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Biology

उच्च-रिज़ॉल्यूशन क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी के लिए 3 डी-कोररिलेटिव केंद्रित आयन बीम मिलिंग द्वारा नमूना तैयारी

Published: October 25, 2021 doi: 10.3791/62886
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 1, 1,3
1Max Planck Institute of Biochemistry, 2Max Planck Institute for Biophysics, 3Fondazione Human Technopole
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी के लिए सेलुलर नमूनों की तैयारी का मार्गदर्शन करने पर 3 डी-कोररिलेटिव केंद्रित आयन बीम मिलिंग के लिए एक पाइपलाइन प्रस्तुत करते हैं। रुचि के फ्लोरोसेंटली टैग किए गए प्रोटीन की 3 डी स्थिति पहले क्रायो-फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा निर्धारित की जाती है, और फिर मिलिंग के लिए लक्षित होती है। प्रोटोकॉल स्तनधारी, खमीर और जीवाणु कोशिकाओं के लिए उपयुक्त है।

Abstract

क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी (क्रायो-ईटी) अपने मूल, जमे हुए-हाइड्रेटेड अवस्था में सेलुलर अल्ट्रास्ट्रक्चर और आणविक परिसरों की जांच के लिए पसंद की विधि बन गई है। हालांकि, क्रायो-ईटी के लिए आवश्यक है कि नमूने इतने पतले हों कि घटना इलेक्ट्रॉन बीम को बिखेरया या अवरुद्ध न करें। मोटे सेलुलर नमूनों के लिए, यह क्रायो-केंद्रित आयन बीम (एफआईबी) मिलिंग द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल बताता है कि 3 डी-कोररिलेटिव दृष्टिकोण का उपयोग करके एफआईबी मिलिंग के दौरान विशिष्ट सेलुलर साइटों को कैसे लक्षित किया जाए, जो एफआईबी-स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप से जानकारी के साथ तीन-आयामी फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी डेटा को जोड़ता है। इस तकनीक का उपयोग करके, दुर्लभ सेलुलर घटनाओं और संरचनाओं को उच्च सटीकता के साथ लक्षित किया जा सकता है और क्रायो-ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-टीईएम) का उपयोग करके आणविक संकल्प पर कल्पना की जा सकती है।

Introduction

केंद्रित आयन बीम मिलिंग आमतौर पर यांत्रिक सेक्शनिंग जैसे चाकू के निशान और संपीड़न कलाकृतियों से जुड़ी समस्याओं के बिना क्रायो-फिक्स्ड नमूनों से पतले जैविक नमूने तैयार करने की अनुमतिदेता है। जब क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी के साथ जोड़ा जाता है, तो एफआईबी मिलिंग सेलुलर आकृति विज्ञान के उच्च-रिज़ॉल्यूशन जैविक अध्ययन और उप-नैनोमीटर रिज़ॉल्यूशन 2,3,4 पर कोशिकाओं के भीतर से सीधे मैक्रोमोलेक्यूलर कॉम्प्लेक्स की संरचना का निर्धारण करने में सक्षम बनाता है। जबकि प्रचुर मात्रा में प्रजातियां, जैसे राइबोसोम, यादृच्छिक रूप से काटे गए एफआईबी लैमेला में आसानी से पाई जाती हैं, कई सेलुलर प्रक्रियाएं कई परिसरों के सह-स्थानीयकरण पर निर्भर करती हैं या सेल के भीतर विशिष्ट साइटों के लिए स्थानीयकृत होती हैं। नतीजतन, मिलिंग प्रक्रिया के दौरान रुचि की जैविक विशेषता को न खोने और यादृच्छिक हिट तक सीमित होने के लिए कुशल लक्ष्यीकरण की आवश्यकता होती है। स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (एसईएम) -एफआईबी और क्रायो-फ्लोरेसेंस लाइट माइक्रोस्कोप (एफएलएम) से डेटा को जोड़ने वाला एक सहसंबंधित दृष्टिकोण इसलिए आवश्यक है। जबकि प्रारंभिक सहसंबंध को छोड़ना और टीईएम अधिग्रहण5,6 के बाद ही एफएलएम और क्रायो-ईटी डेटा को संयोजित करना संभव है, प्रतिदीप्ति-निर्देशित केंद्रित आयन बीम मिलिंग पहले से मिलिंग क्षेत्र का सटीक चयन करने में सक्षम बनाता है, जिसके परिणामस्वरूप अधिक कुशल डेटा अधिग्रहण होता है। इसकी अवधारणा7 के बाद से, जैविक अध्ययनों में 3 डी-सहसंबद्ध एफआईबी मिलिंग का आवेदन तब तक सीमित था जब तक कि हमने हाल ही मेंइस तकनीक का उपयोग करके खमीर में एक नए तरल-तरल चरण-अलग (एलएलपीएस) डिब्बे की पहचान नहीं की।

यहां वर्णित एक सामान्यीकृत 3 डी क्रायो-सहसंबद्ध प्रकाश और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (सीएलईएम) प्रोटोकॉल है, जिसका उपयोग बैक्टीरिया से लेकर खमीर और स्तनधारी कोशिकाओं तक के नमूनों की एक विस्तृत विविधता का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। जबकि प्रयोगों को उपकरणों के एक निश्चित सेट का उपयोग करके किया गया था, व्यक्तिगत चरण विशिष्ट हार्डवेयर से बंधे नहीं हैं और आसानी से मौजूदा प्रोटोकॉल 3,5 के विस्तार के रूप में अन्य प्रणालियों में स्थानांतरित किए जा सकते हैं। परीक्षण किए गए उपकरणों और सुझाई गई सेटिंग्स की एक सूची सामग्री की तालिका और तालिका 1 में प्रदान की जाती है। पाइपलाइन के चार प्रमुख चरण हैं (1) नमूना तैयारी, (2) क्रायो-फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा रुचि की विशेषताओं का स्थानीयकरण, (3) 3 डी-सहसंबद्ध केंद्रित आयन बीम मिलिंग, और (4) क्रायो-ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप में लैमेला पर क्रायो-ईटी डेटा अधिग्रहण के लिए लक्षित संरचनाओं का स्थानीयकरण (चित्रा 1)।

Protocol

Figure 1
चित्र 1: महत्वपूर्ण चरणों के चयन के साथ वर्कफ़्लो का सारांश। पूरे प्रोटोकॉल को उपयोग किए गए उपकरणों के अनुसार चार चरणों में विभाजित किया गया है: नमूना तैयारी, जिसमें डुबकी फ्रीजिंग, क्रायो-फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी, क्रायो-केंद्रित आयन बीम मिलिंग और क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी शामिल हैं। प्रत्येक चरण के लिए, कई प्रमुख बिंदुओं पर प्रकाश डाला गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

