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Bioengineering

लिक्विड क्रोमेटोग्राफी लिसेट-आधारित सेल-फ्री सिस्टम्स में मेटाबोलाइट प्रोफाइलिंग के लिए अपवर्तक इंडेक्स या मास स्पेक्ट्रोमेट्रिक डिटेक्शन के साथ मिलकर

Published: September 23, 2021 doi: 10.3791/62852
Automatic Translation
1,3, 2,3, 3, 3
1Graduate School of Genome Science & Technology, University of Tennessee Knoxville, 2Bredesen Center for Interdisciplinary Research, University of Tennessee Knoxville, 3Biosciences Division, Oak Ridge National Laboratory

Summary

प्रोटोकॉल जटिल lysate आधारित सेल मुक्त प्रणालियों में मेटाबोलिक प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए अपवर्तक सूचकांक या बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्रिक डिटेक्शन के साथ-साथ उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमेटोग्राफी विधियों का वर्णन करते हैं।

Abstract

लक्षित बायोसिंथेसिस के लिए इंजीनियरिंग सेलुलर मेटाबोलिज्म को व्यापक डिजाइन-बिल्ड-टेस्ट-लर्न (डीबीटीएल) चक्रों की आवश्यकता हो सकती है क्योंकि इंजीनियर सेल की जीवित रहने की आवश्यकताओं के आसपास काम करता है। वैकल्पिक रूप से, सेल-मुक्त वातावरण में डीबीटीएल चक्र ों को ले जाने से इस प्रक्रिया में तेजी आ सकती है और मेजबान अनुकूलता के साथ चिंताओं को कम किया जा सकता है। सेल-फ्री मेटाबोलिक इंजीनियरिंग (सीएफएमई) के लिए एक आशाजनक दृष्टिकोण बायोमैन्यूफैक्चरिंग के लिए प्लेटफार्मों के रूप में और तेजी से खोज और संशोधित प्रोटीन और रास्तों को प्रोटोटाइप करने के लिए मेटाबोलिक रूप से सक्रिय क्रूड सेल अर्क का लाभ उठाता है। इन क्षमताओं को साकार करने और CFME प्रदर्शन का अनुकूलन करने के लिए lysate आधारित सेल मुक्त प्लेटफार्मों के मेटाबोलोम की विशेषता के लिए तरीकों की आवश्यकता है । यही है, लक्षित मेटाबोलाइट रूपांतरणों में सुधार की निगरानी के लिए विश्लेषणात्मक उपकरण और मेटाबॉलिज्म में हेरफेर करते समय मेटाबोलाइट फ्लक्स में परिवर्तन को स्पष्ट करने के लिए आवश्यक हैं। यहां, ई कोलाई S30 lysates में मेटाबोलाइट उत्पादन और प्रवाह की विशेषता के लिए ऑप्टिकल या मास स्पेक्ट्रोमेट्रिक डिटेक्शन के साथ मिलकर उच्च प्रदर्शन वाले तरल क्रोमेटोग्राफी (एचपीएलसी) का उपयोग करके मेटाबोलाइट विश्लेषण लागू किया गया था। विशेष रूप से, इस रिपोर्ट में विभिन्न उच्च मूल्य वाले उत्पादों के लिए कम लागत वाले सब्सट्रेट्स (यानी ग्लूकोज) के रूपांतरण में केंद्रीय मेटाबोलिक इंटरमीडिएट और उप-उत्पादों के उत्पादन की मात्रा निर्धारित करने के लिए अपवर्तक सूचकांक डिटेक्शन (आरआईड) का उपयोग करके एचपीएलसी विश्लेषणों के लिए सीएफएमई lysates से नमूनों की तैयारी का वर्णन किया गया है । सीएफएमई प्रतिक्रियाओं में मेटाबोलाइट रूपांतरण का विश्लेषण उलट-चरण तरल क्रोमेटोग्राफी के माध्यम से 13सी-लेबल ग्लूकोज के साथ खिलाया जाता है, जो विशिष्ट मेटाबोलाइट पैदावार और शुरू सामग्री से मेटाबोलिक प्रवाह की विशेषता के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। कुल मिलाकर, इन विश्लेषणात्मक तरीकों को CFME lysate मेटाबोलिज्म के लिए लागू करने से इन प्रणालियों को तेजी से या उपन्यास मेटाबोलिक इंजीनियरिंग कार्यों को निष्पादित करने के लिए वैकल्पिक प्लेटफार्मों के रूप में उन्नति में सक्षम बनाता है।

Introduction

रासायनिक उत्पादन के लिए इंजीनियरिंग रोगाणुओं में सीमाओं को विट्रो में जैव रासायनिक प्रतिक्रियाओं को फिर से बढ़ाकर संबोधित किया जा सकता है जहां प्रतिस्पर्धी सेलुलर अस्तित्व कार्य अनुपस्थित हैं1। इसके अलावा, खुली प्रतिक्रिया वातावरण (यानी, कोशिका झिल्ली की अनुपस्थिति) हेरफेर के लिए अधिक उत्तरदायी है और जीवित कोशिकाओं की तुलना में निगरानी करना आसान है। सेल-फ्री मेटाबोलिक इंजीनियरिंग (CFME) की इस मूलभूत अवधारणा को हाइड्रोजन और मोनोटरपेन जैसे मूल्यवान रसायनों को उत्पादन मैट्रिक्स के साथ संश्लेषित करने के लिए मेटाबोलिक रास्तों के पुनर्गठन द्वारा सुंदर ढंग से प्रदर्शित किया गया है जो माइक्रोबियल सेल कारखानों में प्रस्तुत की तुलना में अधिक परिमाण के आदेश हैं इस प्रकार अब तक1,2,3 . हालांकि, पूरे रास्तों को शुद्ध करने के तरीके वर्तमान में समय और लागत से विवश हैं। वैकल्पिक रूप से, सेल-मुक्त मेटाबोलिक सिस्टम को कच्चे सेल अर्क से पूरे मार्ग पुनर्गठन4के सापेक्ष तेजी से और सस्ती विधियों के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है। सेल अर्क में बनाए गए केंद्रीय मेटाबॉलिज्म को ऊर्जा सब्सट्रेट्स (जैसे ग्लूकोज और एंजाइमेटिक कोफैक्टर) और बफर किए गए समाधानों में लवण के साथ पूरक किया जा सकता है ताकि 24 घंटे5,6से अधिक के लिए केंद्रीय मेटाबोलिक अग्रदूत उत्पन्न हो सके। लजीदने वाले सीएफएमई प्रतिक्रिया में एक्सोजेनस एंजाइमों को जोड़ने से ग्लूकोज के अधिक जटिल जैव-परिवर्तन उच्चटाइटर्स4,6, 7पर अधिक मूल्यवान रसायनों मेंहोतेहैं। यद्यपि इन प्रणालियों में उनकी कोशिका जैसी मेटाबॉलिक जटिलता के कारण उपज से समझौता किया जाता है, लेकिन अधिक उपज रूपांतरण के लिए लाइकेट प्रोटेक्स को क्यूरेट करने के अनूठे तरीके7,8विकसित किए जा रहे हैं।

lysate आधारित सेल मुक्त प्रणालियों में मेटाबॉलिक परिवर्तनों को पूरा करने में आसानी इन उत्कृष्ट प्लेटफार्मों या तो कोशिका के बाहर रासायनिक विनिर्माण पूरी तरह से ले जाने के लिए या वीवो2,9में इन डिजाइनों के निर्माण और परीक्षण से पहले उच्च थ्रूपुट के साथ नएरास्तोंप्रोटोटाइप के लिए बनाता है । या तो आवेदन के लिए, मेटाबोलिक रूपांतरणों की निगरानी या lysates में मेटाबॉलिक प्रवाह के लिए समग्र परिवर्तन देखने के लिए उपकरण CFME की उन्नति के अभिन्न अंग हैं। उच्च प्रदर्शन वाले तरल क्रोमेटोग्राफी (एचपीएलसी) का उपयोग सीएफएम प्रतिक्रियाओं के रासायनिक घटकों को उच्च-रिज़ॉल्यूशन के साथ अलग करने के लिए किया जा सकता है और मेटाबोलाइट क्वांटिफिकेशन5,10के लिए ऑप्टिकल या मास-स्पेक्ट्रोमेट्रिक डिटेक्टरों के साथ जोड़ा जा सकता है। एचपीएलसी का अंतर्निहित सिद्धांत यह है कि एक विलायक (यानी, मोबाइल चरण) में भंग हुए और एक कॉलम के माध्यम से पंप किए गए विश्लेषण विशिष्ट कॉलम पैकिंग सामग्री (यानी स्थिर चरण)11के साथ बातचीत करेंगे। उनके रासायनिक गुणों के आधार पर, ये विश्लेषणात्मक बार-बार अलग-अलग प्रदर्शन करते हैं, इससे पहले कि वे अंततः स्थिर चरण से बाहर हो जाते हैं और मोबाइल चरण द्वारा डिटेक्टर तक ले जाते हैं। इस रिपोर्ट में एचपीएलसी आधारित तरीकों के माध्यम से ई कोलाई लिस्एट आधारित सीएफएमई प्रतिक्रियाओं की तैयारी और विश्लेषण का ब्यौरा दिया गया है।

एचपीएलसी ने अपवर्तक सूचकांक का पता लगाने के लिए मिलकर (एचपीएलसी-आरआईड) केंद्रीय मेटाबोलिक अग्रदूतों और अंत-उत्पादों की जल्दी पहचान करने के लिए एक आम तौर पर सुलभ तरीका है। संक्षेप में, छुटकारा उपाय कैसे विश्लेषणलिटे मोबाइल चरण12द्वारा प्रकाश के विक्षेप को बदल देते हैं । नमूनों में विश्लेषण को लक्षित करने के लिए संबंधित रिड सिग्नल को मानक समाधानों के आरआईड संकेतों के साथ तुलना करके निर्धारित किया जा सकता है। CFME अनुप्रयोगों में, पता लगाने के इस तरीके का सबसे अधिक उपयोग एचपीएलसी स्तंभों के साथ किया जाता है जो आकार के बहिष्कार और लिगांड विनिमय तंत्र, या आयन-मॉडरेट विभाजन क्रोमेटोग्राफी5,6,8,13के संयोजन के आधार पर अलग-अलग यौगिकों का उपयोग करता है। इस विशेष तकनीक का उपयोग ग्लूकोज जैसे चीनी सब्सट्रेट्स की खपत को जल्दी से निर्धारित करने के साथ-साथ lysate-आधारित CFMEप्रतिक्रियाओंमें संक्षेप, लैक्टेट, फोर्टमेट, एसीटेट और इथेनॉल जैसे किण्वन उत्पादों के गठन के लिए किया जाता है। एचपीएलसी के माध्यम से इन यौगिकों के एकाग्रता परिवर्तनों को रिकॉर्ड करना कच्चे सेल अर्क की क्षमता को केंद्रीय मेटाबॉलिक अग्रदूतों को पूल करने और यह समझने के लिए उपयोगी रहा है कि6,8,14में ग्लूकोज से जटिल मेटाबोलिक रूपांतरणों के दौरान किण्वित मार्ग के माध्यम से कैसे मार्ग प्रवाह को पुनः निर्देशित किया जाता है। ई. कोलाई सेल अर्क में मौलिक CFME अध्ययन इस बात की पुष्टि करते हैं कि किण्वन यौगिक ग्लूकोज कैटाबोलिज्म के अंत-उत्पादों के रूप में जमा होते हैं और यह भी होते हैं कि एक्सोजेनस एंजाइमों को अधिक बढ़ाते हैं6,15। यह सुझाव दिया जाता है कि किण्वित चयापचय ग्लाइकोलिटिक प्रतिक्रियाओं को बनाए रखने के लिए कोफैक्टर (यानी, एनएडी (पी) एच और एटीपी) के रेडॉक्स समकक्ष को पुनर्जीवित करने में आवश्यक भूमिका निभाता है8। इसलिए, विभिन्न lysate-आधारित CFME कार्यों को निष्पादित करते समय किण्वन उत्पादों को अलग करने के लिए डिज़ाइन किया गया एचपीएलसी आधारित ऑप्टिकल डिटेक्शन विधि एक उपयोगी और आमतौर पर लागू उपकरण है।

