Summary
최근 진행에도 불구하고 많은 효모 미토콘드리아 단백질은 여전히 완전히 알려지지 않은 기능으로 남아 있습니다. 이 프로토콜은 분자 기능의 해명에 대한 기본이었던 단백질의 제출국국화를 결정하는 간단하고 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다.
Abstract
효모 미토콘드리아 프로테오메의 특성화에 있는 최근 어드밴스에 있는 진보에도 불구하고, 단백질의 상당수의 제출국국화는 애매하게 남아 있습니다. 여기서, 우리는 미토콘드리아 단백질 기능 용해화 동안 근본적인 단계로 간주되는 효모 미토콘드리아 단백질의 소구체국화를 결정하는 강력하고 효과적인 방법을 설명합니다. 이 방법은 고도로 순수한 그대로미토콘드리아를 얻는 것으로 구성된 초기 단계를 포함한다. 이러한 미토콘드리아 제제는 단백질제 K(protease)를 사용하여 저혈압(swelling) 및 배양으로 구성된 서브배율 프로토콜을 받게 된다. 붓기 동안, 외부 미토콘드리아 막은 선택적으로 중단되어 단백질Ae K가 막 간 공간 구획의 단백질을 소화할 수 있게 합니다. 병행하여 막 단백질의 토폴로지에 대한 정보를 얻기 위해 미토콘드리아 제제는 처음에는 초음파 처리된 다음 탄산나트륨을 사용하여 알칼리성 추출을 실시한다. 마지막으로, 원심 분리 후, 이러한 다른 치료법에서 펠릿과 상피 분획은 SDS-PAGE 및 서부 블롯에 의해 분석됩니다. 관심 있는 단백질의 막 토폴로지뿐만 아니라 제출된 국소화는 서양 블롯 프로파일을 알려진 표준과 비교하여 얻어진다.
Introduction
미토콘드리아는 생체 에너지, 세포 대사 및 신호 경로1에서 중요한 역할을 하는 진핵 세포의 필수 세포입니다. 이러한 작업을 제대로 실행하기 위해 미토콘드리아는 구조와 기능을 담당하는 독특한 단백질과 지질 세트에 의존합니다. 신진 효모 사카로미세스 cerevisiae 널리 미토콘드리아 프로세스에 대한 조사를위한 모델 시스템으로 사용되었습니다, 뿐만 아니라 다른 세포기관2. 효모에 있는 단지 8개의 단백질을 위한 미토콘드리아 게놈 코드; 미토콘드리아 단백질의 대다수 (~99%)는 세포성 리보솜에서 번역되는 핵 유전자에 의해 인코딩되고, 그 후에 정교한 단백질 수입 기계에 의해 그들의 정확한 제출된 제출으로 수입됩니다3,4,5. 따라서, 미토콘드리아 생물발생은 핵과 미토콘드리아 게놈 6,7의 조정된 발현에 의존한다6,7. 미토콘드리아 생물 발생에 결함을 일으키는 유전 돌연변이는 인간 질병8,9,10과 연관됩니다.
지난 2년간 고정화 미토콘드리아를 대상으로 한 고처리량 프로테오믹 연구는 효모 미토콘드리아 프로테오메의 포괄적인 특성화를 초래했으며, 이는 적어도 900단백질11,12,13,14로 구성된 것으로 추정되고 있다. 이러한 연구는 귀중한 정보를 제공했지만, 4개의 미토콘드리아 하위 구획, 즉 외부 막(OM), 막 간 공간(IMS), 내부 막(IM) 및 매트릭스에서 각 단백질의 소구체화가 여전히 요구된다. 이 질문은 부분적으로 두 개의 작은 미토콘드리아 하위 구획의 프로테오믹 전체 연구로 해결되었다 (OM 및 IMS)15,16. 최근에는 Vögtle과 협력자들은 효모에서 고품질의 글로벌 프로포톤드 단백질 분포지도를 생성하여 큰 진전을 이루었습니다. 저자는 SILAC 기반 정량 질량 분광법, 상이한 제출 분별 프로토콜 및 OM 및 IMS 프로테옴의 데이터 세트를 결합한 통합 된 접근 방식을 사용하여 818 단백질을 4 개의 미토콘드리아 하위 구획13에 할당했습니다.
이러한 높은 처리량 프로테오믹 연구에 의해 달성 된 진보에도 불구하고, 제출 프로테오메 조성에 대한 우리의 지식은 완료되지 않습니다. 실제로, Vögtle및 협력자가 효모 미토콘드리아로 국소화되는 것으로 보고된 986개의 단백질 중, 168개는 4개의 제출된 제출된 구획13에서 할당될 수 없었습니다. 더욱이, 저자는 미토콘드리아 막의 주변에 말초로 부착될 것으로 예상되었던 단백질의 막 토폴로지에 관하여 정보를 제공하지 않았다. 예를 들어, 내막에 말초로 부착된 단백질이 매트릭스 또는 막 간 공간을 향하고 있는지 알 수 없다. 프로테오메 전체 연구에서 이러한 누락 된 데이터 외에도, 미토콘드리아 단백질의 상당수의 suborganellar 국소화에 대 한 충돌 하는 정보가 있다. 한 가지 예는 Saccharomyces 게놈 데이터베이스 (SGD) 및 Uniprot와 같은 일반적인 데이터베이스에 있는 막 간 공간 단백질로 할당된 protease Prd1입니다. 놀랍게도, 여기에 설명된 것과 유사한 과절 프로토콜을 사용하여 Vögtle 및 협력자들은 Prd1이 정품 매트릭스 protein13임을 분명히 보여주었습니다. 위에서 언급했듯이, 많은 미토콘드리아 단백질의 제출국국화는 해명되거나 재평가될 필요가 있다. 여기서, 우리는 효모 미토콘드리아 단백질의 소독제 국소화를 결정하기 위하여 간단하고 신뢰할 수 있는 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜은 다양한 연구 그룹에 의해 개발되고 최적화되었으며 많은 미토콘드리아 단백질의 막 토폴로지뿐만 아니라 제출국소화를 결정하는 데 일상적으로 사용되었습니다.
