Summary
Предусмотрен высокопроизводительный протокол поверхностной стерилизации семян Arabidopsisthaliana (Arabidopsis), оптимизирующий этапы обработки жидкости с помощью простого всасывающего устройства, построенного с вакуумным насосом. Сотни образцов семян могут быть стерилизованы поверхностно за один день.
Abstract
Arabidopsis на сегодняшний день является модельным видом растений, наиболее широко используемым для функциональных исследований. Поверхностная стерилизация семян арабидопсиса является фундаментальным шагом, необходимым для достижения этой цели. Таким образом, крайне важно установить высокопроизводительные методы поверхностной стерилизации семян Arabidopsis для обработки от десятков до сотен образцов (например, трансгенных линий, экотипов или мутантов) одновременно. В данном исследовании представлен метод стерилизации поверхности семян, основанный на эффективном устранении жидкости в трубах с помощью самодельного всасывающего устройства, построенного из общего вакуумного насоса. За счет резкого сокращения трудоемкого практического времени с помощью этого метода обработка нескольких сотен образцов за один день возможна с небольшими усилиями. Последовательные анализы времени также показали весьма гибкий диапазон времени поверхностной стерилизации за счет поддержания высоких показателей всхожести. Этот метод может быть легко адаптирован для поверхностной стерилизации других видов мелких семян с простой настройкой всасывающего устройства в соответствии с размером семян и скоростью, желаемой для устранения жидкости.
Introduction
Arabidopsis — вид диплоидных растений, относящийся к семейству Brassicaceae. Его относительно короткий жизненный цикл (два месяца на поколение в условиях долгого дня выращивания), небольшой размер растения и самоопыление с производством сотен семян на растение сделали его первым фундаментальным модельным видом растений1,2. Кроме того, его геном был полностью секвенирован3,обширные инструменты обратной генетики (насыщенные Т-ДНК, транспозоны и химически мутагенизированные популяции) доступны4,5,6, и эффективная Agrobacterium-опосредованная трансформация хорошо установлена для получения достаточных трансгенных линий для дальнейшей последующей работы7 . Таким образом, за последние два десятилетия были достигнуты большие успехи, используя Arabidopsis в качестве модельного вида для препарирования различных аспектов биологии растений на молекулярном уровне, включая естественные, генетические и фенотипические вариации8,9.
Чтобы функционально охарактеризовать гены, представляющие интерес для Arabidopsis, стерилизация поверхности семян для устранения грибковых и бактериальных загрязнителей является предварительным этапом для многих последующих протоколов, требующих аксеновых культур. Генетическая трансформация для сверхэкспрессии10,нокдауна (РНК-I11)или нокаута (редактирование генома12,13)функции гена, субклеточной локализации14,промоторной активности15,16,белка-белка17 и белково-ДНК-взаимодействия18,чтобы привести только наиболее распространенные применения, все это требует стадии стерилизации поверхности семян. Таким образом, несмотря на свою относительную простоту, стерилизация поверхности семян играет фундаментальную роль во многих функциональных анализах.
До настоящего времени были разработаны две основные категории методов поверхностной стерилизации семян, основанные либо на газофазной, либо на жидкофазной стерилизации19. В то время как пропускная способность газофазной поверхностной стерилизации семян является средней или высокой, использование опасного реагента газообразного хлора в качестве поверхностного стерилизующего агента препятствует его широкому применению. Методы, основанные на жидкофазной стерилизации, напротив, полагаются на более мягкие химические вещества, такие как этанол и отбеливающие растворы для поверхностной стерилизации, и они более широко используются, несмотря на то, что они имеют по своей сути более низкую пропускную способность, чем фумигация хлором. В общем, обычно используются два разных метода, в которых используются жидкие реагенты. Один из широко используемых методов основан на промывке этанолом и отбеливателем в разных концентрациях на разную продолжительностьвремени 20,21. Другой метод основан на нанесении отбеливателятолько 21,22. Оба метода в основном применяются для мелкомасштабной поверхностной стерилизации семян. Однако во многих экспериментах необходимо экранировать многие трансгенные линии Arabidopsis, полученные из одного преобразования15,23 или экранировать параллельно множество трансгенных линий, генерируемых из разных преобразований24,25. Насколько нам известно, не было опубликовано ни одного жидкого метода высокопроизводительной поверхностной стерилизации семян, который представляет собой, хотя и малопризнанный, важное узкое место для подходов функциональной геномики. Поэтому разработка безопасных, надежных и высокопроизводительных методов стерилизации поверхности семян является необходимым и критическим шагом на пути к успеху функциональной характеристики многих генов одновременно.