CFME मेटाबोलिक अंत उत्पादों है कि कार्बोहाइड्रेट, कार्बनिक एसिड, या शराब4नहीं कर रहे है जमा करने के लिए लागू किया जा सकता है । मध्यवर्ती का माप जिसका सेवन जितनी जल्दी होता है , उसके संश्लेषण में भी10वांछनीय हो सकतेहैं . जबकि एचपीएलसी-आरआईडी लागत और कठिनाई के मामले में सुलभ है, यह विधि प्रतिधारण समय के आधार पर केवल मेटाबोलाइट्स को अलग करने की क्षमता से विवश है। जब लिक्विड क्रोमेटोग्राफी एमएस/एमएस डिटेक्शन (एलसी-एमएस/एमएस)16से मिलकर होता है तो मेटाबोलाइट्स की व्यापक रेंज का विश्लेषण किया जा सकता है । इस विधि से, मोबाइल चरण में विश्लेषण आयनित और अंतर से प्रत्येक अणु के द्रव्यमान और चार्ज गुणों के आधार पर पता लगाया जाता है। कॉलम पर मेटाबोलाइट के मास-टू-चार्ज (एम/जेड) अनुपात और प्रतिधारण समय दोनों का ज्ञान इस प्रकार उच्च संकल्प16के साथ अधिकांश मेटाबोलिक मध्यवर्ती और अंत उत्पादों के पृथक्करण की सुविधा प्रदान करता है । इस डिटेक्शन तकनीक को नैनो-लिक्विड क्रोमेटोग्राफी के साथ भी जोड़ा जा सकता है, जो बहुत कम प्रवाह दरों और नमूना इंजेक्शन की मात्रा प्रदान करता है, जिससे जटिल दृष्टि से सिद्धांत पृष्ठभूमि17में छोटे अणुओं का अधिक संवेदनशील पता लगाने की अनुमति मिलती है। एलसी-एमएस/एमएस को आइसोटोप लेबलिंग के साथ अतिरिक्त रूप से लागू किया जा सकता है क्योंकि इसमें शामिल लेबल एनालाइट्स के एम/जेड वैल्यूज18में बदलाव प्रदान करते हैं । 13सी6-ग्लूकोज सब्सट्रेट के साथ पूरक CFME प्रतिक्रिया से निकाले गए टाइमपॉइंट माप इस प्रकार पूरक ग्लूकोज से विशेष रूप से प्राप्त अंत या उप-उत्पादों को निर्धारित कर सकते हैं। यद्यपि यह आइसोटोप ट्रेसिंग विधि अभी तक आमतौर पर सीएफएमई अध्ययनों में लागू नहीं होती है, यह lysate-आधारित CFME सिस्टम में मेटाबोलिक रूपांतरणों को समझने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है, विशेष रूप से इन प्रतिक्रियाओं में नमक प्रतिदेश (यानी, एसीटेट और ग्लूटामेट) को माध्यमिक सब्सट्रेट्स19के रूप में भी कैटाबोलाइज्ड किया जाता है। इस तकनीक का लाभ उठाने से lysates में ग्लूकोज चयापचय की एक व्यापक तस्वीर खींच सकते हैं, जो इस दिन के लिए पूरी तरह से समझ में नहीं आता है । यहां, प्रोटोकॉल नैनो-लिक्विड क्रोमेटोग्राफी के लिए एक विधि का विवरण देता है, जो नैनोइलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण (नैनो ईएसआई) एमएस/एमएस के साथ मिलकर ग्लूकोज मेटाबोलिज्म के संभावित मॉडल से पूछताछ करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, विशेष रूप से ई. कोलाई lysates(चित्रा 1)में । यह मॉडल किण्वित मार्गों और पेंटोज फॉस्फेट मार्ग के ई. कोलाई में सक्रिय होने की रिपोर्टों पर आधारित है जो अमीर मीडिया 5 ,6,8,14में बढ़े उपभेदों से प्राप्त होता है । इस तकनीक का उपयोग अमीनो एसिड उत्पादन की जांच करने के लिए किया जाता है क्योंकि लाइसेट में ग्लूकोज से अमीनो एसिड एनाबोलिज्म पर वर्तमान ज्ञान कुछ उदाहरणों तक सीमित है जैसे कि सुगंधित अमीनो एसिड का संश्लेषण7। इन रास्तों (यानी ऑर्गेनिक एसिड, शुगर फॉस्फेट और अमीनो एसिड) में एंड-प्रॉडक्ट्स और इंटरमीडिएट की ज्यादातर ध्रुवीय प्रकृति को देखते हुए रिवर्स-चरणबद्ध लिक्विड क्रोमेटोग्राफी का इस्तेमाल यहां किया गया । यह तकनीक ध्रुवीय यौगिकों को एक गैर-ध्रुवीय स्थिर चरण से दूर करती है। इन यौगिकों को तब नैनो ईएसआई द्वारा नकारात्मक आयन मोड में आयनित किया गया था जो कम से कम एक नकारात्मक प्राथमिक शुल्क के साथ विश्लेषण का पता लगाने की अनुमति देता है और इस प्रकार अम्लीय यौगिकों का पता लगाने के लिए उपयोगी है। इस तकनीक को ग्लूकोज-व्युत्पन्न 13सी-शामिल मेटाबोलाइट्स का विश्लेषण करने के लिए यहां नियोजित किया जाता है और lysates में ग्लूकोज चयापचय को समझने के लिए एलसी-एमएस/एमएस की उपयोगिता को दर्शाता है ।

Protocol

1. एचपीएलसी-रिड क्वांटिफिकेशन के लिए समय पाठ्यक्रम CFME प्रतिक्रियाओं को शुरू करना, रोकना और प्रसंस्करण करना।

  1. गल पहले तैयार ई. कोलाई lysates और बर्फ पर प्रतिक्रिया घटकों के बाकी तैयार करते हैं ।
    नोट: यहां रिपोर्ट किए गए lysates ई. कोलाई BL21DE3-स्टार से 2xYPTG (१.८% ग्लूकोज) मीडिया में मध्य लॉग चरण के लिए उगाया गया था ।
    1. फ़िल्टर-स्टरलाइज्ड (0.20 माइक्रोन पोर फ़ोर फिल्टर) S30 बफर (1 एम ट्रिस-ओसी को हिमनदों के एसीटिक एसिड, 1.4 एम मिलीग्राम (OAc) 2, और 6 एम KOAc के साथ पीएच8.2में समायोजित) की एक उपयुक्त मात्रा तैयार करें।
    2. S30 बफर में ग्लूकोज, ग्लूटामेट साल्ट, एटीपी, कोएंजाइम ए, एनएडी +, बीआईएस-ट्रिस बफर और डिपोटासियम फॉस्फेट युक्त ऊर्जा मिश्रण तैयार करें। यहां CFME प्रतिक्रियाओं को तैयार करने के लिए उपयोग की जाने वाली वांछित प्रतिक्रिया मात्रा में अंतिम सांद्रता 100 mM ग्लूकोज थे, 18 एमएम मैग्नीशियम ग्लूटामेट, 15 एमएम अमोनियम ग्लूटामेट, 195 एमएम पोटेशियम ग्लूटामेट, 1 एमएम एटीपी, 0.2 एमएम कोएंजाइम ए, 1 एमएम एनएडी+,150 एमएम बीआईएस-ट्रिस, और 10 एमएम डिपोटासियम फॉस्फेट।
  2. कुल lysate प्रोटीन के 4.5 मिलीग्राम/एमएल के साथ अंतिम प्रतिक्रियाओं को तैयार करने के लिए घटकों को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में मिलाएं। यहां, CFME प्रतिक्रियाओं को प्रति टाइमपॉइंट ट्रिपलीकेट में 50 माइक्रोन के अंतिम संस्करणों के साथ तैयार किया गया था। अपने-अपने समय-सीमा के लिए प्रतिक्रियाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: तेजी से काम करें और ग्लूकोज और ग्लूटामेट लवण के साथ समय से पहले मेटाबॉलिक प्रतिक्रियाओं को रोकने के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण के अंतिम घटक के रूप में lysate जोड़ें। न्यूनतम ग्लूकोज की खपत कितनी देर तक प्रतिक्रिया घोला जा सकता है बर्फ पर इनक्यूबेटेड कर रहे है के आधार पर हो सकता है ।
  3. प्रतिक्रियाओं को समाप्त करें और एचपीएलसी-आरआईड विश्लेषण के लिए नमूनों को संसाधित करें।
    1. अपने उचित समय बिंदुओं पर ट्रिपलिटे डेट प्रतिक्रियाओं को समाप्त करने के लिए, तुरंत प्रत्येक नमूने की अंतिम प्रतिक्रिया मात्रा में 5% ट्राइक्लोरोएसेटिक एसिड की बराबर मात्रा जोड़ें (यानी, 50 माइक्रोन एसिड के 50 माइक्रोनल प्रतिक्रिया में)। 2x प्रतिक्रिया मात्रा (यानी, 100 μL) पर बाँझ पानी के साथ प्रत्येक नमूने को पतला करें।
    2. समय शून्य को फिर से शुरू करने के लिए, बाकी प्रतिक्रिया घटकों को जोड़ने से पहले lysate के साथ कुल अंतिम प्रतिक्रिया मात्रा (यानी, 50 माइक्रोन) के रूप में 5% ट्राइक्लोरोएसेटिक एसिड की एक ही मात्रा मिलाएं। यह अम्लीकरण कदम ग्लूकोज को काफी मेटाबोलाइज करने से पहले lysate एंजाइमों को उपजी है ।
    3. भंवर 5 मिनट के लिए 11,600 x ग्राम पर एक बेंचटॉप माइक्रोसेंट्रफ्यूज पर नमूने और अपकेंद्रित्र और ट्यूबों को साफ करने के लिए कार्बनिक विश्लेषण युक्त सुपरनेटेंट स्थानांतरित करें। यदि एचपीएलसी विश्लेषण अलग दिन किया जाना है तो नमूनों को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। अगले चरण के लिए आगे बढ़ने से पहले बर्फ पर संग्रहीत नमूनों गल करने के लिए सुनिश्चित करें ।
    4. 0.22 माइक्रोन पोर फिल्टर के साथ प्रत्येक सुपरनेट को फ़िल्टर करें। सीरिंज के विकल्प के रूप में, 1 मिनट के लिए 16,300 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र ट्यूब फिल्टर और अपकेंद्रित्र सुपरनेटेंट का उपयोग करें।
    5. प्रत्येक फिल्ट्रेट को एक साफ एचपीएलसी ग्लास शीशी में स्थानांतरित करें। एचपीएलसी ऑटोसंप्लर ट्रे पर एलसीडी लोड करें।
  4. मानक वक्र उत्पादन के लिए नमूने तैयार करें।
    1. CFME प्रतिक्रियाओं में ग्लूकोज की शुरुआती एकाग्रता से ऊपर सममोलर मात्रा में S30 बफर में भंग सभी लक्ष्य विश्लेषण का एक स्टॉक समाधान तैयार करें। यहां 150 माइक्रोनम ग्लूकोज, सक्सिटेट, लैक्टेट, फॉरमेट, एसीटेट और इथेनॉल से मिलकर एक स्टॉक सॉल्यूशन तैयार किया गया। 0 माइक्रोन से लेकर स्टॉक एकाग्रता (यानी, 150 माइक्रोन) तक अंतिम सांद्रता के साथ ट्रिपलीकेट 50 माइक्रोल समाधान प्राप्त करने के लिए स्टॉक समाधान से 1:1 (v/v) धारावाहिक कमजोर करते हैं।
    2. 5% ट्राइक्लोरोएसेटिक एसिड के 50 माइक्रोन और बाँझ पानी के 100 माइक्रोन के साथ प्रत्येक समाधान को पतला करें। चरण 1.3.4-1.3.5 दोहराएं।
      नोट: मेटाबोलाइट सांद्रता के सटीक मात्राकरण को सुनिश्चित करने के लिए नमूनों के प्रत्येक बैच के साथ मानक वक्र पीढ़ी के लिए समाधान चलाएं।

