Summary
Bioluminescens-lys udsendt af et luciferaseenzym, der oxiderer et lille molekylesubstrat, et luciferin-kan udnyttes til at aktivere fotosensoriske proteiner og derved tilføje en anden dimension til lysstimulering og muliggøre manipulation af en lang række lysmedierede funktioner i celler på tværs af tidsmæssige og rumlige skalaer.
Abstract
Bioluminescens - lys udsendt af et luciferaseenzym, der oxiderer et lille molekylesubstrat, et luciferin - er blevet brugt in vitro og in vivo til at aktivere lysporterede ionkanaler og pumper i neuroner. Mens denne bioluminescerende optogenetik (BL-OG) tilgang giver en kemogenetisk komponent til optogenetiske værktøjer, er den ikke begrænset til brug i neurovidenskab. Snarere kan bioluminescens udnyttes til at aktivere ethvert fotosensorisk protein, hvilket muliggør manipulation af en lang række lysmedierede funktioner i celler. En række luciferase-luciferinpar kan matches med fotosensoriske proteiner, der kræver forskellige bølgelængder af lys og lysintensiteter.
Afhængigt af den specifikke anvendelse kan effektiv lyslevering opnås ved anvendelse af luciferase-fotoreceptorfusionsproteiner eller ved simpel co-transfektion. Fotosensoriske proteiner baseret på lysafhængig dimerisering eller konformationsændringer kan drives af bioluminescens for at påvirke cellulære processer fra proteinlokalisering, regulering af intracellulære signalveje til transkription. Protokollen nedenfor beskriver den eksperimentelle udførelse af bioluminescensaktivering i celler og organismer og beskriver resultaterne ved hjælp af bioluminescensdrevne rekombinaser og transkriptionsfaktorer. Protokollen giver efterforskerne de grundlæggende procedurer for udførelse af bioluminescerende optogenetik in vitro og in vivo. De beskrevne tilgange kan udvides yderligere og individualiseres til en lang række forskellige eksperimentelle paradigmer.
Introduction
Fotosensoriske proteiner kan aktiveres af lys fra enten en fysisk lyskilde eller fra et luciferaseenzym i nærværelse af dets substrat, luciferin, for at generere bioluminescens. For applikationer, der kræver milli- eller endda femtosekund-tidsskalaer og / eller rumlig opløsning med en enkelt celle, er fysiske lyskilder (lasere og lysemitterende dioder (LED'er)) de eneste, der kan indstilles til disse skalaer. Eksempler er den rumlige begrænsning af lys, der anvendes til at stimulere modsatte poler i udviklingen af Drosophila larver med millisekund tidsmæssig kontrol1 eller den præcise stimulering af enkelte subcellulære strukturer såsom mitokondrielle tubuli2. Imidlertid har mange andre applikationer til optiske kontakter forskellige prioriteter, herunder udvidet rumlig kontrol og gentagen anvendelse ikke-invasivt og uden lysskader, men med defineret tidsmæssig kontrol i minuttidsskalaer og justerbare intensiteter. Her har det flere fordele at bruge luciferaser som en alternativ lyskilde til at aktivere lysfølende domæner. I modsætning til aktivering af optisk fiberlys når bioluminescens hvert lysfølsomt domæne udtrykt i målcellepopulationen, da lyskilden er genetisk kodet. Brug af bioluminescens lindrer bekymringer over vævs- og celleskader ved fiberoptik og udvidet fysisk lyseksponering. Lyset tændes ved påføring af luciferasesubstratet. Starten er øjeblikkelig in vitro og in vivo afhængigt af administrationsvejen og varer i ~ 15-30 minutter; udvidet tilstedeværelse eller fasisk stimulering af lys kan opnås med forskellige luciferiner og med yderligere eller gentagne anvendelser af substrat3. Endelig kan bioluminescensemission indstilles ved at variere koncentrationen af luciferin.
Anvendelsen af bioluminescens til at aktivere ionbevægelige fotoreceptorer, dvs. optogenetiske elementer, såsom kanalhodopsiner eller pumper, er blevet påvist i vid udstrækning4,5,6,7,8. Denne BioLuminescerende OptoGenetics (BL-OG) tilgang er blevet anvendt i in vivo-eksperimenter i mus og rotter5,6,7,9,10,11,12. BL-OG-aktivering af opsiner viste sig at kræve en mængde bioluminescens på mindst ~ 33 μW / mm2, hvor effektiviteten af aktiveringen steg med højere lysemission6,9. Ionbevægelige sensoriske fotoreceptorer er en undergruppe af det store kontingent af sensoriske fotoreceptorer, der findes i naturen, og som ikke bevæger sig ion13,14. Udvidelsen af bioluminescens til at aktivere ikke-ion-bevægelige fotoreceptorer, såsom fotosenserende domæner fra planter eller bakterier, tilskyndes af rapporter15,16 om, at fotosensorer, der ikke bevæger sig i ion, er betydeligt mere lysfølsomme end kanaliseringshodopsiner, hvilket sikrer et endnu bedre drev af lyssensorer med bioluminescens end allerede opnået med ionbevægelige optogenetiske elementer. For nylig rapporterede flere publikationer brugen af bioluminescens som lyskilde til aktivering af en række fotoreceptorer, herunder lys-ilt-spænding-sensing (LOV) domæner, blå-lys-using-flavin (BLUF) domæner, og kryptokromer (CRY'er)3,17,18,19,20,21,22 (tabel 1 ). Anvendelser til bioluminescensdrevet aktivering af optiske kontakter målrettede intracellulære processer, der spænder fra reaktiv iltartsinduceret celledød, cAMP-syntese, proteinrekruttering og dissociation til genomisk rekombination og induktion af transkription.
