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Biology

अरबीडोप्सिस बीजों की सतह नसबंदी के लिए उच्च थ्रूपुट, मजबूत और अत्यधिक समय-लचीला विधि

Published: October 4, 2021 doi: 10.3791/62893
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biodiversity and Molecular Ecology, Research and Innovation Centre, Fondazione Edmund Mach

Summary

अरबीडोप्सिस्टलियाना (अरबीडोप्सिस) बीजों की सतह नसबंदी के लिए एक उच्च-थ्रूपुट प्रोटोकॉल प्रदान किया जाता है, जो वैक्यूम पंप के साथ निर्मित एक साधारण सक्शन डिवाइस के साथ तरल हैंडलिंग चरणों का अनुकूलन करता है। बीज के सैकड़ों नमूनों को एक दिन में सतह पर बंध्याकरण किया जा सकता है ।

Abstract

अरबीडोप्सिस अब तक पौधों के मॉडल प्रजातियों का सबसे व्यापक रूप से कार्यात्मक अध्ययन के लिए उपयोग किया जाता है। अरबीडोप्सिस बीजों की सतह नसबंदी इस उद्देश्य की दिशा में आवश्यक एक मौलिक कदम है। इस प्रकार, एक बार में सैकड़ों नमूनों (जैसे, ट्रांसजेनिक लाइनों, इकोटाइप, या म्यूटेंट) को संभालने के लिए उच्च-थ्रूपुट अरबीडोप्सिस बीज सतह नसबंदी विधियों को स्थापित करना सर्वोपरि है। एक आम वैक्यूम पंप से निर्मित एक घर का बना सक्शन डिवाइस के साथ ट्यूबों में तरल के कुशल उन्मूलन के आधार पर एक बीज सतह नसबंदी विधि इस अध्ययन में प्रस्तुत की जाती है। नाटकीय रूप से श्रम को कम करने के द्वारा गहन हाथ समय पर इस विधि के साथ एक दिन में नमूनों के कई सैकड़ों हैंडलिंग थोड़ा प्रयास के साथ संभव है । श्रृंखला समय-पाठ्यक्रम विश्लेषण ों ने उच्च अंकुरण दरों को बनाए रखते हुए सतह नसबंदी की एक अत्यधिक लचीला समय सीमा का संकेत दिया। इस विधि को बीज के आकार के अनुसार सक्शन डिवाइस के सरल अनुकूलन के साथ अन्य प्रकार के छोटे बीजों की सतह नसबंदी के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है, और तरल को खत्म करने के लिए वांछित गति।

Introduction

अरबीडोप्सिस ब्रासिकासी परिवार से संबंधित एक डिप्लोइड पौधे की प्रजाति है। इसके अपेक्षाकृत कम जीवन चक्र (लंबे दिन की बढ़ती परिस्थितियों में प्रति पीढ़ी दो महीने), छोटे पौधों का आकार, और प्रति पौधे सैकड़ों बीजों के उत्पादन के साथ आत्म-परागण ने इसे पहली मौलिक पौधे मॉडल प्रजातियां1,2बना दिया है। इसके अलावा, इसके जीनोम को पूरी तरह से अनुक्रमित किया गया था3,व्यापक रिवर्स जेनेटिक्स टूल (संतृप्त टी-डीएनए, ट्रांसपोसन, और रासायनिक रूप से म्यूटेजेनाइज्ड आबादी) उपलब्ध हैं4,5,6,और प्रभावी एग्रोबैक्टीरियम-मध्यस्थतापरिवर्तन आगे डाउनस्ट्रीम काम के लिए पर्याप्त ट्रांसजेनिक लाइनों को प्राप्त करने के लिए अच्छी तरह से स्थापित है7 . इस प्रकार, पिछले दो दशकों के दौरान, प्राकृतिक, आनुवंशिक और फेनोटाइपिक भिन्नता8,9सहित आणविक स्तर पर पादप जीव विज्ञान के विविध पहलुओं को विच्छेदन करने के लिए एक मॉडल प्रजाति के रूप में अरबीडोप्सिस का उपयोग करके महान प्रगति हासिल की गई है।

अरबीडोप्सिस में रुचि के जीन को कार्यात्मक रूप से चित्रित करने के लिए, फंगल और बैक्टीरियल संदूषकों को खत्म करने के लिए बीज सतह नसबंदी कई डाउनस्ट्रीम प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक कदम है जो एक्सनिक संस्कृतियों की आवश्यकता होती है। ओवरएक्सप्रेशन10के लिए जेनेटिक ट्रांसफॉर्मेशन, नॉक-डाउन (आरएनए-आई11)या नॉक आउट (जीनोम एडिटिंग12,13)जीन फंक्शन, सबसेल्युलर लोकलाइजेशन14,प्रमोटर एक्टिविटी15,16,प्रोटीन-प्रोटीन17 और प्रोटीन-डीएनए इंटरैक्शन18,केवल सबसे आम अनुप्रयोगों का हवाला देते हैं, सभी को बीज सतह नसबंदी कदम की आवश्यकता है । इस प्रकार, अपनी सापेक्ष सादगी के बावजूद, बीज सतह नसबंदी कई कार्यात्मक विश्लेषणों में एक मौलिक भूमिका निभाता है।

