Summary
Denne protokol beskriver en metode til isolering af neutrofiler fra fuldblod, buffy frakker, eller leukaferse membraner, opnå godt udbytte, høj renhed, og minimal celle aktivering. Vi bruger gradient rensning, rød blodlegemer (RBC) sedimentering, og RBC lysis at opnå en høj kvalitet / renhed neutrophil forberedelse.
Abstract
Neutrofiler (PMNs) er de mest rigelige leukocytter i menneskelig omsætning, der spænder fra 40 til 70% af det samlede blod leukocytter. De er de første celler rekrutteret på stedet for betændelse via hurtig ekstravasation gennem fartøjer. Der udfører neutrofiler en række funktioner for at dræbe invaderende patogener og mægle immunsignalering. Friskrensede neutrofiler fra humant blod er den foretrukne model for undersøgelse, da ingen cellelinje fuldt replikerer PMN-funktioner og biologi. Neutrofiler er imidlertid kortvarige, terminalt differentierede celler og er meget modtagelige for aktivering som reaktion på fysiske (temperatur, centrifugeringshastighed) og biologiske (endotoksin-, kemo- og cytokiner) stimuli. Derfor er det afgørende at følge en standardiseret, pålidelig og hurtig metode til at opnå rene og ikke-aktiverede celler. Denne protokol præsenterer en opdateret protokol, der kombinerer tæthedsgradientcentrifugering, RBC-sedimentering (Red Blood) og RBC lysis for at opnå høj PMN-renhed og minimere celleaktivering. Desuden diskuteres metoder til vurdering af neutrophil isolation kvalitet, levedygtighed og renhed også.
Introduction
Det medfødte immunsystem består af mange celletyper, der opretholder immun homøostase og patogen clearance sammen med mange andre fysiologiske funktioner. Neutrofiler omfatter den største pulje af hvide blodlegemer i menneskets omsætning1. De fleste modne neutrofiler opbevares i knoglemarven, som er stedet for generation til nye neutrofiler, også kaldet granulopoiesis. I knoglemarven forlader granulocytforfadererne cellecyklussen og differentierer terminalt og erhverver deres karakteristiske segmenterede kerner og granulat2. Under inflammatoriske tilstande mobiliseres neutrofiler fra blodbanen og ud af knoglemarven som reaktion på chemokiner, cytokiner og skadesrelaterede og patogenrelaterede molekylære mønstre fra blodbanen og ud af knoglemarven for at udføre en bred vifte af funktioner. Disse omfatter cytokin sekretion, direkte fagocytose af patogenetose, frigivelse af reaktive iltarter, degranulation af antimikrobielle proteiner, og dannelse af neutrophil ekstracellulære fælder.
De molekyler, der anvendes af neutrofiler til at bekæmpe infektion er giftige for mikrober og værten. Således er levetiden og korrekt fjernelse af aldrende / døende neutrofiler stærkt reguleret, og de har en begrænset levetid i omløb (<48 h)3. På grund af denne korte overlevelse producerer menneskekroppen i gennemsnit 100 milliarder nye neutrofiler hver dag for at opretholde befolkningen homøostase4. Emergency granulopoiesis kan yderligere øge frigivelsen af neutrofiler, både modne og umodne, i blodet under betændelse og infektion5. Betydningen af neutrofiler i det medfødte immunrespons fremhæves af patienter med erhvervet eller medfødt neutropeni, som er modtagelige for bakterie- og svampeinfektioner6.
Mange udfordringer opstår, når man studerer neutrophilbiologi og deres roller i immunresponset på grund af deres natur, herunder deres korte overlevelse og cytotoksiske indhold. Neutrohil-lignende cellelinjer er blevet almindeligt differentieret fra human promyelocytic leukæmi HL-60 celler og PLB-985 celler7,8. Selv om de kan vise neutrohil-lignende morfologi og udføre chemotaxis, kan disse cellelinjer ikke fuldt ud generobre biologi neutrofiler. In vitro assays ved hjælp af disse cellelinjer er heller ikke i stand til at generobre in vivo eksperimenter. Desuden skal differentiering af disse celler induceres og kan påvirkes negativt af genmanipulation før differentiering.