1. सेल कल्चर और ग्रिड की फ्रीजिंग

  1. क्रायो-प्रयोगों में जाने से पहले पसंद की कोशिकाओं को कल्चर करें और कमरे के तापमान पर लेबलिंग और उपचार रणनीतियों को अनुकूलित करें। रुचि के लक्ष्यों को या तो फ्लोरोसेंट प्रोटीन संलयन या लाइव स्टेनिंग (जैसे, हेलो-टैग, लाइसोट्रैकर, बीओडीआईपीवाई, लाइव एंटीबॉडी स्टेनिंग, आदि) का उपयोग करके लेबल किया जाता है। यदि रुचि की जैविक प्रक्रिया की जांच करने के लिए रासायनिक या जैविक एजेंटों (छोटे अणुओं, विशेष मीडिया, सीआरएनए, आदि) के साथ उपचार की आवश्यकता होती है, तो लाइव-सेल एफएलएम इमेजिंग का उपयोग करके स्थितियों (जैसे, समय, एकाग्रता) का अनुकूलन करें।
    1. सुनिश्चित करें कि रुचि की साइटों को इमेजिंग सेटिंग्स का उपयोग करके पर्याप्त संख्या में कोशिकाओं में पृष्ठभूमि के ऊपर सफलतापूर्वक स्थानीयकृत किया जा सकता है जो बाद में क्रायो-स्थितियों से यथासंभव निकटता से मेल खाते हैं (यानी, एनए, एक्सपोज़र समय, आदि)।
  2. ग्रिड का चयन और तैयारी
    1. छेद के आकार और अंतराल के साथ ग्रिड का चयन करें जो कोशिकाओं और उपयोग किए जाने वाले भौतिक मार्करों के लिए उपयुक्त है (चरण 1.3.1 देखें)। छेद के बिना निरंतर फिल्म का उपयोग न करें क्योंकि इससे ब्लोटिंग के बाद बहुत अधिक अवशिष्ट बफर हो सकता है और इस प्रकार विट्रीफिकेशन दक्षता कम हो सकती है और फिड्यूशियल मोतियों का पता लगाने में बाधा उत्पन्न हो सकती है। ग्रिड के साथ कोशिकाओं के लंबे समय तक संपर्क के लिए, सुनिश्चित करें कि ग्रिड समर्थन और फिल्म सामग्री जैव-संगत हैं।
    2. प्लाज्मा-क्रायो-ईएम ग्रिड को साफ करें ताकि उन्हें अधिक हाइड्रोफिलिक बनाया जा सके। अनुगामी सेल संस्कृति में उपयोग के लिए, एक लामिनर प्रवाह हुड में 20 मिनट के लिए यूवी विकिरण के साथ प्लाज्मा-सफाई के बाद ग्रिड को निष्फल करें। वैकल्पिक रूप से, ग्रिड को उन यौगिकों के साथ पूर्व-उपचारित किया जा सकता है जो सेल आसंजन में मदद करते हैं, जैसे कि पॉली-एल-लाइसिन या कॉनकानावेलिन ए, जैसा कि नीचे वर्णित है।
      नोट: सामान्य तौर पर, निम्नलिखित ग्रिड / नमूना संयोजनों का उपयोग कोररिलेटिव क्रायो-एफआईबी वर्कफ़्लो में सफलतापूर्वक किया गया है: खमीर: क्यू या एयू, 200 जाल, आर 1/4 कार्बन या एसआईओ2 फिल्म, वैकल्पिक रूप से कॉनकानावेलिन ए के साथ लेपित; एस्चेरिचिया कोलाई: क्यू या एयू, 200 जाल, आर 1/4 कार्बन या एसआईओ2 फिल्म; क्लैमाइडोमोनास रेनहार्ड्टी: क्यू या एयू, 200 जाल, आर 1/2 या आर 1/4 कार्बन या एसआईओ2 फिल्म; हेला: एयू, 200 जाल, आर 1/4 एसआईओ2 फिल्म, पॉली-एल-लाइसिन के साथ लेपित; HEK293: AU, 200 जाल, R1/4 SiO2 फिल्म, पॉली-एल-लाइसिन के साथ लेपित।
    3. खमीर कोशिकाओं के लगाव में सुधार के लिए कोनकावेलिन ए कोटिंग:
      • 100 μM CaCl2, pH 8.5 के साथ 10 mM HEPES बफर में 1 mg/mL concanavalin A का कोटिंग समाधान तैयार करें। कोटिंग समाधान की एक बूंद (50 μL) और आसुत जल की दो बूंदें पैराफिन फिल्म के एक टुकड़े पर अलग से रखें।
      • रिवर्स-फोर्स ट्वीज़र्स के साथ प्लाज्मा-साफ ग्रिड को उठाएं और फिल्म को नुकसान को रोकने के लिए ग्रिड के लंबवत आंदोलनों से बचने के लिए इसे कोटिंग समाधान की बूंद में सावधानी से डालें।
      • ~ 5 सेकंड इनक्यूबेशन के बाद, ग्रिड को दो बार पानी की बूंदों में डालकर इसी तरह से धोएं। अंत में, ग्रिड के पीछे एक फिल्टर पेपर लगाकर अतिरिक्त तरल को हटा दें और इसे चिमटी से छोड़ने से पहले ग्रिड को पूरी तरह से सूखने दें। डुबकी-ठंड के लिए सूखे ग्रिड का उपयोग करें।
    4. निलंबन संस्कृति और अनुयायी कोशिकाओं के लिए पॉली-एल-लाइसिन कोटिंग:
      • 0.1 एम सोडियम बोरेट बफर, पीएच 8.5 में पॉली-एल-लाइसिन के 1 मिलीग्राम / एमएल का कोटिंग समाधान तैयार करें।
      • प्लाज्मा-साफ ग्रिड को सेल कल्चर के लिए एक उपयुक्त डिश में रखें और यूवी विकिरण द्वारा 20 मिनट के लिए निष्फल करें।
      • धीरे से सभी ग्रिड को कवर करने के लिए पर्याप्त कोटिंग समाधान जोड़ें और कम से कम 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। तरल को एस्पिरेट करें और कोशिकाओं को वांछित एकाग्रता में बीजारोपण करने से पहले पीबीएस के साथ दो बार ग्रिड को धीरे से धोएं।
  3. कोशिकाओं और भौतिक मोतियों की तैयारी।
    नोट: 3 डी-कोररिलेटिव एफआईबी मिलिंग की अनुमति देने के लिए एफआईबी / एसईएम माइक्रोस्कोप में ली गई छवियों के साथ फ्लोरेसेंस डेटा के 3 डी पंजीकरण के लिए फिड्यूशियल बीड्स की आवश्यकता होती है।
    1. सभी इमेजिंग तौर-तरीकों, यानी, एफएलएम, एसईएम और आईबी (अनुशंसित व्यास 0.5-1 μm) में पहचानने योग्य मोती चुनें, लेकिन सुनिश्चित करें कि ये प्रतिदीप्ति इमेजिंग के दौरान सेलुलर लक्ष्य संरचना से आगे न बढ़ें ताकि मोतियों और रुचि की जैविक विशेषता को अलग करना आसान हो सके। निर्माता द्वारा दिए गए निर्देश के अनुसार फिड्यूशियल बीड्स (जैसे, एनएएन3) में साइटोटोक्सिक परिरक्षकों को हटा दें।
      नोट: रुचि की जैविक विशेषताओं और फिड्यूशियल ्स के बीच एक आसान अंतर के लिए, यह उपयोगी है यदि प्रतिदीप्ति उत्सर्जन स्पेक्ट्रा केवल आंशिक रूप से ओवरलैप होता है ताकि एफएलएम चैनलों में तीव्रता अंतर के आधार पर संकेतों को अलग किया जा सके।
    2. यदि निलंबन संस्कृति का उपयोग किया जाता है, तो कोशिकाओं को एक उपयुक्त घनत्व (जैसे, खमीर OD 600 = 0.8, E. coli OD 600 = 0.8-1.0, C. reinhardtii 1500 cells / μL) तक बढ़ाएं और प्रयोग के लिए आवश्यक उपचार करें जैसे कि माध्यम का परिवर्तन, रसायनों को जोड़ना, भुखमरी, आदि। प्लंजिंग विधि (मैनुअल / स्वचालित) के लिए आवश्यक रूप से चिमटी में प्लाज्मा-साफ ग्रिड संलग्न करें, और ग्रिड के फिल्म साइड पर ~ 1 x 105 मोती / μL के साथ मिश्रित सेल सस्पेंशन के 4 μL लागू करें।
      नोट: अनुमापन प्रयोगों में कोशिकाओं और फिड्यूशियल ्स के इष्टतम कमजोर पड़ने का निर्धारण करें (उदाहरण के लिए, क्रायो-एफएलएम या एफआईबी / एसईएम पर जांच करके, नीचे देखें)। हालांकि, निलंबन में उगाई गई अधिकांश कोशिकाओं के लिए, 1 μm fiducial मोतियों के ~ 1 x 105 मोती / μL की अंतिम एकाग्रता (स्टॉक से 1:20 कमजोर पड़ना; विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें) एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु साबित हुआ है।
    3. यदि अनुयायी संस्कृति का उपयोग किया जाता है, तो एसेप्टिक कल्चर के लिए यूवी-विकिरण का उपयोग करके ग्रिड को प्लाज्मा-साफ और निष्फल करें। यदि आवश्यक हो, तो यौगिकों के साथ प्री-कोट ग्रिड जो सेल आसंजन में मदद करते हैं (जैसे, पॉली-एल-लाइसिन, फाइब्रोनेक्टिन, लैमिनिन; चरण 1.2.2 देखें)। ग्रिड के लिए उपखंडों के साथ सामान्य संस्कृति व्यंजन या व्यंजनों में ग्रिड पर कोशिकाओं को बीज और विकसित करें।
    4. प्रयोग के लिए नमूनों को आवश्यक मानें और कोशिकाओं को इष्टतम परिस्थितियों में बनाए रखें जब तक कि ठंड न हो जाए (उदाहरण के लिए, एचईके / एचईएलए के लिए 37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ2 )। कल्चर डिश से ग्रिड को सावधानी पूर्वक निकालें और उन्हें प्लंजिंग चिमटी से संलग्न करें। 4 μL कल्चर माध्यम को फिड्यूशियल्स (1 μm fiducial के लिए 1 x 105 मोती / μL) के साथ मिश्रित सेल-असर पक्ष पर लागू करें।
  4. मैन्युअल या स्वचालित फ्रीजिंग प्रक्रिया का उपयोग करके कोशिकाओं को फ्रीज करें। यदि संभव हो, तो केवल कोशिकाओं को यांत्रिक रूप से नुकसान पहुंचाने से रोकने के लिए कोशिकाओं के विपरीत साइड से ग्रिड को ब्लॉट करें (चित्रा 2 ए)। दो-सशस्त्र स्वचालित प्लंगिंग सिस्टम पर, कोशिकाओं के सामने पैड पर ब्लोटिंग पेपर के बजाय पॉलीटेट्राफ्लोरोएथिलीन (जैसे, टेफ्लॉन) शीट रखकर इसे प्राप्त करें। ग्रिड को भंडारण बक्से में स्थानांतरित करें और उपयोग तक उन्हें तरल नाइट्रोजन (एलएन2) में रखें।
    सावधानी: एलएन2 और अन्य क्रायोजेन आंखों और त्वचा को गंभीर नुकसान पहुंचा सकते हैं। व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) का उपयोग करें और खतरनाक एन2 सांद्रता के निर्माण से बचने के लिए केवल अच्छी तरह से हवादार जगह में काम करें।
    नोट: सेल और लैमेला सतहों के संदूषण से बचने के लिए एलएन2 के तरल चरण में सभी बाद के चरणों को सबसे अच्छा किया जाना चाहिए, क्योंकि यह डाउनस्ट्रीम प्रसंस्करण को जटिल कर सकता है। हमेशा स्वच्छ तरल नाइट्रोजन (जैसे, तैरने वाली बर्फ को हटाने के लिए फ़िल्टर करें) का उपयोग करके फ्लोटिंग बर्फ क्रिस्टल के साथ संपर्क को कम करें, अनावश्यक हस्तांतरण चरणों को समाप्त करें, और यदि संभव हो, तो आर्द्रता-नियंत्रित वातावरण में काम करें।
  5. बाद में क्रायो-फ्लोरेसेंस इमेजिंग और एफआईबी मिलिंग के लिए कटआउट और कोशिकाओं का सामना करने वाली कोशिकाओं (चित्रा 2 ए) के साथ ऑटोग्रिड में डुबकी-जमे हुए ग्रिड को माउंट और क्लिप करें। टीईएम में नमूनों के उचित संरेखण को सुनिश्चित करने के लिए, मिलिंग दिशा को क्रायो-ईटी झुकाव अक्ष के लिए ऑर्थोगोनल होना चाहिए। तदनुसार, इस संरेखण में मदद करने के लिए क्लिपिंग से पहले ऑटोग्रिड पर अभिविन्यास चिह्न (जैसे, लेजर-उत्कीर्णन या हटाने योग्य मार्कर डॉट्स) रखें (चित्रा 2 ए)।
  6. क्रायो-एफएलएम और एफआईबी / एसईएम पर ग्रिड गुणवत्ता (चित्रा 2 बी) को स्क्रीन करें। कोशिकाओं और मोतियों के समान वितरण को प्राप्त करने के लिए सेल घनत्व, सोख्ता समय और बल का अनुकूलन करें। क्रायो-फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप पर परावर्तित प्रकाश इमेजिंग का उपयोग करें या यह सुनिश्चित करने के लिए क्रायो-एफआईबी-एसईएम का उपयोग करें कि कोशिकाएं और फिड्यूशियल मोती दोनों स्पष्ट रूप से दिखाई देते हैं (चित्रा 2 बी, सफेद तीर)।
  7. यदि आवश्यक हो, तो बेहतर परिस्थितियों के साथ प्लंगिंग को दोहराएं, उदाहरण के लिए, अलग-अलग सेल एकाग्रता और / या ब्लोटिंग समय। एक बार उपयुक्त प्लंगिंग पैरामीटर पाए जाने के बाद, प्रयोगों के प्रत्येक नए दौर के लिए ग्रिड स्क्रीनिंग को न दोहराएं।