अब तक, बीज सतह नसबंदी विधियों की दो प्रमुख श्रेणियां या तो गैस के आधार पर विकसित की गई हैं या तरल चरण नसबंदी19पर । जबकि गैस चरण बीज सतह नसबंदी के थ्रूपुट मध्यम से उच्च है, एक सतह नसबंदी एजेंट के रूप में खतरनाक अभिकर्ण क्लोरीन गैस का उपयोग कर अपने व्यापक आवेदन रुकावट है । तरल चरण नसबंदी के आधार पर विधियां, इसके विपरीत, सतह नसबंदी के लिए इथेनॉल और ब्लीच समाधान जैसे मामूली रसायनों पर भरोसा करते हैं, और क्लोरीन धूमकेतु की तुलना में स्वाभाविक रूप से कम थ्रूपुट होने के बावजूद उनका अधिक व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। सामान्य तौर पर, तरल अभिकर्णों का उपयोग करने वाले दो अलग-अलग तरीकों का आमतौर पर उपयोग किया जाता है। इस्तेमाल की जाने वाली एक विधि20,21के विभिन्न समय के लिए विभिन्न सांद्रता पर इथेनॉल और ब्लीच के साथ धोने पर आधारित है । एक अन्य विधि केवल21 , 22ब्लीच के अनुप्रयोग पर आधारित है . दोनों तरीकों को मुख्य रूप से छोटे पैमाने पर बीज सतह नसबंदी के लिए लागू कर रहे हैं। हालांकि, कई प्रयोगों में, एक परिवर्तन15, 23या स्क्रीन से प्राप्त कई अरबीडोप्सिस ट्रांसजेनिक लाइनों को विभिन्न परिवर्तनों24, 25 से उत्पन्न समानांतर कई ट्रांसजेनिक लाइनों में स्क्रीन करना आवश्यकहै। हमारे ज्ञान का सबसे अच्छा करने के लिए, उच्च थ्रूपुट बीज सतह नसबंदी के लिए कोई तरल आधारित विधि प्रकाशित किया गया है, जो गठन, हालांकि थोड़ा मांयता प्राप्त है, कार्यात्मक जीनोमिक्स दृष्टिकोण के लिए एक महत्वपूर्ण अड़चन । इसलिए, बीज सतह नसबंदी के लिए सुरक्षित, मजबूत और उच्च थ्रूपुट विधियों का विकास एक बार में कई जीन के कार्यात्मक लक्षण वर्णन की सफलता की दिशा में एक आवश्यक और महत्वपूर्ण कदम है।

इस उद्देश्य के लिए, वर्तमान अध्ययन में, अरबीडोप्सिस बीजों की सतह नसबंदी के लिए एक बेहतर विधि प्रस्तुत की जाती है। यह विधि सुरक्षित, कम लागत, अत्यधिक मजबूत और उच्च-थ्रूपुट है, जो बीज सतह नसबंदी की शुरुआत से पेट्री व्यंजनों में बीज बुवाई के अंत तक एक घंटे के भीतर 96 स्वतंत्र लाइनों को संभालने की अनुमति देती है। प्रदर्शित विधि व्यापक रूप से उपलब्ध, एक वैक्यूम पंप, उपभोग्य कांच के बर्तन, और प्लास्टिक के बर्तन की तरह बुनियादी प्रयोगशाला इंस्ट्रूमेंटेशन पर निर्भर करती है। यह बेहतर विधि वैज्ञानिक समुदाय को अरबीडोप्सिस और अन्य गैर-मॉडल पौधों की प्रजातियों में आधुनिक कार्यात्मक जीनोमिक्स दृष्टिकोणों के लिए पर्याप्त थ्रूपुट के साथ बीज सतह नसबंदी को कारगर बनाने के लिए एक सुरक्षित, सरल और किफायती दृष्टिकोण प्रदान करती है।

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Protocol

1. रिएजेंट्स और मीडिया की तैयारी

  1. 70% इथेनॉल समाधान तैयार करें: 95% तकनीकी इथेनॉल के 737 एमएल को 263 एमएल आसुत पानी में जोड़ें। अच्छी तरह मिला लें।
    नोट: एक गैर बाँझ काम बेंच पर 70% इथेनॉल समाधान तैयार करें।
    सावधानी: इथेनॉल अत्यधिक ज्वलनशील है और आंखों में गंभीर जलन पैदा कर सकता है। आग की लपटों और गर्मी के स्रोतों से दूर रहें। आंखों के संपर्क के मामले में, प्रचुर मात्रा में पानी से कुल्ला करें।
  2. 5% ब्लीच समाधान तैयार करें: घरेलू ब्लीच के 5 एमएल (सोडियम हाइपोक्लोराइट, नाक्लो के ~ 3.5% से युक्त) बाँझ आसुत पानी के 95 एमएल में जोड़ें। गैर आयनिक डिटर्जेंट की कुछ बूंदें जोड़ें (जैसे, ट्वीन 20) और अच्छी तरह से मिलाएं।
    नोट: लैमिनार हुड के अंदर 5% ब्लीच समाधान तैयार करें।
    सावधानी: सोडियम हाइपोक्लोराइट, ब्लीच का सक्रिय घटक, अत्यधिक परेशान है। यह अत्यधिक संक्षारक है और गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्रैक्ट को गंभीर नुकसान पहुंचा सकता है। संपर्क के मामले में, प्रचुर मात्रा में पानी के साथ तुरंत कुल्ला। घूस के मामले में, उपचार सलाह के लिए जहर नियंत्रण केंद्र या एक चिकित्सा चिकित्सक को बुलाओ।
  3. आधी ताकत मुरशिगे और स्कूग (आधा एमएस) मीडियम26तैयार करें ।
    1. आसुत पानी के 800 मिली में 2.2 ग्राम एमएस मीडियम पाउडर (विटामिन सहित) और 10 ग्राम सुक्रोज जोड़ें। 1 एम कोह का उपयोग करके समाधान के पीएच को समायोजित करें और आसुत पानी का उपयोग करके वॉल्यूम को 1 एल तक लाएं। अलीकोट 500 एमएल को 1 एल बोतल में डालकर एक ठोस माध्यम तैयार करने के लिए एगर का 4जी जोड़ें। समाधान को ऑटोक्लेव करें।
    2. ऑटोक्लेविंग के बाद, मध्यम को पानी के स्नान में 50-53 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें और इसे लैमिनार प्रवाह हुड के नीचे पेट्री व्यंजनों में डालें। चुनिंदा माध्यम तैयार करने के लिए 50 मिलीग्राम/एमएल कानमाइसिन स्टॉक सॉल्यूशन (10 मिलीग्राम कानामीसिन सल्फेट मोनोहाइड्रेट को 10 एमएल डिस्टिल्ड वाटर में मिलाएं, फिल्टर स्टरलाइज और स्टोर -20 डिग्री सेल्सियस) मीडियम (50-53 डिग्री सेल्सियस) में डालें। घूमता द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं, और पहले बताए गए पेट्री व्यंजनों में डालें।