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Protocol
1. 효모 세포의 성장
- -80°C 글리세롤 스톡으로부터 세포의 작은 부분을 YPD(효모 추출물 1%, 펩톤 2%, 포도당 2% 포도당)에 적신시켜 관심의 단일 콜로니를 분리한다. 플레이트를 30°C에서 2-3일 동안 배양한다.
참고: 이 프로토콜에 사용되는 S. 세레비시아에 균주는 BY4741(MATα; his3Δ1; leu2Δ0; met15Δ0; ura3Δ0). 보조 영양 마커 유전자를 제외하고,이 균주는 삭제 된 유전자를 포함하지 않으며 플라스미드를 수행하지 않습니다. 따라서, 그것은 성공적으로 활발한 세포 성장을 자극, 풍부한 매체에서 재배 될 수있다. 플라스미드로 변형된 균주로 작업할 때 플라스미드 선택을 위해 적절한 최소 배지를 사용합니다. - YPGal 배지의 10-20 mL에서 YPD 한천 플레이트에서 2-3 개의 개별 콜로니를 접종하여 스타터 문화를 준비 (1% 효모 추출물, 2 % 펩톤, 2 % 갈락토세) 100 mL Erlenmeyer 플라스크에서. 30°C에서 24시간 동안 활발한 흔들림으로 배양합니다.
참고: 성장 배지의 선택은 프로토콜에 사용되는 효모 변형에 따라 달라집니다. YPD와 YPGal은 모두 미토콘드리아 호흡을 수행하지 않는 균주의 성장을 허용하는 발효 탄소 원을 함유하고 있습니다. 그러나, 포도당은 많은 미토콘드리아 유전자의 발현을 억압하기 때문에, 미토콘드리아의 더 적은 양을 생성하기 때문에 이 탄소 원을 사용하는 것이 좋습니다. 호흡할 수 있는 호흡기 유능한 균주와 함께 작업할 때, 미토콘드리아의 더 높은 수율을 얻기 위해 글리세롤과 에탄올과 같은 탄소원을 사용할 수도 있다. - 스타터 문화를 신선한 YPGal 배지 1L로 희석하여 OD600 미만으로 0.1 이내로 희석합니다. OD600이 1-1.5에 도달할 때까지 활발한 흔들림으로 30 °C에서 세포를 경작시다.
참고: 실험을 수행하기 전에 각 효모 변형에 대한 성장률(두 배 시간)을 결정합니다. 이것은 문화권이 1-1.5의 OD600 에 도달하는 데 필요한 배양 시간의 정확한 추정을 제공합니다.
2. 고도로 정제된 미토콘드리아의 격리
참고: 이 프로토콜은 17에서 약간 수정되어 조정됩니다.
- 실온에서 5 분 동안 3,000 x g 에서 원심 분리로 세포를 수확하십시오.
- 증류수로 세포를 씻고 실온에서 5 분 동안 3,000 x g 에서 원심 분리로 수집하십시오.
- 세포의 젖은 무게를 결정합니다.
참고: 2.2단계에서 세포 펠릿의 중량을 측정하는 가장 쉬운 방법은 세포 수집 직전에 빈 원심분리기 튜브의 무게를 결정하는 것입니다. 원심 분리 후, 상체를 버리고 세포와 동일한 튜브의 무게를 측정합니다. 셀의 무게는 두 측정간의 차이입니다. - 파스퇴르 파이펫 또는 P5000 팁을 사용하여 DTT 버퍼(셀 1g당 2mL)에서 세포를 다시 중단합니다. DDT 버퍼 컴포지션의 표 1 을 참조하십시오.
- 부드러운 흔들림 (~70 rpm)으로 20분 동안 30°C에서 세포를 배양합니다.
- 심열기는 3,000 x g 에서 실온에서 5 분 동안 세포를 펠렛합니다.
- 효소없이 Zymolyase 버퍼로 세포를 씻으면 (세포 1 g당 약 7 mL).
Zymolyase 버퍼 컴포지션의 표 1 을 참조하십시오. - 심열기는 3,000 x g 에서 실온에서 5 분 동안 세포를 펠렛합니다.
- Zymolyase없이 버퍼에서 세포를 다시 일시 중지 (세포의 1 g 당 7 mL).
- 셀 서스펜션을 250mL 에렌마이어 플라스크로 옮기고 Zymolyase-20T(젖은 체중 당 3 mg)를 추가합니다.
- 30°C에서 30-40분 동안 부드러운 흔들림(~70rpm)으로 세포를 배양합니다. Zymolyase 치료 전후에 세포 현탁액의 탁도를 비교하여이 과정의 효율성을 확인하십시오.
참고: 이 단계에서 세포는 Zymolyase에 의한 세포 벽 소화로 인해 구형으로 변환됩니다.- 이를 위해 각 셀 서스펜션의 50 μL을 2mL의 물을 포함하는 별도의 유리 튜브에 추가하십시오. 적극적으로 혼합 한 후, Zymolyase로 치료 된 세포 현탁액의 탁도는 구엽세포의 삼투질 중단으로 인해 급격히 감소해야합니다. 한편, 비처리된 세포 현탁액의 탁도는 변하지 않아야 한다.
참고: 탁도의 효과는 간단한 육안 검사또는 두 샘플의 OD600 을 측정하여 모니터링할 수도 있습니다. 두 번째 경우, Zymolyase 처리 된 샘플의 OD600 은 비 처리 된 샘플의 10 %-20 %여야합니다. 대체 방법은 가벼운 현미경 검사를 사용하여 두 샘플모두에서 세포를 계산하는 것을 포함한다. - 구엽세포 형성의 수율이 낮으면 Zymolyase를 더 추가하고 추가 로 15 분 간격으로 인큐베이션하십시오.