С этой целью в настоящем исследовании представлен усовершенствованный метод поверхностной стерилизации семян арабидопсиса. Этот метод является безопасным, недорогим, высокопрочным и высокопроизводительным, что позволяет обрабатывать 96 независимых линий в течение одного часа от начала стерилизации поверхности семян до конца посева семян в чашках Петри. Продемонстрированный метод опирается на широко доступные, базовые лабораторные приборы, такие как вакуумный насос, расходная стеклянная посуда и пластиковая посуда. Этот улучшенный метод предоставляет научному сообществу безопасный, простой и доступный подход к оптимизации стерилизации поверхности семян с пропускной способностью, адекватной современным подходам функциональной геномики у арабидопсиса и других немодельных видов растений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Реагенты и подготовка сред
- Приготовьте 70% раствор этанола: Добавьте 737 мл 95% технического этанола в 263 мл дистиллированной воды. Тщательно перемешать.
ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте 70% раствор этанола на нестерильном рабочем столе.
ВНИМАНИЕ: Этанол легко воспламеняется и может вызвать серьезное раздражение глаз. Хранить вдали от пламени и источников тепла. При попадании в глаза промыть обильной водой. - Приготовьте 5% раствор отбеливателя: Добавьте 5 мл бытового отбеливателя (содержащего ~3,5% гипохлорита натрия, NaClO) в 95 мл стерильной дистиллированной воды. Добавьте несколько капель неионного моющего средства (например, Tween 20) и тщательно перемешайте.
ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте 5% раствор отбеливателя внутри ламинарной вытяжки.
ВНИМАНИЕ: Гипохлорит натрия, активный компонент отбеливателя, сильно раздражает. Он очень коррозионный и может нанести серьезный ущерб желудочно-кишечному тракту. В случае контакта немедленно промойте обильной водой. В случае проглатывания позвоните в токсикологический центр или к врачу для консультации по лечению. - Готовят полусилу Мурасиге и Скуг (1/2 МС) средние26.
- Добавьте 2,2 г порошка ms medium (включая витамины) и 10 г сахарозы в 800 мл дистиллированной воды. Отрегулируйте рН раствора с помощью 1 М КОН и доведите объем до 1 л с помощью дистиллированной воды. Aliquot 500 мл в бутылку 1 л и добавьте 4 г агара для приготовления твердой среды. Автоклав решения.
- После автоклавирования охладите среду до 50-53 °C на водяной бане и вылейте ее в чашку Петри под ламинарной вытяжкой. Для приготовления селективной среды добавляют 1000 мкл/л 50 мг/мл раствора канамицина (смешивают 500 мг моногидрата канамицина сульфата в 10 мл дистиллированной воды, фильтруют стерилизуют и хранят при -20°С) к среде (50-53 °С). Хорошо перемешайте, закручиваясь, и вылейте в чашку Петри, как упоминалось ранее.
2. Настройка аспиратора
ПРИМЕЧАНИЕ: Настройка приборов обобщена на рисунке 1.
- Подключите входное отверстие вакуумного насоса к одному концу полиэтиленовой (ПЭ) трубки подходящего размера. Подключите другой конец трубки к выходному отверстию двусторонней крышки декантационного флакона. Плотно оберните соединение трубки уплотнительной пленкой(Таблица материалов)для обеспечения герметичного соединения.
- Подключите вторую полиэтиленовую трубку к входному отверстию (отверстие, выступающее внутрь бутылки) завинчивающейся крышки на бутылке для декантации. Поднесите другую сторону трубки к выходу аквариумного клапана. При необходимости оберните уплотнительной пленкой вдоль стыка, чтобы исключить утечку воздуха.
- Непосредственно перед использованием подойдите стерильным наконечником пипетки объемом 200 мкл к входному отверстию аквариумного фильтра под ламинарной вытяжкой.
