Summary
Hier presenteren we een pijplijn voor 3D-correlatieve gerichte ionenbundelfrezen op het begeleiden van de voorbereiding van cellulaire monsters voor cryo-elektronentomografie. De 3D-positie van fluorescerend gelabelde eiwitten van belang wordt eerst bepaald door cryo-fluorescentiemicroscopie en vervolgens gericht op frezen. Het protocol is geschikt voor zoogdieren, gisten en bacteriële cellen.
Abstract
Cryo-elektronentomografie (cryo-ET) is de voorkeursmethode geworden voor het onderzoeken van cellulaire ultrastructuur en moleculaire complexen in hun oorspronkelijke, bevroren-gehydrateerde toestand. Cryo-ET vereist echter dat monsters dun genoeg zijn om de invallende elektronenbundel niet te verstrooien of te blokkeren. Voor dikke cellulaire monsters kan dit worden bereikt door cryo-gerichte ionenbundel (FIB) frezen. Dit protocol beschrijft hoe specifieke cellulaire locaties tijdens FIB-frezen kunnen worden gericht met behulp van een 3D-correlatieve benadering, die driedimensionale fluorescentiemicroscopiegegevens combineert met informatie van de FIB-scannende elektronenmicroscoop. Met behulp van deze techniek kunnen zeldzame cellulaire gebeurtenissen en structuren met hoge nauwkeurigheid worden gericht en gevisualiseerd op moleculaire resolutie met behulp van cryo-transmissie elektronenmicroscopie (cryo-TEM).
Introduction
Gefocusseerd ionenbundelfrezen maakt de bereiding van dunne biologische monsters van cryo-gefixeerde monsters mogelijk zonder de problemen die gewoonlijk gepaard gaan met mechanische secties zoals mesmarkeringen en compressieartefacten1. In combinatie met cryo-elektronentomografie maakt FIB-frezen biologische studies met hoge resolutie van de cellulaire morfologie en bepaling van de structuur van macromoleculaire complexen rechtstreeks vanuit cellen mogelijk met subnanometerresolutie 2,3,4. Hoewel overvloedige soorten, zoals ribosomen, gemakkelijk worden gevonden in willekeurig gesneden FIB-lamellen, zijn veel cellulaire processen afhankelijk van de colokalisatie van verschillende complexen of zijn ze gelokaliseerd op specifieke plaatsen in de cel. Bijgevolg is efficiënte targeting vereist om het biologische kenmerk van belang tijdens het freesproces niet te verliezen en beperkt te blijven tot willekeurige treffers. Een correlatieve benadering die gegevens van de scanning elektronenmicroscoop (SEM)-FIB en een cryo-fluorescentielichtmicroscoop (FLM) combineert, is daarom noodzakelijk. Hoewel het mogelijk is om de initiële correlatie weg te laten en FLM- en cryo-ET-gegevens pas na TEM-acquisitie5,6 te combineren, maakt fluorescentiegeleid gericht ionenbundelfrezen een nauwkeurige selectie van het freesgebied vooraf mogelijk, wat resulteert in een efficiëntere gegevensverzameling. Sinds de conceptie7 was de toepassing van 3D-gecorreleerd FIB-frezen in biologische studies beperkt totdat we onlangs meldden dat we met behulp van deze techniek een nieuw vloeibaar-vloeibaar fasegescheiden (LLPS) compartiment in gist identificeerden8.
Hier wordt een gegeneraliseerd 3D cryo-gecorreleerd licht- en elektronenmicroscopieprotocol (CLEM) beschreven, dat kan worden gebruikt om een breed scala aan monsters te bestuderen, variërend van bacteriën tot gist- en zoogdiercellen. Hoewel de experimenten werden uitgevoerd met behulp van een bepaalde set instrumenten, zijn de afzonderlijke stappen niet gebonden aan specifieke hardware en kunnen ze gemakkelijk worden overgedragen naar andere systemen als een uitbreiding op bestaande protocollen 3,5. Een lijst met geteste apparatuur en voorgestelde instellingen vindt u in de materiaaltabel en tabel 1. De vier belangrijkste stappen van de pijplijn zijn (1) monstervoorbereiding, (2) lokalisatie van interessante kenmerken door cryofluorescentiemicroscopie, (3) 3D-gecorreleerd gefocusseerd ionenbundelfrezen en (4) lokalisatie van de beoogde structuren voor cryo-ET-gegevensverzameling op de lamellen in de cryotransmissie-elektronenmicroscoop (figuur 1).
Protocol
Figuur 1: Samenvatting van de workflow met een selectie van kritieke stappen. Het hele protocol is verdeeld in vier fasen volgens de gebruikte apparatuur: monstervoorbereiding, inclusief dompelbevriezing, cryo-fluorescentiemicroscopie, cryo-gerichte ionenbundelfrezen en cryo-elektronenmicroscopie. Voor elke stap worden verschillende belangrijke punten gemarkeerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
1. Celkweek en ondervriezen van roosters
- Kweek cellen naar keuze en optimaliseer etiketterings- en behandelingsstrategieën bij kamertemperatuur voordat u overgaat op cryo-experimenten. Doelwitten van belang worden ofwel gelabeld met behulp van fluorescerende eiwitfusies of levende kleuring (bijv. Halo-Tag, LysoTracker, BODIPY, levende antilichaamkleuring, enz.). Als behandeling met chemische of biologische agentia (kleine moleculen, speciale media, siRNA, enz.) nodig is om het biologische proces van belang te onderzoeken, optimaliseer dan de omstandigheden (bijv. Tijd, concentratie) met behulp van live-cell FLM-beeldvorming.
- Zorg ervoor dat de interessante locaties met succes boven de achtergrond kunnen worden gelokaliseerd in een voldoende aantal cellen met behulp van beeldvormingsinstellingen die zo goed mogelijk overeenkomen met latere cryo-omstandigheden (d.w.z. NA, blootstellingstijd, enz.).
- Selectie en voorbereiding van roosters
- Selecteer rasters met gatgrootte en afstand die geschikt zijn voor de gebruikte cellen en fiduciale markeringen (zie stap 1.3.1). Gebruik geen continue film zonder gaten, omdat dit kan leiden tot te veel restbuffer na het blotten en dus de verglazingsefficiëntie vermindert en de detectie van fiduciale kralen belemmert. Voor langdurig contact van de cellen met de roosters, moet u ervoor zorgen dat de rasterondersteuning en het filmmateriaal biocompatibel zijn.
- Plasma-reinig de cryo-EM-roosters om ze meer hydrofiel te maken. Voor gebruik in hechtende celkweek, steriliseer de roosters na plasmareiniging met UV-straling gedurende 20 minuten in een laminaire stroomkap. Optioneel kunnen roosters worden voorbehandeld met verbindingen die helpen bij celadhesie, zoals poly-L-lysine of concanavaline A, zoals hieronder beschreven.
OPMERKING: Over het algemeen zijn de volgende raster/monstercombinaties met succes gebruikt in de correlatieve cryo-FIB-workflow: Gist: Cu of Au, 200 mesh, R1/4 koolstof of SiO2 film, optioneel gecoat met concanavaline A; Escherichia coli: Cu of Au, 200 mesh, R1/4 carbon of SiO2 film; Chlamydomonas reinhardtii: Cu of Au, 200 mesh, R1/2 of R1/4 carbon of SiO2 film; HeLa: Au, 200 mesh, R1/4 SiO2 film, gecoat met poly-L-lysine; HEK293: Au, 200 mesh, R1/4 SiO2 film, gecoat met poly-L-lysine. - Concanavaline Een coating om de aanhechting van gistcellen te verbeteren:
- Bereid een coatingoplossing van 1 mg/ml concanavaline A in 10 mM HEPES-buffer met 100 μM CaCl2, pH 8,5. Plaats één druppel (50 μL) van de coatingoplossing en twee druppels gedestilleerd water afzonderlijk op een stuk paraffinefilm.
