Summary
Een high-throughput protocol voor de oppervlaktesterilisatie van Arabidopsisthaliana (Arabidopsis) zaden wordt geleverd, waarbij de vloeistofbehandelingsstappen worden geoptimaliseerd met een eenvoudig zuigapparaat dat is gebouwd met een vacuümpomp. Honderden zaadmonsters kunnen op één dag aan de oppervlakte worden gesteriliseerd.
Abstract
Arabidopsis is veruit de plantenmodelsoort die het meest wordt gebruikt voor functionele studies. De oppervlaktesterilisatie van Arabidopsis-zaden is een fundamentele stap die nodig is om dit doel te bereiken. Het is dus van het grootste belang om arabidopsis-zaadoppervlaksterilisatiemethoden met hoge doorvoer vast te stellen om tientallen tot honderden monsters (bijv. Transgene lijnen, ecotypen of mutanten) tegelijk te verwerken. Een sterilisatiemethode voor zaadoppervlakken op basis van de efficiënte eliminatie van vloeistof in buizen met een zelfgemaakte zuiginrichting die is opgebouwd uit een gemeenschappelijke vacuümpomp, wordt in deze studie gepresenteerd. Door de arbeidsintensieve hands-on tijd drastisch te verminderen met deze methode is het verwerken van enkele honderden monsters op één dag mogelijk met weinig moeite. Serie-tijdsverloopanalyses wezen verder op een zeer flexibel tijdsbereik van oppervlaktesterilisatie door hoge kiemsnelheden te handhaven. Deze methode kan gemakkelijk worden aangepast voor oppervlaktesterilisatie van andere soorten kleine zaden met eenvoudige aanpassing van het zuigapparaat op basis van de zaadgrootte en de gewenste snelheid om de vloeistof te elimineren.
Introduction
Arabidopsis is een diploïde plantensoort uit de familie Brassicaceae. De relatief korte levenscyclus (twee maanden per generatie onder lange dag groeiomstandigheden), kleine plantgrootte en zelfbestuiving met de productie van honderden zaden per plant hebben het de eerste fundamentele plantmodelsoortgemaakt 1,2. Bovendien was het genoom volledig gesequenced3,uitgebreide reverse genetica-instrumenten (verzadigd T-DNA, transposon en chemisch gemuteerde populaties) zijn beschikbaar4,5,6,en effectieve Agrobacterium-gemedieerdetransformatie is goed ingeburgerd om voldoende transgene lijnen te verkrijgen voor verder stroomafwaarts werk7 . Zo zijn er in de afgelopen twee decennia grote vorderingen gemaakt met arabidopsis als modelsoort om verschillende aspecten van de plantenbiologie op moleculair niveau te ontleden, waaronder natuurlijke, genetische en fenotypische variatie8,9.
Om genen van belang in Arabidopsis functioneel te karakteriseren, is sterilisatie van het zaadoppervlak om schimmel- en bacteriële verontreinigingen te elimineren de vereiste stap voor veel stroomafwaartse protocollen die axeenculturen vereisen. Genetische transformatie voor de overexpressie10, knock-down (RNA-I11) of knock-out (genoombewerking12,13) van genfunctie, subcellulaire lokalisatie14, promotoractiviteit15,16, eiwit-eiwit17 en eiwit-DNA-interactie18, om alleen de meest voorkomende toepassingen te noemen, vereisen allemaal een sterilisatiestap voor het zaadoppervlak. Ondanks de relatieve eenvoud speelt sterilisatie van het zaadoppervlak dus een fundamentele rol in veel functionele analyses.
Tot nu toe zijn twee belangrijke categorieën sterilisatiemethoden voor zaadoppervlakken ontwikkeld op basis van gas- of vloeistoffasesterilisatie19. Hoewel de doorvoer van gasfase zaadoppervlaksterilisatie gemiddeld tot hoog is, heeft het gebruik van het gevaarlijke reagens chloorgas als oppervlaktesterilisatiemiddel de brede toepassing ervan belemmerd. Methoden op basis van vloeistoffasesterilisatie vertrouwen daarentegen op mildere chemicaliën zoals ethanol en bleekoplossingen voor oppervlaktesterilisatie, en ze worden op grotere schaal gebruikt ondanks dat ze een inherent lagere doorvoer hebben dan chloorontsmetting. Over het algemeen worden vaak twee verschillende methoden gebruikt die vloeibare reagentia gebruiken. Een veel gebruikte methode is gebaseerd op wassen met ethanol en bleekmiddel in verschillende concentraties gedurende verschillende tijdsduur20,21. Een andere methode is gebaseerd op de toepassing van bleekmiddel slechts21,22. Beide methoden worden voornamelijk toegepast voor kleinschalige sterilisatie van zaadoppervlakken. In veel experimenten is het echter noodzakelijk om veel Arabidopsis transgene lijnen afgeleid van één transformatie15,23 te screenen of parallel veel transgene lijnen te screenen die zijn gegenereerd uit verschillende transformaties24,25. Voor zover wij weten, is er geen op vloeistof gebaseerde methode voor sterilisatie van zaadoppervlakken met hoge doorvoer gepubliceerd, wat, hoewel weinig erkend, een belangrijk knelpunt vormt voor functionele genomica-benaderingen. Daarom is het ontwikkelen van veilige, robuuste en high-throughput methoden voor sterilisatie van zaadoppervlakken een noodzakelijke en kritieke stap naar het succes van de functionele karakterisering van veel genen tegelijk.