Denne protokol skitserer det generelle design af bioluminescensdrevne optogenetiske værktøjer og beskriver procedurerne for eksperimentel udførelse af bioluminescensaktivering i celler og organismer. Den indeholder beskrivelser af, hvordan man opretter et rum, en vævskulturhætte og inkubator og et mikroskop til arbejde med bioluminescens samt trinene fra forberedelse af luciferin til påføring af det. Denne protokol giver efterforskerne de grundlæggende procedurer for udførelse af bioluminescerende optogenetik (BL-OG) in vitro og in vivo. De beskrevne tilgange kan udvides yderligere og individualiseres til forskellige eksperimentelle paradigmer. Vi forventer, at denne protokol vil lette vedtagelsen af brugen af bioluminescens i optogenetiske biologiske undersøgelser.
Protocol
Alle procedurer i den nuværende undersøgelse blev udført ved hjælp af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) godkendte protokoller til håndtering af dyr ved Central Michigan University, MI.
1. Bioluminescensaktivering af fotosensoriske proteiner in vitro
- Konstruktioner
- Vælg en luciferasesekvens eller luciferase-fluorescerende proteinfusionssekvens, der vil resultere i ekspression af en lysudsender, der producerer lys af en bølgelængde, der matcher den fotoreceptor, der skal aktiveres.
BEMÆRK: For eksempel kan blå lysemitterende luciferaser, såsom Gaussia luciferase-varianter eller NanoLuc, parres med blå lysfølsomme fotoreceptorer som CRY / Ca2 + - og integrinbindende protein (CIB), LOV eller Vivid (VVD). - Hvis det ikke allerede er tilgængeligt fra andre investigatorer eller plasmidaflejringer, skal du bruge standard molekylærbiologiske teknikker til at klone DNA'et til et pattedyrs ekspressionsplasmid.
BEMÆRK: Valget af promotorer dikteres af behovet for at give et stærkt og konstitutivt udtryk for det lysemitterende modul, såsom det, der leveres af CAG- og CMV-promotorerne. - Til indledende undersøgelser skal du bruge separate plasmider til co-transfektion af lysudsenderen og lyssensoren. Generer fusionsproteiner fra de to moieties efter behov og til efterfølgende undersøgelser.
- Få plasmid-DNA'er af høj kvalitet ved hjælp af mini-, midi- eller maxiprep-sæt i henhold til producentens protokoller.
- Vælg en luciferasesekvens eller luciferase-fluorescerende proteinfusionssekvens, der vil resultere i ekspression af en lysudsender, der producerer lys af en bølgelængde, der matcher den fotoreceptor, der skal aktiveres.
- Cellekultur og transfektion
BEMÆRK: HeLa-celler og HEK293-celler bruges som eksempler i denne protokol.- Pladeceller i formater og tal i henhold til den ønskede slutanvendelse.
BEMÆRK: Der gives specifikke eksempler i tabel 2. Celletæthed på tidspunktet for plettering bestemmer, hvor hurtigt celler kan transfekteres.- Til vurdering af bioluminescensaktiveret transkription ved fluorescensmikroskopi, plade HEK293-celler på poly-D-lysin (PDL)-belagte 12 mm dæksler anbragt i 24-brønds skåle.
- Til vurdering af bioluminescensaktiveret transkription ved at måle lysemission fra en ortogonal reporter luciferase i et luminometer, plade HeLa-celler oprindeligt i 6- eller 12-brønds skåle til transfektion, men omplade dem efter transfektion (se trin 4).
- Hvis der vil blive udført gentagen bioluminescensstimulering i levende cellebilleddannelseskamre, skal du vælge dæksler af passende størrelse og anbringe dem i plader med flere brønde af passende størrelse (24-brøndsplader til 12 mm dæksler; 12-brøndsplader til 15 mm og 18 mm dæksler). Frø cellerne oven på dæksedlerne ved hjælp af de cellenumre, der er angivet i tabel 2. Hvis den valgte celletype ikke klæber godt til kulturoverfladen, skal du plade cellerne på PDL-belagte retter.
- Udfør transfektion ved lipofection i henhold til producentens anbefaling, eller brug en transfektionsmetode, der passer til den valgte celletype.
BEMÆRK: Tabel 3 beskriver transfektionseksperimenter for to forskellige fotoreceptorer, EL222 og CRY2 / CIB, og deres respektive reporterplasmider ud over forskellige lysemitterende proteiner. Forholdet mellem de forskellige plasmider fungerer godt for de udvalgte eksempler, men skal optimeres for hvert lysudsender/lyssensorpar. - Efter transfektion skal cellerne placeres i en inkubator, der er helt lysforseglet (figur 1).
- Afhængigt af den ønskede slutanvendelse skal du bruge cellerne til bioluminescensstimulering den næste dag i deres originale brønde / fade eller plade dem igen 3-4 timer efter fedtsugning. Til læsning transkription af et firefly luciferase reporter gen i et luminometer, re-plate cellerne i hvide 96-brønd plader.
BEMÆRK: Udfør alle manipulationer i et lystæt rum i en laminær flowhætte oplyst af rødt lys (figur 2).- Vask de transfekterede celler én gang med Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM) eller fosfatbufret saltvand (PBS).
- Tilsæt minimumsvolumenet af et trypsiniserende reagens til brøndene (24-brønd: 100 μL; 12-brønd: 150 μL; 6-brønd: 300 μL) og inkuber cellerne i 3 minutter ved 37 ° C.
- Tilsæt kulturmedium for at opnå en cellekoncentration, der giver den passende celletæthed til det næste pletteringstrin (for eksempel resuspendceller i en 24-brønd i et endeligt volumen på 1,2 ml til plettering i 10 brønde af en 96-brønds plade; resuspendceller i en 12-brønd i et endeligt volumen på 2,4 ml til plettering i 20 brønde af en 96-brønds plade). Pool de transfekterede celler fra flere brønde afhængigt af antallet af brønde, der er nødvendige i sidste ende.
- Plade de transfekterede celler i deres endelige format og returner pladerne til den lysbeskyttede inkubator.
- Pladeceller i formater og tal i henhold til den ønskede slutanvendelse.
- Aktivering af bioluminescens in vitro
- Forbered luciferasesubstratet (luciferin).