- Pak het plasmagereinigde rooster op met een pincet met omgekeerde kracht en steek het voorzichtig in de druppel van de coatingoplossing, vermijd bewegingen loodrecht op het rooster om schade aan de film te voorkomen.
- Na ~ 5 s incubatie, was het rooster twee keer door het op een vergelijkbare manier in de druppels water te steken. Dep ten slotte de overtollige vloeistof af door een filterpapier op de achterkant van het rooster aan te brengen en laat het rooster volledig drogen voordat u het uit het pincet loslaat. Gebruik de gedroogde roosters voor het invriezen.
- Poly-L-lysine coating voor suspensiecultuur en aanhechtende cellen:
- Bereid een coatingoplossing van 1 mg/ml poly-L-lysine in 0,1 M natriumboraatbuffer, pH 8,5.
- Plaats plasmagereinigde roosters in een geschikte schaal voor celkweek en steriliseer gedurende 20 minuten door UV-straling.
- Voeg voorzichtig voldoende coatingoplossing toe om alle roosters te bedekken en incubeer gedurende ten minste 2 uur bij 37 °C. Zuig de vloeistof op en was de roosters twee keer voorzichtig met PBS voordat u de cellen tot de gewenste concentratie zaait.
- Bereiding van cellen en fiduciale kralen
OPMERKING: Fiduciale kralen zijn vereist voor 3D-registratie van de fluorescentiegegevens met afbeeldingen die zijn gemaakt in de FIB / SEM-microscoop om 3D-correlatief FIB-frezen mogelijk te maken.- Kies kralen die herkenbaar zijn in alle beeldvormingsmodaliteiten, d.w.z. FLM, SEM en IB (aanbevolen diameter 0,5-1 μm), maar zorg ervoor dat deze de cellulaire doelstructuur niet overtreffen tijdens fluorescentiebeeldvorming om het gemakkelijker te maken om de kralen en het biologische kenmerk van belang te onderscheiden. Verwijder cytotoxische conserveermiddelen in fiduciale kralen (bijv. NaN3) volgens de instructies van de fabrikant.
OPMERKING: Voor een gemakkelijker onderscheid tussen de biologische kenmerken van belang en de fiducialen, is het nuttig als fluorescentie-emissiespectra elkaar slechts gedeeltelijk overlappen, zodat signalen kunnen worden onderscheiden op basis van intensiteitsverschillen in de FLM-kanalen. - Als suspensiecultuur wordt gebruikt, kweek de cellen dan tot een geschikte dichtheid (bijv. gist OD 600 = 0,8, E. coli OD 600 = 0,8-1,0, C. reinhardtii 1500 cellen / μL) en voer behandelingen uit zoals vereist voor het experiment, zoals verandering van medium, toevoeging van chemicaliën, uithongering, enz. Bevestig de plasmagereinigde roosters aan een pincet zoals vereist voor de ploffmethode (handmatig / automatisch) en breng 4 μL van de celsuspensie gemengd met ~ 1 x 105 kralen / μL fiduciale kraalsuspensie aan op de filmzijde van de roosters.
OPMERKING: Bepaal de optimale verdunning van cellen en fiducialen in titratie-experimenten (bijvoorbeeld door de cryo-FLM of FIB/SEM te controleren, zie hieronder). Voor de meeste cellen die in suspensie worden gekweekt, is een eindconcentratie van ~ 1 x10 5 kralen / μL van de 1 μm fiduciale kralen (1: 20 verdunning uit voorraad; zie tabel met materialen voor details) een goed uitgangspunt gebleken. - Als een hechtende cultuur wordt gebruikt, reinig en steriliseer de roosters dan met behulp van UV-straling voor aseptische cultuur. Indien nodig, pre-coat roosters met verbindingen die de celhechting helpen (bijv. Poly-L-lysine, fibronectine, laminine; zie stap 1.2.2). Zaai en kweek cellen op de roosters in normale kweekschalen of schalen met onderverdelingen voor roosters.
- Behandel de monsters zoals nodig voor het experiment en houd de cellen in optimale omstandigheden tot het invriezen (bijv. 37 °C/5% CO2 voor HEK/HeLa). Verwijder voorzichtig de roosters van de kweekschaal en bevestig ze aan het plungerende pincet. Breng 4 μL van het kweekmedium gemengd met fiducialen (1 x 105 kralen/μL voor 1 μm fiducialen) aan op de celdragende zijde.
- Kies kralen die herkenbaar zijn in alle beeldvormingsmodaliteiten, d.w.z. FLM, SEM en IB (aanbevolen diameter 0,5-1 μm), maar zorg ervoor dat deze de cellulaire doelstructuur niet overtreffen tijdens fluorescentiebeeldvorming om het gemakkelijker te maken om de kralen en het biologische kenmerk van belang te onderscheiden. Verwijder cytotoxische conserveermiddelen in fiduciale kralen (bijv. NaN3) volgens de instructies van de fabrikant.
- Vries de cellen in met behulp van een handmatige of een geautomatiseerde invriesprocedure. Dep het rooster indien mogelijk alleen van de kant tegenover de cellen om te voorkomen dat de cellen mechanisch worden beschadigd (figuur 2A). Op tweearmige geautomatiseerde plunging-systemen bereikt u dit door een polytetrafluorethyleen (bijv. Teflon) vel te plaatsen in plaats van vloeipapier op de pad tegenover de cellen. Breng de roosters over naar opslagboxen en bewaar ze in vloeibare stikstof (lN2) tot gebruik.
LET OP: lN2 en andere cryogenen kunnen ernstige schade aan de ogen en huid veroorzaken. Gebruik persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM' s) en werk alleen in een goed geventileerde ruimte om de opbouw van gevaarlijke N2-concentraties te voorkomen.
OPMERKING: Alle volgende stappen kunnen het beste worden uitgevoerd in de vloeibare fase van lN2 om besmetting van de cel- en lamellenoppervlakken te voorkomen, omdat dit de verwerking stroomafwaarts kan bemoeilijken. Verminder contact met drijvende ijskristallen door altijd schone vloeibare stikstof te gebruiken (bijv. Filter om drijvend ijs te verwijderen), onnodige overdrachtsstappen te elimineren en, indien mogelijk, te werken in een vochtige omgeving. - Monteer en knip de diepgevroren roosters in AutoGrids met uitsparing en de cellen naar boven gericht (figuur 2A) voor daaropvolgende cryo-fluorescentiebeeldvorming en FIB-frezen. Om een goede uitlijning van de monsters in de TEM te garanderen, moet de freesrichting orthogonaal zijn ten opzichte van de cryo-ET-kantelas. Plaats daarom de oriëntatiemarkeringen (bijv. LASER-gravering of verwijderbare markeringstippen) op AutoGrids voordat u uitknipt om te helpen bij deze uitlijning (afbeelding 2A).
- Screen de rasterkwaliteit (figuur 2B) op de cryo-FLM en FIB/SEM. Optimaliseer de celdichtheid, blottingtijd en kracht om een gelijkmatige verdeling van cellen en kralen te krijgen. Gebruik beeldvorming van gereflecteerd licht op een cryofluorescentiemicroscoop of gebruik de cryo-FIB-SEM om ervoor te zorgen dat zowel cellen als fiduciale kralen duidelijk zichtbaar zijn (figuur 2B, witte pijlen).
- Herhaal indien nodig het duiken met betere omstandigheden, bijvoorbeeld een variërende celconcentratie en/of de blottingtijd. Zodra geschikte duikparameters zijn gevonden, herhaalt u de rasterscreening niet voor elke nieuwe ronde van experimenten.
