Summary
يتم توفير بروتوكول عالي الإنتاجية للتعقيم السطحي لبذور Arabidopsisthaliana (Arabidopsis) ، وتحسين خطوات التعامل مع السائل باستخدام جهاز شفط بسيط تم بناؤه بمضخة فراغ. يمكن تعقيم مئات عينات البذور في يوم واحد.
Abstract
أربيدوبسيس هو إلى حد بعيد الأنواع نموذج النبات الأكثر استخداما على نطاق واسع للدراسات الوظيفية. التعقيم السطحي لبذور أربيدوبسيس هو خطوة أساسية مطلوبة لتحقيق هذه الغاية. وبالتالي، من الأهمية بمكان إنشاء طرق عالية الإنتاجية لتعقيم سطح بذور أربيدوبسيس للتعامل مع عشرات إلى مئات العينات (على سبيل المثال، الخطوط المعدلة وراثيا، أو الأنماط الإيكولوجية، أو المسوخ) في وقت واحد. يتم تقديم طريقة التعقيم السطحي للبذور على أساس القضاء الفعال على السائل في الأنابيب مع جهاز شفط محلي الصنع تم بناؤه من مضخة فراغ مشتركة في هذه الدراسة. من خلال الحد بشكل كبير من العمل الكثيف التدريب العملي على الوقت مع هذه الطريقة التعامل مع عدة مئات من العينات في يوم واحد ممكن مع القليل من الجهد. كما أشارت تحليلات الدورة الزمنية السلسلية إلى نطاق زمني مرن للغاية للتعقيم السطحي من خلال الحفاظ على معدلات إنبات عالية. يمكن تكييف هذه الطريقة بسهولة للتعقيم السطحي لأنواع أخرى من البذور الصغيرة مع تخصيص بسيط لجهاز الشفط وفقا لحجم البذور ، والسرعة المطلوبة للقضاء على السائل.
Introduction
أربيدوبسيس هو نوع نباتي ثنائي الفصي ينتمي إلى عائلة براسيكاي. دورة حياتها قصيرة نسبيا (شهرين لكل جيل في ظل ظروف النمو ليوم طويل)، وحجم النبات الصغير، والتلقيح الذاتي مع إنتاج مئات البذور لكل نبات جعلت من أول نوع نموذج نباتي أساسي1،2. وبالإضافة إلى ذلك، كان تسلسل الجينوم لها تماما3،واسعة أدوات علم الوراثة العكسي (المشبعة T-DNA، transposon، والسكان المعدلة كيميائيا) متوفرة4،5،6، وفعالة Agrobacterium-بوساطة التحول راسخة للحصول على خطوط معدلة وراثيا كافية لمزيد من العمل المصب7 . وهكذا، خلال العقدين الماضيين، تم تحقيق تقدم كبير باستخدام Arabidopsis كنوع نموذجي لتشريح جوانب متنوعة من بيولوجيا النبات على المستوى الجزيئي، بما في ذلك الاختلاف الطبيعي والوراثي والفينوتيبيك8،9.
لتوصيف وظيفيا الجينات ذات الاهتمام في Arabidopsis، التعقيم السطحي البذور للقضاء على الملوثات الفطرية والبكتيرية هو الخطوة الأساسية لكثير من بروتوكولات المصب التي تتطلب الثقافات المحورية. التحول الوراثي لفرط التعبير10، الضربة القاضية (RNA-I11)أو خروج المغلوب (تحرير الجينوم12،13)من وظيفة الجينات ، توطين subcellular14، نشاط المروج15،16، البروتين البروتين17 والتفاعل بين البروتين والحمض النووي18، على سبيل المثال لا يذكر سوى التطبيقات الأكثر شيوعا ، وكلها تتطلب خطوة التعقيم سطح البذور. وهكذا، على الرغم من بساطته النسبية، يلعب تعقيم سطح البذور دورا أساسيا في العديد من التحليلات الوظيفية.
حتى الآن، وقد وضعت فئتين رئيسيتين من أساليب التعقيم السطحي البذور على أساس إما الغاز أو على التعقيم في مرحلة السائل19. وفي حين أن إنتاجية التعقيم السطحي للبذور في مرحلة الغاز متوسطة إلى عالية، فإن استخدام غاز الكلور الكاشف الخطر كعامل تعقيم سطحي أعاق تطبيقه على نطاق واسع. تعتمد الطرق القائمة على التعقيم في المرحلة السائلة ، على العكس من ذلك ، على مواد كيميائية أكثر اعتدالا مثل الإيثانول وحلول التبييض للتعقيم السطحي ، وتستخدم على نطاق أوسع على الرغم من أن إنتاجها أقل بطبيعته من تبخير الكلور. بشكل عام، يتم استخدام طريقتين مختلفتين تستخدمان الكواشف السائلة بشكل عام. ويستند أسلوب واحد يستخدم إلى حد كبير على الغسيل مع الإيثانول والتبييض بتركيزات مختلفة لمدة مختلفة من الوقت20،21. ويستند أسلوب آخر على تطبيق التبييض فقط21،22. وتطبق كلتا الطريقتين أساسا لتعقيم سطح البذور على نطاق صغير. ومع ذلك، في العديد من التجارب، فمن الضروري لفحص العديد من خطوط أربيدوبسي المعدلة وراثيا المستمدة من تحويل واحد15،23 أو الشاشة في موازاة العديد من خطوط المعدلة وراثيا ولدت من التحولات المختلفة24،25. وعلى حد علمنا، لم تنشر أي طريقة قائمة على السوائل لتعقيم سطح البذور عالي الإنتاجية، مما يشكل، على الرغم من عدم الاعتراف به، اختناقا هاما لنهج الجينوم الوظيفي. لذلك، تطوير أساليب آمنة وقوية وعالية الإنتاجية لتعقيم سطح البذور هو خطوة ضرورية وحاسمة نحو نجاح التوصيف الوظيفي للعديد من الجينات في وقت واحد.