Figure 2
चित्र 2: एसईएम और आईबी का उपयोग करके उपयुक्त ग्रिड के लिए स्क्रीनिंग (ए) टीईएम में सही लोडिंग को सरल बनाने के लिए मिलिंग दिशा के लंबवत ऑटोग्रिड पर अभिविन्यास चिह्न लगाए जाने चाहिए। कोशिकाओं को इकट्ठे ऑटोग्रिड में आमने-सामने रखा जाता है। (बी) ठंड के बाद, प्लंगिंग स्थितियों का मूल्यांकन और अनुकूलन करने के लिए एसईएम में ग्रिडों का निरीक्षण किया जाता है: ए) प्रति ग्रिड बहुत अधिक सेल नहीं होने चाहिए। उदाहरण के लिए, हेला कोशिकाओं के लिए, 1-4 कोशिकाओं / वर्ग से अधिक का उपयोग न करें। छोटी कोशिकाओं के लिए जैसे कि सैकरोमाइसेस सेरेविसिया (यहां दिखाया गया है), 4-6 कोशिकाओं के झुरमुट उपयोगी पाए गए हैं। बी) फिड्यूशियल बीड्स (सफेद तीर) स्पष्ट रूप से दिखाई देने चाहिए, और कोशिकाओं के आसपास बहुत अधिक बफर नहीं होना चाहिए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

2. क्रायो-फ्लोरेसेंस लाइट माइक्रोस्कोपी।

  1. प्रत्येक ग्रिड के लिए, (वाइडफील्ड) फ्लोरेसेंस और डिफरेंशियल इंटरफेरेंस कंट्रास्ट (डीआईसी) या परावर्तित मोड में एक अवलोकन प्राप्त करें और फ्लोरेसेंस सिग्नल के साथ उपयुक्त ग्रिड वर्गों का चयन करें। दृश्य के क्षेत्रों का चयन करें जिसमें रुचि की कोशिकाएं और पर्याप्त संख्या में भौतिक मार्कर (6-12) दोनों शामिल हैं।
    1. सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं और मोतियों को समान रूप से वितरित किया जाता है, बहुत घना नहीं होता है, और प्रत्येक वर्ग के केंद्र की ओर। केवल एफआईबी-एसईएम और टीईएम उपकरण दोनों के लिए सुलभ वर्ग चुनें, इसलिए वे 200 जाल ग्रिड (चित्रा 3 ए, लाल सर्कल के अंदर) पर ग्रिड किनारे से कम से कम तीन वर्ग दूर हैं।
  2. चयनित ग्रिड वर्गों में से प्रत्येक पर, बाद में डीकन्वोल्यूशन के लिए उपयुक्त फोकस चरण के साथ एक फ्लोरोसेंट स्टैक प्राप्त करें, यानी, अक्षीय रिज़ॉल्यूशन सीमा <1/2। यदि संभव हो, तो फोटॉन गिनती और स्थानीयकरण सटीकता बढ़ाने के लिए उच्च-संख्यात्मक-एपर्चर (एनए) उद्देश्यों का उपयोग करें।
    1. एनए 0.9 उद्देश्य के साथ एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप में, 300 एनएम चरण आकार के साथ ढेर प्राप्त करें, जो निक्विस्ट मान को ओवरसैंपल करें। यदि आवश्यक हो तो कई रंग के ढेर रिकॉर्ड करें (चित्रा 2 बी)। आगे के उपयोग तक एलएन2 के तहत ग्रिड स्टोर करें।
      नोट: इष्टतम चरण आकार निर्धारित करने के लिए, माइक्रोस्कोप नियंत्रण सॉफ़्टवेयर द्वारा गणना किए गए मान चुनें या ऑनलाइन उपकरण9 का उपयोग करें। चैनलों के बीच सिग्नल के ब्लीड-थ्रू की जांच करें क्योंकि अत्यधिक रक्तस्राव सह-स्थानीयकरण प्रयोगों के लिए हानिकारक है। हालांकि, बहु-रंग के ढेर में क्रोमैटिक विपथन के लिए कुछ को सही करना फायदेमंद हो सकता है।
  3. उपयुक्त सॉफ्टवेयर10,11 का उपयोग करके डीकोनवोल्व स्टैक और यदि आइसोट्रोपिक पिक्सेल आकार की आवश्यकता होतो उन्हें फिर से स्लाइस करें। डीकॉन्वोल्यूशन - कमरे के तापमान पर - एफएलएम सिग्नल को साफ करता है और स्थानीयकरण सटीकता में सुधार कर सकता है (चित्रा 3 सी)।

Figure 3
चित्रा 3: एफएलएम स्टैक अधिग्रहण के लिए वर्गों का चयन करना और डीकॉन्वोल्यूशन द्वारा डेटा में सुधार । (ए) ईजीएफपी-एडीई 1 (हरा) और एमचेरी-एटीजी 8 (मैजेंटा) व्यक्त करने वाले खमीर कोशिकाओं के साथ एक ग्रिड का अवलोकन। मोतियों और कोशिकाओं के अच्छे वितरण वाले पदों का चयन करें, लेकिन ग्रिड के किनारों (छायांकित लाल) से बचें। बक्से अच्छे सेल वितरण वाले पदों को इंगित करते हैं जहां प्रतिदीप्ति ढेर लिए गए थे। (बी) डीकन्वोल्यूशन के बाद पीले-बॉक्स वाले वर्ग (ए से) पर लिए गए बहु-रंग स्टैक का अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण (एमआईपी)। एफएलएम स्टैक्स का डीकन्वोल्यूशन अवांछित पृष्ठभूमि संकेतों को काफी हद तक साफ करता है और जेड में मोतियों को अधिक सटीक रूप से स्थानीयकृत करने में मदद करता है, जैसा कि गॉसियन फिट ्स से पहले (सी) और बाद में डीकॉन्वोल्यूशन (डी) से स्पष्ट है (फिट 3डीसीटी में किए गए थे और 1 के साथ चिह्नित मोती के लिए दिखाए गए हैं)। चित्र लाल चैनल के ज़ूम-इन एमआईपी दृश्य दिखाते हैं (उत्तेजना: 552 एनएम, उत्सर्जन: 585-650 एनएम)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