Figuur 2: Screening op geschikte roosters met behulp van SEM en IB . (A) Oriëntatiemarkeringen moeten loodrecht op de freesrichting op de AutoGrids worden geplaatst om de juiste belasting in de TEM te vereenvoudigen. Cellen worden naar boven gemonteerd in het geassembleerde AutoGrid. (B) Na het bevriezen van de duik worden roosters geïnspecteerd in de SEM om de duikomstandigheden te evalueren en te optimaliseren: a) Er mogen niet te veel cellen per rooster zijn. Gebruik voor HeLa-cellen bijvoorbeeld niet meer dan 1-4 cellen / vierkant. Voor kleinere cellen zoals Saccharomyces cerevisiae (hier afgebeeld) zijn klonten van 4-6 cellen nuttig gebleken. b) Fiduciale kralen (witte pijlen) moeten duidelijk zichtbaar zijn en er mag niet te veel buffer rond de cellen zijn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
2. Cryo-fluorescentielichtmicroscopie
- Verkrijg voor elk raster een overzicht in (widefield) fluorescentie en differentieel interferentiecontrast (DIC) of gereflecteerde modus en selecteer geschikte rastervierkanten met fluorescentiesignaal. Kies gezichtsvelden die zowel de cellen van belang als een voldoende aantal fiduciale markeringen (6-12) bevatten.
- Zorg ervoor dat de cellen en kralen gelijkmatig verdeeld zijn, niet te dicht en naar het midden van elk vierkant. Kies alleen vierkanten die zowel toegankelijk zijn voor het FIB-SEM- als het TEM-instrument, vandaar die op ten minste drie vierkanten afstand van de rasterrand op 200 netrasters (figuur 3A, binnen de rode cirkel).
- Verkrijg op elk van de geselecteerde rastervierkanten een fluorescerende stapel met een focusstap die geschikt is voor latere deconvolutie, d.w.z. <1/2 van de axiale resolutielimiet. Gebruik indien mogelijk na-objectieven (high-numerical-aperture) om het aantal fotonen en de lokalisatienauwkeurigheid te verhogen.
- In een confocale microscoop met NA 0.9-objectief verwerft u stapels met een stapgrootte van 300 nm, waarbij de Nyquist-waarde wordt oversampled. Neem indien nodig meerdere kleurstapels op (figuur 2B). Bewaar roosters onder lN2 tot verder gebruik.
OPMERKING: Om de optimale stapgrootte te bepalen, kiest u de waarden die zijn berekend door de microscoopbesturingssoftware of gebruikt u online tools9. Controleer op doorbloeding van het signaal tussen kanalen, omdat overmatige doorbloeding schadelijk is voor colokalisatie-experimenten. Sommige kunnen echter voordelig zijn om te corrigeren voor chromatische aberraties in meerkleurige stapels.
- In een confocale microscoop met NA 0.9-objectief verwerft u stapels met een stapgrootte van 300 nm, waarbij de Nyquist-waarde wordt oversampled. Neem indien nodig meerdere kleurstapels op (figuur 2B). Bewaar roosters onder lN2 tot verder gebruik.
- Deconvolve stacks met behulp van de juiste software10,11 en re-slice7 ze als een isotrope pixelgrootte vereist is. Deconvolutie - net als bij kamertemperatuur - reinigt het FLM-signaal en kan de lokalisatienauwkeurigheid verbeteren (figuur 3C).
Figuur 3: Vierkanten selecteren voor FLM-stackacquisitie en verbetering van gegevens door deconvolutie . (A) Overzicht van een rooster bedekt met gistcellen die eGFP-Ede1 (groen) en mCherry-Atg8 (magenta) tot expressie brengen. Kies posities met een goede verdeling van kralen en cellen, maar vermijd de randen van het raster (rood gearceerd). De vakken geven posities aan met goede celverdelingen waar fluorescentiestapels zijn genomen. (B) Maximale intensiteitsprojectie (MIP) van de meerkleurige stapel genomen op het gele vierkant (van A) na deconvolutie. Deconvolutie van de FLM-stacks ruimt ongewenste achtergrondsignalen aanzienlijk op en helpt kralen in z nauwkeuriger te lokaliseren, zoals blijkt uit gaussische aanvallen vóór (C) en na deconvolutie (D) (pasvormen werden uitgevoerd in 3DCT en worden weergegeven voor de kraal gemarkeerd met 1). Afbeeldingen tonen ingezoomde MIP-weergaven van het rode kanaal (excitatie: 552 nm, emissie: 585-650 nm). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
3. Gefocusseerde ionenbundel frezen
- Laad de roosters in het cryo-FIB-SEM-instrument en gebruik de uitsparings- en/of oriëntatiemarkeringen om de juiste oriëntatie te garanderen voor latere plaatsing in de TEM (figuur 2A). Zorg ervoor dat de freesrichting loodrecht staat op de kantelas van de TEM.
- Gebruik een gasinjectiesysteem (GIS; CpMePtMe3) op de podiumposities die vooraf zijn gedefinieerd door de FIB-SEM-opstelling om de roosters te coaten met een beschermende organometaallaag. Pas niet te veel toe, omdat dit de fiduciale kraallokalisatie in de TEM later kan verstoren. Gebruik een plasmacoater om metallisch platina aan te brengen om het opladen van monsters te verminderen.
OPMERKING: Als er geen instellingen voor GIS-coating beschikbaar zijn, kunnen deze gemakkelijk worden gevonden door opeenvolgende rondes van korte coating (~ 2 s) uit te voeren, gevolgd door FIB-frezen. Zorg ervoor dat het monster nog steeds met succes kan worden gesneden bij gemiddelde stromen (~ 100 pA) zonder duidelijke randen van de beschermende organometaallaag rond de lamellenranden. Zowel de tijd als de afstand van de GIS-naald (ten opzichte van het monster) zijn belangrijke parameters om rekening mee te houden. Gebruik de GIS-naald niet bij kamertemperatuur (d.w.z. 45 °C), maar zo koud mogelijk om toch een gelijkmatige coating te bieden (25-27 °C). - Neem een SEM-rasteroverzicht op en voer een 2D-correlatie uit met FLM-overzichten om de rastervierkanten te vinden waarvoor fluorescerende stapels zijn vastgelegd. Inspecteer beide weergaven handmatig of gebruik verschillende softwarepakketten 7,10,12 om de rastervierkanten te vinden. Hier ligt de focus op de 3D-correlatietoolbox (3DCT)7, die gebruik maakt van 3D-rigide lichaamstransformatie met isotrope schaling tussen weergaven. Een uitstekende walk-through op 3DCTs functies is online beschikbaar13.
- Selecteer en markeer ten minste vier overeenkomstige posities, bijvoorbeeld oriëntatiepunten zoals rasterbalken of gaten in de ondersteuningsfilm, in zowel het FLM- als het SEM-rasteroverzicht (klik met de rechtermuisknop) en bereken de transformatie tussen de gemarkeerde punten (correleren).
- Plaats vervolgens de markeringen in het midden van de overeenkomstige rastervierkanten waarvoor FLM-stapels zijn verkregen en voorspel hun positie in de SEM-weergave (correleren; Figuur 4A).
- Neem voor elk gecorreleerd rastervierkant een afbeelding van een ionenbundel (IB) met lage stroom (≤10 pA) bij de FIB-freeshoek naar keuze (10 ° -25 ° voor 45 ° pre-tilt shuttle). Selecteer een gezichtsveld (d.w.z. positie en vergroting) dat overeenkomt met de fluorescentiegegevens. Voor 200 netrasters verzamelt u fluorescentie- en FIB/SEM-gegevens om enkelvoudige rastervierkanten te bevatten, inclusief de rasterbalken (zie figuur 3A en figuur 4A).
OPMERKING: Het frezen moet onder een zo ondiepe hoek mogelijk worden uitgevoerd om te voorkomen dat een aanzienlijk hoekbereik verloren gaat tijdens cryo-ET en om identificatie van een voldoende aantal fiduciale kralen mogelijk te maken. Bijvoorbeeld: met een trapkanteling van 17°, een shuttlevoorkanteling van 45° en een FIB-balkkanteling van 52° ten opzichte van de plummet, is de lamellenvoorkanteling 10°, wat ongeveer voldoet aan het gewenste hoekbereik van ±60° in de TEM door te kantelen van -50° tot +70°, het maximum van veel TEM cryo-houders. - Maak een SEM-afbeelding van hetzelfde vierkant om te helpen bij de identificatie van overeenkomstige kralen in de fluorescentie- en ionenbundelweergave.