وتحقيقا لهذه الغاية، في الدراسة الحالية، يتم تقديم طريقة محسنة للتعقيم السطحي لبذور الأرابيدوسيس. هذه الطريقة آمنة ومنخفضة التكلفة وقوية للغاية وعالية الإنتاجية ، مما يسمح بالتعامل مع 96 خطا مستقلا في غضون ساعة واحدة من بداية تعقيم سطح البذور حتى نهاية بذر البذور في أطباق بيتري. تعتمد الطريقة التي أثبتت على الأجهزة المختبرية الأساسية المتاحة على نطاق واسع مثل مضخة فراغ ، وأواني زجاجية قابلة للاستهلاك ، وأدوات بلاستيكية. توفر هذه الطريقة المحسنة للمجتمع العلمي نهجا آمنا وبسيطا وبأسعار معقولة لتبسيط تعقيم سطح البذور مع إنتاجية كافية لنهج الجينوم الوظيفي الحديث في Arabidopsis وغيرها من الأنواع النباتية غير النموذجية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. الكواشف وإعداد وسائل الإعلام
- إعداد محلول الإيثانول بنسبة 70٪: أضف 737 مل من الإيثانول التقني بنسبة 95٪ إلى 263 مل من الماء المقطر. تخلط جيدا.
ملاحظة: إعداد محلول الإيثانول 70٪ على مقاعد البدلاء العمل غير عقيمة.
تنبيه: الإيثانول شديد الاشتعال ويمكن أن يسبب تهيجا خطيرا في العينين. الابتعاد عن النيران ومصادر الحرارة. في حالة ملامسة العينين، اشطفي بالماء الوفير. - إعداد محلول التبييض بنسبة 5٪: أضف 5 مل من التبييض المنزلي (يحتوي على ~ 3.5٪ من هيبوكلوريت الصوديوم، NaClO) إلى 95 مل من الماء المقطر العقيم. أضف بضع قطرات من المنظفات غير الأيونية (على سبيل المثال، توين 20) واخلطها جيدا.
ملاحظة: إعداد محلول التبييض 5٪ داخل غطاء محرك السيارة صفح.
تنبيه: هيبوكلوريت الصوديوم، المكون النشط للتبييض، هو مزعج للغاية. وهو شديد التآكل ويمكن أن يسبب أضرارا جسيمة للجهاز الهضمي. في حالة الاتصال، شطف فورا مع وفرة المياه. في حالة الابتلاع، اتصل بمركز مكافحة السموم أو طبيب للحصول على المشورة العلاجية. - إعداد نصف قوة Murashige وسكوغ (1/2 MS)المتوسطة 26.
- أضف 2.2 غرام من مسحوق MS المتوسط (بما في ذلك الفيتامينات) و 10 غرام من السكروز في 800 مل من الماء المقطر. ضبط درجة الحموضة للمحلول باستخدام 1 M KOH وبذلك يصل حجم إلى 1 لتر باستخدام الماء المقطر. Aliquot 500 مل في زجاجة 1 لتر وإضافة 4G من أجار لإعداد وسيطة صلبة. أوتوكلاف الحل.
- بعد الالاستعباد التلقائي، تبرد المتوسطة إلى 50-53 درجة مئوية في حمام مائي وتصب في أطباق بيتري تحت غطاء محرك السيارة تدفق صفح. لإعداد المتوسطة الانتقائية، أضف 1000 ميكرولتر/لتر من محلول مخزون كاناميسين 50 ملغم/مل (اخلط 500 ملغ من الكاناميسين كبريتات أحادية الهيدروهيدرات في 10 مل من الماء المقطر، وتصفية التعقيم وتخزينها عند -20 درجة مئوية) إلى الوسط (50-53 درجة مئوية). تخلط جيدا عن طريق الدوامة، وتصب في أطباق بيتري كما ذكر من قبل.
2. الإعداد أسبيراتور
ملاحظة: يتم تلخيص إعداد الأداة في الشكل 1.
- قم بتوصيل مدخل مضخة الفراغ بأحد طرفي أنبوب البولي إيثيلين (PE) بحجم مناسب. قم بتوصيل الطرف الآخر من الأنبوب بمنفذ الغطاء ثنائي الاتجاه لزجاجة التكتكة. التفاف تقاطع الأنابيب بإحكام مع فيلم الختم(جدول المواد)لضمان اتصال الهواء ضيق.
- توصيل أنبوب PE الثاني إلى مدخل (ثقب جاحظ إلى داخل الزجاجة) من screwcap على زجاجة decantation. تناسب الجانب الآخر من الأنبوب إلى منفذ صمام حوض السمك. إذا لزم الأمر، التفاف مع فيلم الختم على طول تقاطع للقضاء على تسرب الهواء.