2. एस्पिरेटर सेटअप

नोट: इंस्ट्रूमेंट सेटअप को चित्र 1में संक्षेप में प्रस्तुत किया गया है ।

  1. वैक्यूम पंप इनलेट को उपयुक्त आकार की पॉलीथीन (पीई) ट्यूब के एक छोर से कनेक्ट करें। ट्यूब के दूसरे छोर को डिकेंशन बॉटल के दो तरह के ढक्कन के आउटलेट से कनेक्ट करें। हवा तंग कनेक्शन सुनिश्चित करने के लिए एक सीलिंग फिल्म(सामग्री की तालिका) केसाथ ट्यूबिंग के जंक्शन कसकर लपेटें।
  2. डिकेंशन बोतल पर स्क्रूकैप के इनलेट (बोतल के अंदर तक फैला हुआ छेद) के लिए एक दूसरी पीई ट्यूब कनेक्ट करें। एक मछलीघर वाल्व के आउटलेट के लिए ट्यूब के दूसरे पक्ष फिट। यदि आवश्यक हो, तो हवाई रिसाव को खत्म करने के लिए जंक्शन के साथ एक सीलिंग फिल्म के साथ लपेटें।
  3. उपयोग से ठीक पहले, लैमिनार फ्लो हुड के तहत एक मछलीघर फिल्टर के इनलेट के लिए एक बाँझ 200 माइक्रोल पिपेट टिप फिट करें।

Figure 1
चित्रा 1:नसबंदी तरल पदार्थ के उच्च थ्रूपुट हटाने के लिए सक्शन डिवाइस की योजनाबद्ध ड्राइंग। स्पष्टता के लिए, एकल भागों को पैमाने पर तैयार नहीं किया जाता है। पत्र(ए)वैक्यूम पंप को इंगित करता है,(बी)जलाशय की बोतल तरल पदार्थ (इथेनॉल, ब्लीच, या बाँझ पानी) एकत्र करने के लिए,(सी)तरल पदार्थ के भाटा से बचने के लिए वाल्व,(डी)बाँझ २०० μL पिपेट टिप, और(ई)१.५ एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब जिसमें बीज और नसबंदी तरल होते हैं । तीर एयरफ्लो की दिशा को इंगित करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

3. बीजों की उच्च थ्रूपुट तरल सतह नसबंदी

नोट: 96 स्वतंत्र नमूनों वाले अरबीडोप्सिस थैलियाना (एल) हेनह वाइल्ड-टाइप (कर्नल-0) (अरबीडोप्सिस) बीजों की सतह नसबंदी के लिए आवश्यक समग्र प्रक्रिया और न्यूनतम समय चित्र 2में संक्षेप में प्रस्तुत किया गया है।