- Forbered 50 mM lagre ved at opløse 5 mg lyofiliseret coelenterazin (CTZ) i 250 μL af dets specifikke opløsningsmiddel. Sørg for, at al CTZ langs hætteglassets vægge opløses ved pipettering eller hvirvel. Beskyt hætteglasset mod direkte lys.
- Der forberedes 50 μL alikvoter i 0,5 ml sorte mikrocentrifugerør og opbevares ved -80 °C til fremtidig brug.
BEMÆRK: CTZ opløst i opløsningsmiddel fryser ikke ved -80 °C. Aliquots kan fjernes fra og returneres til fryseren flere gange til fremstilling af arbejdsløsninger, så længe udsættelse for lys og stuetemperatur holdes på et minimum.
- Enkelt bioluminescens lysstimulering
BEMÆRK: Alle manipulationer udføres i et lystæt rum i en laminær flowhætte oplyst af rødt lys (figur 2).- Forbered en arbejdsløsning af luciferin i cellekulturmedium (DMEM eller NeuroBasal). Juster koncentrationen af luciferin, således at den endelige koncentration er 100 μM. Forbered alle fortyndinger af CTZ i medium kort før tilsætning til cellerne, da CTZ oxiderer over tid.
BEMÆRK: Hvis hele medievolumenet udskiftes, vil arbejdsløsningen være 100 μM. Hvis luciferinholdigt medium tilsættes til cellerne, vil koncentrationen være højere med fortyndingsfaktoren (for eksempel vil tilsætning af 50 μL medium indeholdende 300 μM luciferin til 100 μL medium i brønden resultere i en 1: 3 fortynding og dermed i en 100 μM endelig koncentration af luciferin). - Tilsæt luciferinholdigt medium til cellerne og inkuber i den ønskede varighed af lysstimulering.
BEMÆRK: Dette kan være så kort som 1 min eller så længe som 15 min og kan være endnu kortere eller længere. Længden af tiden for at forlade det luciferinholdige medium på cellerne afhænger af halveringstiden og kinetikken for den valgte luciferase-luciferin-kombination. - Overvåg lysemissionen ved 100 μM endelig luciferinkoncentration med øjet efter slukning af det røde lys; vent et par sekunder, indtil øjnene har tilpasset sig for at fuldføre mørket. Dokumentér lysemissionen ved at tage et fotografi (selv med en mobiltelefon).
- Afslut lysstimuleringen ved at fjerne det luciferinholdige medium og erstatte det med kulturmedium. Afhængigt af forsøgenes følsomhed vaskes cellerne med dyrkningsmedium en eller to gange efter fjernelse af det luciferinholdige medium for at eliminere al luciferin. Hvis cellerne ikke klæber godt til kulturoverfladen, skal du tallerken dem på PDL-belagte tallerkener for at undgå at miste cellerne under vask.
- Returner cellerne til den lysbeskyttede inkubator i 16-24 timer.
- Forbered en arbejdsløsning af luciferin i cellekulturmedium (DMEM eller NeuroBasal). Juster koncentrationen af luciferin, således at den endelige koncentration er 100 μM. Forbered alle fortyndinger af CTZ i medium kort før tilsætning til cellerne, da CTZ oxiderer over tid.
- Gentagen bioluminescens lysstimulering
BEMÆRK: Alle manipulationer udføres i et rum, der kan gøres lystæt og belyses af rødt lys.- Konfigurer billedkammeret med levende celler. Opret et lystæt rum omkring levende cellebilleddannelsesmikroskop ved hjælp af en kasse og sorte plastplader eller sorte gardiner (figur 3). Dæk alle de lyskilder, der findes inde i det lystætte rum og rummet (f.eks. LED-indikatorer på mikroskopet eller instrumenterne).
- Opsæt perfusionssystemet med den ønskede opløsning til indsugning og kammerudporten, der fører til en affaldsbeholder.
BEMÆRK: For eksempel kan billeddannelsesopløsningen være Tyrode's Solution (natriumchlorid (124 mM), kaliumchlorid (3 mM), HEPES (10 mM), calciumchloriddihydrat (2 mM), magnesiumchloridhexahydrat (1 mM), D-glucose (20 mM)). - Forbered en arbejdsløsning af luciferin i billeddannelsesopløsningen. Aliquot i så mange mikrocentrifugerør som antallet af gentagne stimuleringer. Koncentrationen af luciferin justeres således, at den endelige koncentration i billeddannelseskammeret er 100 μM.
- Placer et dækslip med transfekterede celler i kammeret.
- Mens pumpen holdes kørende, skal du fjerne pumpens indløbsrør fra indsugningsbægerglasset og hurtigt nedsænke det i luciferinopløsningen, så overgangstiden holdes så kort som muligt for at undgå lufthul i slangen.
- Så snart luciferinopløsningen er taget op, anbringes indløbsrøret tilbage i indsugningsglasset. Gentag denne proces så mange gange som nødvendigt og med intervaller på flere minutter til timer, afhængigt af det fysiologiske mønster, som cellerne skal udsættes for.
- Returner cellerne til den lysbeskyttede inkubator i 16-24 timer til transkription, eller i det tidsrum effekten af lysstimulering skal vurderes.
- Forbered luciferasesubstratet (luciferin).
2. Bioluminescensaktivering af fotosensoriske proteiner in vivo
- Konstruktioner
- Vælg en luciferasesekvens eller luciferase-fluorescerende proteinfusionssekvens, der vil resultere i ekspression af en lysudsender, der producerer lys af en bølgelængde, der matcher den fotoreceptor, der skal aktiveres.
- Brug standard molekylærbiologiske teknikker til at klone DNA'et til et pAAV-plasmid, hvis det ikke allerede er tilgængeligt fra andre efterforskere eller plasmidaflejringer.
- Vælg stærke promotorer til udtryk for de lysemitterende moduler, såsom CAG eller CMV.
- Brug standardmetoder til fremstilling af virale bestande med høj titer6 eller få virale vektorer kommercielt forberedt.
- Til indledende undersøgelser skal der anvendes separate virale vektorer til co-transduktion af lysudsenderen og lyssensoren for at muliggøre justering af forholdet mellem de forskellige komponenter, hvis det er nødvendigt.