- قبل الاستخدام مباشرة، تناسب العقيمة 200 ميكرولتر ماصة تلميح إلى مدخل مرشح الحوض تحت غطاء محرك السيارة تدفق صفح.
الشكل 1: الرسم التخطيطي لجهاز الشفط لإزالة عالية الإنتاجية من السوائل التعقيم. للوضوح، لا يتم رسم أجزاء واحدة إلى الحجم. الحرف (أ) يشير إلى مضخة فراغ،(ب)زجاجة الخزان لجمع السوائل (الإيثانول، التبييض، أو المياه العقيمة)،(ج)صمام لتجنب ارتجاع السوائل،(D)العقيمة 200 ميكرولتر ماصة تلميح، و (ه) أنبوب الطرد الدقيق 1.5 مل تحتوي على البذور والتعقيم السائل. تشير الأسهم إلى اتجاه تدفق الهواء. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
3. عالية الإنتاجية السائل تعقيم سطح البذور
ملاحظة: الإجراء العام والحد الأدنى من الوقت اللازم للتعقيم السطحي ل Arabidopsis thaliana (L.) Heynh البرية نوع (كول-0) (Arabidopsis) البذور مع 96 عينات مستقلة هي تلخيصها في الشكل 2.
- تسمية مع علامة دائمة دفعتين من أنابيب الطرد الدقيق 48 × 1.5 مل مع أرقام التدريجي.
- إضافة 100-200 بذور Arabidopsis إلى كل من أنابيب الطرد الدقيق 1.5 مل معقمة 96 (ما يقرب من 1-2 مم فوق الجزء السفلي من نهاية مخروطية من الأنبوب).
- Aliquot حوالي 1000 ميكرولتر من الإيثانول 70٪ في كل أنبوب باستخدام ماصة المصلية المعقمة 10 مل داخل غطاء محرك السيارة تدفق صفح (دفعة البذور واحد، 48 أنابيب) وإغلاق بعناية الأغطية.
ملاحظة: الاستغناء عن الحلول لا تحتاج إلى أن تكون دقيقة للغاية، طالما أن حجم الاستغناء عدة مرات أعلى من حجم البذور. بدلا من ذلك، قم بتنفيذ هذه الخطوة خارج غطاء غطاء الرأس (حالة غير معقمة). - هز الأنابيب على تردد التذبذب من 8.0 هرتز لمدة 3 دقائق على الأقل في شاكر.
- إزالة المحولات من شاكر ونقلها إلى سلة من جهاز الطرد المركزي على مقاعد البدلاء.
- تدور بسرعة أسفل البذور باستخدام وظيفة نبض (موجودة في معظم أجهزة الطرد المركزي benchtop) للوصول إلى 1880 × ز (~ 15 ق).
ملاحظة: تؤثر قوى الطرد المركزي الأطول أو الأعلى سلبا على إنبات البذور. - نقل أنابيب 48 من المحولات إلى رف واحد وفتح جميع الأنابيب تحت غطاء محرك السيارة تدفق صفح. تجنب التلوث بعدم لمس جزء من الأغطية المناسب في الأنابيب. إذا كانت الأغطية قريبة جدا من بعضها البعض، فقسم الأنابيب إلى رفين لتسهيل التعامل معها.
- تناسب العقيمة 200 μL تلميح أصفر على مدخل صمام الحوض من الطامح محلية الصنع تحت غطاء محرك السيارة تدفق صفح والتبديل على المضخة.
- أدخل الطرف الأصفر فوق مستوى البذور لتجنب لمس البذور عند مص السائل. بدلا من ذلك، بسرعة وضع طرف في الجزء السفلي من الأنبوب. إذا كانت البذور كتل شفط السائل، والقضاء على طرف أصفر وإدراج واحدة جديدة.
- Aliquot في كل أنبوب حوالي 1000 ميكرولتر من 5٪ التبييض باستخدام ماصة المصلية العقيمة 10 مل داخل غطاء محرك السيارة تدفق صفح.
- أغلق جميع الأغطية بإحكام وضع جميع الأنابيب مرة أخرى في محولات شاكر. هز الأنابيب على تردد التذبذب من 8.0 هرتز لمدة 3 دقائق على الأقل في شاكر.
- تدور بسرعة أسفل البذور باستخدام وظيفة نبض الطرد المركزي benchtop للوقت اللازم للوصول إلى 1880 × ز (~ 15 ق).
- تناسب العقيمة الجديدة 200 μL تلميح أصفر على صمام الحوض متصلة مضخة فراغ تحت غطاء محرك السيارة تدفق صفح، والتبديل على المضخة.
- أدخل الطرف الأصفر فوق مستوى البذور لتجنب لمس البذور عند مص محلول التبييض.
- Aliquot في كل أنبوب حول 1000 ميكرولتر من تعقيم H2O باستخدام ماصة المصلية المعقمة 10 مل في غطاء محرك السيارة تدفق صفح.
ملاحظة: ضم دفعتين من البذور لتقليل وقت العملية. - تناسب جديدة عقيمة 200 ميكرولتر تلميح أصفر على صمام الحوض متصلة مضخة فراغ تحت غطاء محرك السيارة تدفق صفح والتبديل على المضخة.
- إدراج طرف أصفر فقط فوق مستوى البذور لتجنب لمس البذور عند مص H2O.