  1. एक स्थायी मार्कर के साथ लेबल प्रगतिशील संख्या के साथ 48 x 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब के दो बैच।
  2. 96 बाँझ 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों (ट्यूब के शंकु अंत के नीचे से लगभग 1-2 मिमी ऊपर) में से प्रत्येक में 100-200 अरबीडोप्सिस बीज जोड़ें।
  3. लेमिनार फ्लो हुड (बीज बैच एक, 48 ट्यूब) के अंदर 10 एमएल बाँझ सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके प्रत्येक ट्यूब में 70% इथेनॉल के 1000 माइक्रोन के आसपास अलीकोट करें और ध्यान से ढक्कन बंद करें।
    नोट: समाधान वितरण के लिए अत्यंत सटीक होने की जरूरत नहीं है, जब तक तिरस्कृत मात्रा बीज की मात्रा से कई गुना अधिक है । वैकल्पिक रूप से, लैमिनार हुड (गैर-बाँझ स्थिति) के बाहर इस चरण को करें।
  4. एक शेकर में कम से कम 3 मिनट के लिए 8.0 हर्ट्ज की दोलन आवृत्ति पर ट्यूबों को हिलाएं।
  5. शेकर से एडाप्टर निकालें और उन्हें एक बेंचटॉप माइक्रोसेंट्रफ्यूज की टोकरी में स्थानांतरित करें।
  6. 1880 x ग्राम (~ 15 एस) तक पहुंचने के लिए पल्स फ़ंक्शन (अधिकांश बेंचटॉप अपकेंद्री में मौजूद) का उपयोग करके बीजों को जल्दी से स्पिन करें।
    नोट: लंबे समय या उच्च अपकेंद्रित्र बलों नकारात्मक बीज अंकुरण को प्रभावित करता है ।
  7. एडाप्टर से 48 ट्यूबों को एक रैक में स्थानांतरित करें और लेमिनार फ्लो हुड के नीचे सभी ट्यूब खोलें। ट्यूबों में फिटिंग ढक्कन के हिस्से को न छूकर संदूषण से बचें। यदि ढक्कन भी एक दूसरे के करीब हैं, आसान हैंडलिंग के लिए दो रैक में ट्यूबों विभाजित ।
  8. लैमिनार फ्लो हुड के तहत घर के बने एस्पिरेटर के एक्वेरियम वाल्व इनलेट पर एक बाँझ 200 माइक्रोन पीले टिप फिट करें और पंप पर स्विच करें।
  9. तरल चूसने के दौरान बीजों को छूने से बचने के लिए बीजों के स्तर के ठीक ऊपर पीले टिप डालें। वैकल्पिक रूप से, ट्यूब के नीचे टिप को जल्दी से रखें; यदि एक बीज तरल के चूषण को रोकता है, तो पीले टिप को खत्म करें और एक नया डालें।
  10. लैमिनार फ्लो हुड के अंदर 10 एमएल बाँझ सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके 5% ब्लीच के 1000 माइक्रोन के आसपास प्रत्येक ट्यूब में अलीकोट।
  11. सभी ढक्कनों को कसकर बंद करें और सभी ट्यूबों को वापस शेकर एडाप्टर में डाल दें। शेकर में कम से कम 3 मिनट के लिए 8.0 हर्ट्ज की दोलन आवृत्ति पर ट्यूबों को हिलाएं।
  12. 1880 x g (~ 15 एस) तक पहुंचने के लिए आवश्यक समय के लिए बेंचटॉप अपकेंद्रित्र के पल्स फ़ंक्शन का उपयोग करके बीजों को जल्दी से स्पिन करें।
  13. लैमिनार फ्लो हुड के नीचे वैक्यूम पंप से जुड़े एक्वेरियम वाल्व पर एक नया बाँझ 200 माइक्रोन पीले टिप फिट करें, और पंप पर स्विच करें।
  14. ब्लीच समाधान चूसने पर बीजों को छूने से बचने के लिए बीजों के स्तर के ऊपर पीले सिरे डालें।
  15. लैमिनार फ्लो हुड में 10 एमएल बाँझ सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके 1000 μL की निष्फल एच2ओ के आसपास प्रत्येक ट्यूब में अलीकोट।
    नोट: ऑपरेशन समय को कम करने के लिए बीज के दो बैचों को मिलाएं।
  16. लेमिनार फ्लो हुड के तहत वैक्यूम पंप से जुड़े एक्वेरियम वाल्व पर एक नया बाँझ 200 माइक्रोन पीला टिप फिट करें और पंप पर स्विच करें।
  17. एच2ओ चूसने पर बीजों को छूने से बचने के लिए बीजों के स्तर के ठीक ऊपर पीले टिप डालें।
  18. 10 एमएल बाँझ सीरोलॉजिकल पिपेट काउपयोग करके 500 μL के आसपास प्रत्येक ट्यूब में एलिकोट करें और लैमिनार प्रवाह हुड में सभी ढक्कन बंद करें। बीज बोने की तैयारी है। जरूरत पड़ने पर ट्यूबों को कमरे के तापमान पर कुछ घंटे अधिकतम या 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर रखें।
  19. पर्याप्त मात्रा में पानी के साथ तरल एकत्र करने के लिए उपयोग की जाने वाली जलाशय की बोतल भरें और इसे ऑटोक्लेव करें। इसके बाद, तरल को सामान्य सिंक में फेंक दें।
    नोट: जलाशय के अंदर सभी बीजों को मारने के लिए तरल को ऑटोक्लेव करें।

Figure 2
चित्रा 2:96 स्वतंत्र नमूनों के साथ अरबीडोप्सिस बीजों की सतह नसबंदी के लिए आवश्यक प्रक्रिया और न्यूनतम समय का अवलोकन। प्रस्तुत प्रयोग में, ९६ स्वतंत्र नमूनों को दो समान आकार के बैचों में संभाला जाता है । पूरी प्रक्रिया दोनों बैचों के लिए एक ही है, और वे समानांतर में संसाधित कर रहे हैं, लेकिन बैच दो बैच एक की तुलना में एक कदम देरी के साथ संसाधित किया जाता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

4. 1/2 एमएस प्लेटों पर अरबीडोप्सिस की चढ़ाना और स्कोरिंग

  1. बीज और बाँझ एच 2 ओ के 300-400माइक्रोनको 1000 माइक्रोल पिपेट के साथ कोमल पिपटिंग द्वारा पेट्री डिश में स्थानांतरित करें।
  2. 10 ट्यूबों को स्थानांतरित करने के बाद, एंटीबायोटिक दवाओं के बिना पिघल 1/2 एमएस माध्यम के 1.5-2.0 ml के आसपास प्रत्येक प्लेट में डालना ।
    नोट: पहले से पिघला और फिर एक थर्मोस्टेटिक स्नान में 1/2 एमएस पिघल माध्यम रखने के लिए 50-53 डिग्री सेल्सियस पर सेट ठोस से बचने के लिए । सुनिश्चित करें कि बीजों की अंकुरण क्षमता को कम करने से बचने के लिए तापमान 58 डिग्री सेल्सियस से अधिक न हो।
  3. इसके अंदर बीज वितरित करने के लिए प्लेट को जल्दी से चक्कर लगाता है। विपरीत दिशाओं पर प्लेटों टेप।
  4. प्लेटों को प्लास्टिक या एल्यूमीनियम पन्नी में लपेटें और फिर उन्हें एक फ्रिज (4 डिग्री सेल्सियस) में 3 दिनों के लिए अंधेरे में एक फ्रिज (4 डिग्री सेल्सियस) में रखें ताकि समान अंकुरण प्राप्त किया जा सके।
  5. प्लेटों को लंबे दिन की स्थितियों (16 घंटे प्रकाश/8 एच अंधेरे) के तहत 23 डिग्री सेल्सियस पर सेट एक विकास कक्ष में स्थानांतरित करें, जिसमें 100-120 माइक्रोमोलम-2-एस-1और60% सापेक्ष आर्द्रता की हल्की तीव्रता है।
  6. दो दिनों के बाद, पौधों को रेडिकल्स की उपस्थिति से स्कोर करें। बीज अंकुरण का मूल्यांकन करने के लिए रेडिकल उद्भव और हरे कोटिलेडॉन गठन (दो कोटिलेडॉन का पूर्ण उद्घाटन) का पता लगाएं।