Hiertoe wordt in de huidige studie een verbeterde methode voor oppervlaktesterilisatie van Arabidopsis-zaden gepresenteerd. Deze methode is veilig, goedkoop, zeer robuust en met een hoge doorvoer, waardoor 96 onafhankelijke lijnen binnen een uur vanaf het begin van de sterilisatie van het zaadoppervlak tot het einde van het zaaien in petrischalen kunnen worden verwerkt. De gedemonstreerde methode is gebaseerd op algemeen beschikbare, elementaire laboratoriuminstrumenten zoals een vacuümpomp, consumeerbaar glaswerk en plastic waren. Deze verbeterde methode biedt de wetenschappelijke gemeenschap een veilige, eenvoudige en betaalbare aanpak om de sterilisatie van zaadoppervlakken te stroomlijnen met een doorvoer die voldoende is voor moderne functionele genomica-benaderingen in Arabidopsis en andere niet-modelplantensoorten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Reagentia en mediavoorbereiding
- Bereid 70% ethanoloplossing voor: Voeg 737 ml 95% technische ethanol toe aan 263 ml gedestilleerd water. Meng.
OPMERKING: Bereid 70% ethanoloplossing op een niet-steriele werkbank.
LET OP: Ethanol is licht ontvlambaar en kan ernstige irritatie aan de ogen veroorzaken. Uit de buurt van vlammen en warmtebronnen houden. In geval van contact met de ogen, spoel met overvloedig water. - Bereid 5% bleekoplossing voor: Voeg 5 ml huishoudelijk bleekmiddel (met ~ 3,5% natriumhypochloriet, NaClO) toe aan 95 ml steriel gedestilleerd water. Voeg een paar druppels niet-ionisch wasmiddel toe (bijv. Tween 20) en meng grondig.
OPMERKING: Bereid 5% bleekoplossing in de laminaire kap.
LET OP: Natriumhypochloriet, het actieve bestanddeel van bleekmiddel, is zeer irriterend. Het is zeer corrosief en kan ernstige schade aan het maagdarmkanaal veroorzaken. In geval van contact, onmiddellijk spoelen met overvloedig water. In geval van inname, bel het antigifcentrum of een arts voor behandelingsadvies. - Bereid halfsterkte Murashige en Skoog (1/2 MS) medium26.
- Voeg 2,2 g MS medium poeder (inclusief vitaminen) en 10 g sucrose toe aan 800 ml gedestilleerd water. Pas de pH van de oplossing aan met 1 M KOH en breng het volume met gedestilleerd water op 1 L. Aliquot 500 ml in een fles van 1 l en voeg 4 g agar toe om een vast medium te bereiden. Autoclaaf de oplossing.
- Koel het medium na het autoclaveren af tot 50-53 °C in een waterbad en giet het in petrischalen onder de laminaire stromingskap. Om het selectieve medium te bereiden, voegt u 1000 μL / L van 50 mg / ml kanamycine-stamoplossing toe (meng 500 mg kanamycinesulfaatmonohydraat in 10 ml gedestilleerd water, filtersteriliseer en bewaar bij -20 ° C) op het medium (50-53 ° C). Meng goed door te wervelen en giet in petrischaaltjes zoals eerder vermeld.
2. Aspirator instellen
OPMERKING: De opstelling van het instrument is samengevat in figuur 1.
- Sluit de inlaat van de vacuümpomp aan op het ene uiteinde van een polyethyleen (PE) buis van geschikte grootte. Sluit het andere uiteinde van de buis aan op de uitlaat van het tweerichtingsdeksel van de decantatiefles. Wikkel de verbinding van de buis stevig in met eenafdichtingsfolie (Table of Materials)om een luchtdichte verbinding te garanderen.
- Sluit een tweede PE-buis aan op de inlaat (het gat dat aan de binnenkant van de fles uitsteekt) van de schroefdop op de decantatiefles. Plaats de andere kant van de buis op de uitlaat van een aquariumklep. Wikkel indien nodig met een afdichtingsfolie langs de kruising om luchtlekkage te elimineren.
- Plaats vlak voor gebruik een steriele pipetpunt van 200 μL op de inlaat van het aquariumfilter onder de laminaire stroomkap.