- Aliquot في كل أنبوب حول 500 ميكرولتر من تعقيم H2O باستخدام ماصة المصلية المعقمة 10 مل وإغلاق جميع الأغطية في غطاء محرك السيارة تدفق صفح. البذور جاهزة للنواة. إذا لزم الأمر، والحفاظ على أنابيب في درجة حرارة الغرفة لبضع ساعات كحد أقصى أو في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- ملء زجاجة الخزان المستخدمة لجمع السائل مع كمية كافية من المياه وautclave ذلك. بعد ذلك، تجاهل السائل في بالوعة عادية.
ملاحظة: أوتوكلاف السائل لقتل جميع البذور داخل الخزان.
الشكل 2:نظرة عامة على الإجراء والحد الأدنى من الوقت اللازم للتعقيم السطحي لبذور Arabidopsis مع 96 عينات مستقلة. وفي التجربة المقدمة، تعالج 96 عينة مستقلة على دفعتين متساويتي الحجم. الإجراء بأكمله هو نفسه لكلا الدفعتين، وتتم معالجتها بالتوازي، ولكن تتم معالجة الدفعة الثانية مع تأخير خطوة واحدة مقارنة بالدفعة الأولى. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
4. الطلاء وتسجيل Arabidopsis على لوحات MS 1/2
- نقل البذور و300-400 ميكرولتر من H2O المعقمة في طبق بيتري عن طريق الأنابيب لطيف مع ماصة 1000 ميكرولتر.
- بعد نقل 10 أنابيب، تصب في كل لوحة حول 1.5-2.0 مل من المتوسطة 1/2 MS الذائبة دون المضادات الحيوية.
ملاحظة: تذوب مقدما ثم تبقى 1/2 MS ذاب المتوسطة في حمام الحرارة تعيين في 50-53 درجة مئوية لتجنب التجسيد. تأكد من أن درجة الحرارة لا تتجاوز 58 درجة مئوية لتجنب تقليل قابلية البذور للانبات. - دوامة بسرعة لوحة لتوزيع البذور داخله. الشريط لوحات على طرفي نقيض.
- لف الأطباق في رقائق بلاستيكية أو الألومنيوم ثم وضعها في الثلاجة (4 درجة مئوية) لمدة 3 أيام في الظلام للحصول على الإنبات موحدة.
- نقل لوحات في غرفة النمو المحددة في 23 درجة مئوية في ظل ظروف اليوم الطويل (16 ساعة ضوء / 8 ساعة الظلام) مع كثافة الضوء من 100-120 ميكرومول ·م-2· ق-1 و 60٪ الرطوبة النسبية.
- بعد يومين، يسجل النباتات من خلال وجود الشقوق. الكشف عن ظهور شعاعي وتشكيل كوتيليدون الخضراء (فتح كامل من اثنين من cotyledons) لتقييم إنبات البذور.
5. التحليلات الإحصائية
ملاحظة: هنا، تم استخدام اختبار توكي الثنائي للتحليلات الإحصائية.
- النظر في القيم P أقل من 0.01 كما ذات دلالة إحصائية. إجراء جميع التجارب على الأقل مع خمس نسخ بيولوجية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
من أجل تقييم الوقت اللازم لإجراء تعقيم البذور بأكمله ، تم حساب الاختلافات الزمنية للتعامل مع السائل 96 عينة في البروتوكول الحالي ومقارنتها مع طرق الأنابيب التقليدية. وتشير النتيجة إلى أن البروتوكول الحالي يوفر الوقت، مما يقلل من وقت المناولة السائلة إلى ربع ذلك مع البروتوكولات التقليدية(الجدول 1). ويسلط الجدول الضوء كذلك على أن وقت إزالة السائل في البروتوكول الحالي يوفر وقتا أطول من الوقت الذي توفره الأساليب التقليدية، مع تخفيض إجمالي قدره ثمانية أضعاف.
اختيار النطاق الزمني لتعقيم البذور
خطوات التعقيم أطول تقليل معدلات التلوث ولكن يمكن أن تؤثر سلبا على إنبات البذور. لتحديد أفضل نطاق زمني لتعقيم البذور مع أعلى معدلات الإنبات دون تلوث، تم اختبار فترات مختلفة من كل خطوة تعقيم، وتقييم كل من إنبات البذور ومعدلات ظهور كوتيلون الخضراء. لم تشر تحليلات الإنبات التي أجريت من اليوم الثاني إلى اليوم الرابع وفي اليوم السابع إلى عدم وجود اختلافات كبيرة بين النطاق الزمني من 10 دقائق إلى 40 دقيقة من تعقيم الإيثانول بنسبة 70٪. ومع ذلك ، من 40 دقيقة من العلاج مع الإيثانول 70 ٪ ، انخفضت معدلات الإنبات(الشكل 3). وفي المقابل، انخفضت معدلات ظهور الكوتيليدون الأخضر(الشكل 4). وبما أن فترات التعقيم الأقصر يمكن أن تزيد من الإنتاجية ولكنها تزيد من معدلات التلوث، فقد تم تقييم الحد الأدنى من الوقت اللازم لتعقيم 96 عينة بذور مختلفة على دفعتين من 48 عينة. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا للإعداد المفضل مع الهز الذي يتم إجراؤه في شاكر ، اختبرنا الحد الأدنى من الوقت اللازم لتعقيم البذور من خلال التعامل مع 96 عينة على دفعتين من 48 عينة لكل منهما. وكان الحد الأدنى من الوقت اللازم لمعالجة 48 عينة في وقت واحد 3 دقائق، مما يسمح بمعالجة المجموعة الثانية من 48 عينة مباشرة بعد المجموعة الأولى دون أي وقت للانتظار. وهكذا، تم تطبيق 3 دقائق ل70٪ الإيثانول و 3 دقائق لمدة 5٪ التبييض والحد الأدنى من الوقت لتعقيم البذور (نقطة (أ) في الشكل 3). وأسفرت هذه التحليلات عن معدلات إنبات مماثلة لأعلى المعدلات دون تلوث وفقدان حيوية البذور(الشكل 3).