Рисунок 1:Схематический чертеж всасывающего устройства для высокопроизводительного удаления стерилизационных жидкостей. Для ясности отдельные части не рисуются в масштабе. Буква(A)обозначает вакуумный насос,(B)резервуарную бутылку для сбора жидкостей (этанола, отбеливателя или стерильной воды),(C)клапан для предотвращения рефлюкса жидкостей,(D)стерильный наконечник пипетки объемом 200 мкл и(E)микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл, содержащую семена и стерилизационную жидкость. Стрелки указывают направление воздушного потока. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
3. Высокопроизводительная жидкостная поверхностная стерилизация семян
ПРИМЕЧАНИЕ: Общая процедура и минимальное время, необходимое для поверхностной стерилизации семян Arabidopsis thaliana (L.) Heynh wild-type (Col-0) (Arabidopsis) с 96 независимыми образцами, обобщены на рисунке 2.
- Этикетка перманентным маркером двух партий микроцентрифужных трубок 48 х 1,5 мл с прогрессивными номерами.
- Добавьте 100-200 семян арабидопсиса в каждую из 96 стерильных микроцентрифужных трубок объемом 1,5 мл (примерно на 1-2 мм выше нижней части конического конца трубки).
- Aliquot около 1000 мкл 70% этанола в каждую трубку, используя 10 мл стерильной серологической пипетки внутри ламинарной вытяжки (первая партия семян, 48 пробирок) и осторожно закройте крышки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Дозирование растворов не должно быть чрезвычайно точным, если дозируемый объем в несколько раз превышает объем семян. Кроме того, выполните этот шаг за пределами ламинарной вытяжки (нестерильное состояние). - Встряхните трубки с частотой колебаний 8,0 Гц в течение не менее 3 мин в шейкере.
- Извлеките адаптеры из шейкера и переложите их в корзину настольной микроцентрифуги.
- Быстро раскрутите семена, используя импульсную функцию (присутствующую в большинстве настольных центрифуг), чтобы достичь 1880 х г (~ 15 с).
ПРИМЕЧАНИЕ: Более длительное время или более высокие силы центрифугирования негативно влияют на прорастание семян. - Переложите 48 трубок с адаптеров в одну стойку и откройте все трубки под ламинарной вытяжкой. Избегайте загрязнений, не касаясь части крышек, врезающихся в трубки. Если крышки находятся слишком близко друг к другу, разделите трубки на две стойки для облегчения обработки.
- Установите стерильный желтый наконечник объемом 200 мкл на входное отверстие аквариумного клапана самодельного аспиратора под ламинарной вытяжкой и включите насос.
- Вставьте желтый кончик чуть выше уровня семян, чтобы не касаться семян при всасывании жидкости. Кроме того, быстро расположите наконечник в нижней части трубки; если семя блокирует всасывание жидкости, удалите желтый наконечник и вставьте новый.
- Aliquot в каждой трубке около 1000 мкл 5% отбеливателя с использованием 10 мл стерильной серологической пипетки внутри ламинарного проточного капюшона.
- Плотно закройте все крышки и поместите все трубки обратно в адаптеры шейкера. Встряхните трубки при частоте колебаний 8,0 Гц в течение не менее 3 мин в шейкере.
- Быстро раскручивайте семена, используя импульсную функцию настольной центрифуги в течение времени, необходимого для достижения 1880 х г (~ 15 с).
- Установите новый стерильный желтый наконечник объемом 200 мкл на клапан аквариума, подключенный к вакуумному насосу под ламинарной вытяжкой, и включите насос.
- Вставьте желтый кончик выше уровня семян, чтобы избежать прикосновения к семенам при высасывании раствора отбеливателя.
- Aliquot в каждую трубку около 1000 мкл стерилизованногоH2Oс использованием 10 мл стерильной серологической пипетки в ламинарной вытяжке.
ПРИМЕЧАНИЕ: Объедините две партии семян, чтобы свести к минимуму время работы. - Установите новый стерильный желтый наконечник объемом 200 мкл на клапан аквариума, подключенный к вакуумному насосу под ламинарной вытяжкой, и включите насос.
- Вставьте желтый кончик чуть выше уровня семян, чтобы избежать прикосновения к семенам при сосании H2O.
- Aliquot в каждую трубку около 500 мкл стерилизованногоH2Oс помощью 10 мл стерильной серологической пипетки и закройте все крышки в ламинарной вытяжке. Семена готовы к посеву. При необходимости держите трубки при комнатной температуре в течение нескольких часов максимум или при 4 °C в течение ночи.
- Наполните резервуар бутылки, используемой для сбора жидкости, достаточным количеством воды и автоклавируйте ее. После этого выбросьте жидкость в обычную раковину.