Figuur 1: Schematische tekening van de zuiginrichting voor verwijdering van sterilisatievloeistoffen met hoge doorvoer. Voor de duidelijkheid, de afzonderlijke delen zijn niet op schaal getekend. Letter (A) geeft de vacuümpomp aan, (B) de reservoirfles om vloeistoffen (ethanol, bleekmiddel of steriel water) op te vangen), (C) de klep om reflux van de vloeistoffen te voorkomen, (D) de steriele pipetpunt van 200 μL en (E) de microcentrifugebuis van 1,5 ml die zaden en sterilisatievloeistof bevat. Pijlen geven de richting van de luchtstroom aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
3. High-throughput vloeistof oppervlakte sterilisatie van zaden
OPMERKING: De algemene procedure en minimale tijd die nodig is voor oppervlaktesterilisatie van Arabidopsis thaliana (L.) Heynh wild-type (Col-0) (Arabidopsis) zaden met 96 onafhankelijke monsters zijn samengevat in figuur 2.
- Label met een permanente marker twee batches van 48 x 1,5 ml microcentrifugebuizen met progressieve nummers.
- Voeg 100-200 Arabidopsis-zaden toe aan elk van de 96 steriele microcentrifugebuizen van 1,5 ml (ongeveer 1-2 mm boven de bodem van het conische uiteinde van de buis).
- Gebruik ongeveer 1000 μL 70% ethanol in elke buis met behulp van een steriele serologische pipet van 10 ml in de laminaire stroomkap (zaadbatch één, 48 buizen) en sluit de deksels voorzichtig.
OPMERKING: Het doseren van de oplossingen hoeft niet extreem nauwkeurig te zijn, zolang het afgegeven volume meerdere malen hoger is dan het volume zaden. U kunt deze stap ook buiten de laminaire kap uitvoeren (niet-steriele toestand). - Schud de buizen met een oscillatiefrequentie van 8,0 Hz gedurende ten minste 3 minuten in een shaker.
- Haal de adapters uit de shaker en breng ze over in de mand van een benchtop microcentrifuge.
- Draai de zaden snel af met behulp van de pulsfunctie (aanwezig in de meeste benchtop centrifuges) om 1880 x g (~ 15 s) te bereiken.
OPMERKING: Langere tijd of hogere centrifugeerkrachten hebben een negatieve invloed op de kieming van zaden. - Breng de 48 buizen van de adapters over naar één rack en open alle buizen onder de laminaire flowkap. Voorkom verontreinigingen door het deel van de deksels dat in de buizen past niet aan te raken. Als deksels te dicht bij elkaar liggen, verdeel de buizen dan in twee rekken voor eenvoudiger gebruik.
- Plaats een steriele gele punt van 200 μL op de aquariumklepinlaat van de zelfgemaakte aspirator onder de laminaire stroomkap en schakel de pomp in.
- Plaats de gele punt net boven het niveau van de zaden om te voorkomen dat de zaden worden aangeraakt bij het zuigen van de vloeistof. U kunt ook snel de punt aan de onderkant van de buis plaatsen; als een zaadje de zuigkracht van de vloeistof blokkeert, verwijder dan de gele punt en plaats een nieuwe.
- Aliquot in elke buis ongeveer 1000 μL 5% bleekmiddel met behulp van een 10 ml steriele serologische pipet in de laminaire stroomkap.
- Sluit alle deksels goed af en plaats alle buizen terug in de schudadapters. Schud de buizen met een oscillatiefrequentie van 8,0 Hz gedurende ten minste 3 minuten in de shaker.
- Draai de zaden snel af met behulp van de pulsfunctie van de tafelcentrifuge voor de tijd die nodig is om 1880 x g (~ 15 s) te bereiken.
- Plaats een nieuwe steriele gele punt van 200 μL op de aquariumklep die is aangesloten op de vacuümpomp onder de laminaire stroomkap en schakel de pomp in.
- Plaats de gele punt boven het niveau van de zaden om te voorkomen dat de zaden worden aangeraakt bij het zuigen van de bleekoplossing.
- Aliquot in elke buis ongeveer 1000 μL gesteriliseerde H2O met behulp van een 10 ml steriele serologische pipet in de laminaire stromingskap.
OPMERKING: Combineer de twee partijen zaden om de gebruikstijd te minimaliseren. - Plaats een nieuwe steriele gele punt van 200 μL op de aquariumklep die is aangesloten op de vacuümpomp onder de laminaire stroomkap en schakel de pomp in.
- Plaats de gele punt net boven het niveau van de zaden om te voorkomen dat de zaden worden aangeraakt tijdens het zuigen van de H2O.
- Aliquot in elke buis ongeveer 500 μL gesteriliseerde H2O met behulp van een steriele serologische pipet van 10 ml en sluit alle deksels in de laminaire stroomkap. De zaden zijn klaar om gezaaid te worden. Houd de buizen indien nodig maximaal enkele uren op kamertemperatuur of 's nachts bij 4 °C.