- 이를 위해 각 셀 서스펜션의 50 μL을 2mL의 물을 포함하는 별도의 유리 튜브에 추가하십시오. 적극적으로 혼합 한 후, Zymolyase로 치료 된 세포 현탁액의 탁도는 구엽세포의 삼투질 중단으로 인해 급격히 감소해야합니다. 한편, 비처리된 세포 현탁액의 탁도는 변하지 않아야 한다.
- 4°C에서 5분 동안 2500 x g 에서 원심분리로 구형성형을 수확하십시오.
참고: 모든 추가 단계는 가수분해 효소에 의한 단백질 분해를 피하기 위해 얼음또는 4°C에서 빠르고 빠르게 수행되어야 합니다. - 스푸퍼러스트에 얼음-차가운 균질화 버퍼(세포 1g당 약 6.5mL)와 펠릿을 4°C에서 5분 동안 2,500xg에서 원심 분리하여 세척합니다. 균질화 버퍼 컴포지션의 표 1을 참조하십시오.
- 얼음 차가운 균질화 완충제(세포 1g당 6.5mL)로 구형 세포를 다시 중단하고 미리 냉각된 유리 두스균제로 옮긴다. 약 30mL의 대형 유리 균질화제를 사용하십시오.
- 유봉을 사용하여 15 스트로크로 구획을 균질화합니다.
참고: 유봉 피팅에 따라 스트로크 수를 조정해야 합니다. 단단한 유봉의 경우 15 스트로크가 충분합니다. 다른 한편으로는, 느슨한 유봉을 사용하는 경우, 최대 수행 하는 것이 좋습니다 25 스트로크. - 균류를 50mL 원심분리기 튜브로 옮기고 1부의 얼음-차가운 균질화 버퍼를 추가합니다.
- 원심분리기는 저속으로 균동화, 4°C에서 5분 동안 1,500 x g 의 핵, 세포 이물질 및 끊어지지 않은 세포를 환원한다.
- 펠릿을 방해하지 않도록 주의를 기울이는 파스퇴르 파이펫 또는 P5000 팁을 사용하여 새로운 50mL 원심분리기 튜브로 상체를 전송합니다.
- 4°C에서 5분 동안 4,000 x g 의 원심분리기.
- 상체를 고속 원심분리기 튜브로 옮기고, 원심분리기는 4°C에서 15분 동안 12,000 x g 에서 원심분리기를 전달하여 조잡한 미토콘드리아 분획을 펠렛합니다.
- P5000 팁을 사용하여 부드러운 파이펫팅으로 20-30mL 얼음-차가운 균질화 버퍼에서 상체를 버리고 원유 미토콘드리아 펠릿을 부드럽게 세척합니다.
- 현탁액을 50mL 원심분리기 튜브및 원심분리기로 4,000 x g 에서 4°C에서 5분 동안 나머지 세포 이물질을 펠렛으로 옮긴다.
- 상체를 고속 원심분리기 튜브로 옮기고, 원심분리기는 4°C에서 15분 동안 12,000 x g 에서 원심분리기를 전달하여 조잡한 미토콘드리아 분획을 펠렛합니다.
- P1000 팁을 사용하여 부드러운 파이펫팅을 통해 상체를 버리고 소량(일반적으로 1000 μL)의 얼음-차가운 SEM 버퍼로 원유 미토콘드리아 펠릿을 부드럽게 재놓습니다. SEM 버퍼 컴포지션의 표 1 을 참조하십시오.
참고: 이 조미토콘드리아 분획 은 organello 단백질 수입 분석과 같은 일부 응용 분야에서 직접 사용할 수 있지만, 그것은 다른 세포 성분의 상당한 양을 포함. 이러한 오염은 단백질의 제출 국소화를 결정할 때 결과의 오해로 이어질 수 있습니다. 따라서, 아래에 설명된 바와 같이, 고도로 정제된 미토콘드리아 제제를 얻기 위해서는 추가 정화 단계가 요구된다. - 60%, 32%, 23%, 15%(w/v)의 농도로 EM 버퍼에서 자당 솔루션을 준비합니다. 이러한 용액은 4°C에서 최대 1개월 동안 안정적입니다. EM 버퍼 컴포지션의 표 1 을 참조하십시오.
- 다음과 같이 초원심분리기 튜브에 4단계 자당 그라데이션을 준비하십시오: 원심분리기 튜브의 바닥에 60%(w/v)의 1.5mL을 놓습니다. 다음으로, 파이펫은 조심스럽게 단계별로: 32%, 1.5mL의 32%, 1.5mL, 15% 자당(w/v)의 1.5mL. 단계를 방해하지 않도록 주의하십시오.
- 자당 그라데이션 위에 조잡한 미토콘드리아 분획을 조심스럽게 적재합니다.
- 스윙 버킷 로터에서 4 °C에서 134,000 x g 에서 1 h의 원심 분리기.
- 60%/32% 자당 인터페이스에서 갈색 밴드로 표현되는 고도로 정제된 미토콘드리아 분획에 도달할 때까지 자당 용액을 조심스럽게 제거하십시오.
- P1000 컷 팁을 사용하여 정제 된 미토콘드리아를 복구하고 미리 냉각 된 고속 원심 분리 튜브에 넣습니다.
- 복구된 미토콘드리아를 5-10부의 얼음-차가운 SEM 버퍼로 희석시 희석시.
- 4°C에서 12,000 x g 에서 30분 동안 원심분리기.
- P1000 컷 팁을 사용하여 부드러운 파이펫팅으로 얼음 차가운 SEM 버퍼의 500 μL에서 순수한 미토콘드리아를 다시 중단합니다.