2 मेटाबोलाइट डिटेक्शन के लिए एचपीएलसी सिस्टम तैयार करना।

  1. एक धुएं के हुड के तहत, डिएक्रिन और फिल्टर-स्टरलाइज्ड पानी से एक निष्फल 5 m सल्फ्यूरिक एसिड समाधान तैयार करें। 5 एमएम सल्फ्यूरिक एसिड तैयार करने के लिए 2 एल पानी में 98% एचपीएलसी ग्रेड सल्फ्यूरिक एसिड समाधान के ~ 550 माइक्रोन जोड़ें।
    सावधानी: सल्फ्यूरिक एसिड एक खतरनाक रसायन है, और उचित प्रयोगशाला पीपीई के साथ एक धुएं हुड के नीचे काम करना साँस लेना, त्वचा से संपर्क और आंखों से संपर्क को रोकता है। केंद्रित सल्फ्यूरिक एसिड पानी के साथ सख्ती से प्रतिक्रिया करता है और सीधे पानी में जोड़ा जाना चाहिए, न कि दूसरी तरह से। सीधे सूरज की रोशनी से दूर एक शांत, शुष्क क्षेत्र में स्टोर करें और प्रयोगशाला द्वारा निर्धारित उचित अपशिष्ट निपटान उपायों का पालन करें।
  2. एचपीएलसी उपकरण के बगल में पानी के स्नान में 5 एमएम सल्फ्यूरिक एसिड की 2 एल बोतल रखें। पानी स्नान को 35 डिग्री सेल्सियस तक सेट करें। सॉल्वेंट बोतल में एक सॉल्वेंट फिल्टर के साथ ट्यूबिंग रखें और पंप मॉड्यूल के अनुरूप एक डेगासर मॉड्यूल के लिए दूसरे छोर संलग्न करें।
    नोट: कॉलम स्थापित करने से पहले एक हौसले से तैयार सॉल्वेंट के साथ प्रणाली मिटाना अच्छा साधन हैंडलिंग अभ्यास है।
  3. आरआईड मॉड्यूल के अनुरूप एचपीएलसी कॉलम से एचपीएलसी उपकरण को लैस करें। अगर कोई कॉलम थर्मोस्टेट उपलब्ध नहीं है तो कॉलम को 35 डिग्री सेल्सियस वाटर बाथ में रखें।
  4. सिस्टम कंप्यूटर पर स्थापित क्रोमेटोग्राफी डाटा सिस्टम (सीडीएस) सॉफ्टवेयर में 35 डिग्री सेल्सियस पर विश्लेषण के लिए आरआईड मॉड्यूल तैयार करें।
    1. व्यू मेन्यू में, विधि का चयन करें और नियंत्रण दृश्य चलाएं। पंप मॉड्यूल > विधिपर राइट-क्लिक करें । 0.55 mL·मिनट-1 के लिए प्रवाह दर सेट करें और पंप शुरू करने के लिए बटन पर चयन करें।
      नोट: यदि कॉलम एचपीएलसी पर सुसज्जित होने से पहले भंडारण में था, तो निर्माता के निर्देशों का पालन करने वाले कॉलम को बराबर करने के बाद प्रवाह दर को0.55 मिलियन-1 तक बढ़ा दें।
    2. आरआईड मॉड्यूल > विधिके अनुरूप पैनल पर राइट-क्लिक करें। आरआई डिटेक्टर मॉड्यूल का तापमान 35 डिग्री सेल्सियस तक सेट करें और आरआई डिटेक्टर मॉड्यूल को वार्मिंग शुरू करने के लिए चुनें।
    3. कंट्रोल के > पैनल रिड मॉड्यूलपर राइट-क्लिक करें । इस सेटअप से पहले आरआई डिटेक्टर के माध्यम से अलग-अलग सॉल्वैंट्स बहने पर नए सॉल्वेंट या 1 एच का उपयोग करते समय कम से कम 15 मिनट के लिए शुद्ध संदर्भ सेल के लिए चुनें। ऑन बटन पर क्लिक करें।
      नोट: ऑनलाइन प्लॉट पर एक स्थिर आधार रेखा प्राप्त करने के लिए पंप और आरआई डिटेक्टर रखें। यह प्रयोगशाला में तापमान में उतार-चढ़ाव से प्रभावित होता है और 4 घंटे या उससे अधिक समय तक ले जा सकता है। नमूना लोड होने से पहले रात भर सिस्टम रखें।

3. सीडीएस में कार्बनिक किण्वन उत्पादों के आइसोक्रेटिक एचपीएलसी पृथक्करण के लिए एक विधि बनाना।

  1. मेनू बार से, विधि > नई विधिका चयन करें । विधि > सेव मेथड को [विधिनाम] .M के रूप में चुनें विधि > साधन/अधिग्रहण के > पूरी विधि को संपादित करें
  2. बाइनरी पंप टैब के भीतर, 0.55 mL·मिनट-1के लिए प्रवाह सेट। सॉल्वैंट्स केतहत, पंप मॉड्यूल पर सॉल्वेंट इनपुट के अनुरूप पत्र का चयन करें और इसे आइसोक्रैटिक एल्यूशन के लिए 100% तक सेट करें। स्टॉपटाइम के रूप में 0 और 400 बार और इनपुट 30 मिनट के लिए दबाव सीमा निर्धारित करें।
  3. पारखी टैब के भीतर, इंजेक्शन की मात्रा को 50 माइक्रोन सेट करें। स्टॉपटाइमके तहत एएस पंप/नो लिमिट ऑप्शन चुनें । ड्रा स्पीड, इजेक्ट स्पीड और ड्रा पोजीशन के लिए उन्नत सहायक सेटिंग्स सेट करें 200 μL·मिनट-1,200 μL·मिनट-1,और -0.5 मिमी।
  4. रिड टैब के भीतर, ऑप्टिकल यूनिट तापमान को 35 डिग्री सेल्सियस तक सेट करें। सिग्नलके तहत, सिग्नल के लिए अधिग्रहण का चयन करें और पीकविड्थके लिए >0.2 मिनट। स्टॉपटाइमके लिए एएस पंप/इंजेक्टर विकल्प का चयन करें ।
  5. आरआईड टैब के भीतर उन्नत के तहत, एनालॉग आउटपुट को 5% शून्य ऑफसेट और 500,000 एनआरयू को एटटेनेशनके लिए सेट करें। सिग्नल पोलरिटी के लिए सकारात्मक विकल्प और विश्लेषण से पहले स्वचालित शून्यके लिए ऑन ऑप्शन चुनें ।
  6. विधि का चयन करके विधि को सहेजें > विधि बचाओ। विधि > लोड विधि > [विधिनाम] का चयन करके विधि लोड करें। एम.

4. ऑटोसैंपलिंग के लिए एक अनुक्रम तालिका बनाना और डेटा अधिग्रहण के लिए एचपीएलसी-आरआईड सिस्टम शुरू करना।

  1. मेनू बार से, नए अनुक्रम टेम्पलेट > अनुक्रमका चयन करें। सीक्वेंस > सेव सीक्वेंस टेम्पलेट को [सीक्वेंसटेम्पलेटनेम] के रूप में चुनें। एस।
  2. अनुक्रम > अनुक्रम तालिका का चयनकरें । ऑटोसंप्लर ट्रे पर उनकी व्यवस्था के अनुसार, 'एन' शीशियों के अनुरूप 'एन' पंक्तियां, फिर क्रमशः शीशी और नमूना नाम के तहत इनपुट शीशी की स्थिति और नमूना नाम। प्रत्येक पंक्ति के लिए विधि नाम ड्रॉपडाउन मेनू और इनपुट 50 माइक्रोल के रूप में Inj/शीशी (इंजेक्शन प्रति शीशी) से चरण 3 में उत्पन्न विधि का चयन करें।
  3. सीक्वेंस टेम्पलेट को सेव > सीक्वेंस टेम्पलेट का चयन करके अप्लाई करें और सीक्वेंस टेम्पलेट को सेवकरें । सुनिश्चित करें कि सीक्वेंस टेम्पलेट को > लोड सीक्वेंस टेम्पलेट > अनुक्रम > चयन करके लोड किया गया है। एस।
  4. ऑनलाइन प्लॉट पर एक स्थिर आधार रेखा प्राप्त करने के बाद, दाएं क्लिक करें पैनल रिड मॉड्यूल > नियंत्रण > रीसाइक्लिंग वाल्व को बर्बाद करने के लिए रिड डिटेक्टर के माध्यम से सॉल्वेंट प्रवाह को निर्देशित करने के लिए। डेटा अधिग्रहण शुरू करने के लिए, मेनू बार, अनुक्रम > रन से अनुक्रम काचयन करें ।

5. डेटा को निकालने और विश्लेषण करने के बाद चलाते हैं।

  1. व्यू मेनू से डेटा विश्लेषण दृश्य चुनें। स्क्रीन के बाएं हाथ की ओर फ़ाइल सूची से अनुक्रम फ़ाइल नाम का पता लगाएं। स्क्रीन पर केंद्र पैनल पर, नमूना क्रोमेटोग्राम देखने के लिए सिग्नल व्यू सेलेक्शन > आरआईड सिग्नल पर जाएं।
  2. स्क्रीन पर शीर्ष पैनल से उच्च एकाग्रता मानक नमूने के अनुरूप एक पंक्ति का चयन करें। प्रदर्शित क्रोमेटोग्राम पर लक्ष्य विश्लेषण चोटियों के लिए प्रतिधारण समय पर ध्यान दें। लक्ष्य विश्लेषण के अनुरूप चोटियों को ग्लूकोज, संक्षेप, लैक्टेट, फोरमेट, एसीटेट और इथेनॉल(पूरक चित्रा 1)के रूप में प्रतिधारण समय धुरी के साथ व्यवस्थित किया जाएगा।
    नोट: क्रोमाटोग्राम पर पहली बड़ी चोटी ट्राइक्लोरोएसेटिक एसिड से मेल खाती है। इसकी आरआई इकाइयां सभी मानक वक्र नमूनों में सुसंगत होनी चाहिए। प्रत्येक यौगिक को एक अलग नमूने के रूप में चलाकर प्रत्येक लक्ष्य विश्लेषण के प्रतिधारण समय को मान्य करें।
  3. मानकों और प्रतिक्रिया नमूनों के क्रोमाटोग्राम से प्रत्येक लक्ष्य विश्लेषण के लिए पीक क्षेत्रों को निकालें।
    1. विचार करें कि क्या चोटियों की रुचि सॉफ्टवेयर द्वारा अच्छी तरह से एकीकृत है। वक्र के तहत एक सटीक एकीकृत क्षेत्र प्राप्त करने के लिए प्रत्येक चोटी के आधार के रूप में लाल रेखा ड्रा। यदि स्वचालित एकीकरण विफल रहता है (यानी, लाल रेखा तिरछा है), तो एकीकरण टूल सेट से मैनुअल एकीकरण बटन का चयन करें और पीक क्षेत्र को एकीकृत करने के लिए मैन्युअल रूप से एक चोटी का आधार आकर्षित करें।
      नोट: यदि मैन्युअल एकीकरण एक नमूने में एक लक्ष्य विश्लेषण के लिए किया जाना चाहिए, लगातार रखने के लिए और मैन्युअल रूप से सभी नमूनों में एक ही विश्लेषण एकीकृत ।
    2. ठीक से एकीकृत चोटियों पर क्लिक करने के लिए कॉमन टूल सेट से कर्सर टूल चुनें। शिखर क्षेत्र और चयनित चोटी के इसी प्रतिधारण समय स्क्रीन के नीचे पैनल पर एक मेज पंक्ति के रूप में प्रकाश डाला जाएगा ।
    3. पीक क्षेत्रों का निर्यात करने के लिए, फ़ाइल > निर्यात > एकीकरण परिणामोंका चयन करें ।
  4. मानक घटता का उपयोग कर लक्ष्य विश्लेषणाय सांद्रता की मात्रा निर्धारित करें।
    1. एक स्प्रेडशीट में नमूनों की ज्ञात सांद्रता बनाम प्लॉट पीक क्षेत्र मूल्यों। प्लॉट किए गए डेटा पर राइट-क्लिक करें, चार्ट पर डिस्प्ले समीकरण > ट्रेंडलाइन > फॉर्मेट ट्रेंडलाइन जोड़ें।
    2. एक अलग स्प्रेडशीट में, प्रत्येक नमूने से हर विश्लेषण के लिए पीक क्षेत्र मूल्यों को सांद्रता में परिवर्तित करने के लिए मानक वक्र ट्रेंडलाइन के समीकरणों का उपयोग करें। डेटा विज़ुअलाइज़ेशन के लिए ट्रिप्लिकेट में औसत पीक क्षेत्रों और मानक त्रुटि मानों की गणना करें.

