工作得到了辛辛那提儿童研究基金会(Cincinnati Children's Research Foundation)到M.N.的启动基金的支持。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1 N Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.09137 | For Akta Avant cleaning |
2 L flasks | ThermoFisher Scientific | 431281 | Flask for suspension culture |
50 ml Conical tube | ThermoFisher Scientific | 14-959-49A | For collection of supernatants |
24-well plate | ThermoFisher Scientific | 07-200-80 | Adherent cell culture plate |
250 mL flasks | ThermoFisher Scientific | 238071 | Flask for suspension culture |
Akta Avant 150 with Unicorn Software | Cytiva | 28976337 | Chromatography system |
AVB Sepharose High Performance | Cytiva | 28411210 | Chromatography medium |
Baculovirus-AAV-2 GFP | In-house | non-catalog | AAV transfer vector |
Baculovirus-AAV-2 rep-cap | In-house | non-catalog | AAV packaging vector |
Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Enzyme to degrade DNA and RNA |
Blocking buffer | Santa Cruz Biotechnologies | 516214 | Blocking to prevent non-specific antibody binding to cells |
Cell lysis buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.5 % Titron X-100 |
Cellbag, 2 L and 10 L | Cytiva | 28937662 | Bioreactor bag |
Cleaning buffer | In-house | Non-catalog item | 100 mM citric acid (pH 2.1) |
Cryovial | Thomas Scientific | 1222C24 | For cryopreservation |
DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Growth media for cell lines |
Elution buffer | In-house | Non-catalog item | 50 mM sodium citrate buffer (pH 3.0) |
Ethanol | Sigma-Aldrich | E7073 | For disinfection and storage of the chromatography |
Filtration unit | Pall Corporation | 12941 | Membrane filter |
HT1080 cell line | ATCC | CCL-121 | Fibroblast cell line |
HyClone™ SFX-Insect culture media | Cytiva | SH30278.02 | Serum-free insect cell growth medium |
Peristaltic Pump | Pall Corporation | Non-catalog item | TFF pump |
MaxQ 8000 orbital shaker incubator | ThermoFisher Scientific | Non-catalog item | Shaker for suspension culture |
Microscope | Nikon | Non-catalog item | Cell monitoring and counting |
Mouse anti-baculovirus gp64 PE antibody | Santa Cruz Biotechnologies | 65498 PE | Monitoring baculovirus infection in Sf9 cells |
Oxygen tank | Praxair | Non-catalog item | 40 % Oxygen supply is needed for Sf9 cell growth |
PBS | ThermoFisher Scientific | 20012027 | Wash buffer |
Silver Staining kit | ThermoFisher Scientific | LC6100 | Staining AAV capsid proteins |
Sf9 cells | ThermoFisher Scientific | 11496-015 | Insect cells |
Steile water | In-house | Non-catalog item | For Akta Avant cleaning |
Table top centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | For clarification of Baculovirus supernatant |
Tangential Flow Filtration (TFF) cartridge | Pall Corporation | OA100C12 | TFF cartridge to concentrate the AAV |
Tris-HCl, pH 8.0 | ThermoFisher | 15568025 | Alkaline buffer to neutralize the eluted AAV |
WAVE Bioreactor System 20/50 | Cytiva | 28-9378-00 | Bioreactor |
References
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