- AAV-transduktion
- Forsøgsdyrets målorgan injiceres med virale vektorer fra lysudsenderen, lyssensoren og reporteren, der svarer til de koncentrationsforhold, der anvendes til in vitro-transfektionerne (tabel 3).
- Returner dyrene til deres hjemmebure i mindst 2 uger for at tillade maksimal ekspression af alle komponenterne.
BEMÆRK: Hvis målorganet er inde i kroppen og beskyttet mod omgivende lys, kan dyrene opholdes under normale lysforhold.
- Aktivering af bioluminescens in vivo
- Forbered luciferasesubstratet (luciferin).
- Tag et hætteglas med vandopløselig CTZ ud af fryseren -80 °C, og lad det varme op til stuetemperatur. Hold det beskyttet mod lys.
- Pr. 500 μg hætteglas tilsættes 250 μL sterilt vand ved hjælp af enten en sprøjte eller ved at åbne hætteglasset og tilsætte vand med en pipette, hvorefter gummiproppen sættes tilbage på glashætteglasset.
- Inkuber det rekonstituerede hætteglas i et vandbad på 55 °C i et par minutter for at opløse pulveret fuldstændigt.
- Overfør opløsningen til et sort mikrocentrifugerør. Skyl væggene i glashætteglasset for at hente al CTZ.
- Fjern den mængde opløsning, der er nødvendig for dagen. Den resterende opløsning opbevares ved 4 °C til brug næste dag. Frys ikke!
- Udfør de samme trin (2.3.1.1.-2.3.1.5) for et hætteglas med køretøjet.
- Bioluminescens lysstimulering
- Fjern den mængde luciferin/køretøj, der er nødvendig for dyrets størrelse og den valgte anvendelsesvej (tabel 4).
- Injicer dyrene med luciferin eller køretøj. Gentag bioluminescenslysstimuleringen i henhold til det eksperimentelle design. For eksempel, hvis aktivering af en rekombinase ønskes under et specifikt adfærdsparadigme, skal du injicere dyrene lige før adfærdstesten. Hvis fasisk transkription af et molekyle er målet, injiceres dyrene gentagne gange over dage.
- Indsaml data fra de bioluminescensstimulerede dyr som designet.
- Forbered luciferasesubstratet (luciferin).
Representative Results
Der er mange intracellulære begivenheder, der kan manipuleres med aktuatorer, der reagerer på lys, og som er modtagelige for bimodal aktivering med fysiske og biologiske lyskilder. Nedenfor er eksempler, der anvender en fotosenserende calciumintegrator (Ca2+), lysinduceret proteintranslokation, en lysfølsom transkriptionsfaktor og en lysfølsom rekombininase. Eksemplerne illustrerer muligheden for at bruge bioluminescens til at aktivere forskellige former for fotoreceptorer. De præsenterede eksperimenter var ikke specifikt optimeret med hensyn til lysdiode (LED) applikation, den valgte luciferase, eller med hensyn til koncentrationer og timing af luciferin applikation.
Hurtig lys- og aktivitetsreguleret ekspression (FLARE) er et optogenetisk system, der muliggør transkription af et reportergen med samtidig forekomst af øget intracellulær Ca2+ og lys23 (figur 4A). Tilstedeværelsen af Ca2+ er nødvendig for at bringe proteasen i nærheden af proteasespaltningsstedet kun tilgængeligt med lysstimulering, hvilket resulterer i frigivelse af transkriptionsfaktoren. HEK293-celler blev co-transfekteret med de originale FLARE-komponenter, en dobbelt Firefly (FLuc)-dTomato-reporterkonstruktion og en membranforankret Gaussia luciferase-variant sbGLuc6. I nærvær af øget intracellulær Ca2+ gennem eksponering af celler for 2 μM ionomycin og 5 mM calciumchlorid (CaCl2), anvendelsen af blå LED førte til robust ekspression af fluorescensindberetteren sammenlignet med celler, der er tilbage i mørket, samt til ekspressionen af FLuc bestemt ved måling af luminescens ved tilsætning af FLuc-substratet, D-luciferin. Lignende niveauer af FLuc-ekspression blev opnået med bioluminescens udsendt af sbGLuc ved påføring af sbGLuc-substratet (CTZ) sammen med ionomycin og CaCl2. Bemærk, at luciferaserne, der anvendes til lysaktivering (sbGLuc) og til rapportering af effekten af lysaktivering (transkription af FLuc), kun producerer lys med deres respektive luciferiner (CTZ vs. D-luciferin) og ikke krydsreagerer.
Forskellige komponenter blev kombineret for at generere et lysinduceret transkriptionssystem baseret på heterodimerisering af kryptokromer23,24 (figur 4B). CRY2 blev smeltet sammen til en protease, mens den membranbundne CIB blev smeltet sammen med proteasespaltningsstedet og transkriptionsfaktoren. Lysinduceret proteintranslokation frigav transkriptionsfaktoren, hvilket førte til ekspression af FLuc og dTomato, som vist i figur 4A. Mens tilstedeværelsen af transkriptionsfaktorkomponenten alene resulterede i et betydeligt baggrundssignal muligvis på grund af spontan proteolyse, øgede både fysisk lys (LED) og bioluminescens (CTZ) robust ekspressionen af FLuc som målt i et in vivo-billeddannelsessystem (IVIS).