6. एलसी-एमएस/एमएस क्वांटिफिकेशन के लिए शुरू, रोक, और प्रोसेसिंग टाइम कोर्स आइसोटोप ट्रेसिंग सीएफएमई प्रतिक्रियाएं।

  1. 1.1-1.2 में वर्णित बर्फ पर प्रति टाइम पॉइंट (समय शून्य को छोड़कर) ट्रिपलिकेट प्रतिक्रियाओं को सेट करें। हालांकि, ग्लूकोज के बजाय, प्रतिक्रियाओं में 100 mm 13सी6- ग्लूकोज की अंतिम एकाग्रता का उपयोग करें। 1 घंटे, 2 घंटे और 3 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रियाओं को इनक्यूबेट करें।
  2. समाप्त करने के लिए, तरल नाइट्रोजन में प्रतिक्रियाओं को फ्लैश करें और उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। एक ही दिन के विश्लेषण के लिए इस भंडारण चरण को छोड़ें।
    नोट: एलसी-एमएस/एमएस के माध्यम से कुछ केंद्रीय कार्बन मेटाबोलाइट्स का पता लगाते समय एसिड से हस्तक्षेप के कारण प्रतिक्रियाओं को रोकने के लिए ट्राइक्लोरोएसेटिक एसिड का उपयोग नहीं किया गया था । इसके बजाय, फोर्मिक एसिड (चरण 6.3) युक्त निष्कर्षण विलायक का उपयोग मेटाबोलिक प्रोटीन को कम करने के लिए किया गया था क्योंकि फॉर्मिक एसिड का द्रव्यमान रिपोर्ट की गई एमएस/एमएस विधि की पहचान सीमा से नीचे है।
  3. एक्सट्रेक्शन सॉल्व करने की 50 एमएल तैयार करें। एसिटोनिट्रिल के 20 एमएल, मेथनॉल के 20 एमएल और 10 एमएल पानी (सभी एलसी-एमएस ग्रेड) में 50 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब के साथ-साथ 0.199 एमएल फॉरमिक एसिड के साथ 0.1 एम सॉल्यूशन बनाने के लिए मिलाएं और भंवर। एक्सट्रैक्ट के दौरान सॉल्वेंट को 4 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें और उपयोग में न आने पर सॉल्वेंट को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  4. एलसी-एमएस/एमएस विश्लेषण के लिए प्रसंस्करण नमूने
    1. विश्लेषण के दिन, प्रत्येक नमूने के लिए निष्कर्षण सॉल्वेंट (यानी, 50 माइक्रोल) की बराबर मात्रा पिपेट करें। यदि नमूने जमे हुए थे, तो ग्लूकोज मेटाबोलिज्म के पुनः सक्रिय होने को रोकने के लिए नमूनों को पूरी तरह से गल जाने से पहले निष्कर्षण सॉल्वेंट जोड़ें। बर्फ पर सभी नमूना प्रसंस्करण चरणों का प्रदर्शन करें।
    2. समय शून्य को फिर से शुरू करने के लिए, एक्सट्रेक्शन सॉल्वेंट (यानी, 50 माइक्रोन) की अंतिम मात्रा को प्रतिक्रिया में वांछित अंतिम एकाग्रता के लिए लिसेट की उचित मात्रा के लिए पिपेट करें (यानी, 50 माइक्रोन प्रतिक्रिया मात्रा में 4.5 मिलीग्राम/एमएल) । बाकी प्रतिक्रिया घटकों को चरण 1.2 में जोड़ें। यह अम्लीकरण कदम ग्लूकोज को काफी मेटाबोलाइज करने से पहले lysate एंजाइमों को उपजी है ।
    3. कोमल मिलाते हुए 30 मिनट के लिए बर्फ पर निष्कर्षण विलायक में नमूनों को इनक्यूबेट करें, फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 21,000 x ग्राम पर नमूनों को स्थिर करें ताकि उपजी प्रोटीन से सुपरनैंट को अलग किया जा सके। ऑटोसम्पलर शीशियों में सुपरनेटेंट के 50 माइक्रोन ट्रांसफर करें और 4 डिग्री सेल्सियस ऑटोसंपलर के भीतर ट्रे पर शीशियों को लोड करें। भविष्य के विश्लेषण के लिए बाकी सुपरनेट को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

7. एलसी-एमएस/एमएस विश्लेषण के लिए एलसी प्रणाली की स्थापना।

  1. 950 एमएल पानी में 77.08 मिलीग्राम अमोनियम एसीटेट और आइसोप्रोपेनॉल के 50 एमएल को पूरी तरह से भंग करके सॉल्वेंट ए के 1 एल तैयार करें। 650 एमएल एसीटोनिट्रिल के साथ सॉल्वेंट बी के 1 एल, 300 एमएल पानी और 50 एमएल आइसोप्रोपेनॉल के साथ-साथ 77.08 मिलीग्राम अमोनियम एसीटेट तैयार करें। सुनिश्चित करें कि सभी सॉल्वेंट एलसी-एमएस ग्रेड हैं।
  2. सॉल्वैंट्स ए और बी वाली सॉल्वेंट बोतलों को पंप मॉड्यूल से कनेक्ट करें। एलसी सिस्टम को सॉल्वैंट्स के उपकरण के दौरान होने वाले किसी भी वायु संदूषण को हटाने/सीमित करने के लिए उच्च प्रवाह दर पर सिस्टम को शुद्ध करें ।
  3. सिस्टम को C18 उत्क्रमित-चरणबद्ध कॉलम (30 सेमी कॉलम लंबाई, 75 माइक्रोन आंतरिक व्यास, और 5 माइक्रोन कण व्यास) से लैस करें। 100% सॉल्वेंट बी बहकर और धीरे-धीरे सॉल्वेंट ए को 100% तक बहते हुए एलसी-एमएस सिस्टम के कॉलम को कंडीशन करें।
    नोट: कॉलम टिप्स एक माइक्रोपिपेट खींचने वाले का उपयोग करके घर में तैयार किए गए थे और दबाव कोशिकाओं और हीलियम से भरे हुए थे।

8. फोरियर ट्रांसफॉर्म और आयन ट्रैप मास स्पेक्ट्रोमीटर से जुड़े एलसी सिस्टम के लिए एलसी-एमएस/एमएस डेटा अधिग्रहण और व्याख्या सॉफ्टवेयर पर एक विधि बनाना।

  1. एमएस विधि के लिए एक ट्यून फ़ाइल को संपादित करने के लिए ट्यून प्लस सॉफ्टवेयर खोलें।
    1. मेनू बार पर फ़ाइल से, एक प्रीइंस्टॉल्ट निगेटिव मोड ट्यून फाइल खोलें।
    2. मेनू बार पर स्कैनमोड का चयन करें, फिर स्कैन विंडो को परिभाषितकरें। आयन ट्रैप और एफटी दोनों के लिए एमएसएन को 1 करने के लिए माइक्रोस्कैन समय सेटिंग सेट करें।
    3. नैनो-ईएसआई स्रोत के लिए सेटिंग्स पर जाएं और स्प्रे वोल्टेज को 4 केवी पर सेट करें। इसे तब तक मिलाना जब तक कि एक स्वीकार्य इलेक्ट्रोस्प्रे उत्पन्न न हो; आमतौर पर, स्वीकार्य इलेक्ट्रोस्प्रे को 2-5 केवी की सीमा के भीतर प्राप्त किया जा सकता है।
    4. ट्यून फ़ाइल को सहेजें।
  2. उपकरण के डेटा अधिग्रहण और व्याख्या सॉफ्टवेयर के सेटअप जादूगर का उपयोग करके एक नई एलसी विधि उत्पन्न करें। ओपन रोडमैप > सीक्वेंस सेटअप > जादूगर। चूंकि इन तरीकों को कॉलम हीटर के उपयोग की आवश्यकता नहीं होती है, इसलिए अस्थायी नियंत्रण चरण को छोड़ दें।
    1. फ्लो रेडिएंट पंप विकल्प केतहत, मल्टीस्टेपका चयन करें । अगली विंडो में, 7 लाइनें डालें और प्रत्येक पंक्ति के लिए प्रवाह दर 0.1 mL·मिनट-1तक सेट करें। प्रत्येक पंक्ति के लिए निम्नलिखित मापदंडों को इनपुट करें: 0-3 मिनट से, 100% सॉल्वेंट ए वितरित करें; 3-9 मिनट से, 100% सॉल्वेंट ए से 20% सॉल्वेंट बी तक एक ढाल पेश करें; 9-19 मिनट से, 20% सॉल्वेंट बी से 100% सॉल्वेंट बी तक एक नया ढाल पेश करें; 19-27 मिनट से, 100% सॉल्वेंट बी पर पकड़; 27-28 मिनट से, ढाल को 100% सॉल्वेंट ए में वापस सेट करें; 28-44 मिनट से, 100% सॉल्वेंट ए पर पकड़ करके बाद के रन के लिए कॉलम की कुल्ला और पुनर्संटन शामिल करें। एलसी उपयोग में नहीं होने पर सॉल्वेंट के संरक्षण के लिए रन पूरा होने पर प्रवाह दर को 0.03mL·मिनट-1 तक कम करने के लिए एक अंतिम चरण शामिल करें।
    2. अधिग्रहण विकल्प के रूप में पंप दबाव > पारखी विकल्पों के लिए डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स लागू करें और डिफ़ॉल्ट अधिग्रहण समय का उपयोग करें और डिफ़ॉल्ट पंप दबाव विकल्पों का उपयोग करें।
  3. इंस्ट्रूमेंट सेटअप विंडो पर साइडबार से ऑर्बिटरैप वेलोस प्रो एमएस आइकन का चयन करके एमएस/एमएस विधि बनाएं ।
    1. डेटा निर्भर एमएस/एमएस > नई विधिपर क्लिक करें । एलसी रन (यानी, 44 मिनट), सेगमेंट से 1 और स्कैन इवेंट्स की लंबाई के लिए समय प्राप्त करें। ट्यून फ़ाइल के लिए, चरण 8.1 से संपादित फ़ाइल का चयन करें।
      नोट: पहली घटना फोरियर ट्रांसफॉर्म एमएस (एफटीएमएस) का उपयोग करके एक MS1 अग्रदूत स्कैन है। सफल 10 घटनाओं MS2 विखंडन के लिए प्रत्येक अग्रदूत स्कैन में 10 सबसे तीव्र और अद्वितीय आयनों का चयन MS2 स्कैन किया जाएगा ।
    2. इवेंट 1 के लिए, स्कैन विवरण सेट एनालाइजर के तहत एफटीएमएस और ध्रुवीयता को नकारात्मक। एमएसएन सेटिंग्स के तहत, छोटे अणुओं को पकड़ने के लिए 30,000 के संकल्प और 35 वी सेट स्कैन पर्वतमाला की सामान्यीकृत टक्कर ऊर्जा को 50 मीटर/जेड और अंतिम द्रव्यमान के लिए 1800 मीटर/जेड का उपयोग करें।
    3. 11 के माध्यम से 2 घटनाओं के लिए, स्कैन विवरण सेट एनालाइजर के तहत आयन ट्रैपके लिए । डिपेंडेंट स्कैन का चयन करें और ग्लोबल > डायनेमिक अपवर्जन > सेटिंग्स पर क्लिक करें और सक्षमचुनें; निकटता में दोहराने स्कैन को खत्म करने के लिए एक 30 एस दोहराने की अवधि और १२० एस अपवर्जन अवधि निर्धारित करें ।
    4. स्कैन इवेंट सेटिंग्स पर जाएं और सभी MS2 घटनाओं (2 से 11) के लिए स्कैन इवेंट से 1 तक मास निर्धारित सेट करें। शीर्ष 10 सबसे तीव्र आयनों के लिए स्कैन करने के लिए, प्रत्येक MS2 स्कैन घटना सेटकरने के लिए 1 से 10वीं तक एक nवें सबसे तीव्र आयन का पता लगाने के लिए । इसलिए, 2 का पता लगाने के लिए एनवें मोस्ट इंटेंस आयन, इवेंट 3 के रूप में 1 का पता लगाने के लिए इवेंट 2 सेट करें।
    5. सेटअप विंडो बंद करें और फाइल > सेव ए जैसे [Method_Name].meth पर जाएं।
      नोट: एलसी इंस्ट्रूमेंट और मास स्पेक्ट्रोमीटर के सामान्य उपयोग, रखरखाव और अंशांकन के लिए, निर्माता द्वारा आपूर्ति किए गए ऑपरेटिंग निर्देशों और मैनुअल को संदर्भित करता है।