- 제조업체의 지시에 따라 브래드포드 절차를 사용하여 고도로 정제된 미토콘드리아 제제의 단백질 농도를 결정합니다. 단백질 농도를 10 mg의 단백질/mL로 조정하여 얼음-차가운 SEM 버퍼로 조정합니다.
참고: 아래에 설명된 제출된 분별 프로토콜의 경우, 갓 준비된 미토콘드리아를 사용하는 것이 좋습니다. 그러나, Vögtle 및 협력자는 미토콘드리아 의 손상성에 대한 상세한 품질 관리 분석을 수행하고 냉동 세포기관이 이 프로토콜13에도 사용될 수 있음을 보여주었다. 이를 위해, 40 μL의 알리쿼트를 만들고 액체 질소로 동결하십시오. -80 °C에 보관하십시오.
3. 제출[]
참고: 본 프로토콜은 reference18 로부터 조정되며 단백질제 K의 존재 또는 부재시 (1) 저혈압 부종, (2) 초음파 처리 후 탄산염 추출의 두 단계로 구성됩니다. 단백질 분해를 피하기 위해 얼음 또는 4°C에서 두 프로토콜의 모든 단계를 수행합니다.
- 단백질Ae K의 존재에 저혈압 붓기
- 고도로 정제된 미토콘드리아 40μL을 10 mg/mL(400 μg)에서 4개의 1.5mL 사전 냉각 라벨마이크로센티리슈지 튜브로 옮춥니다.
- 튜브 1과 2에 SEM 버퍼 360 μL을 추가합니다.
- 튜브 3및 4에 EM 버퍼 360 μL을 추가합니다.
- 튜브 2와 4에 단백질라제 K(10 mg/mL)의 4 μL을 추가합니다. 실수방지를 위해 표 2 에 나열된 파이펫팅 스키마를 사용합니다.
참고: 사용하기 직전에 10 mg/mL 의 단백질 제 K 용액을 물에 담근다. 실험에서 단백질Ae K의 최종 농도는 약 50-100 μg/mL이어야 한다. 자세한 내용은 토론 섹션을 참조하십시오. - 모든 튜브를 부드럽게 섞고 얼음에 30분 간 배양하고 가끔 섞어 주세요.
- 단백질Ae K 활동을 중지하는 모든 네 개의 튜브에 200 mM PMSF의 4 μL을 추가합니다.
주의: PMSF는 매우 독성이 있습니다. PMSF가 포함된 솔루션으로 작업할 때 장갑을 착용하십시오. - 4°C에서 30분 동안 20,000 x g 의 원심분리기.
- 상체를 수집하고 새로운 1.5 mL 미리 냉각 된 마이크로 원심 분리기 튜브로 전송합니다. 펠릿을 방해하지 않도록 주의하십시오.
참고: 펠릿은 추가 SDS-PAGE 및 서부 블롯 분석을 위해 샘플 버퍼에서 직접 재장매할 수 있습니다. 그러나, 단백질제 K의 흔적은 PMSF 치료 후에도 활성 상태로 유지될 수 있으며, 결국 펠릿이 SDS 함유 시료 완충액에 용해된 후 일부 단백질을 소화할 수 있다. 이러한 문제를 피하기 위해, 단백질Ae K는 아래에 설명된 바와 같이 트리클로로아세트산(TCA)을 가진 시료의 처리에 의해 완전히 비활성화될 수 있었다.
주의: TCA는 매우 독성이 있습니다. TCA가 포함된 솔루션으로 작업할 때 장갑을 착용하십시오. - 얼음-차가운 SEM 버퍼의 400 μL에서 3.1.8 단계에서 펠릿을 다시 중단합니다.
- 상체(3.1.8단계로부터)와 TCA를 사용하여 재중단된 펠릿(3.1.9단계)을 10%(w/v)의 최종 농도로 침전시한다.
- 얼음에 있는 모든 튜브를 10분 동안 배양합니다.
- 4°C에서 12,000 x g 에서 10분 동안 TCA 처리 된 샘플을 원심 분리합니다.
- 상체를 제거하고 200μL의 샘플 버퍼에서 펠릿을 다시 분리합니다.
참고: 브로모페놀 블루 pH 표시등이 산성 처리로 인해 노란색으로 변할 수 있습니다. 이 경우 파란색으로 변할 때까지 1 M Tris 베이스의 작은 알리쿼트(1-5 μL)를 추가합니다. - 모든 튜브에 200mM PMSF의 4 μL을 추가합니다.
- SDS-PAGE 및 서부 블롯에 의해 추가 분석될 때까지 모든 샘플을 -80°C에 저장합니다.
- 초음파 처리 및 탄산염 추출
참고 : 이 프로토콜에서 초음파 처리가 미토콘드리아 막의 파열을 일으키면 갓 준비된 미토콘드리아를 사용할 필요가 없습니다.- 10 mg/mL (2 mg 단백질)에서 고도로 정제 된 미토콘드리아 200 μL을 1.5 mL 미리 냉각 된 미세 센심 분리 튜브로 옮춥니다.
- 미토콘드리아를 얼음으로 차가운 SEM 버퍼로 1배 희석합니다.
- 얼음 에 3 x 30 초 동안 소닉 미토콘드리아. 작은 볼륨에 호환되는 초음파 처리기를 사용합니다.
- 원심분리기는 4°C에서 100,000 x g 에서 30분 동안 시료를 분리합니다.
- 상체를 수집하고 새로운 1.5 mL 사전 냉각 미세 원심 분리기 튜브로 전송합니다. 얼음 위에 보관하십시오. 이 샘플은 수용성 단백질 분수(S)라는 이름으로 명명됩니다.
- 얼음-차가운 SEM 버퍼의 400 μL에서 3.2.4 단계에서 펠릿을 다시 중단합니다.
- 3.2.6 단계에서 재부유 된 펠릿의 100 μL을 가져 와서 새로운 1.5 mL 미리 냉각 된 미세 원심 분리기 튜브로 옮춥니다. 얼음 위에 보관하십시오. 이 샘플은 제출입자 분수(SMP)로 명명됩니다.