ПРИМЕЧАНИЕ: Автоклав жидкости, чтобы убить все семена внутри резервуара.
Рисунок 2:Обзор процедуры и минимальное время, необходимое для поверхностной стерилизации семян арабидопсиса с 96 независимыми образцами. В представленном эксперименте 96 независимых образцов обрабатываются двумя партиями одинакового размера. Вся процедура одинакова для обеих партий, и они обрабатываются параллельно, но вторая партия обрабатывается с задержкой в один шаг по сравнению с первой партией. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
4. Нанесение покрытия и оценка Arabidopsis на 1/2 MS пластинах
- Переложите семена и 300-400 мкл стерильногоH2Oв чашку Петри путем бережной пипетки пипеткой 1000 мкл.
- После переноса 10 пробирок влейте в каждую пластину около 1,5-2,0 мл расплавленной 1/2 МС среды без антибиотиков.
ПРИМЕЧАНИЕ: Расплавите заранее, а затем храните расплавленную среду 1/2 МС в термостатической ванне, установленной при 50-53 °C, чтобы избежать затвердевания. Убедитесь, что температура не превышает 58 °C, чтобы избежать снижения всхожести семян. - Быстро закрутите тарелку, чтобы распределить семена внутри нее. Заклейте пластины на противоположные стороны.
- Заверните пластины в пластиковую или алюминиевую фольгу, а затем поместите их в холодильник (4 °C) на 3 дня в темноте для получения равномерного прорастания.
- Переложите пластины в камеру роста, установленную при 23 °C в условиях длительного дня (16 ч света/8 ч темноты) с интенсивностью света 100-120 мкмоль·м-2·с-1 и 60% относительной влажностью.
- Через два дня оценивают растения по наличию радиков. Обнаружение появления радика и образования зеленого семядоли (полное открытие двух семядолий) для оценки всхожести семян.
5. Статистический анализ
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь парный тест Туки использовался для статистического анализа.
- Рассматривать значения P ниже 0,01 как статистически значимые. Проведите все эксперименты по крайней мере с пятью биологическими репликами.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для оценки времени, необходимого для всей процедуры стерилизации семян, были рассчитаны и сопоставлены с традиционными методами пипетирования разницы во времени обработки жидкости 96 проб в текущем протоколе. Результат показывает, что текущий протокол экономит время, сокращая время обработки жидкости до одной четверти от времени с традиционными протоколами(таблица 1). В таблице далее подчеркивается, что время удаления жидкости в текущем протоколе экономит больше времени, чем у традиционных методов, с общим восьмикратным сокращением.
Выбор временного диапазона для стерилизации семян
Более длительные этапы стерилизации минимизируют уровень загрязнения, но могут негативно повлиять на прорастание семян. Чтобы определить наилучший временной диапазон для стерилизации семян с самыми высокими показателями всхожести без загрязнения, были протестированы различные продолжительности каждого этапа стерилизации, оценивающие как всхожесть семян, так и скорость появления зеленого семядолона. Анализы всхожести, выполненные со 2-го по 4-й день и на 7-й день, показали отсутствие существенных различий между временными диапазонами от 10 мин до 40 мин 70% стерилизации этанола. Однако с 40 мин обработки 70% этанолом показатели всхожести снизились(рисунок 3). Соответственно, снизились показатели появления зеленого семядолона(рисунок 4). Поскольку более короткое время стерилизации может увеличить пропускную способность, но увеличить скорость загрязнения, было оценено минимальное время, необходимое для стерилизации 96 различных образцов семян в двух партиях по 48 образцов. Кроме того, учитывая предпочтительную установку с встряхиванием, выполненным в шейкере, мы проверили минимальное время, необходимое для стерилизации семян, обработав 96 образцов в двух партиях по 48 образцов в каждой. Минимальное время, необходимое для обработки 48 образцов одновременно, составляло 3 минуты, что позволяло обрабатывать второй набор из 48 образцов сразу после первого набора без какого-либо времени ожидания. Таким образом, 3 мин для 70% этанола и 3 мин для 5% отбеливателя наносили в качестве минимального времени для стерилизации семян (пункт (а) на рисунке 3). Эти анализы привели к показателям всхожести, аналогичным самым высоким, без загрязнения и потери жизнеспособности семян(рисунок 3).