9. एक रन अनुक्रम की स्थापना और एलसी-एमएस/एमएस रन शुरू ।

  1. एलसी-एमएस/एमएस सिस्टम के डेटा अधिग्रहण और व्याख्या सॉफ्टवेयर का उपयोग करके एक रन अनुक्रम स्थापित करें। आरoadmap > अनुक्रम सेटअप केभीतर, नमूने के रूप में कई पंक्तियों के रूप में डालने के लिए मेज पर सही क्लिक करें । प्रत्येक पंक्ति के लिए, 5 माइक्रोन के लिए Inj Vol और ऑटोसंप्लर ट्रे पर शीशी के संबंधित स्थिति के लिए स्थिति निर्धारित करें । इनपुट फ़ाइल नाम के रूप में नमूना नाम और चलाने के परिणामों के लिए वांछित फ़ाइल पथ निर्धारित करते हैं।
    नोट: सॉल्वेंट ए युक्त खाली शीशियों को अनुक्रम की शुरुआत में और कॉलम को खंगालने के लिए ट्रिपलिकेट नमूनों (समय अंकों का प्रत्येक सेट) के प्रत्येक सेट के बीच चलाया जा सकता है।
  2. रन शुरू करने के लिए, अनुक्रम में सभी फ़ाइल नामों को हाइलाइट करें। मेनू बार से, रन सीक्वेंस > एक्शन > ठीक करें।

10. फाइलों को मजबूत करना और MZmine 2.53 पर अस्थायी एनोटेशन की खोज करना।

  1. MZmine खोलें और चरण 9.1 से '.raw' आउटपुट फ़ाइलों का आयात करें। मेनू बार से, कच्चे डेटा आयात > कच्चे डेटा विधियों काचयन करें । नमूनों के अनुरूप फाइलों का चयन करें।
  2. MS1 और MS2 स्कैन के बीच भेद चोटियों की एक सूची का निर्माण। मेनू बार से, रॉ डेटा तरीकों > फीचर डिटेक्शन > एमएस/एमएस पीकलिस्ट बिल्डर। प्रासंगिक सेटिंग्स में 0.01 तक m/z विंडो सेट और रन की लंबाई के लिए टाइम विंडो सेट शामिल है। सेट फिल्टर के तहत, ध्रुवीयता के रूप में नकारात्मक का चयन करें और स्पेक्ट्रम प्रकारके रूप में सेंट्रोइड।
  3. मेनू बार से, फीचर सूची के तरीकों > सुविधा का पता लगाने > पीक एक्सपेंडिचरपर जाएं । 0.005 मीटर/जेड या 10 पीपीएम और न्यूनतम ऊंचाई 1E3 करने के लिए m/z सहिष्णुता सेट करें। यह कदम पूरी तरह से मांसल-बाहर चोटियों का निर्माण करेगा।
  4. डुप्लीकेट चोटियों को हटा दें। डुप्लिकेट पीक फ़िल्टर > फ़िल्टरिंग > फीचर सूची विधियों परवापस जाएं। प्रासंगिक सेटिंग्स में 0.005 मीटर/जेड या 10 पीपीएम और आरटी सहिष्णुता सेट से 5 मिनट तक सेट करने के लिए m/z सहिष्णुता सेट शामिल हैं।
  5. समान डेटा फ़ाइलों (यानी, ट्रिपलिकेट प्रतिक्रियाओं के बीच चोटियों को संरेखित करने के लिए), सामान्यीकरण > सामान्यीकरण > प्रतिधारण समय अंशांकन के लिए सुविधा सूची विधियों परवापस जाएं। एक साथ नमूनों को संसाधित करना सुनिश्चित करें और खाली छोड़ दें। प्रासंगिक सेटिंग्स में 0.005 मीटर/जेड या 10 पीपीएम, आरटी टॉलरेंस सेट टू 3 मिनट निरपेक्ष (न्यूनतम) और न्यूनतम मानक तीव्रता सेट से 1E3 तक सेट करने के लिए सेट m/z सहिष्णुता शामिल है।
  6. सभी फाइलों से एम/जेड और एलाइनमेंट > संरेखण से अवधारण समय द्वारा सभी फाइलों से चोटियों को संरेखित करें > रैंसैक एलाइनर। 0.005 मीटर/ जेड या 10 पीपीएम, आरटी सहिष्णुता और आरटी सहिष्णुता के बाद क्रमशः 44 और 39 मिनट तक सुधार, 1एएसी पुनरावृत्तियों को 0, न्यूनतम अंकों की संख्या 10% और सीमा मूल्य को 1 निर्धारित करें। विकल्प पर टिक करने के लिए समान चार्ज स्टेट की आवश्यकता होतीहै ।
  7. सुविधा सूची के तरीकों में पूर्व चरणों में खोए हुए किसी भी डेटा पॉइंट के लिए सही > गैप फिलिंग > पीक फाइंडर। प्रासंगिक सेटिंग्स में तीव्रता सहिष्णुता 50% तक सेट, एम/जेड सहिष्णुता 0.005 मीटर/जेड या 10 पीपीएम तक सेट, और आरटी सहिष्णुता 3 मिनट के लिए सेट शामिल हैं। आरटी सुधार सक्षम करें।

11. 13सी-लेबल ग्लूकोज-व्युत्पन्न मेटाबोलाइट्स के नकारात्मक मोड जनता की गणना और फ़िल्टर डेटा में इन विश्लेषणों की एम/जेड सुविधाओं की खोज।

  1. लक्षित खोज के लिए ग्लूकोज मेटाबोलिज्म से 13सी-लेबल मेटाबोलाइट्स की जनता की गणना करें।
    1. यौगिक के आणविक सूत्र में परमाणुओं की संख्या और प्रत्येक तत्व20के मोनोआइसोटोपिक द्रव्यमान से प्रत्येक लक्ष्य यौगिक के मोनोआइसोटोपिक द्रव्यमान की गणना करें ।
    2. मोनोआइसोटोपिक द्रव्यमान से 1 प्रोटॉन (1.007276 डीए) के द्रव्यमान को घटाकर यौगिक के नकारात्मक मोड द्रव्यमान [एम-एच] की गणना करें। आयनीकरण के दौरान अणुओं को हाइड्रोजन आयन से छीन लिए जाने के बाद नकारात्मक मोड एमएस डिटेक्शन द्वारा यह द्रव्यमान का पता लगाया जाता है।
    3. नकारात्मक मोड द्रव्यमान से, 13सी-शामिल मेटाबोलाइट के द्रव्यमान की गणना करें। यहां, आइसोटोपोलोग्स की जनता जो ग्लूकोज-व्युत्पन्न 13सी-लेबल को अधिकतम रूप से शामिल करती है।
  2. MZmine परिणामों से एम/जेड सुविधाओं को खोजने और एनोटेट करने के लिए 13सी-लेबल मेटाबोलाइट्स की गणना की गई जनता का उपयोग करें। प्रत्येक संभावित हिट के लिए, निम्नलिखित समीकरण का उपयोग करके बड़े पैमाने पर त्रुटि (पीपीएम) की गणना करें:
    Equation 1
    नोट: <15 पीपीएम मास त्रुटि के साथ प्रायोगिक एम/जेड मानों वर्तमान विश्लेषण में ख्यात एनोटेशन के रूप में माना जाता था ।
  3. एनोटेशन की पुष्टि करने के लिए गुणवत्ता ब्राउज़र पर ख्यात एनोटेशन के स्पेक्ट्रा को मैन्युअल रूप से देखें।
    1. ओपन रोडमैप > Qual ब्राउज़र। टूल बार से, प्रत्येक नमूने के कच्चे एमएस डेटा आयात करने के लिए कच्ची फ़ाइल खोलें।
    2. एक बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रम (नीचे पैनल) को देखने के लिए कुल आयन क्रोमाटोग्राम (शीर्ष पैनल) पर प्रतिधारण समय (यानी, ख्यात एनोटेशन के अनुरूप) की वांछित सीमा के तहत एक लाइन बनाएं। स्पेक्ट्रम पर सही क्लिक करें और जनता की एक श्रृंखला इनपुट है कि लक्ष्य विश्लेषण के m/z शामिल है । जांच करें कि ख्यात एनोटेशन में अलग-अलग पीक सिग्नल होते हैं जो शोर(पूरक चित्रा 2)से सराहनीय रूप से ऊपर हैं।
  4. औसत पीक क्षेत्रों और जैविक प्रतिकृति के मानक त्रुटियों की गणना प्रत्येक बार बिंदु के लिए। ग्लूकोज चयापचय में प्रवृत्तियों का निरीक्षण करने के लिए डेटा (यानी, एक बार ग्राफ पर) की कल्पना करें।

Representative Results

ग्लूकोज से आम किण्वन उत्पादों के लाइसेट-आधारित सेल-मुक्त संश्लेषण की मात्रा निर्धारित करने के लिए, 2xYPTG मीडिया में उगाए गए उपभेदों से प्राप्त लाइसेट को प्राथमिक कार्बन स्रोत8के रूप में 100 माइक्रोन मिलियन ग्लूकोज खिलाया गया था। प्रोटीन एसिडिफिकेशन द्वारा 24 घंटे के समय के पाठ्यक्रम पर प्रतिक्रियाओं को रोक दिया गया था। ग्लूकोज कैटाबोलिज्म से उत्पादित पायरुवेट, संक्षेप, लैक्टेट, फोर्टमेट, एसीटेट और इथेनॉल युक्त फ़िल्टर किए गए सुपरनेटेंट को एक एचपीएलसी सिस्टम के ऑटोसंप्लर मॉड्यूल पर लोड किया गया था जो एक आरआईड मॉड्यूल से लैस था। 1.17 माइक्रोन पर किण्वित अंत उत्पादों और ग्लूकोज के फ़िल्टर मिश्रण के साथ शीशियां, 2.34 माइक्रोन, 4.69 माइक्रोन, 9.38 माइक्रोन, 18.75 माइक्रोन, 37.50 माइक्रोन, 75 माइक्रोन, और S30 बफर में 150 माइक्रोन सांद्रता मानकों के रूप में साधन पर लोड किए गए थे। एनालाइट्स को एचपीएलसी कॉलम से रिड तक इस्कोक्रेटिक रूप से सुनियोजित किया गया था। 1 से 150 माइक्रोन रेंज के भीतर ग्लूकोज, संक्षेप, लैक्टेट, फोरमेट, एसीटेट और इथेनॉल के लिए चोटियों को आरआईड द्वारा हल किया जा सकता है। ग्लूकोज के लिए पीक क्षेत्रों समय पाठ्यक्रम और मानक वक्र नमूनों के लिए RID डेटा से मैनुअल एकीकरण द्वारा प्राप्त किए गए थे । संक्षेप, लैक्टेट, फोर्ट, एसीटेट और इथेनॉल के लिए निकाले गए पीक क्षेत्रों को स्वचालित रूप से एकीकृत संकेतों से लिया गया था। सभी मानक घटता (पीक क्षेत्र बनाम ज्ञात एकाग्रता) आर2 मूल्यों >०.९९ था और यहां इस्तेमाल की गई सांद्रता की सीमा के दौरान रैखिक थे ।