For nylig er der udviklet metoder til at omgå disse problemer ved at bruge indukible initiativtagere til at modulere genekspression efter differentiering i HL-60-celler9. Selv med sådanne værktøjer er primære menneskelige PMN'er forpligtet til at validere mål ved hjælp af farmakologiske tilgange. Det er derfor bydende nødvendigt at opnå rene og inaktiverede neutrofiler isoleret fra blod for at validere resultaterne af cellelinje- og dyremodeller. Dette dokument præsenterer en revideret PMN isolation protokol, hvor fordele og ulemper ved de nuværende metoder blev evalueret10. En kombination blev udtænkt bestående af gradient centrifugering for at adskille PMN'er fra andre immunceller, kort dextran-baseret sedimentering for at fjerne hovedparten af RBC'er, hurtige resterende RBC lysis via osmotisk tryk og lavhastighedscentrifugering for at fjerne blodpladeforurening.
Protocol
BEMÆRK: Menneskelige neutrofiler blev isoleret fra venøst blod fra kasserede hvide blodlegemer filtre fra Blood Bank Lab på Boston Children's Hospital. Bloddonorer var uidentificerbare, og der var ingen interaktion med levende individer eller kendskab til identificerbare personlige oplysninger. Derfor er dette arbejde ikke klassificeret som humane forsøgspersoner forskning i henhold til HHS humane forsøgspersoner forordninger (45 CFR del 46). Boston Children's Hospital Institutional Review Board (IRB) godkendte protokollen.
1. Lagdeling af gradueringen
- Efter sterilisering af buffy frakke eller fuldblodsemballage og laminar hætten, opdele blodet i 50 mL rør med 10 mL blod i hvert rør.
- Volumen op til 35 mL med 5% fosterkvægsserum (FBS)/Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) for at fortynde blodet til en renere gradient.
BEMÆRK: Ved brug af en leukaferesemembran kan cellerne skylles ud ved hjælp af en 60 mL sprøjte og 30 mL 5% FBS/HBSS pr. filter. Fortynding er unødvendig, når du arbejder med friskt trukket fuldblod. - Luk 50 mL rørlåget, bland det flere gange ved inversion, og hold det på hovedet for at have bunden blottet for RBCs.
- Tilsæt 10 mL tæthedsgradientmedium (se materialetabellen)direkte under blodet. Sørg for, at mediet og blodet ikke blandes, og at grænsefladen er skarp (Figur 1A).
BEMÆRK: Dette trin er afgørende. Sørg for, at tæthedsgradientopløsningen er ved stuetemperatur (RT) og godt blandet før hver gradient. Den første milliliter af tætheden gradient medium skal være omhyggeligt og støt lagdelt så langsomt som muligt. Det anbefales at få den elektroniske pipettehastighed indstillet til lav. - Placer forsigtigt røret i en centrifuge uden at forstyrre gradienten og drej ved 400 × g i 30 minutter ved RT, og sørg for at deaktivere bremsen. Overhold, hvordan den spundet gradient adskiller sig i et top serum / plasmalag, en midterste hvid ring af perifere blodmonnukleare celler (PBMCs), et overskyet tæthedsgradient mellemlag og en bundpille bestående af et hvidt, tyndt neutrofilerbånd oven på RBC'erne (Figur 1B).
BEMÆRK: En overskyet eller uigennemsigtig side af røret efter centrifugering kan tyde på, at cellerne (neutrofiler) er aktiveret og muligvis ikke er egnede til brug. - Fjern PBMCs først ved at dukke suge pipetten direkte ind i PBMC-laget. Sørg for at aspirere det helt, mens serum / plasmalaget falder, når ringen fjernes. Skrab den side af røret, hvor cellerne pelleted med suge pipetten for at maksimere fjernelsen af PMBC. Fjern forsigtigt det overskyede tæthedsgradientlag mellem PBMC-ringen og neutrohil/RBC-pelleten.
BEMÆRK: Skrabning af pelleted celler på siden af røret øger renheden af isolationen betydeligt. Pas på ikke at aspirere pellet, da de fleste neutrofiler sidder direkte oven på RBCs.
2. Sedimentering af erythrocytter (RBCs)
- Ved hjælp af en 10 mL pipette overføres neutrohil/RBC-pelleten til et rent rør. Rør ikke op og ned. Tilføj 5% FBS/HBSS til et endeligt volumen på 25 mL. Bland forsigtigt ved inversion.