3. केंद्रित आयन बीम मिलिंग

  1. क्रायो-एफआईबी-एसईएम उपकरण में ग्रिड लोड करें और टीईएम में बाद में प्लेसमेंट के लिए उचित अभिविन्यास सुनिश्चित करने के लिए कटआउट और / या अभिविन्यास चिह्नों का उपयोग करें (चित्रा 2 ए)। सुनिश्चित करें कि मिलिंग दिशा टीईएम के झुकाव अक्ष के लंबवत है।
  2. गैस इंजेक्शन प्रणाली (जीआईएस) का उपयोग करें; CPMEPTME3) चरण में एक सुरक्षात्मक ऑर्गेनोमेटेलिक परत के साथ ग्रिड को कोट करने के लिए FIB-SEM सेटअप द्वारा पूर्व-परिभाषित किया गया है। बहुत अधिक लागू न करें, क्योंकि यह बाद में टीईएम में फिड्यूशियल बीड स्थानीयकरण में हस्तक्षेप कर सकता है। नमूना चार्जिंग को कम करने के लिए धातु प्लैटिनम लगाने के लिए प्लाज्मा कोटर का उपयोग करें।
    नोट: यदि जीआईएस कोटिंग के लिए कोई सेटिंग्स उपलब्ध नहीं हैं, तो उन्हें आसानी से शॉर्ट कोटिंग (~ 2 एस) के लगातार राउंड करके पाया जा सकता है, इसके बाद एफआईबी मिलिंग। सुनिश्चित करें कि नमूना अभी भी मध्यम धाराओं (~ 100 पीए) पर सफलतापूर्वक काटा जा सकता है, बिना लैमेला किनारों के चारों ओर सुरक्षात्मक ऑर्गेनोमेटेलिक परत के स्पष्ट उल्लंघन के। जीआईएस सुई का समय और दूरी (नमूने के संबंध में) दोनों विचार करने के लिए महत्वपूर्ण पैरामीटर हैं। कमरे के तापमान सेटिंग्स (यानी, 45 डिग्री सेल्सियस) पर जीआईएस सुई को संचालित न करें, लेकिन अभी भी एक समान कोटिंग (25-27 डिग्री सेल्सियस) प्रदान करने के लिए जितना संभव हो उतना ठंडा करें।
  3. एक एसईएम ग्रिड अवलोकन रिकॉर्ड करें और ग्रिड वर्गों को खोजने के लिए एफएलएम अवलोकन के साथ 2 डी सहसंबंध करें जिसके लिए फ्लोरोसेंट स्टैक दर्ज किए गए हैं। मैन्युअल रूप से दोनों दृश्यों का निरीक्षण करें या ग्रिड वर्गों को खोजने के लिए विभिन्न सॉफ़्टवेयर पैकेज 7,10,12 का उपयोग करें। यहां, ध्यान 3 डी सहसंबंध टूलबॉक्स (3डीसीटी) 7 पर है, जो दृश्यों के बीच आइसोट्रोपिक स्केलिंग के साथ 3 डी कठोर शरीर परिवर्तन का उपयोग करता है। 3DCT फ़ंक्शंस पर एक उत्कृष्ट वॉक-थ्रूऑनलाइन उपलब्ध है।
    1. एफएलएम और एसईएम ग्रिड अवलोकन (राइट-क्लिक) दोनों में कम से कम चार संबंधित पदों का चयन करें और चिह्नित करें, उदाहरण के लिए, ग्रिड बार या समर्थन फिल्म में छेद जैसे लैंडमार्क और चिह्नित बिंदुओं (सहसंबंधित) के बीच परिवर्तन की गणना करें।
    2. इसके बाद, मार्करों को संबंधित ग्रिड वर्गों के केंद्र में रखें जिसके लिए एफएलएम स्टैक का अधिग्रहण किया गया है और एसईएम दृश्य में उनकी स्थिति की भविष्यवाणी करें (सहसंबंधित; चित्रा 4 ए)।
  4. प्रत्येक सहसंबद्ध ग्रिड वर्ग के लिए, पसंद के एफआईबी मिलिंग कोण पर कम-धारा (≤10 पीए) आयन बीम (आईबी) छवि लें (45 डिग्री प्री-टिल्ट शटल के लिए 10 ° -25 डिग्री)। दृश्य के एक क्षेत्र (यानी, स्थिति और आवर्धन) का चयन करें जो प्रतिदीप्ति डेटा से मेल खाता है। 200 जाल ग्रिड के लिए, ग्रिड बार सहित एकल ग्रिड वर्गों को शामिल करने के लिए प्रतिदीप्ति और एफआईबी / एसईएम डेटा प्राप्त करें (चित्रा 3 ए और चित्रा 4 ए देखें)।
    नोट: क्रायो-ईटी के दौरान महत्वपूर्ण कोणीय सीमा खोने से बचने और पर्याप्त संख्या में फिड्यूशियल मोतियों की पहचान की अनुमति देने के लिए मिलिंग को यथासंभव उथले कोण पर किया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए: 17 ° के चरण झुकाव, 45 ° के शटल पूर्व-झुकाव और गिरावट के सापेक्ष 52 ° के FIB बीम झुकाव के साथ, लैमेला प्री-झुकाव 10 ° है, जो TEM में ±60° की पसंदीदा कोणीय सीमा को -50° से +70° तक झुकाकर पूरा करता है, जो कि कई TEM क्रायो-धारकों का अधिकतम है।
  5. प्रतिदीप्ति और आयन बीम दृश्य में संबंधित मोतियों की पहचान में मदद करने के लिए उसी वर्ग की एक एसईएम छवि लें।
  6. निम्नलिखित (चित्रा 4 बी) चरणों में वर्णित 3डीसीटी के साथ प्रत्येक स्थिति के लिए डिकोनवोल्ड 3 डी एफएलएम स्टैक और 2 डी आयन बीम दृश्य का पंजीकरण करें।
    1. 3DCT में संबंधित रेस्लिस्ड 3D FLM स्टैक और आयन बीम (IB) दृश्य लोड करें।
      नोट: बहु-रंग प्रतिदीप्ति डेटा को तीन अलग-अलग एकल-चैनल स्टैक फ़ाइलों के रूप में लोड किया जा सकता है।
    2. प्रतिदीप्ति डेटा में 4 फिड्यूशियल मोतियों का चयन करें और एक्स, वाई और जेड में सिग्नल की गॉसियन फिटिंग के माध्यम से उनकी 3 डी स्थिति निर्धारित करने के लिए स्थिति सूची पर राइट-क्लिक करें। आईबी छवि में संबंधित मोतियों का चयन करें और प्रारंभिक 3 डी सहसंबंध (सहसंबंधित) करें।
    3. प्रतिदीप्ति छवि में अधिक मोती जोड़ें, उनकी 3 डी स्थिति को परिष्कृत करें, और पंजीकरण में जल्दी से अधिक मोती जोड़ने और सहसंबंध की सटीकता की जांच करने के लिए आईबी दृश्य में उनकी स्थिति की भविष्यवाणी करें। 3DCT में, सहसंबंध स्थिरताका आकलन करने के लिए रूट-माध्य-वर्ग त्रुटि (RMSE) मान प्रदान किए जाते हैं।
      1. सुनिश्चित करें कि आरएमएसई मान छोटे हैं और स्थानीयकरण सटीकता (~ 300 एनएम) के क्रम पर हैं। सहसंबंध की सटीकता निर्धारित करने के लिए, पंजीकरण चरण के दौरान जानबूझकर प्रतिदीप्ति और आयन बीम दोनों में स्पष्ट रूप से पहचाने जाने वाले कुछ फिड्यूशियल मोतियों को छोड़ दें। आयन बीम छवि में उनके अनुमानित बनाम वास्तविक स्थान की जांच करके ऐसा करें। यदि अनुमानित स्थिति वास्तविक से काफी भिन्न होती है, तो प्रारंभिक सहसंबंध को नए सेट के साथ दोहराएं।
        नोट: एफएलएम स्टैक और आईबी दृश्यों के सटीक पंजीकरण के लिए 6-8 मोतियों को सहसंबंधित करना पर्याप्त साबित हुआ है। हालांकि, जेड मानों की एक विस्तृत श्रृंखला पर अधिक फिड्यूशियल (12-15 तक) जोड़ना (उदाहरण के लिए, ग्रिड बार पर या पड़ोसी वर्गों में मोतियों का चयन करके) सहसंबंध की सटीकता में सुधार कर सकता है।
    4. लक्षित सेलुलर संकेतों का चयन करें, एफएलएम स्टैक में उनकी 3 डी स्थिति फिट करें और आईबी दृश्य (चित्रा 4 बी) में लक्ष्य स्थितियों की भविष्यवाणी करने के लिए परिवर्तन लागू करें।
      नोट: एफएलएम पदों की सूची में कोई भी प्रविष्टि, जिसका आईबी सूची में कोई समकक्ष नहीं है, को भविष्यवाणी किए जाने वाले संकेत के रूप में माना जाएगा।
  7. प्रत्येक सहसंबद्ध वर्ग के लिए, एफआईबी-एसईएम उपकरण में रुचि की विशेषताओं की अनुमानित स्थिति को स्थानांतरित करें और लैमेला मिलिंग पैटर्न रखें (चित्रा 4 सी)। मैन्युअल रूप से पदों को स्थानांतरित करें (उदाहरण के लिए, दृश्यमान स्थलों, जैसे कि कोशिकाओं या भौतिक मोतियों की दूरी को मापकर) या स्वचालन और स्क्रिप्टिंग का उपयोग करें, उदाहरण के लिए, सीरियलएफआईबी14 में। यदि प्रति सेल कई सिग्नल हैं, तो थ्रूपुट बढ़ाने के लिए एक ही लैमेला में जितना संभव हो उतने पॉइंट-ऑफ-इंटरेस्ट (पीओआई) को शामिल करने के लिए पैटर्न रखें।
  8. पहले खुरदरा, और फिर लैमेला को 150-250 एनएम की अंतिम मोटाई तक बारीक करें। ऐसे कदमों (जैसे, तनाव राहत कटौती15) से बचें जो लैमेला के सिकुड़ने का कारण बनते हैं और इस प्रकार पहले से अधिग्रहित एफएलएम स्टैक के संबंध में ब्याज की वास्तविक विशेषता की गति होती है। या तो मैनुअल3 या स्वचालित14,16,17,18 एफआईबी मिलिंग प्रक्रियाओं का उपयोग करें। किसी भी विधि के साथ, सुनिश्चित करें कि रुचि की विशेषता लैमेला के केंद्र में बनी हुई है, इसे ऊपर और नीचे से सममित रूप से पतला करके।
  9. प्रत्येक लैमेला के लिए मिलिंग की सटीकता का मूल्यांकन करने के लिए, चरण 3.4 के समान पंजीकरण करें। हालांकि, इस बार, एफआईबी मिलिंग के बाद अंतिम आईबी छवि का उपयोग करें और जांचें कि क्या ब्याज की विशेषताओं की अनुमानित स्थिति अंतिम लैमेला के भीतर निहित है। वैकल्पिक रूप से, 3डीसीटी के आउटपुट और कस्टम स्क्रिप्ट19 से प्राप्त एफएलएम स्टैक के घुमाए गए अनुमानों को अंतिम आईबी छवि (चित्रा 4 सी, छोटा सम्मिलित) के साथ ओवरले करें।

