Summary
En høy gjennomstrømningsprotokoll for overflatesterilisering av Arabidopsisthaliana (Arabidopsis) frø er gitt, og optimaliserer væskehåndteringstrinnene med en enkel sugeenhet konstruert med en vakuumpumpe. Hundrevis av frøprøver kan overflatesteriliseres på en dag.
Abstract
Arabidopsis er den desidert plantemodellarten som er mest brukt til funksjonelle studier. Overflatesteriliseringen av Arabidopsis frø er et grunnleggende skritt som kreves mot denne enden. Dermed er det viktig å etablere høygjennomstrømning Arabidopsis frø overflatesteriliseringsmetoder for å håndtere titalls til hundrevis av prøver (f.eks. transgene linjer, økotyper eller mutanter) samtidig. En frøoverflatesteriliseringsmetode basert på effektiv eliminering av væske i rør med en hjemmelaget sugeenhet konstruert av en vanlig vakuumpumpe presenteres i denne studien. Ved å dramatisk redusere arbeidsintensiv hands-on tid med denne metoden håndtering av flere hundre prøver på en dag er mulig med liten innsats. Serietidsanalyser indikerte videre et svært fleksibelt tidsrom for overflatesterilisering ved å opprettholde høye spiringshastigheter. Denne metoden kan enkelt tilpasses for overflatesterilisering av andre typer små frø med enkel tilpasning av sugeenheten i henhold til frøstørrelsen, og hastigheten som ønskes for å eliminere væsken.
Introduction
Arabidopsis er en diploid planteart som tilhører Brassicaceae-familien. Den relativt korte livssyklusen (to måneder per generasjon under lange vekstforhold), liten plantestørrelse og selvbestøvning med produksjon av hundrevis av frø per plante har gjort det til den første grunnleggende plantemodellarten1,2. I tillegg var genomet fullt sekvensert3, omfattende omvendte genetikkverktøy (mettet T-DNA, transposon og kjemisk mutageniserte populasjoner) er tilgjengelige4,5,6, og effektiv Agrobacterium-mediert transformasjon er veletablert for å oppnå tilstrekkelige transgene linjer for videre nedstrømsarbeid7. . I løpet av de siste to tiårene har det derfor blitt oppnådd store fremskritt ved å bruke Arabidopsis som modellart for å dissekere ulike aspekter av plantebiologi på molekylært nivå, inkludert naturlig, genetisk og fenotypisk variasjon8,9.
For å funksjonelt karakterisere gener av interesse for Arabidopsis, er frøoverflatesterilisering for å eliminere sopp- og bakterieforurensninger det nødvendige trinnet for mange nedstrømsprotokoller som krever akseniske kulturer. Genetisk transformasjon for overekspression10, knock-down (RNA-I11) eller knock-out (genomredigering12,13) av genfunksjon, subcellulær lokalisering14, promotoraktivitet15,16, proteinprotein17 og protein-DNA-interaksjon18, for å sitere bare de vanligste applikasjonene, alle nødvendiggjør et frøoverflatesteriliseringstrinn. Til tross for sin relative enkelhet spiller frøoverflatesterilisering en grunnleggende rolle i mange funksjonelle analyser.
Så langt er to hovedkategorier av frøoverflatesteriliseringsmetoder utviklet basert enten på gass- eller væskefasesterilisering19. Mens gjennomstrømningen av gassfasefrøoverflatesterilisering er middels til høy, har bruk av farlig reagensklorgass som overflatesteriliseringsmiddel hindret den brede anvendelsen. Metoder basert på væskefasesterilisering, tvert imot, er avhengige av mildere kjemikalier som etanol og blekemiddelløsninger for overflatesterilisering, og de er mer utbredt til tross for at de har en iboende lavere gjennomstrømning enn klorfumigering. Generelt brukes to forskjellige metoder som bruker flytende reagenser ofte. En i stor grad brukt metode er basert på vask med etanol og blekemiddel ved forskjellige konsentrasjoner i forskjellig varighet av tid20,21. En annen metode er basert på bruk av blekemiddel bare21,22. Begge metodene brukes hovedsakelig til småskala frøoverflatesterilisering. I mange eksperimenter er det imidlertid nødvendig å screene mange Arabidopsis transgene linjer avledet fra en transformasjon15,23 eller skjerm parallelt mange transgene linjer generert fra forskjellige transformasjoner24,25. Så vidt vi vet, er det ikke publisert noen væskebasert metode for høygjennomstrømning av frøoverflatesterilisering, noe som utgjør, selv om den er lite anerkjent, en viktig flaskehals for funksjonelle genomiske tilnærminger. Derfor er utvikling av sikre, robuste og høygjennomstrømningsmetoder for frøoverflatesterilisering et nødvendig og kritisk skritt mot suksessen til funksjonell karakterisering av mange gener samtidig.