- Voer registratie uit van de gedeconvoleerde 3D FLM-stack en de 2D-ionenbundelweergave voor elke positie met de 3DCT zoals beschreven in de volgende stappen (figuur 4B).
- Laad de bijbehorende resliced 3D FLM-stack en ionenbundel (IB)-weergave in 3DCT.
OPMERKING: Meerkleurige fluorescentiegegevens kunnen worden geladen als maximaal drie afzonderlijke stapelbestanden met één kanaal. - Selecteer 4 fiduciale kralen in de fluorescentiegegevens en klik met de rechtermuisknop op de positielijst om hun 3D-positie te bepalen via Gaussische aanpassing van het signaal in x, y en z. Selecteer de bijbehorende kralen in de IB-afbeelding en voer een eerste 3D-correlatie (correlatie) uit.
- Voeg iteratief meer kralen toe aan het fluorescentiebeeld, verfijn hun 3D-positie en voorspel hun positie in de IB-weergave om snel meer kralen aan de registratie toe te voegen en de nauwkeurigheid van de correlatie te controleren. In 3DCT worden RMSE-waarden (root-mean-square error) gegeven om de correlatieconsistentiete beoordelen 7.
- Zorg ervoor dat de RMSE-waarden klein zijn en in de volgorde van de lokalisatienauwkeurigheid liggen (~300 nm). Om de nauwkeurigheid van de correlatie te bepalen, laat u tijdens de registratiestap enkele fiduciale kralen weg die duidelijk identificeerbaar zijn in zowel fluorescentie als ionenbundel. Doe dit door hun voorspelde versus werkelijke locatie in het ionenbundelbeeld te controleren. Als de voorspelde positie aanzienlijk afwijkt van de reële, herhaal dan de initiële correlatie met een nieuwe set fiducialen.
OPMERKING: Het correleren van 6-8 kralen is voldoende gebleken voor een nauwkeurige registratie van de FLM-stapels en de IB-weergaven. Het toevoegen van meer fiducials (tot 12-15) over een breed scala aan z-waarden (bijvoorbeeld door kralen op de rasterbalk of in aangrenzende vierkanten te selecteren) kan de nauwkeurigheid van de correlatie verbeteren.
- Zorg ervoor dat de RMSE-waarden klein zijn en in de volgorde van de lokalisatienauwkeurigheid liggen (~300 nm). Om de nauwkeurigheid van de correlatie te bepalen, laat u tijdens de registratiestap enkele fiduciale kralen weg die duidelijk identificeerbaar zijn in zowel fluorescentie als ionenbundel. Doe dit door hun voorspelde versus werkelijke locatie in het ionenbundelbeeld te controleren. Als de voorspelde positie aanzienlijk afwijkt van de reële, herhaal dan de initiële correlatie met een nieuwe set fiducialen.
- Selecteer de beoogde cellulaire signalen, pas hun 3D-positie in de FLM-stack en pas de transformatie toe om de doelposities in de IB-weergave te voorspellen (figuur 4B).
OPMERKING: Elke vermelding in de FLM-positielijst, die geen tegenhanger in de IB-lijst heeft, wordt behandeld als een signaal dat moet worden voorspeld.
- Laad de bijbehorende resliced 3D FLM-stack en ionenbundel (IB)-weergave in 3DCT.
- Breng voor elk gecorreleerd vierkant de voorspelde posities van de interessante kenmerken over naar het FIB-SEM-instrument en plaats lamellenfreespatronen (figuur 4C). Breng posities handmatig over (bijvoorbeeld door de afstand tot zichtbare oriëntatiepunten te meten, zoals cellen of fiduciale kralen) of gebruik automatisering en scripting zoals geïmplementeerd in SerialFIB14. Als er meerdere signalen per cel zijn, plaats dan de patronen om zoveel mogelijk points-of-interest (POI's) in dezelfde lamellen op te nemen om de doorvoer te verhogen.
- Eerst ruw en dan fijn de lamellen frezen tot een uiteindelijke dikte van 150-250 nm. Vermijd stappen (bijv. spanningsontlasting15) die verzakking van de lamellen veroorzaken en dus resulteren in beweging van het werkelijke kenmerk van belang met betrekking tot de eerder verworven FLM-stapels. Gebruik handmatige3 of geautomatiseerde 14,16,17,18 FIB-freesprocedures. Zorg er bij beide methoden voor dat het kenmerk van belang in het midden van de lamellen blijft door het symmetrisch van boven en onder te verdunnen.
- Om de nauwkeurigheid van het frezen voor elke lamellen te evalueren, voert u dezelfde registratie uit als in stap 3.4. Gebruik deze keer echter het uiteindelijke IB-beeld na het FIB-frezen en controleer of de voorspelde posities van de interessante kenmerken zich in de uiteindelijke lamellen bevinden. U kunt ook de geroteerde projecties van de FLM-stacks, verkregen uit de uitvoer van 3DCT en aangepaste scripts19, bedekken met de uiteindelijke IB-afbeelding (figuur 4C, kleine insert).
Figuur 4: 3D-correlatieve FIB-freesprocedure . (A) 2D-2D-correlatie van FLM (links) en SEM (rechts) overzichten van het raster wordt gebruikt om de rastervierkanten te lokaliseren waarop eerder fluorescerende stapels werden genomen. (B) Voor elk geselecteerd vierkant worden, na 3D-2D-registratie van overeenkomstige fiduciale posities in 3DCT (gekleurde vakken), posities van biologische kenmerken van belang geselecteerd in de FLM-gegevens. Op basis van de voorspelling van overeenkomstige posities in het ionenbundelbeeld (rode cirkels), worden locaties voor lamellenpreparatie geselecteerd. (C) Scanning elektronenmicroscoop (SEM) en ionenbundel (IB) beelden worden gebruikt om het doel gecentreerd te houden tijdens het frezen. Einddiktes van 150-250 nm zijn voldoende bevonden voor verdere downstream verwerking. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
4. Correlatieve TEM
- Laad de roosters in de TEM en zorg ervoor dat de lamellenoriëntatie (zoals blijkt uit uitsparingen of oriëntatiemarkeringen) loodrecht op de kantelas staat.
OPMERKING: Microscopen van verschillende fabrikanten kunnen worden bestuurd met behulp van verschillende software, bijvoorbeeld Tomo5, TOM of SerialEM20. Hier ligt de focus op het laatste. - Verkrijg rastermontage en overzichten voor elk rastervierkant met lamellen. Zorg ervoor dat de vergrotings- en belichtingstijd geschikt is om de fiduciale kralen in de TEM-afbeeldingen te visualiseren zonder de totale elektronendosis aanzienlijk te verhogen. Verkrijg TEM-kaarten (montages) met hoge resolutie van elke lamellen.
- Register en 3D-2D correleren de FLM-stack met het TEM-rastervierkant en de lamellenoverzichten in 3DCT. Gebruik dezelfde procedure als beschreven in stap 3.6 door overeenkomstige kraalposities te selecteren in de fluorescentiebeelden (x, y, z - gaussische pasvorm) en transmissie-elektronenmicroscoopbeelden. Selecteer vervolgens de interessante posities in de FLM-kanalen en breng ze over naar de TEM-overzichten. Gebruik indien nodig een procedure in twee stappen, bestaande uit een eerste correlatie tussen FLM en TEM met lage vergroting en een tweede van TEM met lage naar hoge vergroting (figuur 5).
- Breng posities handmatig over (door afstanden tot oriëntatiepunten te meten), de registratie- en kaarttools die beschikbaar zijn in SerialEM20 of externe software zoals CorRelator21.
- Stel tilt-series in en voer deze uit op gecorreleerde posities. Gebruik een geschikte vergroting, onscherpte en totale dosis (zie tabel met materialen en tabel 1 voor meer informatie). Start de acquisitie bij de door de lamellen bepaalde voorkanteling (zie ook de opmerking in stap 3.4) en gebruik een dosissymmetrisch kantelschema22. Gebruik handmatige of batchacquisitie.