Figure 4
चित्रा 4: 3 डी-कोररिलेटिव एफआईबी मिलिंग प्रक्रिया । (ए) ग्रिड के एफएलएम (बाएं) और एसईएम (दाएं) अवलोकन के 2 डी -2 डी सहसंबंध का उपयोग ग्रिड वर्गों का पता लगाने के लिए किया जाता है जिस पर फ्लोरोसेंट स्टैक पहले लिए गए थे। (ख) प्रत्येक चयनित वर्ग के लिए, 3डीसीटी (रंगीन बक्से) में तदनुरूपी वित्तीय पदों के 3डी-2डी पंजीकरण के बाद, एफएलएम आंकड़ों में रुचि की जैविक विशेषताओं के पदों का चयन किया जाता है। आयन बीम छवि (लाल घेरे) में संबंधित स्थितियों की भविष्यवाणी के आधार पर, लैमेला तैयारी के लिए साइटों का चयन किया जाता है। (सी) स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (एसईएम) और आयन बीम (आईबी) छवियों का उपयोग मिलिंग के दौरान लक्ष्य को केंद्रित रखने के लिए किया जाता है। 150-250 एनएम की अंतिम मोटाई आगे डाउनस्ट्रीम प्रसंस्करण के लिए पर्याप्त पाई गई है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

4. सहसंबंधी टीईएम

  1. ग्रिड को टीईएम में लोड करें, यह सुनिश्चित करें कि लैमेला ओरिएंटेशन (जैसा कि कटआउट या ओरिएंटेशन मार्क से स्पष्ट है) झुकाव अक्ष के लंबवत है।
    नोट: विभिन्न निर्माताओं के माइक्रोस्कोप को विभिन्न सॉफ्टवेयर, जैसे, टोमो 5, टीओएम, या सीरियलईएम20 का उपयोग करके नियंत्रित किया जा सकता है। यहां, उत्तरार्द्ध पर ध्यान केंद्रित किया गया है।
  2. लैमेला युक्त प्रत्येक ग्रिड स्क्वायर के लिए ग्रिड मोंटाज और अवलोकन प्राप्त करें। सुनिश्चित करें कि आवर्धन और एक्सपोज़र समय कुल इलेक्ट्रॉन खुराक में महत्वपूर्ण रूप से जोड़े बिना टीईएम छवियों में फिड्यूशियल मोतियों की कल्पना करने के लिए उपयुक्त है। प्रत्येक लैमेला के उच्च-रिज़ॉल्यूशन टीईएम मानचित्र (मोंटाज) प्राप्त करें।
  3. रजिस्टर और 3 डी -2 डी एफएलएम स्टैक को टीईएम ग्रिड स्क्वायर और 3डीसीटी में लैमेला अवलोकन के साथ सहसंबंधित करते हैं। प्रतिदीप्ति (एक्स, वाई, जेड - गॉसियन फिट) और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप छवियों में संबंधित मोती स्थितियों का चयन करके चरण 3.6 में वर्णित समान प्रक्रिया का उपयोग करें। फिर, एफएलएम चैनलों में रुचि के पदों का चयन करें और उन्हें टीईएम अवलोकन में स्थानांतरित करें। यदि आवश्यक हो, तो दो-चरणीय प्रक्रिया का उपयोग करें जिसमें एफएलएम और कम आवर्धन टीईएम के बीच पहला सहसंबंध शामिल है, और दूसरा कम से उच्च आवर्धन टीईएम (चित्रा 5) है।
  4. पदों को या तो मैन्युअल रूप से स्थानांतरित करें (स्थलों की दूरी को मापकर), सीरियलईएम20 के भीतर उपलब्ध पंजीकरण और मानचित्र उपकरण, या बाहरी सॉफ्टवेयर जैसे CorRelator21.
  5. सहसंबद्ध पदों पर झुकाव-श्रृंखला सेट करें और चलाएं। एक उपयुक्त आवर्धन, डीफोकस और कुल खुराक का उपयोग करें (विवरण के लिए सामग्री की तालिका और तालिका 1 देखें)। लैमेला द्वारा निर्धारित पूर्व-झुकाव पर अधिग्रहण शुरू करें (चरण 3.4 में नोट भी देखें) और खुराक-सममित झुकाव योजना22 का उपयोग करें। या तो मैन्युअल या बैच अधिग्रहण का उपयोग करें।

Figure 5
चित्रा 5: टीईएम में सहसंबद्ध पदों का स्थानीयकरण। सफल 3 डी-कोररिलेटिव एफआईबी मिलिंग और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप में स्थानांतरण के बाद, एफएलएम स्टैक्स में फिड्यूशियल बीड्स (रंगीन बक्से) के बीच प्रत्येक मिल्ड स्क्वायर के लिए 3 डी -2 डी पंजीकरण किया जाता है और क्रायो-ईटी (लाल घेरे) के लिए संभावित साइटों को स्थानीयकृत करने के लिए टीईएम अवलोकन किया जाता है। उच्च आवर्धन लैमेला अवलोकन (ज़ूम-इन) तब टोमोग्राम को अधिक सटीक रूप से स्थापित करने के लिए प्राप्त किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Representative Results

प्रोटोकॉल ईएच डोमेन युक्त और एंडोसाइटोसिस प्रोटीन 1 (ईडीई 1) -निर्भर एंडोसाइटिक प्रोटीन जमा (ईएनडी) और ऑटोफैजिकनिकायों में इसके क्षरण और फंसने के लिए उपयोग की जाने वाली पाइपलाइन का वॉक-थ्रू प्रदान करता है। सेरेविसिया में एंड एक तरल-तरल चरण-अलग कम्पार्टमेंट है, जो असफल एंडोसाइटिक घटनाओं के बाद क्लैथ्रिन-मध्यस्थता एंडोसाइटोसिस (सीएमई) में शामिल विभिन्न प्रकार के प्रोटीन को बफर करता है। इसके मुख्य घटकों में से एक एडीई 1 है, जो सीएमई घटक के रूप में और इस नए एलएलपीएस डिब्बे के क्षरण के लिए एक चयनात्मक ऑटोफैगी रिसेप्टर के रूप में दोगुना हो जाता है। तदनुसार, अल्कोहल डिहाइड्रोजनेज (एडीएच) प्रमोटर के नियंत्रण में एडीई 1 (ईजीएफपी-ईडीई 1) के ईजीएफपी संलयन का उपयोग ईएनडी की कल्पना करने के लिए किया गया था क्योंकि एडीई 1 ओवरएक्प्रेशन एंडोसाइटोसिस के शुरुआती चरणों में हस्तक्षेप करता है और इसलिए संवैधानिक रूप से एलएलपीएस को प्रेरित करता है।

ईजीएफपी-ईडीई 1 के साथ एक डुबकी-जमे हुए ग्रिड पर खमीर कोशिकाओं और 1 μm fiducial मार्करों को अतिरंजित करते हुए, जीएफपी चैनल में एफएलएम स्टैक अधिग्रहण के लिए पांच पदों का चयन किया गया था (चित्रा 6 ए; चित्र 6 ए) टीएफएस कोरसाइट; कॉन्फोकल मोड, 300 एनएम फोकस चरण आकार, 10 μm रेंज)। ग्रिड को एफआईबी उपकरण (क्वांटा 3 डी एफईजी) में स्थानांतरित कर दिया गया था, और ग्रिड वर्ग जिनके लिए एफएलएम स्टैक का अधिग्रहण किया गया था, की पहचान प्रतिदीप्ति और एसईएम ग्रिड अवलोकन (चरण 3.2 की तुलना) के 2 डी -2 डी सहसंबंध का प्रदर्शन करके की गई थी।

चुने गए वर्गों में से प्रत्येक के लिए, आयन बीम छवियों को कम धारा (10 पीए, 1200 एक्स आवर्धन) पर लिया गया था, और इसी तरह की भौतिक स्थिति 3डीसीटी में पंजीकृत की गई थी। रुचि की जैविक विशेषता के साथ पदों के चयन और एफएलएम स्टैक के भीतर उनकी 3 डी स्थिति को फिट करने के बाद, पाया गया परिवर्तन कथित एंड पदों पर लागू किया गया था, और लैमेला तैयारी के लिए साइटों का चयन किया गया था (चित्रा 6 बी)। ग्रिड की सतह के सापेक्ष 11 ° झुकी हुई एक एफआईबी बीम का उपयोग यहां दिखाए गए उदाहरणों में किया गया था (45 ° एफआईबी शटल पूर्व-झुकाव; 18 ° चरण झुकाव)। रुचि के पदों को स्थानांतरित कर दिया गया था, और एफआईबी पैटर्न को मैन्युअल रूप से तैयार किया गया था (चित्रा 6 डी) एफआईबी छवि में प्रमुख स्थलों के सापेक्ष अनुमानित पदों की दूरी को मापकर (जैसे, छेद, बर्फ संदूषण, भौतिक मोती)। पंजीकरण की सटीकता का मूल्यांकन जानबूझकर मोतियों को छोड़कर किया गया था जिन्हें एफएलएम और आईबी छवि में स्पष्ट रूप से पहचाना जा सकता था, और फिर आयन बीम दृश्य में उनकी वास्तविक और अनुमानित स्थितियों की तुलना की गई थी (उदाहरण के लिए, चित्रा 6 बी, सी में हीरा)। चित्रा 6 सी में दिखाए गए वर्ग के लिए सहसंबंध सटीक पाया गया (यानी, एफएलएम बीड पदों की अनुमानित स्थिति पूरी तरह से उनके संबंधित आईबी स्थान के साथ मेल खाती है और 3डीसीटी ने पंजीकरण के लिए उप-पिक्सेल आरएमएसई मूल्यों की सूचना दी है)। इस प्रकार, लैमेला को अनुमानित स्थिति (साइट बी) पर काटा गया और ~ 200 एनएम (अंतिम पैटर्न ऑफसेट) की मोटाई तक बारीक किया गया।