- 나머지 300 μL을 3.2.6 단계에서 1배 에서 신선하게 준비된 탄산나트륨으로 희석시.
- 30분 동안 얼음 위에서 3.2.8단계에서 샘플을 배양합니다.
- 원심분리기는 4°C에서 100,000 x g 에서 30분 동안 시료를 분리합니다.
- 상체를 수집하고 새로운 1.5 mL 사전 냉각 미세 원심 분리기 튜브로 전송합니다. 얼음 위에 보관하십시오. 이 샘플은 탄산염 상수 분획(CS)으로 명명됩니다.
- 얼음-차가운 SEM 버퍼의 400 μL에서 3.2.10 단계에서 펠릿을 다시 중단합니다. 이 샘플은 탄산침분획(CP)으로 명명됩니다.
- TCA를 사용하여 모든 샘플(S, SMP, CS 및 CP)을 10%(w/v)의 최종 농도로 침전시합니다.
- 얼음에 있는 모든 튜브를 10분 동안 배양합니다.
- 4°C에서 12,000 x g 에서 10분 동안 TCA 처리 된 샘플을 원심 분리합니다.
- 상체를 제거하고 샘플 버퍼의 각 펠릿을 다시 분리합니다. 샘플 버퍼가 노란색이 되면 1 M Tris 베이스의 작은 알리쿼트(1-5 μL)를 추가하여 파란색으로 바뀝니다.
- 모든 튜브에 200mM PMSF의 1 μL을 추가합니다.
- SDS-PAGE 및 서부 블롯에 의해 추가 분석될 때까지 모든 샘플을 -80°C에 저장합니다.
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Representative Results
제출의 성공은 고도로 정제된 미토콘드리아를 얻는 것에 달려 있습니다. 이를 위해 효모 세포 용해 중에 세포세포의 손상성이 거의 완전히 보존되어 있는 것이 필수적입니다. 이는 세포벽의 효소 소화를 결합한 세포 용해 프로토콜을 이용하여 두스호균제를 사용하여 플라즈마 멤브레인의 물리적 중단을 통해 달성된다. 미토콘드리아 내용은 차동 원심분리에 의해 수집됩니다. 이러한 세포전 분획은 미토콘드리아 마커 단백질(도 1, 레인 2)의 높은 수준의 포르린(Por1)의 존재에 의해 확인된 바와 같이 농축된 미토콘드리아 분획을 산출한다. 그러나, 이것은 폐질 망상, 바쿨올, 사이토솔 및 내시경을 포함하여 그밖 세포 구획의 상당한 양을 포함하는 조잡한 미토콘드리아 분획입니다 (그림 1, 레인 2). 이러한 오염은 제출 단백질 국소화 실험과 같은 일부 응용 분야에서 유물을 도입할 수 있습니다. 이러한 오염의 양을 줄이기 위해, 조미토콘드리아 분획은 자당 밀도 그라데이션 원심분리에 더 정제된다. 이러한 추가 정제 단계는 다른 세포 구획에 대한 단백질 마커의 내용물이 현저한 감소에 의해 입증된 바와 같이 매우 순수한 미토콘드리아 분획을 생성한다(도 1, 레인 3).
단백질의 제출된 국소화를 결정하기 위하여는, 고도로 정제된 미토콘드리아는 그들의 하위 구획으로 더 분별됩니다 (그림 2A). 이 프로토콜은 저혈압 삼투충격에 의한 미토콘드리아를 미노플라스트로 변환하는 것을 포함한다. 이 과정에서, 그대로 미토콘드리아는 세포기관의 붓기의 결과로 저산소완충액에서 배양된다. 부종 동안, 외부 미토콘드리아 막은 삼투성 불균형에 의해 선택적으로 파열되고 막 간 공간 단백질 함량이 상퍼로 방출된다. 이 모든 절차는 단백질 제 K의 존재 또는 부재에서 수행됩니다. 외부 막 중단의 결과로, 프로테제는 막 간 공간 단백질 함량에 대한 액세스를 얻고 해당 단백질의 분해를 촉진합니다. 대조적으로, 미토콘드리아 매트릭스의 단백질 함량은 내부 미토콘드리아 막의 무결성으로 인해 프로테아제의 공격으로부터 보호됩니다. 이러한 치료 후, 상이한 시료의 단백질 함량은 SDS-PAGE 및 서부 블롯 분석에 의해 평가된다.
미토콘드리아를 삼투성 쇼크(swelling)에 의한 미토콘드리아를 미토플라스트로 효율적으로 변환하는 것은 용해성 막 간 공간 마커 단백질(예를 들어, 시토크롬 Cyt)의 (예를 들어, 시토크롬 Cyt)의 실종이라는 두 가지 방법으로 모니터링될 수 있다. b2) 상체 분획에서 수반되는 모양으로 미토플라스트로부터펠릿 분획(도 2B, 차선 3과 차선 7비교); (2) 미노플라스트에서만 단백질아제 K에 의해 막 간 공간(예를 들어, 스코이)을 향한 내부 막 마커 단백질의 선택적 분해(도 2B, 레인 4). 또한, 마커 Cyt의 보호. b2 및 미토콘드리아로부터펠릿 분수내의 단백질아제 K 분해에 대한 스코이는 외부 미토콘드리아 막의 무결성을 확인하는 데 사용된다(도 2B, 레인 2). 한편, 내측 미토콘드리아 막의 무결성은 단백질에 대한 α-KGD 매트릭스용용성 단백질 마커의 보호에 의해 확인된다(도 2B, 레인 4). 관심 있는 단백질의 제출 국소화를 결정하기 위해 서부 블롯 프로파일과 이러한 표준의 프로파일을 알려진 현지화와 비교하기만 하면 됩니다.