- Vul de reservoirfles die wordt gebruikt om vloeistof te verzamelen met een voldoende hoeveelheid water en autoclaaf het. Gooi de vloeistof daarna weg in een normale gootsteen.
OPMERKING: Autoclaaf de vloeistof om alle zaden in het reservoir te doden.
Figuur 2: Overzicht van de procedure en minimale tijd die nodig is voor oppervlaktesterilisatie van Arabidopsis-zaden met 96 onafhankelijke monsters. In het gepresenteerde experiment worden 96 onafhankelijke monsters behandeld in twee batches van gelijke grootte. De hele procedure is hetzelfde voor beide batches en ze worden parallel verwerkt, maar batch twee wordt verwerkt met één stap vertraging in vergelijking met batch één. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
4. Plating en score van Arabidopsis op 1/2 MS platen
- Breng de zaden en 300-400 μL steriel H2O over in een petrischaaltje door voorzichtig te pipetteren met een pipet van 1000 μL.
- Na het overbrengen van 10 buizen, giet in elke plaat ongeveer 1,5-2,0 ml gesmolten 1/2 MS-medium zonder antibiotica.
OPMERKING: Smelt van tevoren en bewaar het gesmolten medium van 1/2 MS in een thermostatisch bad op 50-53 °C om stollen te voorkomen. Zorg ervoor dat de temperatuur niet hoger is dan 58 °C om te voorkomen dat de kiemkracht van de zaden afneemt. - Draai de plaat snel om de zaden erin te verdelen. Plak de platen aan weerszijden vast.
- Wikkel de borden in een plastic of aluminiumfolie en plaats ze vervolgens in een koelkast (4 °C) gedurende 3 dagen in het donker om een uniforme kieming te verkrijgen.
- Breng de platen over in een groeikamer van 23 °C onder lange dagomstandigheden (16 uur licht/8 uur donker) met een lichtintensiteit van 100-120 μmol m-2·s-1 en 60% relatieve vochtigheid.
- Na twee dagen scoor je de planten op de aanwezigheid van radicles. Detecteer de radikelopkomst en groene zaadlobbenvorming (volledige opening van de twee zaadlobben) om de kieming van het zaad te evalueren.
5. Statistische analyses
OPMERKING: Hier werd de paarsgewijze test van Tukey gebruikt voor statistische analyses.
- Beschouw de P-waarden onder 0,01 als statistisch significant. Voer alle experimenten ten minste uit met vijf biologische replicaties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om de tijd te beoordelen die nodig is voor de gehele zaadsterilisatieprocedure, werden de tijdsverschillen voor vloeistofbehandeling 96 monsters in het huidige protocol berekend en vergeleken met traditionele pipetteermethoden. Het resultaat geeft aan dat het huidige protocol tijd bespaart, waardoor de vloeistofverwerkingstijd wordt teruggebracht tot een vierde van die met de traditionele protocollen(tabel 1). De tabel benadrukt verder dat de vloeistofverwijderingstijd in het huidige protocol meer tijd bespaart dan die van de traditionele methoden, met een algehele achtvoudige reductie.
Selectie van het tijdsbereik voor zaadsterilisatie
Langere sterilisatiestappen minimaliseren de besmettingsgraden, maar kunnen de kieming van zaden negatief beïnvloeden. Om het beste tijdsbereik voor zaadsterilisatie met de hoogste kiemsnelheden zonder besmetting te bepalen, werden verschillende duur van elke sterilisatiestap getest, waarbij zowel zaadkieming als opkomstpercentages van groene zaadlobben werden beoordeeld. De kiemanalyses uitgevoerd van dag 2 tot dag 4 en op dag 7 gaven geen significante verschillen aan tussen het tijdsbereik van 10 min tot 40 min 70% ethanolsterilisatie. Vanaf 40 minuten behandeling met 70% ethanol daalden de kiemsnelheden echter(figuur 3). Dienovereenkomstig daalde de opkomst van groene zaadlobben(figuur 4). Omdat kortere sterilisatietijden de doorvoer kunnen verhogen, maar de besmettingsgraden kunnen verhogen, werd de minimale tijd beoordeeld die nodig is om 96 verschillende zaadmonsters in twee batches van 48 monsters te steriliseren. Bovendien hebben we, gezien de voorkeursopstelling met schudden uitgevoerd in een shaker, de minimale tijd getest die nodig is voor zaadsterilisatie door 96 monsters te verwerken in twee batches van elk 48 monsters. De minimale tijd die nodig was om 48 monsters tegelijk te verwerken was 3 minuten, waardoor de tweede set van 48 monsters onmiddellijk na de eerste set zonder wachttijd kon worden verwerkt. Zo werden 3 min voor 70% ethanol en 3 min voor 5% bleekmiddel toegepast als de minimale tijd om de zaden te steriliseren (punt (a) in figuur 3). Deze analyses resulteerden in kiemsnelheden die vergelijkbaar zijn met de hoogste zonder besmetting en verlies van zaadvitaliteit(figuur 3).