5. सांख्यिकीय विश्लेषण

नोट: यहां, तुकी के जोड़ीवार परीक्षण का उपयोग सांख्यिकीय विश्लेषणों के लिए किया गया था।

  1. 0.01 से नीचे के पी-मानों को सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण मानते हैं। कम से कम पांच जैविक प्रतिकृति के साथ सभी प्रयोगों को करें।

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Representative Results

पूरे बीज नसबंदी प्रक्रिया के लिए आवश्यक समय का आकलन करने के लिए, वर्तमान प्रोटोकॉल में 96 नमूनों को तरल हैंडलिंग के लिए समय अंतर की गणना की गई थी और पारंपरिक पाइपिंग विधियों की तुलना में की गई थी। परिणाम इंगित करता है कि वर्तमान प्रोटोकॉल समय बचाता है, पारंपरिक प्रोटोकॉल(तालिका 1)के साथ तरल हैंडलिंग समय को एक चौथाई तक काटता है। तालिका में आगे इस बात पर प्रकाश डाला गया है कि वर्तमान प्रोटोकॉल में तरल हटाने का समय पारंपरिक तरीकों की तुलना में अधिक समय बचाता है, जिसमें कुल आठ गुना कमी आती है ।

बीज नसबंदी के लिए समय सीमा का चयन
अब नसबंदी कदम संदूषण दरों को कम लेकिन नकारात्मक बीज अंकुरण को प्रभावित कर सकते हैं । संदूषण के बिना उच्चतम अंकुरण दरों के साथ बीज नसबंदी के लिए सबसे अच्छा समय सीमा निर्धारित करने के लिए, प्रत्येक नसबंदी चरण की विभिन्न अवधियों का परीक्षण किया गया, बीज अंकुरण और हरे रंग की कोटिलेडन उद्भव दरों दोनों का आकलन किया गया। अंकुरण विश्लेषण 2 दिन से 4 दिन तक किया और 7 दिन में 10 मिनट से ७०% इथेनॉल नसबंदी के ४० मिनट के लिए समय सीमा के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर का संकेत दिया । हालांकि, 70% इथेनॉल के साथ उपचार के 40 मिनट से, अंकुरण दरों में गिरावट आई(चित्र 3)। तदनुसार, हरे रंग की cotyledon उद्भव दरों में कमी आई(चित्रा 4)। चूंकि कम नसबंदी समय थ्रूपुट को बढ़ा सकता है लेकिन संदूषण दरों में वृद्धि कर सकता है, ४८ नमूनों के दो बैचों में ९६ विभिन्न बीज नमूनों को निष्फल करने के लिए आवश्यक न्यूनतम समय का आकलन किया गया था । इसके अलावा, एक शेखर में प्रदर्शन मिलाते हुए के साथ पसंदीदा सेटअप को देखते हुए, हमने प्रत्येक ४८ नमूनों के दो बैचों में ९६ नमूनों को संभालकर बीज नसबंदी के लिए आवश्यक न्यूनतम समय का परीक्षण किया । एक बार में ४८ नमूनों को संभालने के लिए आवश्यक न्यूनतम समय 3 मिनट था, इस प्रकार ४८ नमूनों के दूसरे सेट को बिना किसी प्रतीक्षा समय के पहले सेट के तुरंत बाद संसाधित करने की अनुमति दी गई । इस प्रकार, 70% इथेनॉल के लिए 3 मिनट और 5% ब्लीच के लिए 3 मिनट को चित्र 3में बीज (बिंदु (ए) को निष्फल करने के लिए न्यूनतम समय के रूप में लागू किया गया था। इन विश्लेषणों के परिणामस्वरूप अंकुरण दर संदूषण और बीज जीवन शक्ति(चित्रा 3)के नुकसान के बिना उच्चतम लोगों के समान है ।

संक्षेप में, सूक्ष्मजीवों के पर्याप्त उन्मूलन से प्राप्त संदूषण के बिना बीज अंकुरण के उच्चतम प्रतिशत को बनाए रखने के लिए उपयुक्त समय 70% इथेनॉल के लिए 3-30 मिनट के बीच और 5% ब्लीच के लिए 3-22.5 मिनट के बीच है।

आदेश में प्रदर्शित करने के लिए कि बीज हम मूल रूप से इस्तेमाल किया सूक्ष्मजीवों के साथ दूषित थे, गैर बाँझ बीज सीधे एमएस प्लेटों पर बोया गया । कवक दो दिन की बुवाई के बाद प्लेटों पर दिखाई दिया और सात दिन के अंकुरण(पूरक चित्रा 1)के बाद सभी प्लेटों पर फैल गया ।