Figuur 5: Lokalisatie van gecorreleerde posities in de TEM. Na succesvol 3D-correlatief FIB-frezen en overdracht naar de transmissie-elektronenmicroscoop, wordt 3D-2D-registratie uitgevoerd voor elk gefreesd vierkant tussen fiduciale kralen (gekleurde vakken) in FLM-stapels en TEM-overzichten om potentiële locaties voor cryo-ET (rode cirkels) te lokaliseren. Hogere vergroting lamellenoverzichten (zoom-in) kunnen dan worden verkregen om tomogrammen nauwkeuriger in te stellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Representative Results
Het protocol biedt een walk-through van de pijplijn die wordt gebruikt om het EH-domeinbevattende en endocytose-eiwit 1 (Ede1) -afhankelijke endocytische eiwitafzetting (END) en de afbraak en vangst ervan in autofagische lichamente ontdekken 8. De END is een vloeistof-vloeistof fase-gescheiden compartiment in S. cerevisiae, dat een verscheidenheid aan eiwitten buffert die betrokken zijn bij clathrin-gemedieerde endocytose (CME) na mislukte endocytische gebeurtenissen. Een van de belangrijkste componenten is Ede1, dat ook dienst doet als CME-component en als selectieve autofagiereceptor voor de afbraak van dit nieuwe LLPS-compartiment. Dienovereenkomstig werd een EGFP-fusie van Ede1 (EGFP-Ede1) onder controle van de alcoholdehydrogenase (ADH) -promotor gebruikt om END's te visualiseren, aangezien Ede1-overexpressie interfereert met de vroege stadia van endocytose en daarom constitutief LLPS induceert.
Op een diepgevroren rooster met EGFP-Ede1 overexpressie gistcellen en 1 μm fiduciale markers werden vijf posities geselecteerd voor FLM stack acquisitie in het GFP kanaal (Figuur 6A; TFS Corrsight; confocale modus, 300 nm focus stap grootte, 10 μm bereik). Het raster werd overgebracht naar het FIB-instrument (Quanta 3D FEG) en de rastervierkanten waarvoor FLM-stapels waren verkregen, werden geïdentificeerd door een 2D-2D-correlatie uit te voeren van de fluorescentie- en SEM-rasteroverzichten (vergelijk stap 3.2).
Voor elk van de gekozen vierkanten werden ionenbundelbeelden gemaakt met een lage stroom (10 pA, 1200x vergroting) en overeenkomstige fiduciale posities werden geregistreerd in 3DCT. Na selectie van posities met het biologische kenmerk van belang en het passen van hun 3D-positie binnen de FLM-stapel, werd de gevonden transformatie toegepast op vermeende END-posities en werden de locaties voor lamellenpreparatie geselecteerd (figuur 6B). In de hier getoonde voorbeelden werd een FIB-balk gebruikt die 11° ten opzichte van het rasteroppervlak was gekanteld (45° FIB-shuttle voorkantelen; 18° trapkanteling). Interessante posities werden overgedragen en FIB-patronen werden handmatig getekend (figuur 6D) door de afstand van de voorspelde posities ten opzichte van prominente oriëntatiepunten in het FIB-beeld te meten (bijv. Gaten, ijsverontreinigingen, fiduciale kralen). De nauwkeurigheid van de registratie werd geëvalueerd door opzettelijk kralen weg te laten die duidelijk konden worden geïdentificeerd in het FLM- en IB-beeld en vervolgens hun werkelijke en voorspelde posities in de ionenbundelweergave te vergelijken (bijv. Diamant in figuur 6B, C). De correlatie voor het vierkant in figuur 6C bleek nauwkeurig te zijn (d.w.z. de voorspelde positie van FLM-kraalposities viel perfect samen met hun overeenkomstige IB-locatie en 3DCT rapporteerde subpixel RMSE-waarden voor de registratie). Zo werden lamellen gesneden op de voorspelde posities (site B) en fijngefreesd tot een dikte van ~ 200 nm (uiteindelijke patroonverschuiving).
Figuur 6: Representatieve resultaten voor 3D-correlatieve targeting van endocytische eiwitafzettingen (END) in gist. (A) SEM-overzicht van het rooster vóór het frezen. De gekleurde vakken geven rastervierkanten aan waarvoor vooraf fluorescentiestapels zijn genomen. (B-C) 3D-correlatie in een rastervierkant. Na het registreren van verschillende overeenkomstige fiduciale kralen (gekleurde vakken) in de FLM-gegevens (B, hier weergegeven als maximale intensiteitsprojectie) en het ionenbundelbeeld (C), werd de nauwkeurigheid van de 3D-registratie geverifieerd door de positie van de kraal aangegeven met de diamant te voorspellen. Vervolgens werden de posities van het doelsignaal (rode cirkels) voorspeld in de ionenbundelweergave voor twee potentiële freeslocaties. (D) Inzoomen op site B met de voorspelde posities van drie doelpuncta (rode cirkels) en de initiële freespatronen (gele vakken). Een vierde fluorescentie punctum werd voorspeld veel lager te zijn dan de andere puncta en daarom niet gericht tijdens het frezen (grijze cirkel). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Na succesvol FIB-frezen en overdracht van het net naar de cryotransmissie-elektronenmicroscoop (Titan Krios werkte op 300 kV en uitgerust met een Gatan K2 directe elektronendetector en Bioquantum-energiefilter), werd een rasteroverzicht opgenomen in SerialEM en gebruikt om vierkanten met lamellen te lokaliseren. Voor elke lamellen werden overzichtsbeelden verkregen en de FLM-gegevens werden geregistreerd in 3DCT (3D-2D) met behulp van overeenkomstige fiduciale kralen. Posities van de biologische kenmerken van belang (figuur 7A) werden vervolgens voorspeld met behulp van de transformatie berekend uit de fiduciale kralen. Lamellenoverzichten die bij een hogere vergroting werden geregistreerd, werden gestikt en interessante plaatsen correleerden met duidelijk zichtbare oriëntatiepunten (bijv. Fiduciale kralen). Als alternatief kunnen klassieke CLEM-overzichten worden geproduceerd in verschillende softwares10,12.
Op basis van de correlatie werden vier potentiële locaties voor tomogramacquisitie gevonden voor de lamellen die in figuur 7A worden weergegeven. Dit omvat echter ook een positie die niet werd beoogd tijdens het 3D-gecorreleerde FIB-frezen (vergelijk figuur 6D; grijze cirkel) en een positie geblokkeerd door ijsverontreiniging (figuur 7; grijze vakken). Dienovereenkomstig konden tomogrammen slechts voor twee posities worden geregistreerd (figuur 7B). Over het algemeen werd een correlatiesucces van ~ 75%, d.w.z. lamellen die de overdracht naar de TEM- en END-structuren overleefden, gevonden op de voorspelde locaties, werd bereikt (12 gecorreleerde locaties). Na tomogramreconstructie, segmentatie en template matching kunnen individuele END-structuren worden gevisualiseerd binnen hun oorspronkelijke context (Figuur 7C,D). Dit omvat het fenestrated endoplasmatisch reticulum (ER) rond de END, lipidedruppeltjes die af en toe contact maken en ribosomen, die zijn uitgesloten van het LLPS-compartiment. Alles bij elkaar laat dit zien hoe 3D-correlatief FIB-frezen informatie op moleculair niveau kan bieden van zeldzame biologische processen uit intacte cellen.