Kortom, de geschikte tijdsbereiken voor het handhaven van het hoogste percentage zaadkieming zonder verontreiniging afgeleid van voldoende eliminatie van micro-organismen ligt tussen 3-30 minuten voor 70% ethanol en tussen 3-22,5 minuten voor 5% bleekmiddel.
Om aan te tonen dat de zaden die we oorspronkelijk gebruikten besmet waren met micro-organismen, werden de niet-steriele zaden direct op MS-platen gezaaid. Schimmels verschenen op de platen na twee dagen zaaien en verspreidden zich over de platen na zeven dagen ontkieming (aanvullende figuur 1).
Evaluatie van kruisbesmetting tussen verschillende genotypen van zaden
Om te controleren of het gebruik van een enkele steriele pipetpunt om verschillende zaadmonsters te verwerken tot kruisbesmetting kon leiden en om de hoeveelheid van een dergelijke kruisbesmetting te beoordelen, werden twee verschillende genotypen van zaden (Col-0 wild-type, gevoelig voor kanamycine en Arabidopsis transgene lijn AdoIspS-79, resistent tegen kanamycine24) afgewisseld tijdens de sterilisatieprocedure. Na standaard zaadsterilisatie werden ze gezaaid in halfsterkte MS vaste platen aangevuld zonder of met 50 mg / L kanamycine. De experimenten werden vijf keer gerepliceerd. Deze analyses gaven aan dat ongeveer 96% van de zaden ontkiemde in MS-platen die kanamycine bevatten, maar er werden geen groene zaadlobben waargenomen op de7e dag van ontkieming in platen gezaaid met het Col-0 genotype(figuur 5). Tegelijkertijd vertoonden Col-0-zaden gezaaid in MS-platen ongeveer 94% kieming en alle zaadlobben waren groen na 7-daagse ontkieming. Deze resultaten wijzen erop dat er geen overdracht van verontreiniging tussen monsters is, ondanks het gebruik van een enkele pipetpunt om de steriele oplossing te verwijderen.
Figuur 3: Kiempercentage zaad na 2-, 3-, 4- en 7-daagse Arabidopsis zaadzaaien met verschillende sterilisatietijden aangegeven met verschillende letters. a: 3 min 70% ethanol en 3 min 5% bleekmiddel, b: 10 min 70% ethanol en 7,5 min 5% bleekmiddel, c: 20 min 70% ethanol en 15 min 5% bleekmiddel, d: 30 min 70% ethanol en 22,5 min 5% bleekmiddel, e: 40 min 70% ethanol en 30 min 5% bleekmiddel, f: 50 min 70% ethanol en 37,5 min 5% bleekmiddel, g: 70 min 70% ethanol en 52,5 min 5% bleekmiddel. Twee sterren geven significante verschillen aan volgens de paarsgewijze test van Tukey (p < 0,01). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Groen zaadlobbenpercentage na 7-daagse Arabidopsis zaadzaaien met verschillende sterilisatietijden aangegeven met verschillende letters. a: 3 min 70% ethanol en 3 min 5% bleekmiddel, b: 10 min 70% ethanol en 7,5 min 5% bleekmiddel, c: 20 min 70% ethanol en 15 min 5% bleekmiddel, d: 30 min 70% ethanol en 22,5 min 5% bleekmiddel, e: 40 min 70% ethanol en 30 min 5% bleekmiddel, f: 50 min 70% ethanol en 37,5 min 5% bleekmiddel, g: 70 min 70% ethanol en 52,5 min 5% bleekmiddel. Twee sterren geven significante verschillen aan volgens de paarsgewijze test van Tukey (p < 0,01). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Kruisbesmettingstest tussen Col-0 wild-type en AdoIspS-79 zaden. Col-0 kieming in halfsterkte MS-platen (links), Col-0 in halfsterkte MS-plaat aangevuld met 50 mg/L kanamycine (midden) en AdoIspS-79 in halfsterkte MS-plaat aangevuld met 50 mg/L kanamycine (rechts), scalebar = 1 cm. Een representatief beeld van een van de vijf replicaties is weergegeven in de figuur. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Procedure | Huidig protocol (min) | Traditioneel pipetteren (min) |
| Vloeistof toevoegen 1 | 12 | 24 |
| Vloeistof verwijderen 1 | 6 | 48 |
| TOTAAL | 18 | 72 |
Tabel 1: Samenvatting van de minimale tijd die nodig is voor vloeistofbehandeling tijdens sterilisatie van 96 zaadmonsters. De tabel geeft de totale tijd (min) weer die nodig is om de vloeistof toe te voegen en te verwijderen tijdens de belangrijkste stappen van zaadoppervlaksterilisatie met behulp van het huidige protocol en een protocol waarbij traditioneel pipetteren wordt gebruikt.