BEMÆRK: Udførelse af RBC-sedimenteringen efter PBMC-fjernelsen forbedrer udbyttet og reducerer aktivering10. - Der tilsættes direkte 25 mL forvarm (37 °C) 3 % Dextran/0,9 % NaCl/H2O i røret, der indeholder den fortyndede neutrohil/RBC-pille, og blandes forsigtigt ved inversion. Placer røret på en plan, ikke-vibrerende overflade i 15 min (Figur 1C).
BEMÆRK: Længere sedimentering reducerer RBC-forureningen, men reducerer også udbyttet. Desuden kan langvarig dextraneksponering føre til aktivering af neutrofiler eller celledød11. - Bring forsigtigt røret tilbage i hætten (for steril isolering). Ved kun at nedsænke pipetten en smule i væsken opsamles det øverste lag (~30 mL) efter væskeoverfladen nedad.
BEMÆRK: Hvis sedimenteringen frembringer en skarp grænseflade mellem mediet og RBC'erne, er RBC-pelleten mindre, eller hvis der ønskes et højere udbytte, opsamles op til 35 mL. - Drej røret (400 × g, 10 min, RT, ved hjælp af lav bremse (3)), hvilket resulterer i en rød pellet uden partikler, der flyder i medierne.
3. Lysis af de resterende RFC'er
- Skånsomt indsugning supernatanten uden at forstyrre pellet.
- Tilsæt 25 mL sterilt ultrapurt vand direkte i røret og bland forsigtigt ved at invertere i 28 s for at lyse RBCs. Brug ikke en pipet til at genbruge pelleten.
BEMÆRK: Må ikke overstige 30 s som langvarige hypotoniske forhold kan aktivere og føre til neutrohil død12. - Tilsæt straks 25 mL steril 1,8% NaCl/H2O i røret og bland forsigtigt ved at vende for at bringe opløsningen tilbage til isotoniske forhold.
BEMÆRK: Opløsningen skal være rød, men uden uklarhed. - Skru ned ved 200 × g i 3-5 min med lav bremse (niveau 3) for at minimere RBCs og blodplade sedimentering sammen med neutrofiler (Figur 1D og figur 2)13,14.
BEMÆRK: Pellet skal være hvid med et minimalt RBC-lag på toppen, som forsigtigt kan fjernes, mens supernatanten er indsugning. - Resuspend neutrofiler ved pipetter kulturmediet (10% FBS/RPMI1640) direkte på pelleten, men rør ikke op og ned. Rock røret vandret fra side til side for at minimere celleaktivering.
BEMÆRK: Celler skal holdes i en koncentration på ~ 2 × 106 celler / mL, da højere densitet vil føre til øget celleaktivering / død15. Af samme grund skal cellepillen suspenderes så hurtigt som muligt. - Hvis der observeres celleaggregation eller klumpning, filtreres celleaffjedringen ved hjælp af et 70 μm mesh for at kassere klumpede neutrofiler.
4. Bestemmelse af neutrophil isolation kvalitet
- Plet cellerne med markører, der er specifikke for neutrofiler (CD66b, CD11b), eosinofile (CD193) (Figur 3) og en aktiveringsmarkør som CD62L (Figur 4). Indhent 20.000 celler efter flowcytometri. Analysere cellerenhed og aktivering ved hjælp af de gatingstrategier, der foreslås i figur 3 og figur 4.
BEMÆRK: Kvaliteten af neutrophilpræparatet kan vurderes ved hjælp af en 3% eddikesyre-methylenblå opløsning til at visualisere den unikke fligede kerne af neutrofiler. - Bestemme celle levedygtighed ved hjælp af Annexin V/propidium jod (PI) (Figur 5).
BEMÆRK: Trypan blå farvning kan bruges til at evaluere celle levedygtighed.