सभी लक्षित विश्लेषण के लिए मोलर सांद्रता की गणना उनके संबंधित मानक घटता से की गई थी। ग्लूकोज प्रतिक्रिया के पहले 3 घंटे के भीतर भस्म हो गया था और मुख्य रूप से लैक्टेट(चित्रा 2A,बी)के लिए किण्वित । इथेनॉल संचय भी प्रतिक्रिया के पहले 3 घंटे के भीतर काफी हुआ और उसके बाद बंद कर दिया(चित्रा 2C)। 3 घंटे के बाद महत्वपूर्ण ग्लूकोज की खपत के साथ महत्वपूर्ण लैक्टेट और इथेनॉल उत्पादन का अवलोकन अभूतपूर्व नहीं था क्योंकि लैक्टेट और इथेनॉल उत्पादन रास्ते ग्लाइटोलिसिस (चित्रा 1) के माध्यम से निरंतर ग्लूकोज खपत के लिए आवश्यक ग्लाइटोलिटिक एनएचएच से 1 शुद्ध मोल एनएडी + के पुनर्जनन की अनुमतिदेते हैं। लैक्टेट और इथेनॉल को इस प्रकार लिसेट-आधारित सेल-मुक्त ग्लूकोज मेटाबोलिज्म में प्रमुख किण्वन अंत-उत्पादों के रूप में माना जा सकता है। एसीटेट शुरू में S30 बफर के एक घटक के रूप में प्रतिक्रियाओं में मौजूद था और अप्रत्याशित रूप से केवल 6 घंटे के बाद चयापचय के कारण जमा हो गया था जब ग्लूकोज की खपत धीमी हो गई थी(चित्रा 2 डी)। इस परिणाम से पता चलता है कि एसीटेट किण्वन जरूरी पहले के समय बिंदुओं में तेजी से ग्लाइसोलिटिक फ्लक्स को सक्षम नहीं करता है। इस बीच, फोरमेट और संक्षेप को मामूली किण्वन उत्पादों(चित्रा 2E,एफ)के रूप में संश्लेषित किया गया था। कुल मिलाकर, विधि ने ई. कोलाई S30 lysates में चीनी सब्सट्रेट की कमी और किण्वित उत्पाद गठन के पूर्ण मात्राकरण को सक्षम किया।

ग्लूकोज मेटाबोलिज्म को प्रोफाइल करने के लिए एमएस डिटेक्शन विशेष रूप से यहां लागू किया गया था। 2xYPTG मीडिया में उगाए गए उपभेदों से प्राप्त Lysates को कार्बन स्रोत के रूप में 13सी6-ग्लूकोज खिलाया गया था। CFME प्रतिक्रियाओं 0 घंटे, 1 घंटे, 2 घंटे, और 3 घंटे के लिए ट्रिपलेट में चला रहे थे । प्रत्येक समय बिंदु से नमूने एक एलसी सिस्टम पर लोड किए गए थे जो एक उत्क्रमित चरण कॉलम से लैस थे और फोरियर ट्रांसफॉर्म और आयन ट्रैप मास स्पेक्ट्रोमीटर के साथ मिलकर। कार्बनिक एसिड, चीनी फॉस्फेट और अमीनो एसिड का विश्लेषण करने के लिए नकारात्मक आयन मोड स्पेक्ट्रा प्राप्त और संसाधित किया गया था। केंद्रीय कार्बन चयापचय से संबंधित 13सी-लेबल प्रजातियों की गणना सैद्धांतिक जनता को विशेष रूप से ग्लूकोज-व्युत्पन्न यौगिकों की पहचान करने के लिए खोजा गया था । उपयोग किए गए स्रोत तनाव खेती की स्थिति और ई कोलाई CFME में सक्रिय रास्तों की पिछली रिपोर्टों के आधार पर, यहां यह माना जाता है कि lysate प्रोटेम में एक मेटाबोलिक नेटवर्क शामिल है जो ग्लूकोज को ग्लाइकोलिटिक किण्वन, पेंटोज फास्फेट मार्ग और संभवतः अमीनो एसिड एनाबोलिज्म5,6,7,8,14 (चित्रा 1)में खिलाताहै। इसलिए, खोज इन रास्तों के सदस्यों तक संकुचित हो गई थी, जिनमें से ग्लूकोज-व्युत्पन्न 13सी लेबल को शामिल करने वाले 16 मेटाबोलाइट्स स्पष्ट रूप से एनोटेट(पूरक तालिका 1)थे।

13 सी6- ग्लूकोज ग्लाइकोलिसिस के माध्यम से देखा गया था, जैसा कि ग्लाइकोलिटिक इंटरमीडिएट बहुतायत(चित्रा 3 ए-ई)मेंउतार-चढ़ावका सबूतहै। एचपीएलसी-आरआईडी डेटा के अनुरूप, ग्लूकोज 13सी3-लैक्टेट में जमा हुआ और प्रतिक्रिया के पहले 3 घंटे के भीतर 13सी3-संक्षेप में भी किण्वित किया गया था(चित्रा 4A,बी)। 13सी3-संक्षेप आइसोटोपोलोग का गठन लिसेट ग्लूकोज मेटाबोलिज्म(चित्रा 1)के प्रस्तावित मॉडल का समर्थन करता है, जहां 3-कार्बन फॉस्फोरेनोलिरुवेट (पीईपी) अणु के कार्बोक्सिलेशन द्वारा उत्पन्न होने की संभावना है, न कि 2-कार्बन एसिटिल-सीओए अणु के प्रवेश से टीसीए चक्र के लिए। टीसीए चक्र की सक्रियता को पिछले सीएफएमई अध्ययनों में ग्रहण किया गया है, लेकिन टीसीए के अन्य 13सी-लेबल वाले मध्यवर्ती का यहां8,19,21का पता नहीं लगाया गया था। 13 सी3-एस्पार्टेट संश्लेषण हालांकि पहले एच के भीतर हुआ और इसका सेवन किया गया, इस विचार को मजबूत किया गया कि पीईपी सीधे ऑक्सलोसिटेट(चित्र 1, चित्रा 6C)में परिवर्तित हो जाता है। यह डेटा ग्लूकोज से भरपूर मीडिया (2xYPTG) पर किण्वित वृद्धि के दौरान काटे गए स्रोत उपभेदों से एक lysate प्रोटेम को प्रतिबिंबित करता है। इसका मतलब यह होगा कि बाकी टीसीए एंजाइम संक्षेप उत्पादन में भाग नहीं ले रहे हैं, जो ऑक्सीडेटिव टीसीए शाखा(चित्रा 1) बनाते हैं। हालांकि, इस मार्ग में किसी भी मेटाबोलाइट्स का पता नहीं लगाया गया था, संभवतः क्योंकि ग्लूटामेट की उच्च सांद्रता ने सीएफएमई प्रतिक्रिया में जोड़ा क्योंकि नमक प्रतिबेशन इस शाखा की प्रगति को रोकता है।

एचपीएलसी-आरआईडी डेटा को अतिरिक्त रूप से 3 एच रिएक्शन टाइमफ्रेम के भीतर 13सी2-एसीटेट डिटेक्शन की कमी से पूरित किया गया है, जिसमें ग्लूकोज से एसीटेट का 3 घंटे(चित्रा 2 बी)तक कोई निर्माण नहीं करने का सुझाव दिया गया है। हालांकि, एसीटाइल,एसिटिल-फॉस्फेट (एसीटाइल-पी) संचित का सीधा अग्रदूत, यह सुझाव देता है कि एसीटाइल-सीओए से एसीटेट संश्लेषण के लिए पीटीए-एक्का मार्ग की पीटीए शाखा सक्रिय है(चित्रा 4C,डी)। Acka 13सी2के dephosphorylation उत्प्रेरित-एसीटाइल-पी से 13सी2-एसीटेटकी संभावना इस समय सीमा के भीतर नहीं होती है क्योंकि एसीटेट प्रतिक्रियाओं में उपयोग किए जाने वाले S30 बफर का एक प्रमुख घटक है(चित्रा 1, चित्रा 2B)।

13सी6-ग्लूकोजसे व्युत्पन्न कार्बन से चीनी फॉस्फेट 6-फॉस्फोग्लूकोनोलेक्टोन (6PGL), 6-फॉस्फोग्लूकोनेट (6PG), रिबुलोस-5-फॉस्फेट (Ru5P), और सेडोहेप्टुलोज-7-फॉस्फेट (S7P) का समावेश भी(चित्रा 5)मनाया गया । ये परिणाम लाइसेट ग्लूकोज मेटाबोलिज्म में पेंटोज फॉस्फेट पाथवे की भागीदारी की पुष्टि करते हैं और संभावना 13सी9-टायरोसिन संश्लेषण को खिलाते हैं, जिसे प्रोटेओमिक अध्ययन द्वारा पहले सुझाया गया है, जबकि 13सी5-हिस्टीडीन उत्पादन(चित्रा 6 ए,बी)7के लिए एक अग्रदूत भी प्रदान करता है। लेबल फेनिलैनीन और ट्रिप्टोफान यहां नहीं मनाया गया, और न ही अधिकांश आवश्यक अमीनो एसिड थे। हालांकि, यह पूरी तरह से आश्चर्य की बात नहीं है क्योंकि अमीनो एसिड एनाबोलिज्म पोषक तत्वों से वंचित स्थितियों में या स्थिर चरण7,22में उगाई गई कोशिकाओं से प्राप्त lysates में समृद्ध होने की संभावना है। इसके अलावा, इस प्रकार अब तक के आंकड़ों से पता चलता है कि ग्लाइकोलिसिस और किण्वन के मध्यवर्ती को कोफैक्टर पुनर्जनन अंत प्रतिक्रियाओं की ओर फनल कर रहे हैं, जो ग्लाइसेरल्डिहाइड-3-फॉस्फेट, पायरुवेट, और एसिटिल-सीओए (यानी, ग्लाइसिन, सिस्टीन, सेरीन, एलेनिन, वायलाइन, ल्यूसिन, और लाइसिन)(चित्र 1)से प्राप्त कई अमीनो एसिड के संश्लेषण को रोकना होगा। जैसा कि उल्लेख किया गया है, पहले घंटे के भीतर 13सी-एस्पार्टेटका उत्पादन किया गया था, जबकि एस्पार्टेट ने 13 सी-शामिल अमीनो एसिड (यानी,थ्रेनिन, आइसोल्यूसिन, मेथिओनिन और शतावरी) को संभवतः नहीं देखा गया क्योंकि ग्लूकोज-व्युत्पन्न एस्पार्टेट किण्वन(चित्र 1, चित्रा 6C)में भाग लेता है। अंत में, ग्लूटामेट से प्राप्त लेबल ग्लूटामेट और अमीनो एसिड की ओर प्रवाह प्रतिक्रिया वातावरण(चित्रा 1)में ग्लूटामेट के उच्च स्तर से बाधित हो सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: ई. कोलाई BL21DE3-स्टार से प्राप्त लिसेट का एक ख्यात मेटाबोलिक मॉडल उच्च ग्लूकोज सांद्रता में तेजी से बढ़ रहा है । ग्लाइकोलिसिस (ग्रीन), पेंटोज फॉस्फेट पाथवे (डार्क ऑरेंज), और एसिटिल-सीओए से किण्वित मार्ग (नीला) के मध्यवर्ती और अंत-उत्पादों को लाइसेट-आधारित सीएफएमई में सूचित किया गया है। संक्षेप किण्वन की उपस्थिति ऑक्सीडेटिव टीसीए शाखा (ग्रे) की सक्रियता का तात्पर्य है। lysates में अमीनो एसिड एनाबोलिज्म (सोना) अच्छी तरह से परिभाषित नहीं है और यहां जांच की जाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2:ई कोलाई क्रूड अर्क के साथ तैयार सीएफएमई प्रतिक्रियाओं में ग्लूकोज की खपत और किण्वित एंड-प्रोडक्ट संश्लेषण के लिए एचपीएलसी-रीड डेटा। ( ए) ग्लूकोज की खपत और(बी)लैक्टेट,(सी)इथेनॉल,(डी)एसीटेट,(ई)फोरमेट, और(एफ)CFME प्रतिक्रियाओं में संक्षेप उत्पादन 24 घंटे से अधिक निगरानी की गई । मानक घटता के साथ निर्धारित औसत एमएम सांद्रता और त्रुटि सलाखों (एसई) प्रस्तुत कर रहे हैं (एन = 3)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: ई. कोलाई lysate CFME में 13सी6-ग्लूकोज और 13सी लेबल ग्लाइकोलिटिक इंटरमीडिएट के समय पाठ्यक्रम रुझान। (A) 13सी6-ग्लूकोज,(बी) 13सी 6 -ग्लूकोज-6-फॉस्फेट/फ्रक्टोज-6-फॉस्फेट, ( C) 13C6-फ्रक्टोज-1,6-बिस्फोस्फेट,(डी) 13सी3 -ग्लाइसेरल्डिहाइड-3-फॉस्फेट/डिहाइड्रोक्सियासेटोनफॉस्फेट, और(ई) 13सी6 -3 घंटे से अधिक CFME प्रतिक्रियाओं में pyruvate । MzMine सॉफ्टवेयर द्वारा निकाले गए कच्चे पीक क्षेत्रों का उपयोग सकारात्मक एनोटेशन (एन = 3) के लिए औसत और त्रुटि सलाखों (एसई) की गणना करने के लिए किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: ई. कोलाई lysate CFME में 13सी6-ग्लूकोज किण्वन में मध्यवर्ती और अंत उत्पादों के समय पाठ्यक्रम रुझान। 13 सी 3-लैक्टेट,(बी) 13सी3-संक्षेप,(सी) 13सी2-एसिटिल-फॉस्फेट, और(डी) 13सी2-एसिटिल-सीओए CFME प्रतिक्रियाओं में 3 घंटे से अधिक । MzMine सॉफ्टवेयर द्वारा निकाले गए कच्चे पीक क्षेत्रों का उपयोग सकारात्मक एनोटेशन (एन = 3) के लिए औसत और त्रुटि सलाखों (एसई) की गणना करने के लिए किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: ई. कोलाई lysate CFME में 13सी6-ग्लूकोज व्युत्पन्न पेंटोज फॉस्फेट पाथवे इंटरमीडिएट के समय पाठ्यक्रम रुझान। (ए) 13सी 6-6-फॉस्फोग्लूकोनोलेक्टोन,(बी) 13 सी 6-6-फॉस्फोग्लूकोनेट,(सी) 13सी 5-रिबुलोस-5-फॉस्फेट, और(डी) 13सी7-सेडोहेप्टुलोस-7-फॉस्फेट3 एच से अधिक । MzMine सॉफ्टवेयर द्वारा निकाले गए कच्चे पीक क्षेत्रों का उपयोग सकारात्मक एनोटेशन (एन = 3) के लिए औसत और त्रुटि सलाखों (एसई) की गणना करने के लिए किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: ई. कोलाई lysate CFME में पता चला 13सी6-ग्लूकोज प्राप्त अमीनो एसिड के समय पाठ्यक्रम प्रवृत्तियों । (ए) 13सी9-टायरोसाइन,(बी) 13सी5-हिस्टिडीन, और(सी) 13सी3-3 -3 घंटे से अधिक aspartate की सापेक्ष बहुतायत । MzMine सॉफ्टवेयर द्वारा निकाले गए कच्चे पीक क्षेत्रों का उपयोग सकारात्मक एनोटेशन (एन = 3) के लिए औसत और त्रुटि सलाखों (एसई) की गणना करने के लिए किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक चित्रा 1:प्रतिनिधि एचपीएलसी-रिड क्रोमेटोग्राम 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक CFME प्रतिक्रिया में प्रमुख किण्वित उत्पादों के लिए चोटियों दिखा। ग्लूकोज, संक्षेप, लैक्टेट, फोर्टमेट, एसीटेट और इथेनॉल चोटियों को 5 एमएम सल्फ्यूरिक एसिड सॉल्वेंट के साथ आइसोक्रेटिक एल्यूशन के दौरान एचपीएलसी कॉलम पर उनके प्रतिधारण समय से पर्याप्त रूप से अलग किया जाता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक चित्रा 2:13C-लेबल वाले मेटाबोलाइट्स के लिए प्रतिनिधि जन स्पेक्ट्रा, विशेष रूप से (ए) लैक्टेट, (बी) ग्लूकोज, और (सी) 6-फॉस्फोग्लूकोनेट (6PG) एक CFME प्रतिक्रिया में 1 घंटे के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटेड । कृपया इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक तालिका 1:पता लगाया 13सी लेबल मेटाबोलाइट्स की सूची, प्रतिधारण समय (MZmine का उपयोग कर नमूनों भर में गठबंधन), सैद्धांतिक पूरी तरह से 13सी लेबल नकारात्मक मोड m/z मान, पता चला सुविधाओं के m/z मूल्यों, और बड़े पैमाने पर त्रुटियों की गणना की । कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