وباختصار، فإن النطاقات الزمنية المناسبة للحفاظ على أعلى نسبة من إنبات البذور دون تلوث المستمدة من القضاء الكافي على الكائنات الحية الدقيقة بين 3-30 دقيقة ل70٪ الإيثانول وبين 3-22.5 دقيقة لتبييض 5٪.
من أجل إثبات أن البذور التي استخدمناها في الأصل كانت ملوثة بالكائنات الحية الدقيقة ، تم زرع البذور غير المعقمة مباشرة على لوحات MS. ظهرت الفطريات على لوحات بعد زرع لمدة يومين وتنتشر في جميع أنحاء لوحات بعد سبعة أيام الإنبات (الشكل التكميلي 1).
تقييم التلوث المتبادل بين الأنماط الجينية المختلفة للبذور
للتحقق مما إذا كان استخدام طرف ماصة معقم واحد لمعالجة عينات البذور المختلفة يمكن أن يؤدي إلى تلوث متقاطع وتقييم كمية مثل هذا التلوث المتبادل ، تم تناوب نوعين جينيين مختلفين من البذور (Col-0 البرية ، حساسة للكاناميسين ، وخط أرابيدوسيس المعدل وراثيا AdoIspS-79 ، المقاوم للكاناميسين24)أثناء إجراء التعقيم. بعد تعقيم البذور القياسية، زرعت في لوحات صلبة MS نصف قوة تكمل دون أو مع 50 ملغ / ل كاناميسين. وقد تكررت التجارب خمس مرات. وأشارت هذه التحليلات إلى أن حوالي 96٪ من البذور التي نبتت في لوحات MS التي تحتوي على كاناميسين، ولكن لم يتم رصد أي كوتيليدوناتخضراء في اليوم السابع من الإنبات في أي لوحات زرعت مع النمط الجيني كول-0(الشكل 5). وبالتوازي مع ذلك، أظهرت بذور Col-0 المزروعة في لوحات MS حوالي 94٪ من الإنبات، وكانت جميع ال كوتيلودون خضراء بعد الإنبات لمدة 7 أيام. تشير هذه النتائج إلى عدم ترحيل التلوث بين العينات على الرغم من استخدام طرف ماصة واحد لإزالة المحلول العقيم.
الشكل 3: نسبةإنبات البذور بعد 2-, 3-, 4- و 7 أيام بذور Arabidopsis البذر مع أوقات التعقيم المختلفة المشار إليها بأحرف مختلفة. أ: 3 دقائق من الإيثانول 70٪ و 3 دقائق من 5٪ التبييض، ب: 10 دقيقة من الإيثانول 70٪ و 7.5 دقيقة من 5٪ تبييض، ج: 20 دقيقة من الإيثانول 70٪ و 15 دقيقة من 5٪ التبييض، د: 30 دقيقة من الإيثانول 70٪ و 22.5 دقيقة من 5٪ التبييض، ه: 40 دقيقة من الإيثانول 70٪ و 30 دقيقة من 5٪ التبييض، و: 50 دقيقة من الإيثانول 70٪ و 37.5 دقيقة من 5٪ التبييض، ز: 70 دقيقة من الإيثانول 70٪ و 52.5 دقيقة من 5٪ التبييض. يشير نجمان إلى اختلافات كبيرة وفقا لاختبار توكي الثنائي (p < 0.01). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: نسبة كوتيلون الخضراء بعد 7 أيام بذور Arabidopsis البذر مع أوقات التعقيم المختلفة المشار إليها مع رسائل مختلفة. أ: 3 دقائق من الإيثانول 70٪ و 3 دقائق من 5٪ التبييض، ب: 10 دقيقة من الإيثانول 70٪ و 7.5 دقيقة من 5٪ تبييض، ج: 20 دقيقة من الإيثانول 70٪ و 15 دقيقة من 5٪ التبييض، د: 30 دقيقة من الإيثانول 70٪ و 22.5 دقيقة من 5٪ التبييض، ه: 40 دقيقة من الإيثانول 70٪ و 30 دقيقة من 5٪ التبييض، و: 50 دقيقة من الإيثانول 70٪ و 37.5 دقيقة من 5٪ التبييض، ز: 70 دقيقة من الإيثانول 70٪ و 52.5 دقيقة من 5٪ التبييض. يشير نجمان إلى اختلافات كبيرة وفقا لاختبار توكي الثنائي (p < 0.01). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5:المقايسة عبر التلوث بين كول-0 البرية من نوع وبذور AdoIspS-79. كول-0 الإنبات في لوحات MS نصف قوة (يسار)، كول-0 في لوحة MS نصف قوة تكملها مع 50 ملغ / ل كاناميسين (وسط) و AdoIspS-79 في لوحة MS نصف قوة تكملها مع 50 ملغ / ل كاناميسين (يمين)، scalebar = 1 سم. تظهر في الشكل صورة تمثيلية لأحد النسخ المتماثلة الخمس. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| إجراء | البروتوكول الحالي (الحد الأدنى) | الأنابيب التقليدية (دقيقة) |
| إضافة سائل 1 | 12 | 24 |
| إزالة السائل 1 | 6 | 48 |
| مجموع | 18 | 72 |
الجدول 1: موجز عن الحد الأدنى من الوقت اللازم للتعامل مع السوائل أثناء تعقيم 96 عينة من عينات البذور. يسرد الجدول الوقت الإجمالي (دقيقة) المطلوبة لإضافة وإزالة السائل في جميع أنحاء الخطوات الرئيسية للتعقيم سطح البذور باستخدام البروتوكول الحالي وبروتوكول حيث يتم استخدام pipetting التقليدية.