Representative Results
Når du bruger densitetsgradient til at rense neutrofiler, er det afgørende, at grænsefladen mellem blodet og detsitetsgradientmedie er så skarpt som muligt, og at en tydelig lagadskillelse forbliver efter centrifugering (trin 1.4). Efter RBC lysis skal bufferen være klar rød og ikke uklar (trin 3.3). Hvis præparatet er overskyet, kan der kræves en anden lysisrunde (trin 3), selv om dette kan påvirke neutrophils overlevelse (figur 1). Efter lysis anbefales centrifugering ved lav hastighed (200 × g),når renhed prioriteres, da det reducerer blodpladeforurening betydeligt. Centrifugering med høj hastighed (400 × g)øger imidlertid udbyttet på bekostning af renhed (trin 3.4, figur 2). Efter neutrophilisolation kan fluorescensaktiveret cellesortering anvendes til at vurdere isolationsrenhed (trin 4.1) og bør vælges frem for mikroskopi. Selv om FSC/SSC-fordelingen af celler alene giver et skøn over celleisolationskvaliteten (Figur 3A), bør brugen af specifikke cellemarkører foretrækkes. I dette tilfælde er de mest almindelige forurenende cellepopulationer farvet med specifikke antistoffer sammen med CD66b, specifikt udtrykt på granulocytter. CD45 farvning bruges til at skelne leukocytter (CD45+) og røde blodlegemer og blodplader (CD45-).
Andre forurenende stoffer omfatter lymfocytter (CD3+ eller CD19+, figur 3F),monocytter (CD14+, figur 3D)og eosinofile (CD193+, figur 3G). CD11b er en integrin udtrykt på myeloid afstamning; neutrofiler og monocytter er CD11b+, mens lymfocytter er CD11b- (Figur 3C). Da neutrofiliering kan påvirke downstream-eksperimenter, bør udtrykket AF CD62L vurderes. neutrofiler bliver CD62L- når de er aktiveret (trin 4.1). Peptid fMLP kan bruges som en positiv kontrol til CD62L-udgydelse (Figur 4). Det er også vigtigt at evaluere neutrofilers sundhed, før der udføres analyser; neutrofiler har en relativt kort halveringstid, og aktivering kan yderligere forkorte det (trin 4.2). En standard farvning af bilagin V og PI kan give oplysninger om neutrofilerkulturens levende/døde status på bestemte tidspunkter (figur 5).
Figur 1: Mellembaseret tæthedsgradsektion af granulocytter. (A) Før og( B) efter centrifugering. Bemærk den skarpe grænseflade mellem blodet og densitet gradient mellemstore lag. (C) Sedimentering af pellet i B resuspended (1:1) i 5% FBS/HBSS og 3% Dextran-0,9% NaCl. (D) PMN pellet efter lysis af de resterende RBC'er i supernatanten af (C) med H2O. Forkortelser: PBMC = perifer blodmonnuklear celle; PMN = neutrohil; RBC = rød blodlegemer; FBS = føtalt kvægserum; HBSS = Hanks afbalancerede saltopløsning. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Spinning ved lavere hastigheder efter RBC lysis nedsat blodplade forurening. Efter lysis af RFC'er med H2O blev cellerne spundet ned ved 200 × g (A) eller 400 × g (B). Neutrofiler blev plettet, og flowcytometrianalyse blev udført, som beskrevet i figur 3, med tilsætning af anti-CD41 for at mærke blodpladerne. Forkortelser: RBC = rød blodlegemer; CD41 = klynge af differentiering 41; SSC-A = side scatter-område. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Vurdering af neutrofiler isoleret fra buffy pels. Isolerede neutrofiler blev plettet med anti-CD66b, anti-CD11b, anti-CD14, og anti-CD193 efter en standard protokol. Enkelte celler (B) blev gated fra totalceller (A). (C) CD11b+ celler blev indhegnet fra enkelte celler. (D) Prikplot, der viser neutrofiler (CD66b+, CD14 lav/-) og en meget lav monocytforurening (CD66b-, CD14+, Q1). (E) CD66b- og CD66b+ celler blev gated. (F) CD66b- cellerne var positive for lymfocytmarkører (CD3, CD19). (G) Udtryk for CD11b og CD193 i CD66b+ celler, der viser forskellige neutrofiler (CD66b+, CD11b+, CD193-) og eosinofile (CD66b+, CD11b-, CD193+) populationer. I det repræsentative resultat vist her, neutrohil renhed er ~ 93% med ~ 3,7% lymfocyt og ~ 3,7% eosinofil forurening. (H) Kvantificering af neutrophil renhed efter rensning. Data indsamles fra 5 individuelle forsøg og præsenteres som middel ± SD. Forkortelser: CD = klynge af differentiering; SSC-A = SSC-A = side scatter-område; FSC-A = fremadrettet scatter-område. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Gradientrensning forårsagede ikke CD62L-afgivelse. (A-B) Kontrol (A) eller fMLP-stimulerede neutrofiler (B) (1 mM fMLP i 15 min ved 37 °C) blev plettet med neutrofiler og CD62L. (C) Fluorescerende middelintensitet for CD62L nedsættes i fMLP-behandlede celler, hvilket angiver CD62L-udgydelse og neutrofili aktivering. Forkortelser: CD26L = L-selectin; fMLP = N-Formylmethionyl-leucyl-phenylalanin; SSC-A = SSC-A = side scatter-område; FSC-A = fremadrettet scatter-område; PE = phycoerythrin. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Neutrofilers spontane død renset ved tæthedsgradient eller neutrophilisolationssæt. Neutrofiler blev renset med densitetsgradient (A og B) eller kommercielle mikroperler (C og D) og dyrket i 0 h (A og C) eller 24 timer (B og D) i RPMI-10% FCS. Cellerne blev farves ved hjælp af Annexin V og PI på de respektive tidspunkter efter en standardprotokol. (E) Kvantificering af renset neutrofil spontan død. n=5, gennemsnit ± SD. Forkortelser: SSC-A = SSC-A = side scatter-Area; FSC-A = fremadrettet scatter-område; PI = propidium jod; FCS = føtal kalveserum; FITC = fluorescein isothiocyanat; AV5 = Annexin V. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
På grund af neutrofilers korte levetid, terminaldifferentieringsstatus og lytic-indhold har det altid været en udfordring at studere disse celler. Bortset fra at bruge musemodeller eller celler fra patientkohorter er cellelinjer nyttige værktøjer til at hjælpe med at studere neutrohilbiologi16. Men neutrohil-lignende cellelinjer kan ikke helt gentage alle aspekter af neutrophil biologi, tilføjer et ekstra lag af vanskeligheder med at studere disse celler. Den mest almindeligt anvendte in vitro-model er HL-60 cellelinjen, som kan differentieres i neutrofilerlignende celler ved behandling med dimethylsulfoxid eller retinosyre17,18. Selv om disse celler er nyttige i studiet af migration og respiratorisk burst, er de ikke egnede til at studere neutrofilers mikrobiocidale aktivitet. Andre cellelinjer findes (PLB-98, NB4), og de er også forbundet med deres sæt af begrænsninger19.
Det er afgørende at validere med primære menneskelige neutrofiler observationer lavet med musesygdom modeller og cellelinjer. Neutrofiler kan ikke cryopreserved effektivt og dermed er ofte frisk isoleret fra fuldblod eller buffy frakker opnået fra donorer og straks behandles. Når de er isoleret, begynder cellerne at gennemgå en kompleks form for spontan død, reguleret af oxidation, cytoplasmaiske caspaser og proteaser fundet i neutrohilgranulat20,21. Forkert isolation metoder eller teknikker kan føre til aktivering af neutrofiler, kun accelererende celle død. Det er bydende nødvendigt at have en pålidelig og konsekvent metode til at opnå rene neutrofiler af høj kvalitet fra donorer.
Der har været mange metoder offentliggjort på human neutrohil isolation10,22. De falder hovedsageligt i to kategorier med nogle fælles strategier. Den første kategori er antistofbaseret, enten gennem positiv eller negativ udvælgelse. Positivt valg ville mærke neutrofiler direkte, derfor giver en meget ren cellepopulation, selv om det også fører til hurtig celleaktivering, celledød, samt uønsket mærkning af neutrofiler23. Negativ udvælgelse, selvom cellerne ikke er mærket og giver en meget ren population, accelererede neutrophildøden, selvom den præcise mekanisme er ukendt (Figur 5). Hvorvidt gen- eller proteinekspression også ændres efter positiv eller negativ udvælgelse skal undersøges yderligere. Desuden kan disse metoder på grund af mængden af antistof, der er nødvendig for at nedbryde de andre typer celler, ikke udsende store mængder neutrofiler. Antistofbaserede analyser kan dog stadig anvendes til kortsigtet kultur og eksperimenter i mindre skala og er foretrukne metoder til forsøg, der kræver meget høj cellerenhed, såsom gen- og proteinekspressionsundersøgelser.