Aanvullende figuur 1: Detectie van verontreiniging na 7-daagse Arabidopsis zaadzaaien. De afbeelding toont de mate van besmetting van niet-steriele zaden (gespoeld met water; links) en steriele zaden (onderworpen aan oppervlaktesterilisatie zoals beschreven in de hoofdtekst; rechts). Scalebar = 1 cm. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sterilisatie van zaden is de fundamentele stap voor functionele studies in Arabidopsis. Hoewel het vaak voor veel verschillende doeleinden wordt uitgevoerd, zijn er beperkte studies beschikbaar over sterilisatie van zaadoppervlakken met hoge doorvoer in Arabidopsis.
Tot nu toe is een van de methoden met de hoogste doorvoer het gebruik van chloorgas dat wordt gegenereerd door bleekmiddel te mengen met geconcentreerd HCl. Hoewel deze methode beperkte hands-on tijd vereist, gebruikt het een gas dat zeer giftig is voor mensen27. Bovendien moeten het aantal zaden dat aan het oppervlak moet worden gesteriliseerd en de duur van de sterilisatie van oppervlaktezaad zorgvuldig worden gecontroleerd. Als de zaden te veel zijn, zou de dosering van chloorgas niet voldoende zijn om de micro-organismen die op de zaadlaag aanwezig zijn volledig te doden, wat resulteert in wijdverspreide verontreiniging van de zaadbatches. Aan de andere kant, als de duur van oppervlaktesterilisatie te lang is, zullen de zaden worden gedood. Dus, ondanks enkele voordelen, is fumigatie niet de favoriete methode voor sterilisatie van zaadoppervlakken in Arabidopsis.
Daarentegen zijn er een aantal op vloeistof gebaseerde methoden voor oppervlaktesterilisatie van Arabidopsis-zaden beschikbaar28,29,30. De belangrijkste beperking van deze methoden is echter dat ze uitsluitend kunnen worden gebruikt voor een laag aantal monsters en dat ze niet zijn geoptimaliseerd voor doorvoer. Voor zover wij weten, werd de enige studie over high-throughput oppervlaktesterilisatie van Arabidopsis-zaden beschreven door Lindsey, B. E. et al.31. In deze studie stelden de auteurs twee verschillende methoden voor. Naast een benadering met chloorgas die hierboven is genoemd, stelden de auteurs een op vloeistof gebaseerde oppervlaktesterilisatiemethode voor met behulp van een geconcentreerde bleekoplossing die werd toegepast voor sterilisatie van 5-10 minuten. Hoewel deze methode de eerste systematische studie voor oppervlaktezaadsterilisatie met verschillende concentraties bleekmiddel voor verschillende tijdstippen opleverde en de bijbehorende output analyseerde, kon het protocol nog steeds worden verbeterd. Allereerst gebruikte deze methode sterk geconcentreerd bleekmiddel, dat schadelijk kan zijn voor de operator en het milieu. Ten tweede, vanwege het gebruik van sterk geconcentreerd bleekmiddel, is de beste sterilisatietijd van het zaadoppervlak slechts tussen 5-10 minuten, waardoor een smal tijdvenster ontstaat voor de voltooiing van het protocol. Bovendien waren er veel wasstappen nodig om het bleekmiddel te elimineren, waardoor het protocol zowel tijd- als werkintensief was en de doorvoer in zo'n kort tijdsbestek van de oppervlaktesterilisatiestap werd beperkt.
Om al deze beperkingen te overwinnen en de beste aspecten van eerdere werken te combineren, werd de hier beschreven methode uitgevoerd met 70% technische ethanol gevolgd door een volgende stap met een laag percentage bleekmiddel (5%) waardoor de toxiciteit en de arbeidsintensieve wasstappen werden verminderd. Bovendien leverden de systematische analyses van zaadkieming een breder tijdsbereik tussen 3-30 minuten op voor sterilisatie van het zaadoppervlak zonder de kiemkracht te beïnvloeden. Dit zorgt voor een grotere flexibiliteit om de workflow te organiseren, waardoor de oppervlaktesterilisatietijd kan worden geregeld op basis van gelijktijdig werk. Wat nog belangrijker is, de arbeidsintensieve pipetteerprocedure werd vervangen door meervoudige dispensatie met een serologische pipet voor het toevoegen van de vloeistoffen en, belangrijker nog, door een zeer snelle aspiratiemethode, bijgestaan door een eenvoudig maar performant zelfgemaakt zuigapparaat dat geen tipuitwisseling tussen monsters vereist. Gezien de aanwezigheid van een reservoirfles werd experimenteel geen kruisbesmetting tussen lijnen waargenomen, omdat zaden die per ongeluk met de pipetpunt kunnen worden nagestreefd, in de fles worden gedecanteerd. De klep die als adapter tussen de steriele punt en de slang wordt gebruikt, is speciaal geselecteerd om te garanderen dat de vloeistof in de opvangfles wordt aangezogen zonder terug te stromen naar de buis met zaden. Deze methode heeft dus de sterilisatieprocedure van het zaadoppervlak drastisch verbeterd met eenvoudige hantering en tijdsbesparing.