Таким образом, подходящие временные диапазоны для поддержания самого высокого процента прорастания семян без загрязнения, полученного в результате достаточного уничтожения микроорганизмов, составляют от 3 до 30 мин для 70% этанола и от 3-22,5 мин для 5% отбеливателя.
Чтобы продемонстрировать, что семена, которые мы использовали изначально, были загрязнены микроорганизмами, нестерильные семена были посеяны непосредственно на пластинах РС. Грибы появились на тарелках после двухдневного посева и распространились по всем плитам после семидневного прорастания(Дополнительный рисунок 1).
Оценка перекрестного загрязнения между различными генотипами семян
Чтобы проверить, может ли использование одного стерильного наконечника пипетки для обработки различных образцов семян привести к перекрестному загрязнению, и оценить количество такого перекрестного загрязнения, во время процедуры стерилизации чередовались два различных генотипа семян (Col-0 дикого типа, чувствительный к канамицину, и трансгенная линия Arabidopsis AdoIspS-79, устойчивая к канамицину24). После стандартной стерилизации семян их высыпали в твердые пластины MS половинной прочности, дополненные без или с 50 мг / л канамицина. Эксперименты были воспроизведены пять раз. Эти анализы показали, что около 96% семян прорастали в пластинах РС, содержащих канамицин, но на7-й день прорастания в любых пластинах, посеянных с генотипом Col-0, зеленых семядолий не наблюдалось(рисунок 5). Параллельно семена Col-0, посеянные в пластинах MS, показали около 94% всхожесть, и все семядоли были зелеными после 7-дневного прорастания. Эти результаты указывают на отсутствие переноса загрязнения между образцами, несмотря на использование одного наконечника пипетки для удаления стерильного раствора.
Рисунок 3:Процент прорастания семян после 2-, 3-, 4- и 7-дневного посева семян арабидопсиса с разным временем стерилизации, обозначенным разными буквами. a: 3 мин 70% этанола и 3 мин 5% отбеливателя, b: 10 мин 70% этанола и 7,5 мин 5% отбеливателя, c: 20 мин 70% этанола и 15 мин 5% отбеливателя, d: 30 мин 70% этанола и 22,5 мин 5% отбеливателя, e: 40 мин 70% этанола и 30 мин 5% отбеливателя, f: 50 мин 70% этанола и 37,5 мин 5% отбеливателя, г: 70 мин 70% этанола и 52,5 мин 5% отбеливателя. Две звезды указывают на значительные различия в соответствии с попарным тестом Туки (p < 0,01). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4:Процент зеленого семядолона после 7-дневного посева семян арабидопсиса с разным временем стерилизации, обозначенным разными буквами. a: 3 мин 70% этанола и 3 мин 5% отбеливателя, b: 10 мин 70% этанола и 7,5 мин 5% отбеливателя, c: 20 мин 70% этанола и 15 мин 5% отбеливателя, d: 30 мин 70% этанола и 22,5 мин 5% отбеливателя, e: 40 мин 70% этанола и 30 мин 5% отбеливателя, f: 50 мин 70% этанола и 37,5 мин 5% отбеливателя, г: 70 мин 70% этанола и 52,5 мин 5% отбеливателя. Две звезды указывают на значительные различия в соответствии с попарным тестом Туки (p < 0,01). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5:Анализ перекрестного загрязнения между семенами дикого типа Col-0 и AdoIspS-79. Прорастание Col-0 в пластинах MS половинной силы (слева), Col-0 в пластине MS половинной силы, дополненной 50 мг/ л канамицина (средняя) и AdoIspS-79 в пластине MS половинной силы, дополненной 50 мг / л канамицина (справа), шкала = 1 см. Репрезентативное изображение одной из пяти реплик показано на рисунке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Процедура | Текущий протокол (мин) | Традиционная пипетка (мин.) |
| Добавление жидкости 1 | 12 | 24 |
| Удаление жидкости 1 | 6 | 48 |
| ИТОГ | 18 | 72 |
Таблица 1: Сводка минимального времени, необходимого для обработки жидкости во время стерилизации 96 образцов семян. В таблице перечислено общее время (мин), необходимое для добавления и удаления жидкости на всех основных этапах стерилизации поверхности семян с использованием текущего протокола и протокола, в котором используется традиционное пипетирование.