الشكل التكميلي 1: الكشف عن التلوث بعد زرع بذور أرابيدوسيس لمدة 7 أيام. تظهر الصورة درجة تلوث البذور غير المعقمة (المشطفة بالماء؛ إلى اليسار) والبذور العقيمة (التي تخضع للتعقيم السطحي كما هو موضح في النص الرئيسي؛ إلى اليمين). Scalebar = 1 سم. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تعقيم البذور هو الخطوة الأساسية للدراسات الوظيفية في Arabidopsis. على الرغم من أنه كثيرا ما يتم تنفيذها لأغراض مختلفة كثيرة، تتوفر دراسات محدودة على التعقيم السطحي للبذور عالية الإنتاجية في Arabidopsis.
حتى الآن، واحدة من الطرق ذات الإنتاجية العالية هي استخدام غاز الكلور الناتج عن خلط التبييض مع HCl المركزة. على الرغم من أن هذه الطريقة تتطلب التدريب العملي محدودة على الوقت، فإنه يستخدم غاز شديد السمية للبشر27. وبالإضافة إلى ذلك، يجب أن يتم التحكم بعناية في عدد البذور التي سيتم تعقيمها على السطح ومدة تعقيم البذور السطحية. إذا كانت البذور كثيرة جدا، فإن جرعة غاز الكلور لن تكون كافية لقتل الكائنات الحية الدقيقة الموجودة على معطف البذور تماما، مما يؤدي إلى تلوث واسع النطاق من دفعات البذور. من ناحية أخرى ، إذا كانت مدة التعقيم السطحي طويلة جدا ، سيتم قتل البذور. وهكذا، على الرغم من بعض المزايا، والتبخير ليست الطريقة المفضلة للتعقيم سطح البذور في Arabidopsis.
وعلى النقيض من ذلك، هناك عدد من الطرق القائمة على السائل للتعقيم السطحي لبذور Arabidopsis المتاحة28،29،30. ومع ذلك، فإن القيد الرئيسي لهذه الطرق هو أنه يمكن استخدامها حصريا لعدد قليل من العينات، وأنها ليست الأمثل لسرعة النقل. على حد علمنا، وصفت الدراسة الوحيدة على التعقيم السطحي عالي الإنتاجية لبذور أربيدوبسي من قبل ليندسي، ب. إ.وآخرون. في هذه الدراسة، اقترح المؤلفون طريقتين مختلفتين. بالإضافة إلى نهج واحد مع غاز الكلور المذكور أعلاه، اقترح المؤلفون طريقة تعقيم سطحية قائمة على السائل باستخدام محلول تبييض مركز مطبق للتعقيم لمدة 5-10 دقائق. على الرغم من أن هذه الطريقة قدمت أول دراسة منهجية لتعقيم البذور السطحية بتركيزات مختلفة من التبييض لأوقات مختلفة وتحليل الناتج المقابل ، إلا أنه لا يزال من الممكن تحسين البروتوكول. أولا وقبل كل شيء، استخدمت هذه الطريقة التبييض شديد التركيز، والتي يمكن أن تكون ضارة للمشغل والبيئة. ثانيا، نظرا لاستخدام التبييض شديد التركيز، فإن أفضل توقيت لتعقيم سطح البذور يتراوح بين 5 و10 دقائق فقط، مما يتيح نافذة زمنية ضيقة لإكمال البروتوكول. بالإضافة إلى ذلك ، للقضاء على التبييض ، كانت هناك العديد من خطوات الغسيل اللازمة ، مما يجعل البروتوكول كثيف الوقت والعمل ويحد من الإنتاجية في مثل هذا المدى الزمني القصير لخطوة التعقيم السطحي.