도 2B(Prx1)에 묘사된 단백질의 경우, 그것의 서쪽 얼룩 단면도는 이중 미토콘드리아 국소화를 가진 단백질을 나타낸다: 막 간 공간 및 매트릭스. 언뜻 보기에 분획 프로파일은 α-KGD와 유사하여 매트릭스 현지화를 나타냅니다. 그러나, mitoplasts의 상퍼에 그것의 존재는 또한 막 간 공간 지역화를 나타냅니다. 전술한 단백질 마커의 분획 프로파일은 미토콘드리아 제제의 무결성과 관련된 가능한 유물을 제거하고 Prx119의 이중 국소화를 확증한다.
미토콘드리아 막에 단백질의 토폴로지를 조사하기 위해 미토콘드리아는 초음파 처리와 탄산염 추출의 두 가지 추가 치료법(그림 3A)에 제출됩니다. 초음파 처리는 초상 분수로 용해성 단백질만 방출하지만, 탄산 나트륨을 가진 알칼리성 추출은 말초 막 관련 단백질13,20을 추가로 용해시킵니다. 두 치료 모두에서, 일체형 막 단백질은 펠릿 분획13에 남아 있다. 이러한 가정은 두 치료 모두에서 펠릿 및 상류 분획의 서쪽 얼룩 분석에 의해 확인된다 (그림 3B). 일체형 미토콘드리아 막 단백질(예를 들어, 포린 Por1)은 알칼리 가 탄산나트륨을 투여한 후에도 펠릿 분획에서 완전히 발견될 것으로 예상된다(도 3B, 차선 3 및 5). 한편, 용해성 매트릭스 단백질(예를 들어, α-KGD)은 두 치료법 모두에서 완전히 용해될 것으로 예상된다(도 3B, 차선 2 및 4). 초음파 처리에서 펠릿에서 α-KGD의 상당한 보존(도 3B, 레인 3, SMP 분획)은 초음파 처리 파라미터의 약간의 변화로 인해 초음파 처리 입자의 형성에 영향을 줄 수 있으며, 이는 극심분리에 의해 효율적으로 퇴적된다. 알려진 용해도 프로파일을 가진 이 단백질의 행동은 그 때 관심있는 단백질의 미토콘드리아 용해도를 결정하기 위하여 이용됩니다. Prx1의 경우, 그것의 서쪽 얼룩 단면도는 막 주변과 관련되었던 단백질의 암시및 알칼리성 처리는 그것의 용해화를 유도합니다 (도 3B, 레인 4).
그림 1: 고도로 정제된 미토콘드리아의 격리. 총 용해 분획(1차선), 조미토콘드리아 분획(차선 2) 및 고도로 정제된 미토콘드리아 분획(차선 3)의 서부 얼룩 분석. 분획은 12% 폴리아크릴아미드 젤에 SDS-PAGE에 의해 분리되었고, 니트로셀룰로오스로 이송되고 겔의 오른쪽에 설명된 바와 같이 뚜렷한 세포 구획에 대한 마커에 대해 제기된 항체로 조사되었다. 이 그림은 참조19에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 프로페아제 K.(A) 제출분별 분별 프로토콜의 존재시 저혈압 팽윤에 의한 분획 프로토콜을 제출한다. 고도로 정제된 미토콘드리아는 단백질아제 K의 존재(+) 또는 부재(-)에서 이소토닉 또는 저혈압 치료(swelling)를 별도로 받습니다. 치료 후, 단백질효소 K의 활성은 PMSF의 첨가에 의해 억제되고, 미토콘드리아 및 미토플라스트는 원심분리에 의해 회수된다. 결과 펠릿 및 상피 분획에서 단백질 함량은 TCA에 의해 침전된 다음 SDS-PAGE 및 서부 블롯에 의해 분석됩니다. 색상 구체는 수용성 막 간 공간 단백질(녹색), 막 간 공간(분홍색)을 직면하는 내막 단백질, 수용성 매트릭스 단백질(라이트 블루)에 대한 제출단백질 마커를 나타냅니다. (B) 제출된 분획 프로토콜에서 펠릿 및 상류 분획의 서쪽 얼룩 분석. 분획은 12% 폴리아크릴라미드 젤에 SDS-PAGE에 의해 분리되었고, 니트로셀룰로오스로 옮겨져 A에 묘사된 바와 같이 뚜렷한 제출칸에 대한 마커에 대하여 제기된 항체로 조사되었다. 자세한 내용은 텍스트를 참조하십시오. 이 수치는 19에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 초음파 처리 및 탄산염 추출에 의한 제출된 분획 프로토콜. (A) 미토콘드리아 단백질의 용해도 및 막 토폴로지를 결정하는 데 사용되는 프로토콜의 회로도 표현. 미토콘드리아는 처음에는 초음파 처리되고 원심분리되어 수용성 단백질 분획(S)과 카운탈화된 헴브라우스 생성물인 제출형 입자(SMP)를 생성한다. 초음파 처리 단계로부터의 펠릿은 이후 탄산 나트륨 (Na2CO3) 및 원심분리기를 가진 알칼리성 치료에 제출되어 탄산 염상체 (CS) 및 탄산침분획 (CP)이 발생합니다. (B) 초음파 처리 및 탄산 추출 프로토콜에서 펠릿 및 상류 분획의 서쪽 블롯 분석. 분획은 12% 폴리아크릴아미드 젤에 SDS-PAGE에 의해 분리되었고, 니트로셀룰로오스로 옮겨져 뚜렷한 수준의 용해도를 나타내는 단백질 마커에 대해 제기된 항체로 조사되었다. 자세한 내용은 텍스트를 참조하십시오. 이 수치는 19에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 용액 | 구성 요소 | 코멘트 | |
| YPD 매체 | 효모 추출물 1% (w/v) 펩톤 2%, 포도당 2% (w/v) | 바토 효모 추출물 10g, 바토 펩톤 20g, 포도당 20g을 900m의 증류수에 녹입니다. 최대 1,000ml를 채우고 오토클레이브를 사용하여 소독합니다. | |
| YPGal 매체 | 효모 추출물 1% (w/v), 2% (w/v) 펩톤, 2% (w/v) 갈라토세 | 바토 효모 추출물 10g, 바토 펩톤 20g, 갈라토세 20g을 900m의 증류수에 녹입니다. 최대 1,000ml를 채우고 오토클레이브를 사용하여 소독합니다. | |