Дополнительный рисунок 1: Обнаружение загрязнения после 7-дневного посева семян Arabidopsis. На изображении показана степень загрязнения нестерильных семян (промытых водой; слева) и стерильных семян (подвергнутых поверхностной стерилизации, как описано в основном тексте; справа). Scalebar = 1 см. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Стерилизация семян является фундаментальным шагом для функциональных исследований при арабидопсисе. Хотя он часто проводится для многих различных целей, доступны ограниченные исследования по высокопроизводительной стерилизации поверхности семян при арабидопсисе.
До сих пор одним из методов с самой высокой пропускной способностью является использование газообразного хлора, образующегося при смешивании отбеливателя с концентрированным HCl. Хотя этот метод требует ограниченного практического времени, он использует газ, высокотоксичный для людей27. Кроме того, количество семян, подлежащих поверхностной стерилизации, и продолжительность поверхностной стерилизации семян должны тщательно контролироваться. Если семян слишком много, дозировки газообразного хлора будет недостаточно, чтобы полностью убить микроорганизмы, присутствующие на семенной оболочке, что приведет к широкомасштабному загрязнению партий семян. С другой стороны, если продолжительность поверхностной стерилизации слишком велика, семена будут убиты. Таким образом, несмотря на некоторые преимущества, фумигация не является излюбленным методом стерилизации поверхности семян при арабидопсисе.
Напротив, существует ряд жидких методов поверхностной стерилизации семян арабидопсиса, доступных28,29,30. Однако основным ограничением этих методов является то, что они могут использоваться исключительно для небольшого количества образцов, и они не оптимизированы для пропускной способности. Насколько нам известно, единственное исследование по высокопроизводительной поверхностной стерилизации семян арабидопсиса было описано Lindsey, B. E. et al.31. В этом исследовании авторы предложили два разных метода. В дополнение к одному подходу с газообразным хлором, упомянутому выше, авторы предложили метод поверхностной стерилизации на жидкой основе с использованием концентрированного отбеливающего раствора, применяемого в течение 5-10 мин стерилизации. Хотя этот метод обеспечил первое систематическое исследование поверхностной стерилизации семян с различными концентрациями отбеливателя для разного времени и проанализировал соответствующий выход, протокол все же может быть улучшен. Прежде всего, в этом методе используется высококонцентрированный отбеливатель, который может быть вреден для оператора и окружающей среды. Во-вторых, из-за использования высококонцентрированного отбеливателя наилучшие сроки стерилизации поверхности семян составляют всего 5-10 минут, что обеспечивает узкое временное окно для завершения протокола. Кроме того, для устранения отбеливателя требовалось много этапов промывки, что делало протокол как трудоемким, так и трудоемким и ограничивало пропускную способность в таком коротком временном диапазоне этапа стерилизации поверхности.
Чтобы преодолеть все эти ограничения и объединить лучшие аспекты предыдущих работ, описанный здесь метод был выполнен с 70% техническим этанолом с последующим дальнейшим шагом с низким процентом отбеливателя (5%), который снизил токсичность и трудоемкие этапы промывки. Кроме того, систематический анализ прорастания семян обеспечил более широкий диапазон времени между 3-30 мин для стерилизации поверхности семян без влияния на скорость прорастания. Это обеспечивает более высокую гибкость в организации рабочего процесса, позволяя регулировать время стерилизации поверхности в соответствии с параллельной работой. Что еще более важно, трудоемкая процедура пипетирования была заменена многократным дозированием серологической пипеткой для добавления жидкостей и, самое главное, очень быстрым методом аспирации с помощью простого, хотя и производительного самодельного всасывающего устройства, не требующего обмена наконечниками между образцами. Учитывая наличие резервуарной бутылки, экспериментально не наблюдалось перекрестного загрязнения между линиями, так как семена, которые могут быть непреднамеренно доставлены с наконечником пипетки, декантируются в бутылку. Клапан, используемый в качестве адаптера между стерильным наконечником и трубкой, был специально выбран, чтобы гарантировать, что жидкость аспирируется в бутылку для сбора, не перетекая обратно в трубку, содержащую семена. Таким образом, этот метод значительно улучшил процедуру стерилизации поверхности семян с простотой обработки и экономией времени.