من أجل التغلب على كل هذه القيود والجمع بين أفضل جوانب الأعمال السابقة ، تم تنفيذ الطريقة الموصوفة هنا مع الإيثانول التقني بنسبة 70٪ تليها خطوة أخرى مع نسبة منخفضة من التبييض (5٪) مما قلل من السمية وخطوات الغسيل كثيفة العمالة. بالإضافة إلى ذلك، وفرت التحليلات المنهجية لإنبات البذور نطاقا زمنيا أوسع يتراوح بين 3-30 دقيقة لتعقيم سطح البذور دون التأثير على معدلات الإنبات. وهذا يسمح مرونة أعلى لتنظيم سير العمل، مما يسمح لتنظيم وقت التعقيم السطحي وفقا للعمل المتزامن. والأهم من ذلك، تم استبدال إجراء الأنابيب كثيفة العمالة من خلال الاستغناء متعددة مع ماصة المصلية لإضافة السوائل، والأهم من ذلك، من خلال طريقة طموح سريع جدا بمساعدة جهاز شفط بسيطة على الرغم من أداء محلية الصنع لا تتطلب تبادل تلميح بين العينات. وبالنظر إلى وجود زجاجة خزان، لم يلاحظ أي تلوث متقاطع بين الخطوط تجريبيا، حيث أن البذور التي قد تطمح عن غير قصد مع طرف ماصة يتم شجبها في الزجاجة. تم اختيار الصمام المستخدم كمحول بين الطرف العقيم والأنابيب خصيصا لضمان أن السائل يستنشق في زجاجة التجميع دون أن يتدفق مرة أخرى إلى الأنبوب الذي يحتوي على بذور. وهكذا، هذه الطريقة بشكل كبير تحسين إجراء التعقيم السطحي البذور مع سهولة التعامل وتوفير الوقت.
في الختام، يوفر هذا البروتوكول للمجتمع العلمي نهجا آمنا ومرنا للغاية ومنخفض العمالة وموفرا للوقت للتعقيم السطحي لبذور أربيدوبسيس، وهو غير مكلف ويسهل إعداده في أي مختبر. وعلاوة على ذلك، يمكن أيضا تطبيق هذه الطريقة على التعقيم السطحي لأي نوع آخر من البذور الصغيرة عن طريق تغيير في نهاية المطاف طرف معقمة، محول، والأنابيب وفقا لأحجام البذور. على وجه الخصوص، تم استخدام هذه الطريقة بنجاح دون تعديل لعدة أنواع Brassicaceae (على سبيل المثال، كاردامين نفاد الصبر L.، بيرتيروا incana (L.) DC.، Capsella bursa-pastoris (L.) ميديكوس، ألياريا بيتيولاتا (م. بيبرشتاين) كافارا وغراندي، الخ)، وكذلك لنيكوتيانا بنثاميانا دومين ونيكوتيانا تاباكوم ل. البذور. ويمكن أيضا أن تطبق هذه الطريقة على بذور أصغر، مثل تلك التي من بساتين الفاكهة، طالما يمكن تحديد دقيق لسرعة / وقت الطرد المركزي وطول العلاج التعقيم السطحي32.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
جميع المؤلفين لا يعلنون عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
تم تمويل هذا البحث من قبل مقاطعة ترينتو المستقلة من خلال التمويل الأساسي لمجموعة الاقتصاد البيئي التابعة لمنظمة فوندازيون ماخ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aquarium valve | Amazon | B074CYC5SD | Kit including 2 valves and thin-walled tubings. The valve prevents the liquids to go back to the sterile tip |
| Arabidopsis Col-0 wild-type seeds | Nottingham Arabidopsis Stock Center | N1093 | Wild type seeds (sensitive to kanamycin) |
| Arabidopsis transgenic line AdoIspS-79 seeds | NA | NA | Transgenic line overexpressing an isoprene synthase gene from Arundo donax transformed in the Col-0 background, resistant to kanamycin (Li et al. (2017) Mol. Biol. Evol., 34, 2583–2599). Available on request from the authors |
| Microcentrifuge | Eppendorf | EP022628188 | Benchtop microcentrifuge used for spinning down the seeds |
| Murashige & Skoog medium including vitamins | Duchefa | M0222 | Standard medium for plant sterile culture |
| Pipette controller | Brand | 26300 | Used to operate the serological pipette |
| Polyethylene tube 1 | Roth | 9591.1 | Tube for connection from vacuum pump to decantation bottle (inner diameter: 7 mm; outer diameter: 9 mm) |
| Polyethylene tube 2 | Roth | 9587.1 | Tube for connection from decantation bottle to the aquarium valve (inner diameter: 5 mm; outer diameter: 7 mm) |
| Screw cap with connectors | Roth | PY86.1 | 2-way dispenser screw cap GL45 in polypropylene for decanting bottle |
| Serological pipette | Brand | 27823 | Graduated glass (reusable) serological pipette. Disposable pipettes can be used instead |
| Shakeret al. | Qiagen | 85300 | TissueLyser II bead mill used normally for tissue homogenization. Without the addition of beads to the tubes it works as shaker. |
| Technical ethanol | ITW Reagents (Nova Chimica Srl) | 212800 | Ethanol 96% v/v partially denatured technical grade |
| Tween 20 | Merck Millipore | 655205 | Non-ionic detergent acting as surfactant |
| Universal tubing connectors | Roth | Y523.1 | Can be used to improve/simplify tubing connections |
| Vacuum pump | Merck Millipore | WP6222050 | Used for making the suction device |
References
- Somerville, C., Koornneef, M. A fortunate choice: The history of Arabidopsis as a model plant. Nature Reviews Genetics. 3 (11), 883-889 (2002).
- Koornneef, M., Meinke, D. The development of Arabidopsis as a model plant. Plant Journal. 61 (6), 909-921 (2010).
- Initiative, T. A. G. Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana. Nature. 408 (6814), 796-815 (2000).