बीजों के विभिन्न जीनोटाइप के बीच क्रॉस-संदूषण का मूल्यांकन
यह जांचने के लिए कि क्या विभिन्न बीज नमूनों को संसाधित करने के लिए एक बाँझ पिपेट टिप का उपयोग क्रॉस-संदूषण में हो सकता है और इस तरह के क्रॉस-संदूषण की मात्रा का आकलन करने के लिए, बीजों के दो अलग-अलग जीनोटाइप (कर्नल-0 जंगली प्रकार, कानमाइसिन के प्रति संवेदनशील, और अरबीडोप्सिस ट्रांसजेनिक लाइन AdoIspS-79, कानमीसिन24के लिए प्रतिरोधी) नसबंदी प्रक्रिया के दौरान वैकल्पिक थे। मानक बीज नसबंदी के बाद, वे आधी ताकत एमएस ठोस प्लेटों में बोया गया था बिना या ५० मिलीग्राम/एल kanamycin के साथ पूरक । प्रयोगों को पांच बार दोहराया गया । इन विश्लेषणों से पता चला है कि कानामाइसिन युक्त एमएस प्लेटों में अंकुरित होने वाले बीजों में से लगभग ९६% बीज, लेकिनकर्नल-0 जीनोटाइप(चित्रा 5)के साथ बोई गई किसी भी प्लेट में अंकुरण के 7 वें दिन कोई हरा कोटाइलन नहीं मनाया गया । समानांतर में, एमएस प्लेटों में बोए गए कर्नल-0 बीजों में लगभग 94% अंकुरण दिखाया गया, और 7 दिन के अंकुरण के बाद सभी कोटिलेडन हरे रंग के थे। इन परिणामों से पता चलता है कि बाँझ समाधान को हटाने के लिए एक ही पिपेट टिप का उपयोग करने के बावजूद नमूनों के बीच संदूषण का कोई कैरी-ओवर नहीं है ।

Figure 3
चित्र 3:2-, 3-, 4 और 7 दिन के बाद बीज अंकुरण प्रतिशत विभिन्न नसबंदी समय के साथ बीज बुवाई अलग-अलग अक्षरों के साथ इंगित किया गया। क: 70% इथेनॉल के 3 मिनट और 5% ब्लीच के 3 मिनट, ख: 70% इथेनॉल के 10 मिनट और 5% ब्लीच के 7.5 मिनट, सी: 70% इथेनॉल के 20 मिनट और 5% ब्लीच के 15 मिनट, डी: 70% इथेनॉल के 30 मिनट और 5% ब्लीच के 22.5 मिनट, ई: 40 मिनट 70% 70% और इथेनॉल 30 मिनट 5% ब्लीच, ब्लीच च: 70% इथेनॉल के 50 मिनट और 5% ब्लीच के 37.5 मिनट, जी: 70% इथेनॉल के 70 मिनट और 5% ब्लीच के 52.5 मिनट। दो सितारों है Tukey जोड़ी परीक्षण (पी < ०.०१) के अनुसार महत्वपूर्ण मतभेदों का संकेत मिलता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4:7 दिन के बाद ग्रीन कोटिलेडोन प्रतिशत अलग-अलग अक्षरों के साथ दर्शाए गए विभिन्न नसबंदी समय के साथ बीज बुवाई। क: 70% इथेनॉल के 3 मिनट और 5% ब्लीच के 3 मिनट, ख: 70% इथेनॉल के 10 मिनट और 5% ब्लीच के 7.5 मिनट, सी: 70% इथेनॉल के 20 मिनट और 5% ब्लीच के 15 मिनट, डी: 70% इथेनॉल के 30 मिनट और 5% ब्लीच के 22.5 मिनट, ई: 40 मिनट 70% 70% और इथेनॉल 30 मिनट 5% ब्लीच, ब्लीच च: 70% इथेनॉल के 50 मिनट और 5% ब्लीच के 37.5 मिनट, जी: 70% इथेनॉल के 70 मिनट और 5% ब्लीच के 52.5 मिनट। दो सितारों है Tukey जोड़ी परीक्षण (पी < ०.०१) के अनुसार महत्वपूर्ण मतभेदों का संकेत मिलता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5:कर्नल-0 जंगली प्रकार और AdoIspS-७९ बीज के बीच पार संदूषण परख । आधा शक्ति एमएस प्लेटों में कर्नल-0 अंकुरण (बाएं), कर्नल-0 आधी ताकत एमएस प्लेट में ५० मिलीग्राम/एल kanamycin (मध्य) और AdoIspS-७९ के साथ पूरक आधा शक्ति एमएस प्लेट में ५० मिलीग्राम/L kanamycin (दाएं), scalebar = 1 सेमी के साथ पूरक । पांच प्रतिकृति में से एक की एक प्रतिनिधि छवि आंकड़ा में दिखाया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

प्रक्रिया वर्तमान प्रोटोकॉल (न्यूनतम) पारंपरिक पिपटिंग (न्यूनतम)
तरल 1 जोड़ना 12 24
तरल 1 को हटाना 6 48
कुल 18 72

तालिका 1: 96 बीज नमूनों की नसबंदी के दौरान तरल हैंडलिंग के लिए आवश्यक न्यूनतम समय का सारांश। तालिका वर्तमान प्रोटोकॉल और एक प्रोटोकॉल का उपयोग करके बीज सतह नसबंदी के मुख्य चरणों में तरल को जोड़ने और हटाने के लिए आवश्यक कुल समय (न्यूनतम) को सूचीबद्ध करती है जहां पारंपरिक पाइपिंग का उपयोग किया जाता है।