В заключение, этот протокол предоставляет научному сообществу безопасный, гибкий по времени, малотрудоемкий и экономящий время подход к поверхностной стерилизации семян arabidopsis, который является недорогим и легко устанавливается в любой лаборатории. Кроме того, способ может быть также применен для поверхностной стерилизации любого другого типа мелких семян путем окончательного изменения стерильного наконечника, адаптера и трубки в соответствии с размерами семян. В частности, этот метод успешно применялся без модификации для нескольких видов Brassicaceae (например, Cardamine impatiens L., Berteroa incana (L.) DC., Capsella bursa-pastoris (L.) Medicus, Alliaria petiolata (M. Bieberstein) Cavara et Grande и др.), а также для Nicotiana benthamiana Domin и Nicotiana tabacum L. семена. Метод также может быть применен к еще более мелким семенам, таким как семена орхидей, при условии, что точное определение скорости/времени центрифугирования и длины поверхностной стерилизационной обработки может быть установлено32.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Все авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Это исследование финансировалось автономной провинцией Тренто через основное финансирование группы по экономике Fondazione E. Mach.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aquarium valve | Amazon | B074CYC5SD | Kit including 2 valves and thin-walled tubings. The valve prevents the liquids to go back to the sterile tip |
| Arabidopsis Col-0 wild-type seeds | Nottingham Arabidopsis Stock Center | N1093 | Wild type seeds (sensitive to kanamycin) |
| Arabidopsis transgenic line AdoIspS-79 seeds | NA | NA | Transgenic line overexpressing an isoprene synthase gene from Arundo donax transformed in the Col-0 background, resistant to kanamycin (Li et al. (2017) Mol. Biol. Evol., 34, 2583–2599). Available on request from the authors |
| Microcentrifuge | Eppendorf | EP022628188 | Benchtop microcentrifuge used for spinning down the seeds |
| Murashige & Skoog medium including vitamins | Duchefa | M0222 | Standard medium for plant sterile culture |
| Pipette controller | Brand | 26300 | Used to operate the serological pipette |
| Polyethylene tube 1 | Roth | 9591.1 | Tube for connection from vacuum pump to decantation bottle (inner diameter: 7 mm; outer diameter: 9 mm) |
| Polyethylene tube 2 | Roth | 9587.1 | Tube for connection from decantation bottle to the aquarium valve (inner diameter: 5 mm; outer diameter: 7 mm) |
| Screw cap with connectors | Roth | PY86.1 | 2-way dispenser screw cap GL45 in polypropylene for decanting bottle |
| Serological pipette | Brand | 27823 | Graduated glass (reusable) serological pipette. Disposable pipettes can be used instead |
| Shakeret al. | Qiagen | 85300 | TissueLyser II bead mill used normally for tissue homogenization. Without the addition of beads to the tubes it works as shaker. |
| Technical ethanol | ITW Reagents (Nova Chimica Srl) | 212800 | Ethanol 96% v/v partially denatured technical grade |
| Tween 20 | Merck Millipore | 655205 | Non-ionic detergent acting as surfactant |
| Universal tubing connectors | Roth | Y523.1 | Can be used to improve/simplify tubing connections |
| Vacuum pump | Merck Millipore | WP6222050 | Used for making the suction device |
References
- Somerville, C., Koornneef, M. A fortunate choice: The history of Arabidopsis as a model plant. Nature Reviews Genetics. 3 (11), 883-889 (2002).
- Koornneef, M., Meinke, D. The development of Arabidopsis as a model plant. Plant Journal. 61 (6), 909-921 (2010).
- Initiative, T. A. G. Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana. Nature. 408 (6814), 796-815 (2000).
- Krysan, P. J., Young, J. C., Sussman, M. R. T-DNA as an insertional mutagen in Arabidopsis. Plant Cell. 11 (12), 2283-2290 (1999).
- Speulman, E., et al. A two-component enhancer-inhibitor transposon mutagenesis system for functional analysis of the arabidopsis genome. Plant Cell. 11 (10), 1853-1866 (1999).
- Jander, G., et al. Ethylmethanesulfonate saturation mutagenesis in Arabidopsis to determine frequency of herbicide resistance. Plant Physiology. 131 (1), 139-146 (2003).
- Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. -S., Niu, Q. -W., Chua, N. -H. Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nature Protocols. 1 (2), 641-646 (2006).
- Togninalli, M., et al. AraPheno and the AraGWAS catalog 2020: A major database update including RNA-Seq and knock-out mutation data for Arabidopsis thaliana. Nucleic Acids Research. 48 (1), 1063-1068 (2020).
- Lan, Y., et al. AtMAD: Arabidopsis thaliana multi-omics association database. Nucleic Acids Research. 49 (1), 1445-1451 (2021).