Figuur 7: Representatieve resultaten voor het visualiseren van het END met cryo-ET. (A) Het TEM-overzicht met lage vergroting van de maalplaats in figuur 6 kan gemakkelijk worden gecorreleerd met de FLM-projectie van de maximale intensiteit (figuur 6B) om biologische kenmerken van belang te lokaliseren (rode kruisen). (B) In een tweede stap kan een hogere vergroting (gestikt) worden gecorreleerd en worden posities voor tomogramacquisitie (gele vakken) ingesteld. Locaties die het gevolg waren van het out-of-plane signaal (grijs vak, vergelijk figuur 6D) werden genegeerd. (C-D) Met behulp van deze 3D-correlatieve FIB-benadering kan de endocytische eiwitafzetting (END) in zijn oorspronkelijke omgeving worden gevisualiseerd. Structuren zoals het endoplasmatisch reticulum (ER), ribosomen, membranen en lipidedruppels kunnen worden geïdentificeerd en gevisualiseerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Plasma Cleaner-instellingen | |||
| Harrick Plasmareiniger PDG-3XG : | Radio frequentie setiing: "HI", 30 s; N2-plasma | ||
| Instellingen plunjer | |||
| TFS Vitrobot Mk IV: | 100% vochtigheid; blotforce = 8; vlekkertijd = 10 s; wachttijd 0 s; (dit zou moeten werken voor de meeste suspensie- en hechtcellen) | ||
| FIB GIS-posities en -timings | |||
| Quanta 3D FEG: | Kantelen = 0, Rotatie = -180, Z-positie = 13,5, Temperatuur instelpunt = 26,15° , Tijd = 8 s | ||
| TFS Scios: | Kantelen = 0, Rotatie = -180, Z-positie = 9,8, Temperatuur instelpunt =28° C, Tijd = 7 s | ||
| TFS Aquilos 1: | Software voorgedefinieerde positie, Temperatuur instelpunt = 28° , Tijd = 7 s | ||
| TFS Aquilos 2: | Software voorgedefinieerde positie, Temperatuur instelpunt = 28°, Tijd = 7 s | ||
| FIB Sputter Coater Instellingen | |||
| Quorumsysteem: | In quorumvoorbereidingskamer: 10 mA, 40 s | ||
| TFS Scios: | 10 W, 500 V, 250 mA, 0,2 mbar, 15 s | ||
| TFS Aquilos 1: | 1kV, 10 mA, 10 Pa, 15 s | ||
| TFS Aquilos 2: | 1kV, 10 mA, 10 Pa, 15 s | ||
| Tomogram Acquisitie | |||
| Titaan Krios Gi2 | K2 camera, Gatan Bioquantum energiefilter | ||
| 20 eV spleet; dosissymmetrisch kantelschema (Hagen) met stappen van 2°; start bij +10° (lamellen voorkantelen!) tot +70°en -50° | |||
| Titan Krios Gi4 | Valk 4; Selectris X energiefilter | ||
| 10 eV spleet; dosissymmetrisch kantelschema (Hagen) met stappen van 2°; start bij +10° (lamellen voorkantelen!) tot +70° en -50° | |||
| FLM Acquisitie | |||
| Corrsight (confocale modus) | Doelstelling: Zeiss EC Plan-Neofluar 40×/0,9 NA Pol; Stack acquisitie parameters: x-y pixelgrootte = 161,25 nm, z stapgrootte = 300 nm. | ||
| Leica SP8 Cryo-confocale | Doelstelling: Leica HCX PL APO 50x / 0.90 CLEM; Stack acquisitie parameters: x-y pixelgrootte = 84 nm, z stapgrootte = 300 nm. | ||
Tabel 1: Lijst van geteste apparatuur en voorgestelde instellingen.
Discussion
1. Kritieke stappen in het protocol
Optimalisatie van celcultuur en grid plunging parameters is fundamenteel voor deze workflow. Aan het begin van een project is het de moeite waard om tijd te investeren in het optimaliseren van taggingstrategieën, de verdeling van cellen en fiduciale kralen, en het testen van verschillende rastervoorbereiding en blottingparameters. Het werken met een optimaal ondergevroren monster zal de downstream-verwerking aanzienlijk vergemakkelijken.
Zoals voor elk TEM-experiment zijn glasvochtmonsters vereist. Voor grote zoogdiercellen zoals HeLa hebben 1-2 cellen per rastervierkant de voorkeur, maar cellen kunnen nog steeds glasachtig zijn bij een hogere dichtheid. Optioneel kan vitrificatie worden verbeterd in zoogdiercellen (bijv. HEK293, HeLa) door ze te incuberen met 2,5-10% (v / v) glycerol toegevoegd aan het kweekmedium 10 minuten voordat23 wordt gedompeld. Indien beschikbaar, kunnen rasterpatronen worden gebruikt om een perfecte plaatsing en verdeling van de cellen te garanderen, waardoor de vitrificatie en latere correlatieworden verbeterd 24.
Hoewel specifieke cellen tijdens de workflow kunnen worden geselecteerd, zullen te weinig cellen die het biologische kenmerk van belang vertonen, de totale doorvoer aanzienlijk verminderen. Om de correlatie in POI-positieve cellen te verbeteren, moeten voldoende heldere fluoroforen worden gebruikt. Dit is vooral belangrijk op endogene expressieniveaus. We ontdekten dat mVenus onder cryo-omstandigheden vaak beter presteerde dan EGFP vanwege de verhoogde helderheid25 en de hypsochrome verschuiving, waardoor het geschikt blijft voor standaard GFP-filteropstellingen onder cryo-omstandigheden26. Voor niet-puntachtige doelstructuren moet ook de afweging tussen golflengte en lokalisatienauwkeurigheid (Abbe-diffractielimiet) worden overwogen.
Efficiënte 3D-correlatie vereist ook dat rasters mechanisch stabiel zijn en met grote zorg worden behandeld. Hoewel standaard gouden of koperen roosters met koolstofondersteuning kunnen worden gebruikt, kan het slagingspercentage aanzienlijk worden verhoogd door meer rigide SiO2-films te gebruiken, afhankelijk van het project. Het is echter nog niet definitief vastgesteld of (a) mechanische stabiliteit of (b) het matchen van thermische uitzettingscoëfficiënten (substraat versus film) om cryo-rimpelingte verminderen 27, de meest cruciale factor is voor succesvolle 3D-correlatie. Bovendien kunnen voor het oppakken van fragiele Au-roosters met polydimethylsiloxaan gecoate schalen worden gebruikt5.
Naast het waarborgen van de stabiliteit van het monster, is een zorgvuldige keuze van FLM-beeldvormingsparameters noodzakelijk voor het verkrijgen van hoogwaardige fluorescentiestapels die geschikt zijn voor optimale targeting tijdens het FIB-frezen. In dit verband wordt ook geadviseerd om verschillende denoising28 - of deconvolutietechnieken op de FLM-gegevens te testen, omdat dit de lokalisatie van fiducialen en cellulaire signalen aanzienlijk kan verbeteren. Bij het correleren van het fluorescentiesignaal met FIB-SEM-beelden is een goede bemonstering van fiduciale kralen belangrijk. Ze moeten goed verdeeld zijn over de cellen en eventueel op verschillende z-hoogtes. Het is ook een goede gewoonte om de consistentie van de correlatie te valideren door de voorspelde versus werkelijke posities van kralen te controleren die opzettelijk buiten het fiduciale model zijn gelaten, maar duidelijk met het oog kunnen worden gecorreleerd. De RMSE-waarden van 3DCT moeten ook altijd in overweging worden genomen om de consistentie van de registratie te controleren.
Aangezien de afzetting van gefreesd materiaal en restwater uit de FIB-SEM-kamer (d.w.z. herbesmetting) de effectieve lamellendikte verhoogt door amorf materiaal aan beide zijden ervan toe te voegen, vermindert het langdurig in de microscoop houden van fijngemalen lamellen over het algemeen de TEM-gegevenskwaliteit als gevolg van extra elektronenverstrooiingsgebeurtenissen. Dienovereenkomstig wordt frezen meestal in twee stappen uitgevoerd: eerst worden alle posities ruw gefreesd (d.w.z. tot ongeveer 800 nm) en vervolgens fijn (tot ~ 150-250 nm) en wordt het rooster onmiddellijk gelost nadat de laatste lamellen zijn voltooid. Een beter correlatiesucces kan echter worden bereikt door de posities van belang op een locatiegewijze manier te verwerken, waardoor ruw en fijn frezen op dezelfde lamellen direct na elkaar wordt uitgevoerd, omdat dit geen tijd overlaat voor buigen of vervorming. Dit vermindert echter het maximale aantal lamellen dat per rooster kan worden geproduceerd, afhankelijk van de herbesmettingssnelheid van het systeem. Voor een snelheid van 20 nm / h worden 4-6 lamellen geproduceerd binnen 1-1,5 uur.