Den anden type isolationsmetode er gradient- og tæthedsbaseret. Det involverer normalt Percoll, Ficoll-Paque, eller andre polysaccharid / polyvinylpyrrolidone komponenter og udnytter centrifugering kraft til at adskille forskellige typer af blodlegemer baseret på celletæthed. Disse metoder er ofte suppleret med sedimentering af røde blodlegemer ved dextran. Disse metoder kan håndtere større skalaer af udgangsmateriale og kan også opnå høj renhed. En advarsel om tæthedsbaseret isolation er den ineffektive adskillelse af andre langt mindre rigelige granulocytter (for det meste eosinofile) fra neutrofiler, og det er derfor den største begrænsning af den præsenterede protokol, da selv tilstedeværelsen af lille celleforurening kan påvirke neutrohilrespons24.
Præsenteret her er en opsummeret metode baseret på gradient isolation, raffinering tidligere metoder10,22. Vi udnytter den nuværende underdrivelse af neutrofiler til pålideligt at isolere rene menneskelige neutrofiler med begrænset resterende blodplade og RBCs, hvilket forhindrer neutrofil aktivering og accelereret død. Det mest afgørende skridt er lagdelingen af gradienten, som er meget mere effektivt opnået ved at tilføje densitet gradient medium under blodet for at opnå en skarp grænseflade. En hurtig undersøgelse af PBMC ringen og gradient efter centrifugering kan afsløre mulig forurening, aktivering, og lave udbytter. Når du arbejder med en leukapheresis membran eller buffy pels, fortynding af blodet er vigtigt, da overdreven celletæthed ville føre til cellesammenlægning, hvilket fører til urenheder og celleaktivering.
Denne protokol skal udfyldes inden for 2 timer for at sikre cellefriskhed, og trin, der involverer tætheden gradient medium, dextran, og lysis gøres straks, da eksponering for disse løsninger kan ændre neutrofiler. Med denne protokol, det forventede udbytte af neutrofiler er mindst ~ 10 millioner/10 mL af fuldblod og mindst ~ 60 millioner/10 mL buffy pels. Evaluering af isolationskvaliteten bør ske som følger: aktiverede neutrofiler skal være mindre end 10 %, lymfocytforurening lavere end 5 %, minimal eosinofil (samme sidespredning, men lavere fremadgående scatterpopulation), og celleens levedygtighed bør være over 90 %. Lavere renhed kan skyldes forkert lagdeling eller opbevaring af tæthedsgradientmediet eller på grund af kvaliteten og friskheden af startblodproduktet.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at forskningen blev udført i mangel af nogen interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette projekt blev støttet af P01HL095489. A.Y.H blev støttet af T32HL066987.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3% Acetic Acid with Methylene Blue | Stemcell technologies | #07060 | |
| Attune NxT | invitrogen | A24858 | FACS analyzer |
| Cd11b-PE | biolegend | 301305 | |
| CD14-BV421 | biolegend | 367144 | |
| CD193-BV605 | biolegend | 310716 | |
| CD19-PerCP | biolegend | 302228 | |
| CD3-PerCP | biolegend | 300326 | |
| CD41-APC | biolegend | 303710 | |
| Cd45-APC | biolegend | 103111 | |
| CD62L-PE | biolegend | 304802 | |
| CD66b-FITC | biolegend | 305103 | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | 22625101 | Centrifuge |
| Dextran | Fisher | BP1580 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | R&D systems | S11150H | complement inactivation of FBS is recommended |
| FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I | BD | 556547 | |
| Hanks balanced salt solution (-CaCl2), (-MgCl2) (-MgSO4) | Gibco | 14175-095 | HBSS without Ca2+/Mg2+ is advised as they have been shown to lead to neutrohpil activation |
| Lymphoprep | Stemcell technologies | #07801 | density gradient medium |
| MACSxpress Whole Blood Neutrophil Isolation Kit, human | Miltenyi | 130-104-434 | |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875093 | |
| Sodium chloride | sigma | 71376 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermofisher | 15250061 | |
| ultrapure water | KD medical | RGF-3410 |
References
- Rosales, C. Neutrophil: A cell with many roles in inflammation or several cell types. Frontiers in Physiology. 9, 113 (2018).
- Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. Neutrophil function: from mechanisms to disease. Annual Review of Immunology. 30, 459-489 (2012).
- Stoller, J. K. Murray & Nadel's textbook of respiratory medicine, 6th edition. Annals of the American Thoracic Society. 12 (8), 1257-1258 (2015).
- Dancey, J. T., Deubelbeiss, K. A., Harker, L. A., Finch, C. A.
- Manz, M. G., Boettcher, S.
- Summers, C., et al. Neutrophil kinetics in health and disease. Trends in Immunology. 31 (8), 318-324 (2010).
- Pedruzzi, E., Fay, M., Elbim, C., Gaudry, M., Gougerot-Pocidalo, M. A. Differentiation of PLB-985 myeloid cells into mature neutrophils, shown by degranulation of terminally differentiated compartments in response to N-formyl peptide and priming of superoxide anion production by granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. British Journal of Haematology. 117 (3), 719-726 (2002).
- Tucker, K. A., Lilly, M. B., Heck, L., Rado, T. A. Characterization of a new human-diploid myeloid-leukemia cell-line (Plb-985) with granulocytic and monocytic differentiating capacity. Blood. 70 (2), 372-378 (1987).
- Hsu, A. Y., et al. Inducible overexpression of zebrafish microRNA-722 suppresses chemotaxis of human neutrophil like cells. Molecular Immunology. 112, 206-214 (2019).
- Kremserova, S., Nauseef, W. M. Isolation of human neutrophils from venous blood. Methods in Molecular Biology. 2087, 33-42 (2020).
- Quach, A., Ferrante, A. The application of dextran sedimentation as an initial step in neutrophil purification promotes their stimulation, due to the presence of monocytes. Journal of Immunological Research. 2017, 1254792 (2017).
- Thorson, L. M., Turkalj, A., Hung, J. C. In vitro evaluation of neutrophil viability after exposure to a hypotonic medium. Nuclear Medicine Communications. 16 (7), 615-620 (1995).
- Dhurat, R., Sukesh, M. Principles and methods of preparation of platelet-rich plasma: a review and author's perspective. Journal of Cutaneous and Aesthetetic Surgery. 7 (4), 189-197 (2014).
- Etulain, J., et al. An optimised protocol for platelet-rich plasma preparation to improve its angiogenic and regenerative properties. Scientific Reports. 8 (1), 1513 (2018).
- Hannah, S., et al. Constitutive neutrophil apoptosis in culture is modulated by cell density independently of beta2 integrin-mediated adhesion. FEBS Letters. 421 (2), 141-146 (1998).
- Hsu, A. Y., et al. Phenotypical microRNA screen reveals a noncanonical role of CDK2 in regulating neutrophil migration. Proceedings of the National Acadermy of Sciences of the United States of America. 116 (37), 18561-18570 (2019).
- Martin, S. J., Bradley, J. G., Cotter, T. G. HL-60 cells induced to differentiate towards neutrophils subsequently die via apoptosis. Clinical and Experimental Immunology. 79 (3), 448-453 (1990).
- Hauert, A. B., Martinelli, S., Marone, C., Niggli, V. Differentiated HL-60 cells are a valid model system for the analysis of human neutrophil migration and chemotaxis. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 34 (7), 838-854 (2002).
- Blanter, M., Gouwy, M., Struyf, S. Studying neutrophil function in vitro: Cell models and environmental factors. Journal of Inflammation Research. 14, 141-162 (2021).
- Kambara, H., et al. Gasdermin D exerts anti-inflammatory effects by promoting neutrophil death. Cell Reports. 22 (11), 2924-2936 (2018).
- Loison, F., et al. Proteinase 3-dependent caspase-3 cleavage modulates neutrophil death and inflammation. Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4445-4458 (2014).
- Siemsen, D. W., et al. Neutrophil isolation from nonhuman species. Methods in Molecular Biology. 1124, 19-37 (2014).
- Hasenberg, M., et al. Rapid immunomagnetic negative enrichment of neutrophil granulocytes from murine bone marrow for functional studies in vitro and in vivo. PLoS One. 6 (2), 17314 (2011).
- Calzetti, F., Tamassia, N., Arruda-Silva, F., Gasperini, S., Cassatella, M. A. The importance of being "pure" neutrophils. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 139 (1), 352-355 (2017).