उल्लिखित एचपीएलसी-आरआईड दृष्टिकोण का उपयोग समय के साथ lysate केंद्रीय चयापचय के प्रमुख कार्बनिक एसिड और अल्कोहल उत्पादों के लिए चीनी सब्सट्रेट खपत और बाद में रूपांतरणों को सफलतापूर्वक निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, यह प्रोटोकॉल एक मोबाइल चरण का उपयोग करके एक सरल आइसोक्रेटिक विधि को नियोजित करता है, न्यूनतम नमूना तैयारी की आवश्यकता होती है, और एक सरल लक्षित डाउनस्ट्रीम विश्लेषण की अनुमति देता है। एचपीएलसी-आरआईड विधि द्वारा मापा गया विश्लेषण पूरी तरह से उनके प्रतिधारण समय से प्रतिष्ठित होता है, और इसलिए चयनित कॉलम राल के साथ उनकी बातचीत होती है। यहां उपयोग किए गए एचपीएलसी कॉलम को विशेष रूप से आकार-अपवर्जन और लिगांड एक्सचेंज (यानी आयन-मॉडरेट विभाजन क्रोमेटोग्राफी) के संयोजन से कार्बोहाइड्रेट, कार्बनिक एसिड और अल्कोहल को अलग करने के लिए डिज़ाइन किया गया था। इसलिए वर्णित विधि कार्बोहाइड्रेट सब्सट्रेट्स के अधिक लक्षित विश्लेषण के लिए उपयोगी है और ग्लूकोज किण्वन मार्गों के अंतिम उत्पादों का चयन करती है जो मुख्य रूप से lysate आधारित जैव परिवर्तन8,15,21को सुविधाजनक और सक्रिय करने की उम्मीद है। हालांकि, इस प्रोटोकॉल में सेल अर्क में अन्य मेटाबोलिक रास्तों की सक्रियता का हिसाब नहीं है। अन्य क्रोमेटोग्राफिक पृथक्करण तकनीकों (यानी हाइड्रोफिलिक इंटरैक्शन क्रोमेटोग्राफी), ग्रेडिएंट एल्यूशन विधियों, अधिक जटिल नमूना तैयारी (यानी, व्युत्पन्न) को नियोजित करने वाली पाइपलाइनों और विभिन्न ऑप्टिकल डिटेक्टरों (जैसे, पराबैंगनी प्रकाश या वाष्पीकरण प्रकाश बिखरने वाले डिटेक्टर) का उपयोग अमीनो एसिड और चीनी फॉस्फेट23,24 जैसे अन्य मेटाबोलाइट्स का पता लगाने के लिए किया जा सकताहै। . वैकल्पिक रूप से, एलसी-एमएस/एमएस का उपयोग करके lysate चयापचय का अध्ययन करने के लिए एक वैश्विक दृष्टिकोण लिया जा सकता है ।

वर्णित एलसी-एमएस/एमएस विधि मेटाबोलाइट्स की एक व्यापक श्रृंखला को मापने और पहचानने के लिए एक एकल कार्यप्रवाह है । एलसी-एमएस/एमएस मेटाबोलोम प्रोफाइलिंग के लिए एक अत्याधुनिक विश्लेषणात्मक उपकरण है क्योंकि इसकी संवेदनशीलता और उच्च संकल्प16के साथ प्रतिधारण समय और एम/जेड अनुपात द्वारा मेटाबोलाइट्स को अलग करने की क्षमता है । केंद्रीय कार्बन मेटाबोलिक रास्तों और अमीनो एसिड एनाबोलिज्म पर ध्यान केंद्रित करने के साथ, विशेष रूप से ध्रुवीय कार्बनिक एसिड, चीनी फॉस्फेट और अमीनो एसिड का पता लगाने के लिए नकारात्मक मोड एमएस/एमएस लागू किया गया था । नैनो-लिक्विड क्रोमेटोग्राफी तकनीक के साथ मिलकर, विधि जटिल lysate पृष्ठभूमि17में छोटे अणुओं का पता लगाने के लिए उच्च संवेदनशीलता प्रदान करती है। प्रोफाइलिंग लिस् ट-आधारित सीएफएम मेटाबोलिज्म के संदर्भ में, हालांकि, वर्णित एलसी-एमएस/एमएस प्रोटोकॉल की एक सीमा 50 मीटर/जेड की कम पहचान सीमा है, जो इथेनॉल के माप को पहले से ही निर्धारित करती है, जो ग्लूकोज चयापचय में एक प्रमुख उत्पाद है, साथ ही साथ साथी, जो अन्यथा विस्तृत एचपीएलसी-रीड विधि द्वारा आसानी से निर्धारित किया जाता है। एलसी-एमएस/एमएस की तुलना में एचपीएलसी-आरआईड को लागत और कठिनाई के मामले में सापेक्ष पहुंच का अतिरिक्त लाभ है । बाद के बिंदु पर, यहां वर्णित एलसी-एमएस/एमएस विधि का निवारण करने के लिए बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री में विशेषज्ञता के कुछ डिग्री की आवश्यकता हो सकती है । फिर भी, एमएस डिटेक्शन में आरआईड पर विशिष्ट रूप से आकर्षक अनुप्रयोग हैं क्योंकि यह मेटाबोलोम में लेबल किए गए आइसोटोप को अलग कर सकता है, जो जटिल मेटाबोलिक नेटवर्क18के माध्यम से पूरक सब्सट्रेट्स से कार्बन आंदोलन को समझने के लिए एक उत्कृष्ट तकनीक है। इस तरह के एक दृष्टिकोण 13सी6-ग्लूकोजके साथ प्रतिक्रियाओं के पूरक और डाउनस्ट्रीम 13सी के सापेक्ष बहुतायत मूल्यों का विश्लेषण करके यहां लागू किया गया था चयापचय को शामिल । विश्लेषण ने सक्रिय और निष्क्रिय रास्तों की परिभाषा की अनुमति दी, पहले रिपोर्ट की गई मान्यताओं का समर्थन किया और lysates में मेटाबोलिक प्रवाह के बारे में नई अंतर्दृष्टि प्रदान की। विशिष्ट विश्लेषणों के लिए विधि के भीतर भी संशोधन किए जा सकते हैं। उदाहरण के लिए, समय के साथ ग्लूकोज-व्युत्पन्न अणुओं के पूर्ण मात्रात्मक माप प्राप्त करने और प्रवाह वितरण के बारे में निष्कर्ष निकालने के लिए नमूनों के साथ 13सी-लेबल लक्ष्य यौगिकों के मानक समाधानों का विश्लेषण किया जा सकता है। सकारात्मक चार्ज किए गए यौगिकों का बेहतर पता लगाना सकारात्मक मोड डिटेक्शन के लिए समायोजित .meth फ़ाइलों के साथ दृश्यों को चलाकर वर्तमान कार्यप्रवाह के भीतर भी सक्षम किया जा सकता है।