पूरक चित्र 1: 7 दिन के अरबीडोप्सिस बीज बुवाई के बाद संदूषण का पता लगाना। छवि गैर बाँझ बीज के संदूषण की डिग्री से पता चलता है (पानी के साथ धोया; बाएं) और बाँझ बीज (सतह नसबंदी के अधीन के रूप में मुख्य पाठ में वर्णित है; सही) । Scalebar = 1 सेमी. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

बीजों की नसबंदी अरबीडोप्सिस में कार्यात्मक अध्ययन के लिए मौलिक कदम है। यद्यपि यह अक्सर कई अलग-अलग उद्देश्यों के लिए किया जाता है, अरबीडोप्सिस में उच्च-थ्रूपुट बीज सतह नसबंदी पर सीमित अध्ययन उपलब्ध हैं।

अब तक सबसे ज्यादा थ्रूपुट वाले तरीकों में से एक है केंद्रित एचसीएल के साथ ब्लीच मिलाकर पैदा होने वाली क्लोरीन गैस का इस्तेमाल। यद्यपि इस विधि के लिए सीमित हाथों-समय की आवश्यकता होती है, लेकिन यह मनुष्यों के लिए अत्यधिक विषाक्त गैस का उपयोग करता है27। इसके अलावा, सतह-निष्फल होने वाले बीजों की संख्या और सतह बीज नसबंदी की अवधि को सावधानीपूर्वक नियंत्रित किया जाना चाहिए। यदि बीज बहुत अधिक हैं, तो क्लोरीन गैस की खुराक बीज कोट पर मौजूद सूक्ष्मजीवों को पूरी तरह से मारने के लिए पर्याप्त नहीं होगी, जिसके परिणामस्वरूप बीज बैचों का व्यापक संदूषण होगा। दूसरी ओर, यदि सतह नसबंदी की अवधि बहुत लंबी है, तो बीज ों को मार दिया जाएगा। इस प्रकार, कुछ फायदों के बावजूद, अरबीडोप्सिस में बीज सतह नसबंदी के लिए धूमकेतु पसंदीदा विधि नहीं है।

इसके विपरीत, अरबीडोप्सिस बीजों की सतह नसबंदी के लिए तरल आधारित कई तरीके हैंजो 28,29,30उपलब्ध हैं। हालांकि, इन तरीकों की मुख्य सीमा यह है कि उन्हें विशेष रूप से कम संख्या में नमूनों के लिए उपयोग किया जा सकता है, और उन्हें थ्रूपुट के लिए अनुकूलित नहीं किया जाता है। हमारी जानकारी के लिए, अरबीडोप्सिस बीजों की उच्च-थ्रूपुट सतह नसबंदी पर एकमात्र अध्ययन लिंडसे, बी ई एट अल31द्वारा वर्णित किया गया था । इस अध्ययन में लेखकों ने दो अलग-अलग तरीकों का प्रस्ताव रखा। ऊपर उल्लिखित क्लोरीन गैस के साथ एक दृष्टिकोण के अलावा, लेखकों ने 5-10 मिनट नसबंदी के लिए लागू एक केंद्रित ब्लीच समाधान का उपयोग करके तरल आधारित सतह नसबंदी विधि का प्रस्ताव किया। यद्यपि इस विधि ने विभिन्न समयों के लिए ब्लीच की विभिन्न सांद्रता के साथ सतह बीज नसबंदी के लिए पहला व्यवस्थित अध्ययन प्रदान किया और इसी उत्पादन का विश्लेषण किया, प्रोटोकॉल में अभी भी सुधार किया जा सकता है। सबसे पहले, इस विधि ने अत्यधिक केंद्रित ब्लीच का उपयोग किया, जो ऑपरेटर और पर्यावरण के लिए हानिकारक हो सकता है। दूसरा, अत्यधिक केंद्रित ब्लीच के उपयोग के कारण, सबसे अच्छा बीज सतह नसबंदी समय केवल 5-10 मिनट के बीच है, इस प्रकार प्रोटोकॉल के पूरा होने के लिए एक संकीर्ण समय खिड़की वहन । इसके अलावा, ब्लीच को खत्म करने के लिए, कई धोने के कदम आवश्यक थे, प्रोटोकॉल दोनों समय और काम गहन बनाने और सतह नसबंदी कदम के इतने कम समय सीमा में थ्रूपुट को सीमित करने ।