Figure 6
चित्रा 6: खमीर में एंडोसाइटिक प्रोटीन जमा (ईएनडी) के 3 डी-कोररिलेटिव लक्ष्यीकरण के लिए प्रतिनिधि परिणाम। (ए) मिलिंग से पहले ग्रिड का एसईएम अवलोकन। रंगीन बक्से ग्रिड वर्गों को इंगित करते हैं जिनके लिए प्रतिदीप्ति ढेर पहले से लिए गए थे। (बी-सी) ग्रिड वर्ग में 3 डी सहसंबंध। एफएलएम डेटा (बी, यहां अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण के रूप में दिखाया गया है) और आयन बीम छवि (सी) में कई संबंधित फिड्यूशियल बीड्स (रंगीन बक्से) पंजीकृत करने के बाद, हीरे के साथ इंगित मोती की स्थिति की भविष्यवाणी करके 3 डी पंजीकरण की सटीकता को सत्यापित किया गया था। इसके बाद, दो संभावित मिलिंग साइटों के लिए आयन बीम दृश्य में लक्ष्य संकेत (लाल घेरे) की स्थिति की भविष्यवाणी की गई थी। (डी) साइट बी का ज़ूम-इन तीन लक्ष्य पंक्टा (लाल घेरे) और प्रारंभिक मिलिंग पैटर्न (पीले बक्से) की अनुमानित स्थिति को दर्शाता है। एक चौथे फ्लोरेसेंस पंक्टम को अन्य पंक्टा की तुलना में बहुत कम होने की भविष्यवाणी की गई थी और इसलिए मिलिंग (ग्रे सर्कल) के दौरान लक्षित नहीं किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

सफल एफआईबी मिलिंग और क्रायो-ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप में ग्रिड के हस्तांतरण के बाद (टाइटन क्रिओस 300 केवी पर संचालित और गैटन के 2 प्रत्यक्ष इलेक्ट्रॉन डिटेक्टर और बायोक्वांटम ऊर्जा फिल्टर से लैस), सीरियलईएम में एक ग्रिड अवलोकन दर्ज किया गया था और लैमेला के साथ वर्गों का पता लगाने के लिए उपयोग किया गया था। प्रत्येक लैमेला के लिए, अवलोकन छवियों का अधिग्रहण किया गया था, और एफएलएम डेटा को 3डीसीटी (3 डी -2 डी) में इसी फिड्यूशियल बीड्स का उपयोग करके पंजीकृत किया गया था। ब्याज की जैविक विशेषताओं (चित्रा 7 ए) की स्थिति की भविष्यवाणी तब भौतिक मोतियों से गणना किए गए परिवर्तन का उपयोग करके की गई थी। उच्च आवर्धन पर दर्ज किए गए लैमेला अवलोकन सिले गए थे, और रुचि की साइटें स्पष्ट रूप से दिखाई देने वाले स्थलों (जैसे, फिड्यूशियल मोती) का उपयोग करके सहसंबद्ध थीं। वैकल्पिक रूप से, शास्त्रीय सीएलईएम अवलोकन विभिन्न सॉफ्टवेयरों10,12 में उत्पादित किया जा सकता है।

सहसंबंध के आधार पर, चित्र 7 ए में दिखाए गए लैमेला के लिए टोमोग्राम अधिग्रहण के लिए चार संभावित साइटें पाई गईं। हालांकि, इसमें एक ऐसी स्थिति भी शामिल है जिसे 3 डी-सहसंबद्ध एफआईबी-मिलिंग (चित्रा 6 डी; ग्रे सर्कल की तुलना) और बर्फ संदूषण (चित्रा 7; ग्रे बक्से) द्वारा अवरुद्ध स्थिति के दौरान लक्षित नहीं किया गया था। तदनुसार, टोमोग्राम केवल दो पदों के लिए दर्ज किया जा सकता है (चित्रा 7 बी)। कुल मिलाकर, ~ 75% की सहसंबंध सफलता, यानी, टेम और एंड संरचनाओं में स्थानांतरण से बचने वाले लैमेला अनुमानित साइटों पर पाए गए थे, हासिल किए गए थे (12 सहसंबद्ध साइटें)। टोमोग्राम पुनर्निर्माण, विभाजन और टेम्पलेट मिलान के बाद, व्यक्तिगत अंत संरचनाओं को उनके मूल संदर्भ (चित्रा 7 सी, डी) के भीतर देखा जा सकता है। इसमें एंड के आसपास फेनेस्टेड एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर), लिपिड बूंदें कभी-कभी संपर्क करती हैं, और राइबोसोम शामिल हैं, जिन्हें एलएलपीएस डिब्बे से बाहर रखा गया है। एक साथ लिया गया, इससे पता चलता है कि कैसे 3 डी-कोररिलेटिव एफआईबी मिलिंग बरकरार कोशिकाओं से दुर्लभ जैविक प्रक्रियाओं की आणविक स्तर की जानकारी प्रदान कर सकती है।

Figure 7
चित्रा 7: क्रायो-ईटी के साथ अंत की कल्पना करने के लिए प्रतिनिधि परिणाम। (ए) चित्रा 6 में दिखाए गए मिलिंग साइट के कम आवर्धन टीईएम अवलोकन को आसानी से एफएलएम अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण (चित्रा 6 बी) के साथ सहसंबद्ध किया जा सकता है ताकि रुचि की जैविक विशेषताओं (लाल क्रॉस) को स्थानीयकृत किया जा सके। (बी) दूसरे चरण में, एक उच्च आवर्धन (सिले हुए) दृश्य को सहसंबद्ध किया जा सकता है, और टोमोग्राम अधिग्रहण (पीले बक्से) के लिए स्थान स्थापित किए जाते हैं। आउट-ऑफ-प्लेन सिग्नल (ग्रे बॉक्स, चित्रा 6 डी की तुलना) से उत्पन्न स्थानों को अनदेखा कर दिया गया था। (C-D) इस 3 डी-कोररिलेटिव एफआईबी दृष्टिकोण का उपयोग करके, एंडोसाइटिक प्रोटीन जमा (ईएनडी) को अपने मूल वातावरण में देखा जा सकता है। एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर), राइबोसोम, झिल्ली और लिपिड बूंदों जैसी संरचनाओं की पहचान और कल्पना की जा सकती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

प्लाज्मा क्लीनर सेटिंग्स
हैरिक प्लाज्मा क्लीनर पीडीजी -3 एक्सजी: रेडियो फ्रीक्वेंसी सेटिंग: "हाय", 30 एस; एन 2 प्लाज्मा
प्लंजर सेटिंग्स
TFS Vitrobot Mk IV: 100% आर्द्रता; ब्लोटफोर्स = 8; ब्लॉटटाइम = 10 एस; प्रतीक्षा समय 0 सेकंड; (यह अधिकांश निलंबन और अनुयायी कोशिकाओं के लिए काम करना चाहिए)
एफआईबी जीआईएस की स्थिति और समय
क्वांटा 3 डी एफईजी: झुकाव = 0, घूर्णन = -180, Z स्थिति = 13.5, तापमान सेटपॉइंट = 26.15° , समय = 8 s
TFS Scios: झुकाव = 0, घूर्णन = -180, Z स्थिति = 9.8, तापमान सेटपॉइंट = 28 ° C, समय = 7 s
टीएफएस एक्विलोस 1: सॉफ्टवेयर पूर्वनिर्धारित स्थिति, तापमान सेटपॉइंट = 28 °, समय = 7 एस
टीएफएस एक्विलोस 2: सॉफ्टवेयर पूर्वनिर्धारित स्थिति, तापमान सेटपॉइंट = 28 °, समय = 7 एस
FIB स्पटर कोटर सेटिंग्स
कोरम प्रणाली: कोरम प्रेप चैंबर में: 10 एमए, 40 एस
TFS Scios: 10 W, 500 V, 250 mA, 0.2 mbar, 15 s
टीएफएस एक्विलोस 1: 1kV, 10 mA, 10 Pa, 15 s
टीएफएस एक्विलोस 2: 1kV, 10 mA, 10 Pa, 15 s
टोमोग्राम अधिग्रहण
टाइटन क्रिओस Gi2 के 2 कैमरा, गैटन बायोक्वांटम ऊर्जा फिल्टर
20 ईवी स्लिट; 2 ° चरणों के साथ खुराक सममित झुकाव योजना (हेगन); +10° (लैमेला प्री-झुकाव!) से +70° और -50° से शुरू करें
टाइटन क्रिओस जीआई4 फाल्कन 4; सेलेक्ट्रिस एक्स ऊर्जा फिल्टर
10 ईवी स्लिट; 2 ° चरणों के साथ खुराक सममित झुकाव योजना (हेगन); +10° (लैमेला प्री-झुकाव!) से +70° और -50° से शुरू करें
एफएलएम अधिग्रहण
Corrsight (Confocal मोड) उद्देश्य: ज़ीस ईसी प्लान-नियोफ्लुअर 40×/0.9 एनए पोल; स्टैक अधिग्रहण पैरामीटर: एक्स-वाई पिक्सेल आकार = 161.25 एनएम, जेड चरण आकार = 300 एनएम।
लीका एसपी 8 क्रायो-कॉन्फोकल उद्देश्य: लीका एचसीएक्स पीएल एपीओ 50एक्स / स्टैक अधिग्रहण पैरामीटर: एक्स-वाई पिक्सेल आकार = 84 एनएम, जेड चरण आकार = 300 एनएम।

तालिका 1: परीक्षण किए गए उपकरणों और सुझाई गई सेटिंग्स की सूची।

Discussion

1. प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम

सेल कल्चर और ग्रिड प्लंगिंग पैरामीटर का अनुकूलन इस वर्कफ़्लो के लिए मौलिक है। एक परियोजना की शुरुआत में, टैगिंग रणनीतियों, कोशिकाओं और भौतिक मोतियों के वितरण को अनुकूलित करने और विभिन्न ग्रिड तैयारी और ब्लोटिंग मापदंडों का परीक्षण करने के लिए समय का निवेश करना उचित है। एक बेहतर डुबकी-जमे हुए नमूने के साथ काम करने से डाउनस्ट्रीम प्रसंस्करण में काफी सुविधा होगी।