Kortom, dit protocol biedt de wetenschappelijke gemeenschap een veilige, zeer flexibele, arbeidsarme en tijdbesparende aanpak voor oppervlaktesterilisatie van Arabidopsis-zaden, die goedkoop is en gemakkelijk in elk laboratorium kan worden opgezet. Bovendien kan de methode ook worden toegepast op oppervlaktesterilisatie van elk ander type kleine zaden door uiteindelijk de steriele tip, adapter en slang te veranderen volgens de zaadgroottes. In het bijzonder werd deze methode met succes zonder wijziging gebruikt voor verschillende Brassicaceae-soorten (bijv. Cardamine impatiens L., Berteroa incana (L.) DC., Capsella bursa-pastoris (L.) Medicus, Alliaria petiolata (M. Bieberstein) Cavara et Grande, enz.), Evenals voor Nicotiana benthamiana Domin en Nicotiana tabacum L. zaden. De methode kan ook worden toegepast op nog kleinere zaden, zoals die van orchideeën, zolang nauwkeurige bepaling van snelheid / tijd van centrifugering en lengte van oppervlaktesterilisatiebehandeling kan worden vastgesteld32.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle auteurs verklaren geen belangenconflicten te hebben.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gefinancierd door de autonome provincie Trento door middel van kernfinanciering van de Ecogenomics-groep van Fondazione E. Mach.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aquarium valve | Amazon | B074CYC5SD | Kit including 2 valves and thin-walled tubings. The valve prevents the liquids to go back to the sterile tip |
| Arabidopsis Col-0 wild-type seeds | Nottingham Arabidopsis Stock Center | N1093 | Wild type seeds (sensitive to kanamycin) |
| Arabidopsis transgenic line AdoIspS-79 seeds | NA | NA | Transgenic line overexpressing an isoprene synthase gene from Arundo donax transformed in the Col-0 background, resistant to kanamycin (Li et al. (2017) Mol. Biol. Evol., 34, 2583–2599). Available on request from the authors |
| Microcentrifuge | Eppendorf | EP022628188 | Benchtop microcentrifuge used for spinning down the seeds |
| Murashige & Skoog medium including vitamins | Duchefa | M0222 | Standard medium for plant sterile culture |
| Pipette controller | Brand | 26300 | Used to operate the serological pipette |
| Polyethylene tube 1 | Roth | 9591.1 | Tube for connection from vacuum pump to decantation bottle (inner diameter: 7 mm; outer diameter: 9 mm) |
| Polyethylene tube 2 | Roth | 9587.1 | Tube for connection from decantation bottle to the aquarium valve (inner diameter: 5 mm; outer diameter: 7 mm) |
| Screw cap with connectors | Roth | PY86.1 | 2-way dispenser screw cap GL45 in polypropylene for decanting bottle |
| Serological pipette | Brand | 27823 | Graduated glass (reusable) serological pipette. Disposable pipettes can be used instead |
| Shakeret al. | Qiagen | 85300 | TissueLyser II bead mill used normally for tissue homogenization. Without the addition of beads to the tubes it works as shaker. |
| Technical ethanol | ITW Reagents (Nova Chimica Srl) | 212800 | Ethanol 96% v/v partially denatured technical grade |
| Tween 20 | Merck Millipore | 655205 | Non-ionic detergent acting as surfactant |
| Universal tubing connectors | Roth | Y523.1 | Can be used to improve/simplify tubing connections |
| Vacuum pump | Merck Millipore | WP6222050 | Used for making the suction device |
References
- Somerville, C., Koornneef, M. A fortunate choice: The history of Arabidopsis as a model plant. Nature Reviews Genetics. 3 (11), 883-889 (2002).
- Koornneef, M., Meinke, D. The development of Arabidopsis as a model plant. Plant Journal. 61 (6), 909-921 (2010).
- Initiative, T. A. G. Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana. Nature. 408 (6814), 796-815 (2000).
- Krysan, P. J., Young, J. C., Sussman, M. R. T-DNA as an insertional mutagen in Arabidopsis. Plant Cell. 11 (12), 2283-2290 (1999).
- Speulman, E., et al. A two-component enhancer-inhibitor transposon mutagenesis system for functional analysis of the arabidopsis genome. Plant Cell. 11 (10), 1853-1866 (1999).
- Jander, G., et al. Ethylmethanesulfonate saturation mutagenesis in Arabidopsis to determine frequency of herbicide resistance. Plant Physiology. 131 (1), 139-146 (2003).
- Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. -S., Niu, Q. -W., Chua, N. -H. Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nature Protocols. 1 (2), 641-646 (2006).
- Togninalli, M., et al. AraPheno and the AraGWAS catalog 2020: A major database update including RNA-Seq and knock-out mutation data for Arabidopsis thaliana. Nucleic Acids Research. 48 (1), 1063-1068 (2020).
- Lan, Y., et al. AtMAD: Arabidopsis thaliana multi-omics association database. Nucleic Acids Research. 49 (1), 1445-1451 (2021).
- Xu, J., Trainotti, L., Li, M., Varotto, C. Overexpression of isoprene synthase affects ABA-and drought-related gene expression and enhances tolerance to abiotic stress. International Journal of Molecular Sciences. 21 (12), 1-21 (2020).
- Czarnecki, O., et al. Simultaneous knock-down of six non-family genes using a single synthetic RNAi fragment in Arabidopsis thaliana. Plant Methods. 12 (1), 1-11 (2016).
- Yan, L., et al. high-efficiency genome editing in arabidopsis using YAO promoter-driven CRISPR/Cas9 system. Molecular Plant. 8 (12), 1820-1823 (2015).
- Liu, Y., Gao, Y., Gao, Y., Zhang, Q. Targeted deletion of floral development genes in Arabidopsis with CRISPR/Cas9 using the RNA endoribonuclease Csy4 processing system. Horticulture Research. 6 (1), (2019).
- Grefen, C., et al. Subcellular localization and in vivo interactions of the Arabidopsis thaliana ethylene receptor family members. Molecular Plant. 1 (2), 308-320 (2008).
- Gazzani, S., et al.
- Lee, S., Korban, S. S. Transcriptional regulation of Arabidopsis thaliana phytochelatin synthase (AtPCS1) by cadmium during early stages of plant development. Planta. 215 (4), 689-693 (2002).
- Long, Y., et al. In vivo FRET-FLIM reveals cell-type-specific protein interactions in Arabidopsis roots. Nature. 548 (7665), 97-102 (2017).
- Freire-Rios, A., et al. Architecture of DNA elements mediating ARF transcription factor binding and auxin-responsive gene expression in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (39), 24557-24566 (2020).
- Rivero, L., et al. Handling arabidopsis plants: Growth, preservation of seeds, transformation, and genetic crosses. Methods in Molecular Biology. 1062, 3-25 (2014).
- Chen, J. H., et al. Drought and salt stress tolerance of an arabidopsis glutathione S-transferase U17 knock-out mutant are attributed to the combined effect of glutathione and abscisic acid. Plant Physiology. 158 (1), 340-351 (2012).
- Li, D. Z., et al. Comparative analysis of a large dataset indicates that internal transcribed spacer (ITS) should be incorporated into the core barcode for seed plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (49), 19641-19646 (2011).
- Mathur, J., Koncz, C. Establishment and maintenance of cell suspension cultures. Arabidopsis Protocols. Methods in Molecular Biology. 82, Humana Press. 27-30 (1998).
- Li, M., Cappellin, L., Xu, J., Biasioli, F., Varotto, C. High-throughput screening for in planta characterization of VOC biosynthetic genes by PTR-ToF-MS. Journal of Plant Research. 133 (1), 123-131 (2020).
- Li, M., et al. In planta recapitulation of isoprene synthase evolution from ocimene synthases. Molecular Biology and Evolution. 34 (10), 2583-2599 (2017).
- Li, M., et al. Evolution of isoprene emission in Arecaceae (palms). Evolutionary Applications. 14, 902-914 (2020).
- Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum. 15 (3), 473-497 (1962).
- Bent, A. Arabidopsis thaliana floral dip transformation method. Methods in Molecular Biology. 343, Clifton, N.J. 87-104 (2006).
- Lundberg, D. S., et al. Defining the core Arabidopsis thaliana root microbiome. Nature. 488 (7409), 86-90 (2012).
- Tkacz, A., Cheema, J., Chandra, G., Grant, A., Poole, P. S. Stability and succession of the rhizosphere microbiota depends upon plant type and soil composition. ISME Journal. 9 (11), 2349-2359 (2015).
- Singh, N., Gaddam, S. R., Singh, D., Trivedi, P. K. Regulation of arsenic stress response by ethylene biosynthesis and signaling in Arabidopsis thaliana. Environmental and Experimental Botany. 185, 104408 (2021).
- Lindsey, B. E., Rivero, L., Calhoun, C. S., Grotewold, E., Brkljacic, J. Standardized method for high-throughput sterilization of Arabidopsis seeds. Journal of Visualized Experiments: JOVE. (128), e56587 (2017).
- Acemi, A., Özen, F. Optimization of in vitro asymbiotic seed germination protocol for Serapias vomeracea. The EuroBiotech Journal. 3 (3), 143-151 (2019).