| DTT 버퍼 | 100 mM Tris-H2SO4 (pH 9.4), 10 mM 디티오스레이톨 (DTT) | 15 ml를 만들기 위해 : 1 M Tris-H2SO4의 1.5 ml, pH 9.4를 30 °C에서 예동 된 1M DTT의 150 μL과 혼합하십시오. ddH2O가 있는 15ml의 볼륨 사용하기 전에 갓 준비하세요 |
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| 지몰리아제 버퍼 | 20 mM 칼륨 인산염 버퍼 (pH 7.4), 1.2 M 소르비톨 | 100ml 만들기: 2m 소르비톨 60ml와 1M 칼륨 인산염 버퍼(pH 7.4)의 2ml를 섞는다. ddH2O가 있는 15ml의 볼륨 사용 직전 완충제에서 Arthrobacter luteus (MP 생물 의학, 어바인, CA)에서 Zymolyase-20T의 분말 (그램 젖은 무게 당 3 mg)를 용해하십시오. |
|
| 균질화 버퍼 | 10m Tris-HCl (pH 7.4), 0.6 M 소르비톨, 1 mM EDTA, 0.2% (w/v) 소 세럼 알부민 (BSA), 1 mM 페닐메틸술포닐 플루오라이드 (PMSF) | 250 ml를 만들려면: 2m Tris-HCl 버퍼(pH 7.4)의 2.5ml와 2m 소르비톨 75ml, 500mMM EDTA의 500 μL, BSA 0.5g(본질적으로 지방산 프리) 혼합 ddH2O가 있는 250ml의 부피 4°C에서 미리 식힙니다. 사용 직전에 버퍼에 PMSF 및 BSA 추가 |
|
| SEM 버퍼 | 10mM MOPS-KOH (pH 7.2), 250 mM 자당, 1 mM EDTA | 250ml 만들기: 2m MOPS-KOH 버퍼(pH 7.2)의 2.5ml와 2m 자당 31.25ml, 500mMMEDTA 500 μL을 혼합하십시오. ddH2O가 있는 250ml의 부피 사용하기 직전에 4°C에서 미리 식힙니다. |
|
| EM 버퍼 | 10mM MOPS-KOH (pH 7.2), 1 mM EDTA | 250ml 만들기: 500 mM EDTA의 500 μL와 1 M MOPS-KOH 버퍼 (pH 7.2)의 2.5 ml를 혼합 ddH2O가 있는 250ml의 부피 사용하기 직전 4°C에서 미리 식힙니다. |
|
| 샘플 버퍼 | 2% (w/v) 나트륨 도데킬술페이트 (SDS), 50 mM DTT, 10% (v/v) 글리세롤, 0.02% 브로모페놀 블루, 60 mM 트리스-HCl (pH 6.8), |
||
표 1: 미디어, 솔루션 및 버퍼입니다.
| 시약 | 1 | 2 | 3 | 4 | |
| 미토콘드리아 (10 mg/mL) | 40 μL | 40 μL | 40 μL | 40 μL | |
| SEM 버퍼 | 360 μL | 360 μL | - | - | |
| EM 버퍼 | - | - | 360 μL | 360 μL | |
| 프로틴아제 K (10 mg/mL) | - | 4 μL | - | 4 μL | |
표 2: 저혈압 팽창을 수행하는 파이펫팅 방식.
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Discussion
여기에 제시된 프로토콜은 성공적으로 사용되고 지속적으로 제출된 본래의 단백질 국소화를 결정하기 위해 장기간 에 최적화되어 있다13,14,18,21,22,23. 이 프로토콜의 신뢰성과 재현성은 미토콘드리아 제제의 순도와 무결성에 크게 의존한다18. 이 두 가지 요구 사항은 원유 미토콘드리아 제제13,24,25(도 1)에 추가 정화 단계(자당 밀도 그라데이션 원심 분리)를 추가하여 달성된다. 원치 않는 비미토콘드리아 오염 물질을 제거하는 것 외에도, 이 추가 정화 단계는 또한 프로토콜18 동안 시료의 수많은 물리적 조작에서 발생할 수있는 깨진 미토콘드리아 및 미토플라스트를 제거합니다. 따라서, 절차의 시간이 증가함에도 불구하고, 이러한 자당그라데이션 정제 단계는 고도로 정제된 미토콘드리아를 생성하며, 이는 제출된 분획 분획 프로토콜의 성공에 필수적인 것으로 여겨진다18,22.
Vögtle 및 협력자는 냉동 세포기관 (-80 °C)도 성공적으로 제출에 사용될 수 있다고보고13; 그러나 신선한 미토콘드리아 제제를 사용하는 것이 좋습니다. 선택의 여지가, 정제 된 미토콘드리아의 손상성은 외부 추가 단백질 에 대한 막 간 공간 단백질의 감도를 확인하여 확인할 수 있습니다. 세포기관이 손상되지 않은 경우 Cyt와 같은 이 구획의 단백질이 있습니다. b2 및 Sco1은 외부 멤브레인(도 2B, 레인 2)에서 제공하는 장벽으로 인해 프로테오리스틱 분해로부터 보호되어야 합니다. 대조적으로, 세포기관이 저산소완충액에서 배양될 때, 삼투성 쇼크로 인한 외부 막의 파열(swelling)은 이러한 단백질이 저하를 프로테아이즈하는 경향이 있다(도 2B, 레인 4). 한편, α-KGD와 같은 매트릭스 구획에 존재하는 단백질은 내막의 무결성 때문에 미토콘드리아와 미토플라스트 모두에서 분해방지되어야 한다(도 2B, 레인 2 및 4). 따라서, 잘 연구된 미토콘드리아 마커 단백질의 프로파일은 미토콘드리아 제제의 무결성 또는 분획 프로토콜의 성공을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 더욱이, 관심 있는 단백질의 제출국국화는 마커 단백질18,22(도 2B)의 분획 프로파일을 비교하여 서만 얻어진다. 중요한 것은, 미토콘드리아 마커 단백질이 위에서 설명한 것과 구별되는 동작을 보이면, 세포기관의 무결성이 손상될 가능성이 높고, 따라서, 미토콘드리아 제제는 이 프로토콜의 목적을 위해 사용되어서는 안 된다.