I et andet sæt eksperimenter blev NanoLuc (luciferin: furimazin eller hCTZ) anvendt til optogenetisk regulering af transkription gennem dimerisering af CRY / CIB og den lysfølsomme transkriptionsfaktor, EL22225,26,27. Figur 5A,B viser skemaerne for de forskellige komponenter i mørke og lyse tilstande og luciferase co-transfekterede eller smeltede til lyssensoren. Forskellige sammenligninger er vist i figur 5C. Bioluminescens, induceret ved at tilføje hCTZ til HEK293-celler, der udtrykker konstruktionerne og fjerner den efter 15 minutter, var mere effektiv til at drive reportertranskription end 20 minutters LED-lyseksponering for både CRY / CIB og EL222. For CRY/CIB var en times LED-eksponering tilstrækkelig til at nå et transkriptionsniveau, der kan sammenlignes med 15 minutters bioluminescens. I modsætning hertil, for EL222, selv 60 minutters LED var knap halvt så effektiv som en kort eksponering for bioluminescens. Der var ingen signifikante forskelle i transkriptionseffektiviteten mellem de to systemer, når de blev co-transfekterede, selv om fusionsproteinerne i CRY/CIB var mere effektive end EL222.'s. For begge systemer førte fusionsproteinerne til signifikant højere transkriptionsniveauer end de co-transfekterede komponenter. CRY/CIB viste konsekvent højere baggrundsniveauer med køretøjsanvendelse sammenlignet med EL222, som havde ubetydelig baggrundstranskription. Stigende koncentrationer af hCTZ alene havde ingen effekt på transkriptionen af reportergenet.
Fotoaktiverbare rekombinaser giver et alsidigt værktøj til optogenomiske manipulationer. Vi testede bioluminescensaktivering af en lysfølsom spaltet Cre-rekombinase baseret på Vivid LOV-proteinet, iCreV28. Figur 6A viser en skematisk oversigt over de forskellige komponenter, sbGLuc, iCreV og en lox-stop-lox fluorescensreporter (tdTomato) før og efter påføring af CTZ. Resultaterne fra CTZ-applikationen i forhold til kontroller (ingen CTZ eller LED) er vist i figur 6B. Der er noget baggrundsudtryk selv i mørket (ingen CTZ); dog, i nærværelse af CTZ, udtryk øges robust over baggrunden og ligner det, der induceres med LED-applikation.
Figur 1: Let forseglet inkubator. Papkasseklap, der dækker lyset fra det oplyste kontrolpanel (øverste pil). Lysuigennemtrængeligt dæksel over inkubatorens glasdør (nederste pil) for at beskytte cellerne mod lyseksponering. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Laminar flowhætte oplyst af rødt lys. Opsætning, der viser en standard laminær flowvævskulturhætte, der belyses af rødt lys. Pil angiver en standard stationær lampe med en rød pære. Alle manipulationer under rødt lys udføres i et ellers mørkt lystæt rum. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Lystætte rum omkring levende cellebilleddannelsesmikroskoper. To eksempler på opsætninger af levende cellebilleddannelsesmikroskop, der viser brugen af enten en solid kasse med plastgardiner kun på forsiden (venstre paneler: top og bund) eller sorte gardiner rundt om billedopsætningen (højre paneler: top og bund). Forsiderne i begge eksempler forbliver åbne og rullede op, når de ikke er i brug (toppaneler: venstre og højre). De forreste sorte gardiner rulles ned for at forhindre, at lys i rummet (f.eks. Computerskærme) kommer ind i billeddannelsesområdet, når der udføres levende celle bioluminescensstimulering og / eller billeddannelse (nederste paneler: venstre og højre). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Bioluminescens til integration af intracellulære signalhændelser. A) Skemaer over FLARE-komponenterne, der er samtransfekterede med sbGLuc. I nærvær af Ca2+ og den resulterende nærhed af proteasen til proteasespaltningsstedet vil enten bioluminescens eller LED føre til udfoldelse af LOV, eksponering af spaltningsstedet og frigivelse af transkriptionsfaktoren. Celler blev udsat for LED (arbejdscyklus 33%, 2 s tændt / 4 s slukket i 40 minutter; 3,5 mW lyseffekt, 4,72 mW / cm2 bestråling) eller for bioluminescens (100 μM CTZ endelig koncentration i 15 minutter) eller efterladt i mørket. Mikroskopiske billeder af HEK293-celler, der udtrykker ovennævnte komponenter efter behandling for at øge Ca2+- niveauerne og eksponeringen for LED (til venstre). FLuc luminescens målt i et luminometer, der sammenligner eksponering for LED, bioluminescens (CTZ) eller venstre i mørke (højre). (B) Skemaer over et ikke-Ca2+-afhængigt transkriptionssystem, der er co-transfektet med sbGLuc. HEK293-celler i 4-brøndsplader blev transfekteret med fire forskellige arrangementer af komponenter som afbildet i skemaet. Plader blev udsat for enten LED (driftscyklus 33%, 2 s tændt /4 s slukket i 40 minutter; 3,5 mW lyseffekt, 4,72 mW / cm2 bestråling) eller bioluminescens (100 μM CTZ endelig koncentration) ved at tilsætte CTZ og lade den være tændt i 15 minutter; kontrolplader blev efterladt i mørket. Transkription af FLuc-reporteren blev målt i en IVIS. IVIS billeder af repræsentative retter vises til venstre; udstrålingsmålinger fra flere replikater, der er grundlaget for de mørke kontroller, vises til højre. Skalabjælke = 100 μm. Forkortelser: FLARE = Hurtigt lys- og aktivitetsreguleret udtryk; LOV = lys-ilt-spænding-sensing; LED = lysemitterende diode; CTZ = coelenterazin; FLuc = firefly luciferase; dTom = dTomato; CRY2 = kryptokrom 2; CRY2PHR = CRY2 fotolyase homologi region; CIB1 = Ca2+- og integrinbindende protein 1; CIBN = N-terminus for CIB1; IVIS = in vivo-billedbehandlingssystem . Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Bioluminescens til kørsel af transkription. (A) Skemaer over to fotoaktiverbare transkriptionssystemer i deres mørke og lyse tilstand. (B) NanoLuc blev enten co-transfekteret eller smeltet sammen med de lysfølende moieties som afbildet (N-NanoLuc-CRY-GalDD-C; N-NanoLuc-VP16-EL222-C). (C) Sammenligninger ved hjælp af begge systemer vedrørende lyskilder, konstruktionsdesign og signal til støj. Celler blev udsat for LED (arbejdscyklus 33%, 2 s on/4 s slukket i 40 min; 3,5 mW lyseffekt, 4,72 mW/cm2 bestråling) eller for bioluminescens i 15 min (100 μM hCTZ endelig koncentration; undtagen hvor forskellige koncentrationer er noteret). Mørke plader blev efterladt uberørt i inkubatoren mellem den indledende transformation af plasmider og FLuc-måling; VEH, plader blev håndteret på samme måde som dem, der modtog hCTZ, men modtog køretøj i stedet. Forskelle i transkriptionsniveauer: hCTZ, co-transfekterede CRY vs. EL222 - ikke signifikant; hCTZ, luciferase - fotoproteinfusion CRY vs. EL222 - p < 0,005; hCTZ, CRY co-transfektion vs. fusion - p < 0,005; hCTZ, EL222 co-transfektion vs. fusion - p < 0,01; køretøj, CRY vs. EL222 - p < 0,05. Forkortelser: UAS = opstrøms aktiveringssekvens; LED = lysemitterende diode; CTZ = coelenterazin; FLuc = firefly luciferase; CRY = kryptokrom; CIB = Ca2+- og integrinbindende protein; VEH = køretøj. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Bioluminescens til optogenomisk manipulation. (A) Skemaer over bioluminescensdrevet optogenomisk manipulation ved hjælp af sbGLuc, de opdelte iCreV-komponenter og en LSL-reporterkassette før og efter påføring af lys. (B) HEK293-celler blev lipoficerede med plasmider og derefter holdt i mørket. Fireogtyve timer senere blev cellerne behandlet i 30 minutter med kun medium (ingen CTZ) eller med CTZ (100 μM endelig koncentration) eller med LED (arbejdscyklus 25%, 5 s tændt / 15 s slukket i 5 minutter; 14,81 mW lyseffekt, 20 mW / cm2 bestråling) som en positiv kontrol. Mikroskopiske billeder af tdTomato fluorescens ved hjælp af betingelser som angivet. Skalabjælke = 100 μm. Forkortelser: LSL = lox-stop-lox; CTZ = coelenterazin; LED = lysemitterende diode; VVD = Levende. Klik her for at se en større version af denne figur.
Tabel 1: Bioluminescensaktivering af fotoreceptorer. Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 2: Retningslinjer for plettering og transfektering af celler i forskellige formater. Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 3: Forholdet mellem forskellige plasmider til transfektion. Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 4: Injektionsveje, volumener og koncentrationer af luciferin til in vivo-anvendelser (25 g mus). Klik her for at downloade denne tabel.
Discussion
Der er en række luciferaser og luciferiner med lysemissionsbølgelængder, der matcher aktiveringsspektrene for fotosensoriske proteiner fra blåt til rødt lys14,29. Bortset fra at justere emissions- og excitationsbølgelængder er der ingen pålidelig måde at bestemme a priori, hvilken parring der fungerer bedst. Således er behovet for eksperimentelt at bestemme, hvordan luciferin-luciferase-par fungerer i celler og organismer i kørsel af fotosensoriske systemer.
Protokollerne skitseret i denne præsentation beskriver, hvordan man forbereder luciferin, og hvordan man anvender det in vitro og in vivo sammen med retningslinjer for opsætning af rum, vævskulturhætter, inkubatorer og mikroskoper til eksperimenter, der anvender bioluminescens. I de repræsentative eksperimenter blev der anvendt forskellige luciferaser (NanoLuc, Gaussia luciferase) med flere fotosensoriske proteiner (CRY / CIB, EL222, VVD, LOV), der demonstrerede virkningerne af bioluminescens versus fysisk lys, co-transfektion versus fusionsproteiner, signal-til-støj-sammenligninger og forskellige udlæsningsassays. Flere anvendelser af bioluminescensaktiverende fotosensoriske proteiner er beskrevet i publikationer fra flere grupper, der er målrettet mod induktion af celledød, cAMP-syntese og proteinbevægelse ud over transkription (tabel 1).
Blot at co-transfektere lysemitterende og lysfølende komponenter er en god start. Variabler er de molære forhold mellem emitter og sensor; ukendte er baggrundsniveauer for sensoraktivitet i mørke, sensoraktivitet i forhold til lysintensitet og varighed og effektiviteten af sensoraktivering, der sammenligner fysisk og biologisk lys. Mens fusionskonstruktioner har den fordel, at de holder det molære forhold mellem emitter og sensor på 1:1 og bringer lysemitteren tæt på lyssensordomænet, spiller andre overvejelser ind, såsom hvor man skal binde (N- eller C-terminus), og hvordan man forbinder (linkerlængde og sammensætning) uden at påvirke den fotosensoriske aktuators ydeevne.
For forsøg både in vitro og in vivo er der flere muligheder for at indstille bioluminescerende lysemission, enten ved at variere koncentrationen af luciferinein og/eller ved at variere den tid, luciferinen stilles til rådighed for den respektive sensor. Minimumsmængden og -tiden bestemmes af tilstedeværelsen eller fraværet af den forventede effekt med lysaktivering. I modsætning hertil bestemmes de respektive maks.um hovedsageligt af cellernes tolerance over for høje koncentrationer af luciferin over længere tid. Koncentrationen af CTZ valgt i ovenstående eksempler, 100 μM, er tæt på den øvre grænse for forskellige celletyper, fra HEK293-celler til neuroner. Målet er at bruge så lav en koncentration som muligt i kortest mulig tid for at opnå aktivering af det målrettede fotosensingdomæne. Dette vil blive opnået lettere ved hjælp af luciferaser med høj lysemission og fotoreceptorer med høj lysfølsomhed.
Bioluminescens til kørsel af fotoreceptorer er blevet anvendt i gnavere (mus, rotter) med fotosenserende proteiner udtrykt i leveren, musklen, rygmarven og hjernen samt via fotoreceptorekspressorceller transplanteret subkutant eller intraperitonealt. I princippet er der ingen grænser, der forhindrer tilgangen i at blive anvendt på forskellige arter, fra ikke-menneskelige primater til fisk eller fluer. Afhængigt af organismens permeabilitet for luciferin kan anvendelsen være lige så let som at påføre luciferinen på det omgivende vand (f.eks. i fiskelarver30). Før BL-OG anvendes i en ny organisme, skal der udføres pilotforsøg for at sikre, at luciferinen når sine mål via den valgte anvendelsesvej.