Beweging van het gehele rooster of de ruw gefreesde lamellen >300 nm zal resulteren in een slechte of mislukte correlatie (zie ook de hieronder besproken beperkingen). Het moet daarom regelmatig worden gecontroleerd, bijvoorbeeld door IB-beelden te vergelijken voor, tijdens en na het FIB-frezen. Locaties die een significante beweging vertonen (>300 nm) moeten worden weggegooid. Optimaliseer de monstervoorbereiding (d.w.z. keuze van rastertype, celdichtheid en kelderparameters; zie protocolsectie 1) en freesstrategie om deze bewegingen te voorkomen. Lamellenbuiging kan aanzienlijk worden verminderd door plaatselijk te frezen zoals beschreven in stap 3.6 en de lamellenbreedte te verkleinen. Zoals eerder vermeld, terwijl stressverlichtingssneden15 zijn ontworpen om het buigen van lamellen te verminderen, resulteren ze vaak in een gecoördineerde beweging van de ontkoppelde lamellen, waardoor correlatie effectief wordt voorkomen. Geïntegreerde FLM-systemen kunnen worden gebruikt om dit probleem op te lossen.
2. Wijzigingen en problemen met de methode
Het wordt ten zeerste aanbevolen om een grondige karakterisering van het monster uit te voeren in live-cell imaging voordat u naar cryo-omstandigheden gaat. Het optimaliseren van de cellulaire monsters, behandelingsschema's en weten wat voor soort signaal te verwachten voordat de cryo-workflow wordt betreden, kan het slagingspercentage aanzienlijk verbeteren.
In de hier gepresenteerde workflow wordt een stand-alone fluorescentiemicroscoop met een cryotrap gebruikt om de monsters in beeld te brengen, gevolgd door een overdracht van de rasters naar de gefocusseerde ionenbundelmicroscoop. Het is echter getest op systemen waarbij een fluorescentiemicroscoop is geïntegreerd in de FIB-SEM-kamer en daarom is er geen monsteroverdracht vereist om fluorescentiebeeldente verkrijgen 29,30,31. Met behulp van dergelijke geïntegreerde systemen kunnen interessante posities tijdens en na het FIB-frezen in beeld worden gebracht om te controleren op de aanwezigheid van het doelfluorescentiesignaal zonder het risico op verontreiniging van de uiteindelijke lamellen te vergroten. Het is echter belangrijk om rekening te houden met de optische parameters van de gebruikte microscopen, omdat bijvoorbeeld een laag NA-objectief de precisie beperkt waarmee fiduciale kralen en doelsignalen kunnen worden gelokaliseerd. Niettemin zullen geïntegreerde FLM-opstellingen helpen om ook beter om te gaan met lichte vervormingen van rasters en lamellen, omdat FLM-stacks voortdurend kunnen worden bijgewerkt en vergeleken met up-to-date SEM- en IB-weergaven.
Als alternatief voor fluorescentiebeeldvorming van de lamellen tussen FIB-frezen en TEM-gegevensverzameling, kan post-TEM-correlatie worden gebruikt om de juiste plaatsing en frezen van de lamellente verifiëren 5,6.
Tijdens alle stappen van de correlatieve workflow, maar vooral tijdens TEM, wordt aanbevolen om een overlay te maken van de geprojecteerde fluorescentiegegevens op de FIB-SEM/TEM-afbeeldingen. Dergelijke klassieke CLEM-weergaven helpen om intuïtiever te begrijpen welk deel van de cellen zich in de lamellen bevindt. Dit dient ook als een nuttige sanity check om de nauwkeurigheid van de correlatie te verifiëren.
3. Beperkingen van de methode
De 3D-correlatieve FIB-benadering vereist monsters die kunnen worden geleverd met fiduciale kralen. Dienovereenkomstig is deze methode momenteel beperkt tot diepgevroren roosters. Voor hogedruk (HPF) bevroren (weefsel) monsters kunnen momenteel alleen 2D-2D-correlaties worden uitgevoerd. Mogelijk kunnen interne fiduciale markers (bijv. organellen, gekleurde lipidedruppels) een oplossing zijn voor dit probleem32,33. Het uiteindelijke succespercentage van de correlatie hangt af van vele factoren, waaronder de kwaliteit van het monster, de fluorescentiemicroscopie-opstelling, de lamellendikte en de grootte van de beoogde structuur. De correlatienauwkeurigheid met behulp van de beschreven 3D-registratiebenadering wordt geschat op 200-300 nm op het uiteindelijke IB-beeld, ruwweg overeenkomend met de typische dikte van FIB-gefreesde lamellen7. Dienovereenkomstig zullen cellulaire structuren die veel kleiner zijn dan dit op dit moment moeilijk te richten zijn. Bovendien vermindert overmatige beweging op de freeslocatie (> 300 nm) ook de nauwkeurigheid van de correlatie, een probleem dat mogelijk kan worden aangepakt met FLM-opstellingen die zijn geïntegreerd in FIB / SEM-instrumenten. Lamellen die tijdens het frezen een sterke vervorming of buiging vertonen, moeten in ieder geval van de stroomafwaartse workflow worden uitgesloten.
Over het algemeen wordt cryofluorescentiebeeldvorming momenteel beperkt door het Abbe-diffractiecriterium. Met meer routinematige toepassing (en commercialisering) van super-opgeloste cryo-FLM-methoden, zou een nauwkeuriger targeting van cellulaire structuren mogelijk kunnen worden, vooral wanneer geïntegreerd in de FIB / SEM voor on-the-fly operatie.
4. Betekenis van de methode
Vooral in vergelijking met niet-gerichte en post-correlatietechnieken, maakt de 3D-gecorreleerde FIB-freesbenadering de selectie van geschikte posities mogelijk vóór de tijd- en resource-verslindende TEM-stap. Het maakt daardoor efficiëntere gegevensverzameling en projectplanning mogelijk. Bovendien voegen de gecorreleerde fluorescentiegegevens een laag informatie toe die cruciaal kan zijn voor het interpreteren van de tomogrammen en voor het integreren van de cryo-ET-resultaten in projecten op meerdere schalen, vooral wanneer het gaat om niet-gestructureerde eiwitassemblages of die te klein zijn voor sjabloonmatching en subtomogrammiddeling.
5. Belang en mogelijke toekomstige toepassingen
In combinatie met geavanceerde workflows zoals cryo-lift uit HPF-monsters 34,35, cryo-FIB-SEM volume 36 en superresolutiefluorescentiebeeldvorming26,37,38,39, biedt 3D-gerichte lamellenvoorbereiding het vooruitzicht om niet alleen biologische processen in geïsoleerde cellen te ontleden, maar ook om weefsel- en patiëntmonsters toegankelijk te maken voor FIB-frezen en cryo-elektronentomografie. Als zodanig zal het dissectie van pathologische processen met hoge resolutie mogelijk maken en dus een integrale bouwsteen zijn voor een biopsie op nanoschaal.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling te hebben.