इन सभी सीमाओं को दूर करने और पिछले कार्यों के सर्वोत्तम पहलुओं को संयोजित करने के लिए, यहां वर्णित विधि 70% तकनीकी इथेनॉल के साथ की गई थी जिसके बाद ब्लीच (5%) के कम प्रतिशत के साथ एक और कदम उठाया गया था जिसने विषाक्तता और श्रम-गहन धोने के कदमों को कम किया। इसके अतिरिक्त, बीज अंकुरण के व्यवस्थित विश्लेषणों ने अंकुरण दरों को प्रभावित किए बिना बीज सतह नसबंदी के लिए 3-30 मिनट के बीच एक व्यापक समय सीमा प्रदान की। यह कार्यप्रवाह को व्यवस्थित करने के लिए उच्च लचीलापन की अनुमति देता है, जिससे समवर्ती कार्य के अनुसार सतह नसबंदी समय को विनियमित करने की अनुमति होती है। इससे भी महत्वपूर्ण बात, श्रम-गहन पाइपटिंग प्रक्रिया को तरल पदार्थ जोड़ने के लिए एक सीरोलॉजिकल पिपेट के साथ कई वितरण द्वारा प्रतिस्थापित किया गया था और सबसे महत्वपूर्ण बात यह है कि एक बहुत तेजी से आकांक्षा विधि द्वारा एक सरल हालांकि प्रदर्शनात्मक घर का बना सक्शन डिवाइस द्वारा नमूनों के बीच टिप विनिमय की आवश्यकता नहीं थी। जलाशय की बोतल की उपस्थिति को देखते हुए, लाइनों के बीच कोई क्रॉस-संदूषण प्रयोगात्मक रूप से नहीं देखा गया था, क्योंकि बीज जो अनजाने में पिपेट टिप के साथ आकांक्षी हो सकते हैं, बोतल में डिकेंट किए जाते हैं। बाँझ टिप और ट्यूबिंग के बीच एक एडाप्टर के रूप में उपयोग किए जाने वाले वाल्व को विशेष रूप से यह गारंटी देने के लिए चुना गया था कि तरल को बीज युक्त ट्यूब पर वापस बहने के बिना संग्रह बोतल में छोड़ दिया जाता है। इस प्रकार, इस विधि ने आसान हैंडलिंग और समय की बचत के साथ बीज सतह नसबंदी प्रक्रिया में नाटकीय रूप से सुधार किया।

अंत में, यह प्रोटोकॉल वैज्ञानिक समुदाय को अरबीडोप्सिस बीजों की सतह नसबंदी के लिए एक सुरक्षित, अत्यधिक समय लचीला, कम श्रम और समय की बचत करने वाले दृष्टिकोण के साथ प्रदान करता है, जो सस्ती है और आसानी से किसी भी प्रयोगशाला में स्थापित है। इसके अलावा, विधि भी अंततः बाँझ टिप, एडाप्टर, और बीज आकार के अनुसार टयूबिंग बदलकर छोटे बीज के किसी भी अंय प्रकार की सतह नसबंदी के लिए लागू किया जा सकता है । विशेष रूप से, इस विधि का सफलतापूर्वक कई ब्रासिकासी प्रजातियों (जैसे, कार्डमाइन इम्पैटिन्स एल., बर्टेरोआ इंकाना (एल.) डीसी, कैप्सेला बर्सा-पादरी (एल. मेडिस, अलियारी पेटिओलेटा (एम बीबरस्टीन) कैवारा एट ग्रांडे, आदि के लिए संशोधन के बिना सफलतापूर्वक उपयोग किया गया था, साथ ही निकोटियाना बेंथामियाना डोमिन और निकोटीना टैब के लिए भी एल बीज। विधि भी छोटे बीजों के लिए लागू किया जा सकता है, ऑर्किड के उन लोगों की तरह, जब तक गति के सटीक निर्धारण/अपकेंद्रित्र और सतह नसबंदी उपचार की लंबाई के समय३२ स्थापितकिया जा सकता है ।

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Disclosures

सभी लेखकों के हितों का कोई टकराव की घोषणा ।

Acknowledgments

इस शोध को ट्रेंटो के स्वायत्त प्रांत द्वारा फोंडाजिओन ई. मच के इकोजेनोमिक्स समूह के कोर फंडिंग के माध्यम से वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aquarium valve Amazon B074CYC5SD Kit including 2 valves and thin-walled tubings. The valve prevents the liquids to go back to the sterile tip
Arabidopsis Col-0 wild-type seeds Nottingham Arabidopsis Stock Center N1093 Wild type seeds (sensitive to kanamycin)
Arabidopsis transgenic line AdoIspS-79 seeds NA NA Transgenic line overexpressing an isoprene synthase gene from Arundo donax transformed in the Col-0 background, resistant to kanamycin (Li et al. (2017) Mol. Biol. Evol., 34, 2583–2599). Available on request from the authors
Microcentrifuge Eppendorf EP022628188 Benchtop microcentrifuge used for spinning down the seeds
Murashige & Skoog medium including vitamins Duchefa M0222 Standard medium for plant sterile culture
Pipette controller Brand 26300 Used to operate the serological pipette
Polyethylene tube 1 Roth 9591.1 Tube for connection from vacuum pump to decantation bottle (inner diameter: 7 mm; outer diameter: 9 mm)
Polyethylene tube 2 Roth 9587.1 Tube for connection from decantation bottle to the aquarium valve  (inner diameter: 5 mm; outer diameter: 7 mm)
Screw cap with connectors Roth PY86.1 2-way dispenser screw cap GL45 in polypropylene for decanting bottle
Serological pipette Brand 27823 Graduated glass (reusable) serological pipette. Disposable pipettes can be used instead
Shakeret al. Qiagen 85300 TissueLyser II bead mill used normally for tissue homogenization. Without the addition of beads to the tubes it works as shaker.
Technical ethanol ITW Reagents (Nova Chimica Srl) 212800 Ethanol 96% v/v partially denatured technical grade
Tween 20 Merck Millipore 655205 Non-ionic detergent acting as surfactant
Universal tubing connectors Roth Y523.1 Can be used to improve/simplify tubing connections
Vacuum pump Merck Millipore WP6222050 Used for making the suction device

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References

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जीव विज्ञान अंक 176
अरबीडोप्सिस बीजों की सतह नसबंदी के लिए उच्च थ्रूपुट, मजबूत और अत्यधिक समय-लचीला विधि
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Li, M., Yu, J., Barbaro, E.,… More

Li, M., Yu, J., Barbaro, E., Varotto, C. High-throughput, Robust and Highly Time-flexible Method for Surface Sterilization of Arabidopsis Seeds. J. Vis. Exp. (176), e62893, doi:10.3791/62893 (2021).

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