किसी भी टीईएम प्रयोग के लिए, विट्रस नमूने की आवश्यकता होती है। हेला जैसे बड़े स्तनधारी कोशिकाओं के लिए, प्रति ग्रिड वर्ग में 1-2 कोशिकाएं बेहतर होती हैं, लेकिन कोशिकाएं अभी भी उच्च घनत्व पर विट्रस हो सकती हैं। वैकल्पिक रूप से, स्तनधारी कोशिकाओं (जैसे, एचईके 293, हेला) में विट्रीफिकेशन में सुधार किया जा सकता है, उन्हें 23 गिरने से 10 मिनट पहले कल्चर माध्यम में 2.5-10% (वी / वी) ग्लिसरॉल के साथ जोड़ाजाता है। यदि उपलब्ध हो, तो ग्रिड पैटर्निंग का उपयोग कोशिकाओं के सही प्लेसमेंट और वितरण को सुनिश्चित करने के लिए किया जा सकता है, जिससे विट्रीफिकेशन और बाद में सहसंबंधमें सुधार होता है।

जबकि वर्कफ़्लो के दौरान विशिष्ट कोशिकाओं का चयन किया जा सकता है, बहुत कम कोशिकाएं जो रुचि की जैविक विशेषता दिखाती हैं, समग्र थ्रूपुट को काफी कम कर देंगी। पीओआई-पॉजिटिव कोशिकाओं में सहसंबंध में सुधार करने के लिए, पर्याप्त उज्ज्वल फ्लोरोफोर का उपयोग किया जाना चाहिए। यह अंतर्जात अभिव्यक्ति स्तरों पर विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। हमने पाया कि क्रायो-स्थितियों के तहत, एमवीनस ने अक्सर अपनी बढ़ी हुई चमक25 और हाइप्सोक्रोमिक शिफ्ट के कारण ईजीएफपी से बेहतर प्रदर्शन किया, जो इसे क्रायो-कंडीशन26 के तहत मानक जीएफपी फिल्टर सेटअप के लिए उपयुक्त रखता है। गैर-बिंदु जैसी लक्ष्य संरचनाओं के लिए, तरंग दैर्ध्य और स्थानीयकरण सटीकता (अब्बे विवर्तन सीमा) के बीच व्यापार-बंद पर भी विचार किया जाना चाहिए।

कुशल 3 डी-सहसंबंध के लिए यह भी आवश्यक है कि ग्रिड यांत्रिक रूप से स्थिर हों और उन्हें बहुत सावधानी से संभाला जाए। जबकि कार्बन समर्थन के साथ मानक सोने या तांबे के ग्रिड का उपयोग किया जा सकता है, परियोजना के आधार पर अधिक कठोर एसआईओ2 फिल्मों का उपयोग करके सफलता दर में काफी वृद्धि हो सकती है। हालांकि, यह अभी तक निर्णायक रूप से निर्धारित नहीं किया गया है कि (ए) यांत्रिक स्थिरता या (बी) क्रायो-रिंकलिंग27 को कम करने के लिए थर्मल विस्तार गुणांक (सब्सट्रेट बनाम फिल्म) का मिलान, सफल 3 डी सहसंबंध के लिए सबसे महत्वपूर्ण कारक है। इसके अलावा, नाजुक एयू ग्रिड उठाने के लिए, पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन-लेपितव्यंजनों का उपयोग किया जा सकता है।

नमूना स्थिरता सुनिश्चित करने के अलावा, उच्च गुणवत्ता वाले प्रतिदीप्ति ढेर प्राप्त करने के लिए एफएलएम इमेजिंग मापदंडों का सावधानीपूर्वक विकल्प आवश्यक है जो एफआईबी मिलिंग के दौरान इष्टतम लक्ष्यीकरण के लिए उपयुक्त हैं। इस संबंध में, एफएलएम डेटा पर विभिन्न डीनोइज़िंग28 या डीकॉन्वोल्यूशन तकनीकों का परीक्षण करने की भी सलाह दी जाती है, क्योंकि यह फिड्यूशियल ्स और सेलुलर संकेतों के स्थानीयकरण में काफी सुधार कर सकता है। फ्लोरेसेंस सिग्नल को एफआईबी-एसईएम छवियों से संबंधित करते समय, फिड्यूशियल मोतियों का एक अच्छा नमूना महत्वपूर्ण है। उन्हें कोशिकाओं के चारों ओर और संभवतः विभिन्न जेड ऊंचाइयों पर अच्छी तरह से वितरित किया जाना चाहिए। मोतियों की अनुमानित बनाम वास्तविक स्थितियों की जांच करके सहसंबंध की स्थिरता को मान्य करना भी अच्छा अभ्यास है जो जानबूझकर फिड्यूशियल मॉडल से बाहर छोड़ दिए गए थे, लेकिन स्पष्ट रूप से आंखों से सहसंबद्ध किया जा सकता है। पंजीकरण स्थिरता की जांच करने के लिए 3डीसीटी के आरएमएसई मूल्यों पर भी हमेशा विचार किया जाना चाहिए।

चूंकि एफआईबी-एसईएम कक्ष (यानी, पुन: संदूषण) से मिल्ड सामग्री और अवशिष्ट पानी का जमाव इसके दोनों किनारों पर अनाकार सामग्री जोड़कर प्रभावी लैमेला मोटाई को बढ़ाता है, माइक्रोस्कोप में लंबे समय तक बारीक-मिल्ड लैमेला रखने से आम तौर पर अतिरिक्त इलेक्ट्रॉन प्रकीर्णन घटनाओं के कारण टीईएम डेटा की गुणवत्ता कम हो जाती है। तदनुसार, मिलिंग अक्सर दो-चरणीय फैशन में की जाती है: सबसे पहले, सभी पदों को मोटे तौर पर (यानी, लगभग 800 एनएम तक) मिलाया जाता है, और फिर बारीक (~ 150-250 एनएम तक), और अंतिम लैमेला पूरा होने के तुरंत बाद ग्रिड को अनलोड किया जाता है। हालांकि, साइट-वार तरीके से रुचि के पदों को संसाधित करके बेहतर सहसंबंध सफलता प्राप्त की जा सकती है, इसलिए एक दूसरे के बाद सीधे एक ही लैमेला पर खुरदरी और ठीक मिलिंग करना क्योंकि इससे झुकने या विरूपण के लिए कोई समय नहीं बचता है। यह, हालांकि, सिस्टम की पुन: संदूषण दर के आधार पर प्रति ग्रिड उत्पादित किए जा सकने वाले लैमेला की अधिकतम संख्या को कम करता है। 20 एनएम / घंटा की दर के लिए, 1-1.5 घंटे के भीतर 4-6 लैमेला का उत्पादन किया जाता है।

पूरे ग्रिड या रफ-मिल्ड लैमेला >300 एनएम के आंदोलन के परिणामस्वरूप खराब या असफल सहसंबंध होगा (नीचे चर्चा की गई सीमाएं भी देखें)। इसलिए इसे नियमित रूप से जांचना चाहिए, उदाहरण के लिए, एफआईबी मिलिंग से पहले, दौरान और बाद में आईबी छवियों की तुलना करके। महत्वपूर्ण आंदोलन (>300 एनएम) दिखाने वाली साइटों को छोड़ दिया जाना चाहिए। इन आंदोलनों से बचने के लिए नमूना तैयारी (यानी, ग्रिड प्रकार, सेल घनत्व और प्लंगिंग मापदंडों की पसंद; प्रोटोकॉल अनुभाग 1 देखें) और मिलिंग रणनीति का अनुकूलन करें। चरण 3.6 में वर्णित साइट-वार मिलिंग और लैमेला चौड़ाई को कम करके लैमेला झुकने को काफी कम किया जा सकता है। जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, जबकि तनाव राहत कटौती15 को लैमेला झुकने को कम करने के लिए डिज़ाइन किया गया है, वे अक्सर डी-युग्मित लैमेला के एक ठोस आंदोलन के परिणामस्वरूप होते हैं, जिससे सहसंबंध को प्रभावी ढंग से रोका जा सकता है। इस समस्या को हल करने के लिए एकीकृत FLM सिस्टम का उपयोग किया जा सकता है।

2. विधि के संशोधन और समस्या

क्रायो-स्थितियों में जाने से पहले लाइव-सेल इमेजिंग में नमूने का संपूर्ण लक्षण वर्णन करने की अत्यधिक सलाह दी जाती है। सेलुलर नमूनों, उपचार योजनाओं को अनुकूलित करना, और यह जानना कि क्रायो-वर्कफ़्लो में प्रवेश करने से पहले किस तरह के संकेत की उम्मीद की जाती है, इसकी सफलता दर में काफी सुधार हो सकता है।