Acknowledgments
We bedanken Inga Wolf voor het ondersteunen van de IT-infrastructuur, Florian Beck voor computationele ondersteuning en Oda H. Schiøtz voor het kritisch lezen van het manuscript. De financiering werd gedeeltelijk verstrekt door middel van een Alexander von Humboldt returners fellowship aan Philipp S. Erdmann en een EMBO Long-term Fellowship ALTF 764-2014 aan Florian Wilfling. Anna Bieber werd ondersteund door een Boehringer Ingelheim Fonds Ph.D. fellowship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autogrids | Thermo Fisher Scientific / Homemade | 1036173 (no cutout), 1205101 (with cutout) | |
| C-rings | Thermo Fisher Scientific | 1036171 | |
| Corrsight with cryo module | Thermo Fisher Scientific | FLM Alternative 1 | |
| Dynabeads MyOne COOH | Thermo Fisher Scientific | 65011 | recommended 1 µm fiducial beads |
| EM Grids R1/4 SiO2 | Quantifoil | N1-S13nAu20-01 | |
| Falcon 4 camera w. post-column Selectris X energy filter | Thermo Fisher Scientific | Camera/Filter Alternative 1 | |
| FIB Aquilos 1 | Thermo Fisher Scientific | FIB Alternative 1 | |
| FIB Aquilos 2 | Thermo Fisher Scientific | FIB Alternative 2 | |
| FIB Quanta 3D FEG | Thermo Fisher Scientific | FIB Alternative 3 | |
| FIB Scios | Thermo Fisher Scientific | FIB Alternative 4 | |
| K2 summit camera w. post-column energy filter 968 Quantum K2 | Gatan | Camera/Filter Alternative 2 | |
| Leica TCS SP8 with cryo module | Thermo Fisher Scientific | FLM Alternative 2 | |
| Plasma Cleaner PDC-3XG | Harrick | ||
| Teflon Sheet (0.25 mm) | plastx24.de | 11645 | Cut to same dimensions as filter paper |
| TEM Titan Krios XFEG 300 kV Gi2 | Thermo Fisher Scientific | TEM Alternative 1 | |
| TEM Titan Krios XFEG 300 kV Gi4 | Thermo Fisher Scientific | TEM Alternative 2 | |
| THUNDER Imager EM Cryo CLEM | Thermo Fisher Scientific | FLM Alternative 3 | |
| Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher Scientific | alternativevly, use manaual plunger | |
| Whatman filter paper | Sigma Aldrich | 10311807 | 55 mm diamater; needs to be cut to fit the Vitrobot |
References
- Beck, M., Baumeister, W. Cryo-Electron tomography: Can it reveal the molecular sociology of cells in atomic detail. Trends in Cell Biology. 26 (11), 825-837 (2016).
- Plitzko, M., Villa, E., Schaffer, M., Baumeister, W. Opening windows into the cell focused-ion-beam milling for cryo-electron tomography. Current Opinion in Structural Biology. 23, 771-777 (2013).
- Schaffer, M., et al. Optimized cryo-focused ion beam sample preparation aimed at in situ structural studies of membrane proteins. Journal of Structural Biology. 197 (2), 73-82 (2017).
- Tegunov, D., Xue, L., Dienemann, C., Cramer, P., Mahamid, J. Multi-particle cryo-EM refinement with M visualizes ribosome-antibiotic complex at 3.5 Å in cells. Nature Methods. 18 (2), 186-193 (2021).
- Klein, S., Wachsmuth-Melm, M., Winter, S. L., Kolovou, A., Chlanda, P. Cryo-correlative light and electron microscopy workflow for cryo-focused ion beam milled adherent cells. Methods in Cell Biology. 162, Elsevier Inc. 273-302 (2021).
- Klein, S., et al. Post-correlation on-lamella cryo-CLEM reveals the membrane architecture of lamellar bodies. Communications Biology. 4 (1), 1-12 (2021).
- Arnold, J., et al. Site-Specific Cryo-focused ion beam sample preparation guided by 3D correlative microscopy. Biophysical Journal. 110 (4), 860-869 (2016).
- Wilfling, F., et al. A selective autophagy pathway for phase-separated endocytic protein deposits. Molecular Cell. 80 (5), 764-778 (2020).
- Scientific volume imaging, Nyquist calculator. , Available from: https://svi.nl/NyquistCalculator (2021).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Huygens Professional version 19.04. , Scientific Volume Imaging. The Netherlands. Available from: http://svi.nl (2021).
- de Chaumont, F., et al. Icy: an open bioimage informatics platform for extended reproducible research. Nature Methods. 9 (7), 690-696 (2012).
- Arnold, J. 3DCT. , Available from: https://3dct.semper.space/ (2021).
- Klumpe, S., et al. A modular platform for streamlining automated cryo-FIB workflows. bioRxiv. , 444745 (2021).
- Wolff, G., et al. Mind the gap: Micro-expansion joints drastically decrease the bending of FIB-milled cryo-lamellae. Journal of Structural Biology. 208 (3), 0-3 (2019).
- Buckley, G., et al. Automated cryo-lamella preparation for high-throughput in-situ structural biology. Journal of Structural Biology. 210 (2), 107488 (2020).
- Tacke, S., et al. A streamlined workflow for automated cryo focused ion beam milling. bioRxiv. , 963033 (2020).
- Zachs, T., et al. Fully automated, sequential focused ion beam milling for cryo-electron tomography. eLife. 9, e52286 (2020).
- Fung, H. K. H. tools3dct. , Available from: https://github.com/hermankhfung/tools3dct (2021).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).
- Yang, J. E., Larson, M. R., Sibert, B. S., Shrum, S., Wright, E. R. CorRelator: Interactive software for real-time high precision cryo-correlative light and electron microscopy. Journal of Structural Biology. 213 (2), 107709 (2021).
- Hagen, W. J. H., Wan, W., Briggs, J. A. G. Implementation of a cryo-electron tomography tilt-scheme optimized for high resolution subtomogram averaging. Journal of Structural Biology. 197 (2), 191-198 (2017).
- Bäuerlein, F. J. B., et al. In situ architecture and cellular interactions of polyQ inclusions. Cell. 171 (1), 179-187 (2017).
- Toro-Nahuelpan, M., et al. Tailoring cryo-electron microscopy grids by photo-micropatterning for in-cell structural studies. Nature Methods. 17 (1), 50-54 (2020).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
- Kaufmann, R., et al. Super-resolution microscopy using standard fluorescent proteins in intact cells under cryo-conditions. Nano Letters. 14 (7), 4171-4175 (2014).
- Booy, F. P., Pawley, J. B. Cryo-crinkling: what happens to carbon films on copper grids at low temperature. Ultramicroscopy. 48 (3), 273-280 (1993).
- Krull, A., Buchholz, T. O., Jug, F. Noise2void-Learning denoising from single noisy images. Proceedings of the IEEE Computer Society Conference on Computer Vision and Pattern Recognition. 2019, 2124-2132 (2019).
- Gorelick, S., et al. PIE-scope, integrated cryo-correlative light and FIB/SEM microscopy. eLife. 8, 1-15 (2019).
- Delmic METEOR. , Available from: https://www.delmic.com/en/products/cryo-solutions/meteor (2021).
- T. F. Scientific. iFLM. , Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/MSD/Datasheets/iflm-aquilos-datasheet-ds0366.pdf (2021).
- Mahamid, J., et al. Liquid-crystalline phase transitions in lipid droplets are related to cellular states and specific organelle association. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (34), 16866-16871 (2019).
- Scher, N., Rechav, K., Paul-Gilloteaux, P., Avinoam, O. In situ fiducial markers for 3D correlative cryo-fluorescence and FIB-SEM imaging. iScience. 24 (7), 102714 (2021).
- Mahamid, J., et al. A focused ion beam milling and lift-out approach for site-specific preparation of frozen-hydrated lamellas from multicellular organisms. Journal of Structural Biology. 192, 262-269 (2015).
- Schaffer, M., et al. A cryo-FIB lift-out technique enables molecular-resolution cryo-ET within native Caenorhabditis elegans tissue. Nature Methods. 16 (8), 757-762 (2019).
- Wu, G. -H., et al. Multi-scale 3D cryo-correlative microscopy for vitrified cells. Structure. 28 (11), 1231-1237 (2020).
- Liu, B., et al. Three-dimensional super-resolution protein localization correlated with vitrified cellular context. Scientific Reports. 5, 13017 (2015).
- Weisenburger, S., Jing, B., Renn, A., Sandoghdar, V. Cryogenic localization of single molecules with angstrom precision. SPIE NanoScience + Engineering. 8815, (2013).
- Tuijtel, M. W., Koster, A. J., Jakobs, S., Faas, F. G. A., Sharp, T. H. Correlative cryo super-resolution light and electron microscopy on mammalian cells using fluorescent proteins. Scientific Reports. 9 (1), 1-11 (2019).