- Xu, J., Trainotti, L., Li, M., Varotto, C. Overexpression of isoprene synthase affects ABA-and drought-related gene expression and enhances tolerance to abiotic stress. International Journal of Molecular Sciences. 21 (12), 1-21 (2020).
- Czarnecki, O., et al. Simultaneous knock-down of six non-family genes using a single synthetic RNAi fragment in Arabidopsis thaliana. Plant Methods. 12 (1), 1-11 (2016).
- Yan, L., et al. high-efficiency genome editing in arabidopsis using YAO promoter-driven CRISPR/Cas9 system. Molecular Plant. 8 (12), 1820-1823 (2015).
- Liu, Y., Gao, Y., Gao, Y., Zhang, Q. Targeted deletion of floral development genes in Arabidopsis with CRISPR/Cas9 using the RNA endoribonuclease Csy4 processing system. Horticulture Research. 6 (1), (2019).
- Grefen, C., et al. Subcellular localization and in vivo interactions of the Arabidopsis thaliana ethylene receptor family members. Molecular Plant. 1 (2), 308-320 (2008).
- Gazzani, S., et al.
- Lee, S., Korban, S. S. Transcriptional regulation of Arabidopsis thaliana phytochelatin synthase (AtPCS1) by cadmium during early stages of plant development. Planta. 215 (4), 689-693 (2002).
- Long, Y., et al. In vivo FRET-FLIM reveals cell-type-specific protein interactions in Arabidopsis roots. Nature. 548 (7665), 97-102 (2017).
- Freire-Rios, A., et al. Architecture of DNA elements mediating ARF transcription factor binding and auxin-responsive gene expression in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (39), 24557-24566 (2020).
- Rivero, L., et al. Handling arabidopsis plants: Growth, preservation of seeds, transformation, and genetic crosses. Methods in Molecular Biology. 1062, 3-25 (2014).
- Chen, J. H., et al. Drought and salt stress tolerance of an arabidopsis glutathione S-transferase U17 knock-out mutant are attributed to the combined effect of glutathione and abscisic acid. Plant Physiology. 158 (1), 340-351 (2012).
- Li, D. Z., et al. Comparative analysis of a large dataset indicates that internal transcribed spacer (ITS) should be incorporated into the core barcode for seed plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (49), 19641-19646 (2011).
- Mathur, J., Koncz, C. Establishment and maintenance of cell suspension cultures. Arabidopsis Protocols. Methods in Molecular Biology. 82, Humana Press. 27-30 (1998).
- Li, M., Cappellin, L., Xu, J., Biasioli, F., Varotto, C. High-throughput screening for in planta characterization of VOC biosynthetic genes by PTR-ToF-MS. Journal of Plant Research. 133 (1), 123-131 (2020).
- Li, M., et al. In planta recapitulation of isoprene synthase evolution from ocimene synthases. Molecular Biology and Evolution. 34 (10), 2583-2599 (2017).
- Li, M., et al. Evolution of isoprene emission in Arecaceae (palms). Evolutionary Applications. 14, 902-914 (2020).
- Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum. 15 (3), 473-497 (1962).
- Bent, A. Arabidopsis thaliana floral dip transformation method. Methods in Molecular Biology. 343, Clifton, N.J. 87-104 (2006).
- Lundberg, D. S., et al. Defining the core Arabidopsis thaliana root microbiome. Nature. 488 (7409), 86-90 (2012).
- Tkacz, A., Cheema, J., Chandra, G., Grant, A., Poole, P. S. Stability and succession of the rhizosphere microbiota depends upon plant type and soil composition. ISME Journal. 9 (11), 2349-2359 (2015).
- Singh, N., Gaddam, S. R., Singh, D., Trivedi, P. K. Regulation of arsenic stress response by ethylene biosynthesis and signaling in Arabidopsis thaliana. Environmental and Experimental Botany. 185, 104408 (2021).
- Lindsey, B. E., Rivero, L., Calhoun, C. S., Grotewold, E., Brkljacic, J. Standardized method for high-throughput sterilization of Arabidopsis seeds. Journal of Visualized Experiments: JOVE. (128), e56587 (2017).
- Acemi, A., Özen, F. Optimization of in vitro asymbiotic seed germination protocol for Serapias vomeracea. The EuroBiotech Journal. 3 (3), 143-151 (2019).