Kritiske aspekter af det eksperimentelle design er de forskellige kontroller, der er vigtige for fortolkningen af resultaterne. Celler, der udtrykker en reporter drevet af en luciferase, der virker på et fotosensorisk protein, bør sammenlignes med celler, der mangler luciferase eller mangler det fotosensoriske protein. Desuden bør der foretages sammenligninger mellem celler, der udsættes for luciferin, køretøj eller holdes i mørke. Det er også vigtigt at indse begrænsningerne ved forskellige assays til vurdering af virkningerne af bioluminescensdrevet fotoreceptoraktivering. For eksempel kan effekten af bioluminescensaktiveret transkription testes på forskellige måder, afhængigt af om reportergenet er en ortogonal luciferase (luminometer, IVIS) eller et fluorescerende protein (fluorescensaktiveret cellesortering, mikroskopi billedanalyse). Selv om de grundlæggende virkninger bør kunne reproduceres på tværs af testplatforme, kan de kvantitative aspekter af virkningerne variere betydeligt.
Bioluminescensaktiveringen af fotoreceptorer er hidtil blevet påvist for et begrænset antal luciferaser og fotosensoriske proteiner, både in vitro og in vivo. Det kan udvides til den store klasse af fotoreceptorer til aktivering af mange flere biologiske processer. En sådan udvidelse af tilgangen fremmes yderligere af den kontinuerlige udvikling af nye luciferaser og luciferase-fluorescensproteinpar med meget højere lysemission end naturligt forekommende luciferaser og med kinetiske træk, der kan indstilles til forskellige anvendelser. Disse fremskridt er parallelle med generationen af nye luciferiner, hvilket yderligere øger lysstyrken og farvepaletterne29. Denne værktøjsplatform tilbyder applikationer til at manipulere og undersøge intracellulær dynamik og celleinteraktioner inde i levende celler, væv og organismer.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Vi takker vores kolleger for konstruktioner, specifikt A. Ting for Ca-FLARE-proteasen, transkriptionsfaktoren og reporteren (Addgene # 92214, 92213, 92202), H. Kwon for TM-CIBN-BLITz1-TetR-VP16 og NES-CRY2PHR-TevC (Addgene # 89878, 89877), C. Tucker for CRY-GalΔDD (B1013) og CIB-VP64 (B1016) (Addgene # 92035, 92037), M. Walsh for pGL2-GAL4-UAS-Luc (Addgene #33020), K. Gardner for VP-EL222 og C120-Fluc og A. Cetin og H. Zeng for at gøre iCreV tilgængelig inden offentliggørelsen. Dette arbejde blev støttet af bevillinger fra NSF (NeuroNex 1707352), NIH (U01NS099709), W.M. Keck Foundation og det svenske forskningsråd til A.B. (2016-06760).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ABI 25W Deep Red 660 nm LED Light Bulb | Amazon | to be used with any lamp stand | |
| Black Microcentrifuge Tubes, 0.5 mL, Argos Technologies | Fisher Scientific | 03-391-166 | |
| Black Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL, Argos Technologies | Fisher Scientific | 03-391-161 | |
| Black Nylon, Polyurethane-Coated Fabric (1.5 m x 2.7 m) x 0.12 mm (thick) | THOR LABS | BK-5 | |
| C120-Fluc | K. Gardner | ||
| CaCl2 | Sigma | C8106; CAS: 10035-04-8 | |
| Ca-FLARE protease, transcription factor and reporter | Addgene # 92214, 92213, 92202 | A. Ting | |
| CIB-VP64 (B1016) | Addgene # 92037 | C. Tucker | |
| CRY-GalΔDD (B1013) | Addgene # 92035 | C. Tucker | |
| CTZ | Prolume Inc. (NanoLight) | 303 | formulation for in vitro applications with Gaussia luciferases |
| CTZ (Water soluble native coelenterazine) | Prolume Inc. (NanoLight) | 3031 | formulation for in vivo applications with Gaussia luciferases |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G8270; CAS: 50-99-7 | |
| D-Luciferin, Potassium Salt | Gold Biotechnology | LUCK | |
| DMEM | Thermo Fisher | 11960044 | |
| D-PBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher | 14190144 | |
| hCTZ | Prolume Inc. (NanoLight) | 301 | formulation for in vitro applications with Oplophorus luciferases |
| HEK293 | ATCC | CRL-1573 | |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | |
| HEPES | Sigma | H3375; CAS: 7365-45-9 | |
| iCreV | A. Cetin and H. Zeng | ||
| In Vivo Imaging System (IVIS) | Perkin-Elmer | Lumina LT | |
| KCl | Sigma | P5405; CAS: 7447-40-7 | |
| LED Array Driver | Amuza | LAD-1 | |
| LED Array for Multiwell Plates | Amuza | LEDA-x | |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Invitrogen | 11668-019 | Transfection reagent |
| Luminometer | Molecular Devices | SpectraMax L | |
| MgCl2 Hexahydrate | Sigma | M2670; CAS: 7791-18-6 | |
| NaCl | Sigma | S7653; CAS: 7647-14-5 | |
| NanoFuel Solvent | Prolume Inc. (NanoLight) | 399 | for dissolving CTZ preparations for in vitro use |
| NaOH | Sigma | 221465; CAS: 1310-73-2 | |
| NES-CRY2PHR-TevC | Addgene # 89877 | H. Kwon | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher | 11058021 | transfection medium |
| PDL coated coverslips (12 mm, 15 mm, 18 mm) | Neuvitro Corporation | GG-12-PDL, GG-15-PDL , GG-18-PDL | |
| pGL2-GAL4-UAS-Luc | Addgene #33020 | M. Walsh | |
| Prizmatix USB Pulser TTL Generator for Optogenetics | Goldstone Scientific | ||
| TM-CIBN-BLITz1-TetR-VP16 | Addgene # 89878 | H. Kwon | |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-013 | |
| Vehicle (Water-soluble carrier without CTZ) | Prolume Inc. (NanoLight) | 3031C | control for in vivo applications with CTZ |
| VP-EL222 | K. Gardner |
References
- Johnson, H. E., et al. The spatiotemporal limits of developmental Erk signaling. Developmental Cell. 40 (2), 185-192 (2017).