저혈압쇼크는 막간 공간 단백질과 매트릭스를 구별하는 신뢰할 수 있는 방법임이 입증되었지만, 이 방법은 매트릭스 단백질이 용해성인지 미토콘드리아 내막에 부착되는지에 대한 정보를 제공하지 않는다. 이 정보는 소닉에 미토콘드리아를 제출하고 탄산나트륨을 가진 알칼리성 추출을 통해 달성될 수 있다(도 3). 수용성 매트릭스 단백질은 초음파 처리 시 상수 분획으로 방출될 것으로 예상되지만, 멤브레인과 관련된 단백질은 침전13에 있는 경향이 있다. 한편, 탄산나트륨을 가진 알칼리성 추출은 멤브레인에 말초로 부착된 단백질을 효율적으로 용해하지만 일체형 멤브레인 단백질13,20은 용해한다. 따라서, 단백질이 붓기 후에 프로테아제 분해에 저항하지만 알칼리 처리에 의해 상수로 방출되는 경우, 아마도 매트릭스 구획을 향한 말초 부착된 내막 단백질일 것이다. 프로테아제-감도 분석의 성공은 소화에 사용되는 프로테아제에 대한 관심 단백질의 민감도에 현저하게 의존한다는 것을 명심하는 것이 중요합니다. 일부 미토콘드리아 단백질은 일반적으로 굴절 프로토콜(도 2B, 레인 8)19에 사용되는 표준 단백질분석 K 농도(0.1 mg/mL)에서 단백질 분해에 저항하는 것으로 보인다. 단백질Ae K 농도를 두 배로 (0.2 mg/mL) 완전한 단백질 분해를 가능하게 하기에 충분 한 것 같다. 그러나, 프로테아제의 높은 농도는 외부 미토콘드리아 막을 불안정하게 하고 결국 프로토콜의 효과를 손상시킬 수 있다는 것을 명심하십시오.
미토콘드리아 단백질의 기능을 해명하기 위해서는 그들의 제출된 국소화를 결정하는 것이 필수적이라는 것은 의심의 여지가 없습니다. 이와 관련하여, 이 프로토콜은 미토콘드리아를 연구하기 시작하는 연구자를 위한 강력한 공구를 나타냅니다. 효모로 향했음에도 불구하고, 그 원리의 대부분은 쉽게 다른 유기체에 적용 할 수 있습니다. 실제로, 미토콘드리아 정화 단계를 제외하고, 나머지 프로토콜은 다른 유기체에 대해 보고된 것과 매우 유사하다26,27,28. 이 프로토콜의 또 다른 중요한 기여는 변경된 미토콘드리아 생물 발생을 보여주는 S. cerevisiae의 돌연변이의 연구 결과에 있는 그것의 적용성입니다. 미토콘드리아 단백질 수입 기계에 대한 효모 돌연변이가 미토콘드리아 단백질의 변경된 분포를 보여 준다는 것이 널리 보고되었다5,29. 따라서, 이 프로토콜은 미토콘드리아 생물 발생을 바꿀 수 있는 돌연변이에 기인한 미토콘드리아 단백질 분포에 대한 결과를 조사하기 위하여 일상적으로 이용될 수 있다. 마지막으로, 프로토콜은 이중 미토콘드리아 국소화를 보여주는 단백질을 조사하는 데 특히 유용할 수 있다19,30.
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Disclosures
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 제출 에 대한 제기 항체를 제공 에 이 치골로프 박사 (컬럼비아 대학) 박사 에게 감사드립니다 Cyt. b2, αKGD 및 스코1. 우리는 또한 이 프로토콜의 수립 기간 동안 유용한 토론과 의견에 대한 마리오 헨리크 드 바로스 박사 (Universidade 드 상파울루)에게 감사드립니다.
이 작품은 Fundação 드 Amparo à Pesquisa do Estado de 상파울루 (FAPESP) (보조금 2013/07937-8)의 연구 보조금에 의해 지원되었습니다.
페르난도 고메스와 헬레나 투라노도 FAPESP의 지원을 받으며, 2017/09443-3및 2017/23839-7을 각각 지원합니다. 앙겔리카 라모스는 코르데나샤오 데 아페르페이소아멘토 데 페소알 드 니벨 슈페리어(CAPES)의 지원을 받고 있습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| Bacto Yeast extract | BD | 212750 | |
| Beckman Ultra-Clear Centrifuge Tubes, 14 x 89 mm | Beckman Coulter | 344059 | |
| Bovine serum albumin (BSA fatty acid free) | Sigma-Aldrich | A7030 | Component of Homogenization buffer |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43815 | Component of DDT buffer |
| D-Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Galactose | Sigma-Aldrich | G0625 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 | Used to inactivate proteinase K |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | ||
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Trichloroacetic acid (TCA) | Sigma-Aldrich | T6399 | |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Zymolyase-20T from Arthrobacter luteus | MP Biomedicals, Irvine, CA | 320921 | Used to lyse living yeast cell walls to produce spheroplast |
References
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