- Krysan, P. J., Young, J. C., Sussman, M. R. T-DNA as an insertional mutagen in Arabidopsis. Plant Cell. 11 (12), 2283-2290 (1999).
- Speulman, E., et al. A two-component enhancer-inhibitor transposon mutagenesis system for functional analysis of the arabidopsis genome. Plant Cell. 11 (10), 1853-1866 (1999).
- Jander, G., et al. Ethylmethanesulfonate saturation mutagenesis in Arabidopsis to determine frequency of herbicide resistance. Plant Physiology. 131 (1), 139-146 (2003).
- Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. -S., Niu, Q. -W., Chua, N. -H. Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nature Protocols. 1 (2), 641-646 (2006).
- Togninalli, M., et al. AraPheno and the AraGWAS catalog 2020: A major database update including RNA-Seq and knock-out mutation data for Arabidopsis thaliana. Nucleic Acids Research. 48 (1), 1063-1068 (2020).
- Lan, Y., et al. AtMAD: Arabidopsis thaliana multi-omics association database. Nucleic Acids Research. 49 (1), 1445-1451 (2021).
- Xu, J., Trainotti, L., Li, M., Varotto, C. Overexpression of isoprene synthase affects ABA-and drought-related gene expression and enhances tolerance to abiotic stress. International Journal of Molecular Sciences. 21 (12), 1-21 (2020).
- Czarnecki, O., et al. Simultaneous knock-down of six non-family genes using a single synthetic RNAi fragment in Arabidopsis thaliana. Plant Methods. 12 (1), 1-11 (2016).
- Yan, L., et al. high-efficiency genome editing in arabidopsis using YAO promoter-driven CRISPR/Cas9 system. Molecular Plant. 8 (12), 1820-1823 (2015).
- Liu, Y., Gao, Y., Gao, Y., Zhang, Q. Targeted deletion of floral development genes in Arabidopsis with CRISPR/Cas9 using the RNA endoribonuclease Csy4 processing system. Horticulture Research. 6 (1), (2019).
- Grefen, C., et al. Subcellular localization and in vivo interactions of the Arabidopsis thaliana ethylene receptor family members. Molecular Plant. 1 (2), 308-320 (2008).
- Gazzani, S., et al.
- Lee, S., Korban, S. S. Transcriptional regulation of Arabidopsis thaliana phytochelatin synthase (AtPCS1) by cadmium during early stages of plant development. Planta. 215 (4), 689-693 (2002).
- Long, Y., et al. In vivo FRET-FLIM reveals cell-type-specific protein interactions in Arabidopsis roots. Nature. 548 (7665), 97-102 (2017).
- Freire-Rios, A., et al. Architecture of DNA elements mediating ARF transcription factor binding and auxin-responsive gene expression in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (39), 24557-24566 (2020).
- Rivero, L., et al. Handling arabidopsis plants: Growth, preservation of seeds, transformation, and genetic crosses. Methods in Molecular Biology. 1062, 3-25 (2014).
- Chen, J. H., et al. Drought and salt stress tolerance of an arabidopsis glutathione S-transferase U17 knock-out mutant are attributed to the combined effect of glutathione and abscisic acid. Plant Physiology. 158 (1), 340-351 (2012).
- Li, D. Z., et al. Comparative analysis of a large dataset indicates that internal transcribed spacer (ITS) should be incorporated into the core barcode for seed plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (49), 19641-19646 (2011).
- Mathur, J., Koncz, C. Establishment and maintenance of cell suspension cultures. Arabidopsis Protocols. Methods in Molecular Biology. 82, Humana Press. 27-30 (1998).
- Li, M., Cappellin, L., Xu, J., Biasioli, F., Varotto, C. High-throughput screening for in planta characterization of VOC biosynthetic genes by PTR-ToF-MS. Journal of Plant Research. 133 (1), 123-131 (2020).
- Li, M., et al. In planta recapitulation of isoprene synthase evolution from ocimene synthases. Molecular Biology and Evolution. 34 (10), 2583-2599 (2017).
- Li, M., et al. Evolution of isoprene emission in Arecaceae (palms). Evolutionary Applications. 14, 902-914 (2020).
- Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum. 15 (3), 473-497 (1962).
- Bent, A. Arabidopsis thaliana floral dip transformation method. Methods in Molecular Biology. 343, Clifton, N.J. 87-104 (2006).
- Lundberg, D. S., et al. Defining the core Arabidopsis thaliana root microbiome. Nature. 488 (7409), 86-90 (2012).
- Tkacz, A., Cheema, J., Chandra, G., Grant, A., Poole, P. S. Stability and succession of the rhizosphere microbiota depends upon plant type and soil composition. ISME Journal. 9 (11), 2349-2359 (2015).
- Singh, N., Gaddam, S. R., Singh, D., Trivedi, P. K. Regulation of arsenic stress response by ethylene biosynthesis and signaling in Arabidopsis thaliana. Environmental and Experimental Botany. 185, 104408 (2021).
- Lindsey, B. E., Rivero, L., Calhoun, C. S., Grotewold, E., Brkljacic, J. Standardized method for high-throughput sterilization of Arabidopsis seeds. Journal of Visualized Experiments: JOVE. (128), e56587 (2017).
- Acemi, A., Özen, F. Optimization of in vitro asymbiotic seed germination protocol for Serapias vomeracea. The EuroBiotech Journal. 3 (3), 143-151 (2019).