- Wang, Y., et al. Photostimulation by femtosecond laser triggers restorable fragmentation in single mitochondrion. Journal of Biophotonics. 10 (2), 286-293 (2017).
- Li, T., et al. A synthetic BRET-based optogenetic device for pulsatile transgene expression enabling glucose homeostasis in mice. Nature Communications. 12 (1), 615 (2021).
- Berglund, K., Birkner, E., Augustine, G. J., Hochgeschwender, U. Light-emitting channelrhodopsins for combined optogenetic and chemical-genetic control of neurons. PLoS One. 8 (3), 59759 (2013).
- Tung, J. K., Gutekunst, C. -A., Gross, R. E. Inhibitory luminopsins: genetically-encoded bioluminescent opsins for versatile, scalable, and hardware-independent optogenetic inhibition. Scientific Reports. 5, 14366 (2015).
- Berglund, K., et al. Luminopsins integrate opto- and chemogenetics by using physical and biological light sources for opsin activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (3), 358-367 (2016).
- Gomez-Ramirez, M., More, A. I., Friedman, N. G., Hochgeschwender, U., Moore, C. I. The BioLuminescent-OptoGenetic in vivo response to coelenterazine is proportional, sensitive and specific in neocortex. Journal of Neuroscience Research. 98 (3), 471-480 (2020).
- Moore, C. I., Berglund, K.
- Park, S. Y., et al. Novel luciferase-opsin combinations for improved luminopsins. Journal of Neuroscience Research. 98 (3), 410-421 (2020).
- Jaiswal, P. B., Tung, J. K., Gross, R. E., English, A. W. Motoneuron activity is required for enhancements in functional recovery after peripheral nerve injury in exercised female mice. Journal of Neuroscience Research. 98 (3), 448-457 (2020).
- Zenchak, J. R., et al. Bioluminescence-driven optogenetic activation of transplanted neural precursor cells improves motor deficits in a Parkinson's disease mouse model. Journal of Neuroscience Research. 98 (3), 458-468 (2020).
- Tung, J. K., Shiu, F. H., Ding, K., Gross, R. E. Chemically activated luminopsins allow optogenetic inhibition of distributed nodes in an epileptic network for non-invasive and multi-site suppression of seizure activity. Neurobiology of Disease. 109, Pt A 1-10 (2018).
- Hegemann, P.
- Losi, A., Gardner, K. H., Moglich, A.
- Proshkina, G. M., Shramova, E. I., Shilova, O. N., Ryabova, A. V., Deyev, S. M. Phototoxicity of flavoprotein miniSOG induced by bioluminescence resonance energy transfer in genetically encoded system NanoLuc-miniSOG is comparable with its LED-excited phototoxicity. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 188, 107-115 (2018).
- Kawano, F., Okazaki, R., Yazawa, M., Sato, M. A photoactivatable Cre-loxP recombination system for optogenetic genome engineering. Nature Chemical Biology. 12 (12), 1059-1064 (2016).
- Shramova, E. I., Proshkina, G. M., Chumakov, S. P., Khodarovich, Y. M., Deyev, S. M. Flavoprotein miniSOG cytotoxisity can be induced by bioluminescence resonance energy transfer. Acta Naturae. 8 (4), 118-123 (2016).
- Naim, N., et al. Luminescence-activated nucleotide cyclase regulates spatial and temporal cAMP synthesis. Journal of Biological Chemistry. 294 (4), 1095-1103 (2019).
- Kim, C. K., Cho, K. F., Kim, M. W., Ting, A. Y. Luciferase-LOV BRET enables versatile and specific transcriptional readout of cellular protein-protein interactions. Elife. 8, 43826 (2019).
- Parag-Sharma, K., et al. Engineered BRET-based biologic light sources enable spatiotemporal control over diverse optogenetic systems. ACS Synthetic Biology. 9 (1), 1-9 (2020).
- Kim, E. H., et al. Self-luminescent photodynamic therapy using breast cancer targeted proteins. Science Advances. 6 (37), (2020).
- Kim, C. K., et al. A Molecular calcium integrator reveals a striatal cell type driving aversion. Cell. 183 (7), 2003-2019 (2020).
- Wang, W., et al. A light- and calcium-gated transcription factor for imaging and manipulating activated neurons. Nature Biotechnology. 35 (9), 864-871 (2017).
- Lee, D., Hyun, J. H., Jung, K., Hannan, P., Kwon, H. -B. A calcium- and light-gated switch to induce gene expression in activated neurons. Nature Biotechnology. 35 (9), 858-863 (2017).
- Pathak, G. P., et al. Bidirectional approaches for optogenetic regulation of gene expression in mammalian cells using Arabidopsis cryptochrome 2. Nucleic Acids Research. 45 (20), 167 (2017).
- Nishio, H., Walsh, M. J. CCAAT displacement protein/cut homolog recruits G9a histone lysine methyltransferase to repress transcription. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (31), 11257-11262 (2004).
- Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nature Chemical Biology. 10 (3), 196-202 (2014).
- Yao, S., et al. RecV recombinase system for in vivo targeted optogenomic modifications of single cells or cell populations. Nature Methods. 17 (4), 422-429 (2020).
- Love, A. C., Prescher, J. A. Seeing (and using) the light: Recent developments in bioluminescence technology. Cell Chemical Biology. 27 (8), 904-920 (2020).
- Naumann, E. A., Kampff, A. R., Prober, D. A., Schier, A. F., Engert, F. Monitoring neural activity with bioluminescence during natural behavior. Nature Neuroscience. 13 (4), 513-520 (2010).