यहां प्रस्तुत वर्कफ़्लो में, क्रायो-स्टेज के साथ एक स्टैंड-अलोन फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग नमूनों की छवि बनाने के लिए किया जाता है, इसके बाद ग्रिड को केंद्रित आयन बीम माइक्रोस्कोप में स्थानांतरित किया जाता है। हालांकि, यह उन प्रणालियों पर परीक्षण किया गया है जहां एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप एफआईबी-एसईएम कक्ष में एकीकृत है, और इसलिए प्रतिदीप्ति छवियों 29,30,31 को प्राप्त करने के लिए कोई नमूना हस्तांतरण की आवश्यकता नहीं है। इस तरह के एकीकृत प्रणालियों का उपयोग करके, अंतिम लैमेला को दूषित करने के जोखिम को बढ़ाए बिना लक्ष्य प्रतिदीप्ति संकेत की उपस्थिति की जांच करने के लिए एफआईबी मिलिंग के दौरान और बाद में रुचि की स्थिति को चित्रित किया जा सकता है। हालांकि, उपयोग किए गए माइक्रोस्कोप के ऑप्टिकल मापदंडों को ध्यान में रखना महत्वपूर्ण है, उदाहरण के लिए, एक कम एनए उद्देश्य उस परिशुद्धता को सीमित करेगा जिसके साथ भौतिक मोती और लक्ष्य संकेतों को स्थानीयकृत किया जा सकता है। बहरहाल, एकीकृत एफएलएम सेटअप ग्रिड और लैमेला के मामूली विकृतियों से बेहतर ढंग से निपटने में मदद करेंगे, क्योंकि एफएलएम स्टैक को लगातार अपडेट किया जा सकता है और अप-टू-डेट एसईएम और आईबी दृश्यों की तुलना की जा सकती है।

एफआईबी मिलिंग और टीईएम डेटा अधिग्रहण के बीच लैमेला की प्रतिदीप्ति इमेजिंग के विकल्प के रूप में, पोस्ट-टीईएम सहसंबंध का उपयोग लैमेला 5,6 के सही प्लेसमेंट और मिलिंग को सत्यापित करने के लिए किया जा सकता है।

सहसंबंधित वर्कफ़्लो के सभी चरणों के दौरान, लेकिन विशेष रूप से टीईएम के दौरान, एफआईबी-एसईएम / टीईएम छवियों पर अनुमानित प्रतिदीप्ति डेटा का ओवरले बनाने की सिफारिश की जाती है। इस तरह के शास्त्रीय सीएलईएम दृश्य अधिक सहजता से समझने में मदद करते हैं कि कोशिकाओं का कौन सा हिस्सा लैमेला के भीतर निहित है। यह सहसंबंध की सटीकता को सत्यापित करने के लिए एक उपयोगी पवित्रता जांच के रूप में भी कार्य करता है।

3. विधि की सीमाएं

3 डी-कोररिलेटिव एफआईबी दृष्टिकोण के लिए उन नमूनों की आवश्यकता होती है जिन्हें फिड्यूशियल बीड्स के साथ आपूर्ति की जा सकती है। तदनुसार, यह विधि वर्तमान में डुबकी-जमे हुए ग्रिड तक ही सीमित है। उच्च दबाव (एचपीएफ) जमे हुए (ऊतक) नमूनों के लिए, वर्तमान में, केवल 2 डी -2 डी सहसंबंध किए जा सकते हैं। संभावित रूप से, आंतरिक फिड्यूशियल मार्कर (जैसे, ऑर्गेनेल, सना हुआ लिपिड बूंदें)इस समस्या का समाधान हो सकता है। अंतिम सहसंबंध सफलता दर कई कारकों पर निर्भर करती है, जिसमें नमूना गुणवत्ता, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी सेटअप, लैमेला मोटाई और लक्षित संरचना का आकार शामिल है। वर्णित 3 डी पंजीकरण दृष्टिकोण का उपयोग करके सहसंबंध सटीकता अंतिम आईबी छवि पर 200-300 एनएम की सीमा में होने का अनुमान है, जो मोटे तौर पर एफआईबी-मिल्ड लैमेला7 की विशिष्ट मोटाई के अनुरूप है। तदनुसार, इससे बहुत छोटी सेलुलर संरचनाओं को वर्तमान में लक्षित करना मुश्किल होगा। इसके अतिरिक्त, मिलिंग साइट (>300 एनएम) पर अत्यधिक आंदोलन भी सहसंबंध की सटीकता को कम करता है, एक मुद्दा जिसे संभावित रूप से एफआईबी / एसईएम उपकरणों में एकीकृत एफएलएम सेटअप के साथ संबोधित किया जा सकता है। मिलिंग के दौरान मजबूत विरूपण या झुकने वाले लैमेला को किसी भी मामले में, डाउनस्ट्रीम वर्कफ़्लो से बाहर रखा जाना चाहिए।

कुल मिलाकर, क्रायो-फ्लोरेसेंस इमेजिंग वर्तमान में अब्बे विवर्तन मानदंड द्वारा सीमित है। सुपर-रिज़ॉल्यूशन क्रायो-एफएलएम विधियों के अधिक नियमित अनुप्रयोग (और व्यावसायीकरण) के साथ, सेलुलर संरचनाओं का अधिक सटीक लक्ष्यीकरण संभव हो सकता है, खासकर जब ऑन-द-फ्लाई ऑपरेशन के लिए एफआईबी / एसईएम में एकीकृत किया जाता है।

4. विधि का महत्व

विशेष रूप से गैर-लक्षित और पोस्ट-सहसंबंध तकनीकों की तुलना में, 3 डी-सहसंबद्ध एफआईबी मिलिंग दृष्टिकोण समय और संसाधन लेने वाले टीईएम चरण से पहले उपयुक्त पदों के चयन की अनुमति देता है। यह, इस प्रकार, अधिक कुशल डेटा संग्रह और परियोजना योजना को सक्षम बनाता है। इसके अलावा, सहसंबद्ध प्रतिदीप्ति डेटा जानकारी की एक परत जोड़ता है जो टोमोग्राम की व्याख्या करने और बहु-स्तरीय परियोजनाओं में क्रायो-ईटी परिणामों को एकीकृत करने के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है, खासकर जब गैर-संरचित प्रोटीन असेंबली से निपटते हैं या टेम्पलेट मिलान और सबटोमोग्राम औसत के लिए बहुत छोटे होते हैं।

5. महत्व और संभावित भविष्य के अनुप्रयोग

उन्नत वर्कफ़्लोज़ जैसे कि एचपीएफ नमूनों से क्रायो-लिफ्टआउट 34,35, क्रायो-एफआईबी-एसईएम वॉल्यूम 36 और सुपर-रिज़ॉल्यूशन फ्लोरेसेंस इमेजिंग26,37,38,39 के संयोजन में, 3 डी-लक्षित लैमेला तैयारी न केवल पृथक कोशिकाओं में जैविक प्रक्रियाओं को विच्छेदित करने की संभावना प्रदान करती है, बल्कि ऊतक और रोगी के नमूनों को एफआईबी मिलिंग और क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी के लिए सुलभ बनाने की संभावना भी प्रदान करती है। जैसे, यह उच्च रिज़ॉल्यूशन पर पैथोलॉजिकल प्रक्रियाओं के विच्छेदन की अनुमति देगा और इस प्रकार नैनोस्केल में बायोप्सी की ओर एक अभिन्न बिल्डिंग ब्लॉक होगा।

Disclosures

लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

हम आईटी बुनियादी ढांचे का समर्थन करने के लिए इंगा वुल्फ, कम्प्यूटेशनल समर्थन के लिए फ्लोरियन बेक और पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए ओडा एच। फिलिप एस एर्डमैन को अलेक्जेंडर वॉन हम्बोल्ट रिटर्नर्स फैलोशिप और फ्लोरियन विल्लिंग को ईएमबीओ लॉन्ग-टर्म फैलोशिप एएलटीएफ 764-2014 के माध्यम से धन प्रदान किया गया था। अन्ना बीबर को बोहरिंगर इंगेलहेम फोंड्स पीएचडी फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Autogrids Thermo Fisher Scientific / Homemade 1036173 (no cutout), 1205101 (with cutout)
C-rings Thermo Fisher Scientific 1036171
Corrsight with cryo module Thermo Fisher Scientific FLM Alternative 1
Dynabeads MyOne COOH Thermo Fisher Scientific 65011 recommended 1 µm fiducial beads
EM Grids R1/4 SiO2 Quantifoil N1-S13nAu20-01
Falcon 4 camera w. post-column Selectris X energy filter Thermo Fisher Scientific Camera/Filter Alternative 1
FIB Aquilos 1 Thermo Fisher Scientific FIB Alternative 1
FIB Aquilos 2 Thermo Fisher Scientific FIB Alternative 2
FIB Quanta 3D FEG Thermo Fisher Scientific FIB Alternative 3
FIB Scios Thermo Fisher Scientific FIB Alternative 4
K2 summit camera w. post-column energy filter 968 Quantum K2 Gatan Camera/Filter Alternative 2
Leica TCS SP8 with cryo module Thermo Fisher Scientific FLM Alternative 2
Plasma Cleaner PDC-3XG Harrick
Teflon Sheet (0.25 mm) plastx24.de 11645 Cut to same dimensions as filter paper
TEM Titan Krios XFEG 300 kV Gi2 Thermo Fisher Scientific TEM Alternative 1
TEM Titan Krios XFEG 300 kV Gi4 Thermo Fisher Scientific TEM Alternative 2
THUNDER Imager  EM Cryo CLEM Thermo Fisher Scientific FLM Alternative 3
Vitrobot Mark IV Thermo Fisher Scientific alternativevly, use manaual plunger
Whatman filter paper Sigma Aldrich 10311807 55 mm diamater; needs to be cut to fit the Vitrobot

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References

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इस महीने जोव अंक 176 क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी क्रायो-केंद्रित आयन बीम मिलिंग सीटू संरचनात्मक जीव विज्ञान में।
उच्च-रिज़ॉल्यूशन क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी के लिए 3 डी-कोररिलेटिव केंद्रित आयन बीम मिलिंग द्वारा नमूना तैयारी
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Bieber, A., Capitanio, C., Wilfling, … More

Bieber, A., Capitanio, C., Wilfling, F., Plitzko, J., Erdmann, P. S. Sample Preparation by 3D-Correlative Focused Ion Beam Milling for High-Resolution Cryo-Electron Tomography. J. Vis. Exp. (176), e62886, doi:10.3791/62886 (2021).

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