दोनों वर्णित तरीकों में विश्लेषणात्मक नमूना आसानी से स्वचालित है, उच्च प्रजनन क्षमता सुनिश्चित करता है। इसके अलावा, जब तक उचित उपकरण हैंडलिंग प्रथाओं और रखरखाव का अवलोकन किया जाता है, तब तक चिकनी विश्लेषणात्मक रन की उम्मीद की जा सकती है। CFME प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण करने के लिए इन उपकरणों का उपयोग करते समय, नमूने के ऊपर और डाउनस्ट्रीम अधिक महत्वपूर्ण विचार किए जाने चाहिए। नमूना तैयारी के दौरान, यह महत्वपूर्ण है कि समय-पाठ्यक्रम नियंत्रण समय-शून्य के प्रतिनिधि हैं। यहां मेटाबॉलिक प्रतिक्रियाओं को रोकने के लिए एसिडिफिकेशन द्वारा प्रोटीन को lysates में उपजी थी । समय-शून्य नमूनों के लिए, एसिड सॉल्वेंट को ग्लूकोज युक्त प्रतिक्रिया मिश्रण जोड़ने से पहले lysate के साथ जोड़ा गया था। ट्राइक्लोरोएसेटिक एसिड के साथ एसिडिफिकेशन ने प्रभावी रूप से यह सुनिश्चित किया कि ग्लूकोज को समय-शून्य पर मेटाबोलाइज्ड नहीं किया जाता है, जैसा कि एचपीएलसी-रिड डेटा(चित्रा 2)में दिखाया गया है। जबकि ग्लूकोज चयापचय बुझाने के लिए एक समान प्रक्रिया रिपोर्ट एलसी-एमएस/एमएस विश्लेषण में किया गया था, 13सी लेबल मेटाबोलाइट्स समय शून्य नमूनों में पाया गया, हालांकि काफी कम बहुतायत मूल्यों पर बाद में समय बिंदुओं पर निकाले गए नमूनों के सापेक्ष । इसके अलावा, ये टिप्पणियां ग्लाितोलिसिस के मध्यवर्ती तक सीमित थीं। आंकड़ों से पता चलता है कि प्रतिक्रियाएं इस अत्यधिक संवेदनशील विधि द्वारा पता लगाए जाने वाले निष्कर्षण विलायक के साथ एसिडिफिकेशन के बाद ग्लायॉलिटिक गतिविधि के कुछ डिग्री बनाए रखती हैं। हालांकि, इस गतिविधि की सीमा को निर्धारित किया जाना चाहिए । पिछले अध्ययन में बताया गया था कि अम्लीय निष्कर्षण सॉल्वैंट्स मध्यवर्ती ग्लाइकोलिटिक प्रतिक्रियाओं को पर्याप्त रूप से नहीं बुझा सकते हैं, लेकिन ग्लूकोज की महत्वपूर्ण खपत10को रोक सकते हैं। हालांकि यह आगे यहां इस्तेमाल प्रणाली में जांच की जा रही है, समय के बीच सापेक्ष बहुतायत मूल्यों में भारी परिवर्तन-शूंय और बाद में समय बिंदु नमूनों ग्लूकोज चयापचय में प्रवृत्तियों के रूप में व्याख्या की जा सकती है । हालांकि, वैकल्पिक शमन विधियों की खोज, विशेष रूप से मेटाबोलिक मध्यवर्ती10की पूर्ण मात्रा प्राप्त करने के लिए समान अनुप्रयोगों में अनुशंसित है। इसके अलावा, डाउनस्ट्रीम सॉफ्टवेयर विश्लेषण के दौरान अच्छी प्रथाओं को भी देखा जाना चाहिए। मानवीय त्रुटि को कम करने के लिए रिड संकेतों से पीक क्षेत्रों को मैन्युअल रूप से एकीकृत करने पर निरंतरता जरूरी है। जब भी नमूनों में मेटाबोलाइट सांद्रता की मात्रा निर्धारित करने के लिए मैन्युअल रूप से एकीकृत शिखर क्षेत्रों का उपयोग किया जा रहा हो तो मानकों के चरम क्षेत्रों पर मैन्युअल एकीकरण भी लागू किया जाना चाहिए । लक्षित एलसी-एमएस/एमएस विश्लेषण के दौरान, MZmine विश्लेषण से अनंतिम एनोटेशन एक एमएस गुणवत्ता ब्राउज़र का उपयोग कर मैनुअल पीक जांच द्वारा मांय किया जाना चाहिए, और m/z सुविधाओं को केवल एनोटेट किया जाना चाहिए जब गणना की गई सामूहिक त्रुटियां स्वीकार्य हों । यहां, इन विश्लेषणों को लक्ष्यों के सीमित सेट के लिए मैन्युअल रूप से किया गया था क्योंकि आइसोटोप खोज के लिए व्यापक और मजबूत सॉफ्टवेयर अभी तक स्थापित नहीं हुआ है। हालांकि, 13सी लेबल वाले मेटाबोलाइट्स की खोज के लिए इस तरह के स्वचालित तरीके वर्तमान में उभर रहे हैं और अधिक जटिल विश्लेषणों को भी सुव्यवस्थित करेंगे, जैसे केंद्रीय कार्बन मेटाबोलिज्म25से परे प्रोफाइलिंग लाइक्स।

जटिल मेटाबोलिक मिश्रण में छोटे अणुओं को अलग करने के लिए उन्नत तरल क्रोमेटोग्राफी एक मजबूत और व्यापक रूप से लागू विधिहै। वर्णित तरीके इस पृथक्करण तकनीक को रिफ्रएक्टिव इंडेक्स या मास स्पेक्ट्रोमेट्रिक डिटेक्शन के साथ सफलतापूर्वक लिसेट-आधारित CFME प्रतिक्रियाओं में मेटाबोलाइट रूपांतरणों का विश्लेषण करने के लिए जोड़े गए हैं। एचपीएलसी-आरआईड और एलसी-एमएस/एमएस सक्रिय रूप से चयापचय की प्रोफाइलिंग के लिए व्यक्तिगत रूप से शक्तिशाली उपकरण हैं, और प्रत्येक तकनीक की अंतर्निहित सीमाओं को संबोधित करने के लिए उनकी पूरकता का और लाभ उठाया जा सकता है । रिपोर्ट किए गए तरीके सीएफएमई के अनुप्रयोग और विकास को सक्षम करते हैं क्योंकि उनका उपयोग मेटाबोलिज्म को समझने, लक्षित मेटाबोलाइट रूपांतरणों में सुधार की निगरानी करने और लिसेट मेटाबोलिज्म में हेरफेर करते समय मेटाबॉलिक फ्लक्स में परिवर्तन को स्पष्ट करने के लिए किया जा सकता है।

Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई ज्ञात प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों या हितों के अंय संघर्ष है ।

Acknowledgments

इस शोध को जीनोमिक साइंस प्रोग्राम, अमेरिका के ऊर्जा विभाग, विज्ञान, जैविक और पर्यावरण अनुसंधान कार्यालय द्वारा प्रायोजित किया गया था, संयंत्र माइक्रोब इंटरफेस साइंटिफिक फोकस एरिया (http://pmi.ornl.gov) के हिस्से के रूप में । ओक रिज राष्ट्रीय प्रयोगशाला यूटी-बटेल, एलएलसी द्वारा अनुबंध DE-AC05-00OR22725 के तहत अमेरिकी ऊर्जा विभाग के लिए प्रबंधित किया जाता है । इस पांडुलिपि को यूटी-बटेले, एलएलसी द्वारा अनुबंध DE-AC05-00OR22725 के तहत अमेरिकी ऊर्जा विभाग के साथ लिखा गया है । संयुक्त राज्य अमेरिका की सरकार बरकरार रखती है और प्रकाशक, प्रकाशन के लिए लेख स्वीकार करके, स्वीकार करते है कि संयुक्त राज्य अमेरिका सरकार एक गैर-समावेशी, भुगतान अप, अटल, दुनिया भर में इस पांडुलिपि के प्रकाशित रूप को प्रकाशित या पुन: पेश करने के लिए लाइसेंस बरकरार रखती है, या दूसरों को ऐसा करने की अनुमति, संयुक्त राज्य अमेरिका सरकार के प्रयोजनों के लिए । ऊर्जा विभाग डीओई सार्वजनिक पहुंच योजना (http://energy.gov/downloads/doe-public-access-plan) के अनुसार संघीय प्रायोजित अनुसंधान के इन परिणामों तक सार्वजनिक पहुंच प्रदान करेगा ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 μm centrifuge tube filters (spin columns) Corning Costar 8160
1.5 mL microcentrifuge tubes VWR 87003-294
1260 Infinity Binary LC Pump Agilent G1312B HPLC-RID system
1260 Infinity High Performance Degasser Agilent G4225A HPLC-RID system
1260 Infinity Refractive Index Detector Agilent G7162A HPLC-RID system
1260 Infinity Standard Autosampler Agilent G1329B HPLC-RID system
13C6-glucose Sigma-Aldrich 389374 CFME reaction mix component (LC-MS/MS)
500 mL 0.20 μm pore (PES membrane) filter VWR 10040-436
Acetonitrile (LC/MS grade) Fisher Scientific A955 Solvent preparation for LC-MS/MS
Adenosine triphosphate Sigma-Aldrich A7699 CFME reaction mix component
Aminex HPX 87-H column Bio-rad 1250140 Chromatography column for HPLC-RID
Ammonium acetate (LC/MS grade) Fisher Scientific A11450 Solvent preparation for LC-MS/MS
Ammonium glutamate Sigma-Aldrich G1376 CFME reaction mix component
Autosampler vial caps (yellow, snap) Thermo Scientific C4011-50Y Sample storage/delivery for LC-MS/MS
Autosampler vials (0.30 mL, polypropylene) Wheaton W225181 Sample storage/delivery for LC-MS/MS
Benchtop microcentrifuge Fisher Scientific 13-100-675
Bis-Tris Sigma-Aldrich B9754 CFME reaction mix component
Coenzyme A (CoA) Sigma-Aldrich C4282 CFME reaction mix component
D-dextrose (Glucose) VWR BDH9230 CFME reaction mix component
Dipotassium phosphate Sigma-Aldrich P8281 CFME reaction mix component
Ethanol Fisher Scientific BP2818100 Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID)
Formic acid (LC/MS grade) Thermo Scientific 85178 Solvent preparation for LC-MS/MS
Fused silica (internal diameter of 100 μm, external diameter of 375 μm) Polymicro Technologies WM22005-ND Chromatography column for LC-MS/MS
Glacial acetic acid Sigma-Aldrich A6283 S30 buffer ingredient
Isopropanol (LC/MS grade) Fisher Scientific A461 Solvent preparation for LC-MS/MS
Kinetex 5 μm C18 stationary phase (100 Å) Phenomenex N/A; special order Chromatography column for LC-MS/MS
LTQ Orbitrap Velos Pro Mass Spectrometer ThermoFisher Scientific N/A; special order Mass spectrometer for LC-MS/MS
Magnesium acetate Sigma-Aldrich M5661 S30 buffer ingredient
Magnesium glutamate Sigma-Aldrich 49605 CFME reaction mix component
Methanol (LC/MS grade) Fisher Scientific A456 Solvent preparation for LC-MS/MS
NAD+ Sigma-Aldrich N0632 CFME reaction mix component
Nanospray Ionization Source ThermoFisher Scientific/Proxeon ES071 (newest model) Mass spectrometer for LC-MS/MS
OpenLab CDS (Online) Software Agilent Version 2.15.26 Chromatography Data System for acquiring and analyzing HPLC data
Orbitrap Velos Pro LTQ Tune Plus Software Thermo Version 2.7 Software for tuning the LC-MS/MS system
Potassium acetate Sigma-Aldrich P1190 S30 buffer ingredient
Potassium glutamate Sigma-Aldrich G1501 CFME reaction mix component
Refrigerated centrifuge Eppendorf 5415 C
Screw caps (with septa, 9 mm) Supelco 29315-U Sample storage/delivery for HPLC-RID
Screwthread glass vials (2 mL) Supelco 29376-U Sample storage/delivery for HPLC-RID
Sodium acetate Sigma-Aldrich 241245 Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID)
Sodium formate Sigma-Aldrich 247596 Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID)
Sodium lactate Sigma-Aldrich 71716 Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID)
Succinic acid Sigma-Aldrich 398055 Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID)
Sulfuric acid Sigma-Aldrich 258105 Solvent preparation for HPLC-RID
Trichloroacetic acid Sigma-Aldrich T6399
Tris-acetate GoldBio T-090-100 S30 buffer ingredient
Ultimate 3000 LC with autosampler Dionex Solvent Rack: SRD-3600 Liquid chromatography system for LC-MS/MS analysis
Ultimate 3000 LC with autosampler Dionex Rapid Separation Binary Pump: HPG-3400RS Liquid chromatography system for LC-MS/MS analysis
Ultimate 3000 LC with autosampler Dionex Rapid Separation Well Plate Autosampler: WPS-3000TRS Liquid chromatography system for LC-MS/MS analysis
Water (LC/MS grade) Fisher Scientific W6500 Solvent preparation for LC-MS/MS
Xcalibur Software Thermo Version 3.0.63 Data acquisition and interpretation software for LC-MS/MS

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References

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बायोइंजीनियरिंग अंक 175
लिक्विड क्रोमेटोग्राफी लिसेट-आधारित सेल-फ्री सिस्टम्स में मेटाबोलाइट प्रोफाइलिंग के लिए अपवर्तक इंडेक्स या मास स्पेक्ट्रोमेट्रिक डिटेक्शन के साथ मिलकर
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Dinglasan, J. L. N., Reeves, D. T.,… More

Dinglasan, J. L. N., Reeves, D. T., Hettich, R. L., Doktycz, M. J. Liquid Chromatography Coupled to Refractive Index or Mass Spectrometric Detection for Metabolite Profiling in Lysate-based Cell-free Systems. J. Vis. Exp. (175), e62852, doi:10.3791/62852 (2021).

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