For dette formål, i den nåværende studien, presenteres en forbedret metode for overflatesterilisering av Arabidopsis frø. Denne metoden er trygg, rimelig, svært robust og høy gjennomstrømning, slik at håndtering av 96 uavhengige linjer innen en time fra begynnelsen av frøoverflatesterilisering til slutten av frøsåing i Petri-retter. Metoden som demonstreres er avhengig av allment tilgjengelig, grunnleggende laboratorieinstrumentering som en vakuumpumpe, forbruksglass og plastvarer. Denne forbedrede metoden gir det vitenskapelige samfunnet en trygg, enkel og rimelig tilnærming for å effektivisere frøoverflatesterilisering med en gjennomstrømning som er tilstrekkelig til moderne funksjonelle genomiske tilnærminger i Arabidopsis og andre ikke-modell plantearter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Reagenser og medieforberedelse
- Forbered 70% etanolløsning: Tilsett 737 ml 95% teknisk etanol til 263 ml destillert vann. Bland grundig.
MERK: Klargjør 70 % etanoloppløsning på en ikke-steril arbeidsbenk.
FORSIKTIG: Etanol er svært brannfarlig og kan forårsake alvorlig irritasjon i øynene. Holdes unna flammer og varmekilder. Ved kontakt med øynene, skyll med rikelig vann. - Forbered 5% blekemiddeloppløsning: Tilsett 5 ml husholdningsblekemiddel (inneholder ~ 3,5% natriumhypokloritt, NaClO) til 95 ml sterilt destillert vann. Tilsett noen dråper ikke-ionisk vaskemiddel (f.eks. Tween 20) og bland grundig.
MERK: Forbered 5% blekemiddeloppløsning inne i laminær hetten.
FORSIKTIG: Natriumhypokloritt, den aktive komponenten av blekemiddel, er svært irriterende. Det er svært korrosivt og kan forårsake alvorlige skader på mage-tarmkanalen. Ved kontakt, skyll umiddelbart med rikelig vann. Ved inntak, ring giftkontrollsenteret eller en medisinsk lege for behandlingsråd. - Forbered halv styrke Murashige og Skoog (1/2 MS) medium26.
- Tilsett 2,2 g MS middels pulver (inkludert vitaminer) og 10 g sukrose i 800 ml destillert vann. Juster pH-en til løsningen ved hjelp av 1 M KOH og ta volumet opp til 1 L ved hjelp av destillert vann. Aliquot 500 ml i en 1 L flaske og tilsett 4g agar for å forberede et solid medium. Autoklaver løsningen.
- Etter autoklavering, avkjøl mediet til 50-53 °C i et vannbad og hell det i Petri-retter under laminær strømningshette. For å forberede det selektive mediet, tilsett 1000 μL/L 50 mg/ml kanamycinoppløsning (bland 500 mg Kanamycinsulfatmonohydrat i 10 ml destillert vann, filtrer steriliser og oppbevar ved -20 °C) til mediet (50-53 °C). Bland godt ved å virvle, og hell i Petri-retter som nevnt tidligere.
2. Aspirator oppsett
MERK: Instrumentoppsettet er oppsummert i figur 1.
- Koble vakuumpumpeinntaket til den ene enden av et polyetylenrør (PE) av passende størrelse. Koble den andre enden av røret til utløpet av det toveis lokket på dekanteringsflasken. Vikle slangens veikryss tett med en tetningsfilm (Tabell over materialer) for å sikre lufttett tilkobling.
- Koble et annet PE-rør til innløpet (hullet som stikker ut til innsiden av flasken) på skruehetten på dekanteringsflasken. Monter den andre siden av røret til utløpet av en akvarieventil. Om nødvendig, pakk med en tetningsfilm langs krysset for å eliminere luftlekkasje.
- Rett før bruk monteres en steril pipettespiss på 200 μL til innløpet til akvariefilteret under laminær strømningshette.
Figur 1: Skjematisk tegning av sugeanordningen for fjerning av steriliseringsvæsker med høy gjennomstrømning. For klarhet er de enkelte delene ikke trukket til skala. BokstavA) angir vakuumpumpen, (B) reservoarflasken for å samle væsker (etanol, blekemiddel eller sterilt vann), (C) ventilen for å unngå refluks av væskene, (D) den sterile 200 μL pipettespissen, og (E) det 1,5 ml mikrosenterfugerøret som inneholder frø og steriliseringsvæske. Pilene angir luftstrømmens retning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
3. Høy gjennomstrømning flytende overflatesterilisering av frø
MERK: Den generelle prosedyren og minimal tid som kreves for overflatesterilisering av Arabidopsis thaliana (L.) Heynh wild-type (Col-0) (Arabidopsis) frø med 96 uavhengige prøver er oppsummert i figur 2.
- Etikett med en permanent markør to satser på 48 x 1,5 ml mikrosenterrør med progressive tall.
- Tilsett 100-200 Arabidopsis frø til hver av de 96 sterile 1,5 ml mikrocentrifugerørene (omtrent 1-2 mm over bunnen av den koniske enden av røret).
- Aliquot rundt 1000 μL 70% etanol i hvert rør ved hjelp av en 10 ml steril serologisk pipette inne i laminær strømningshette (frø batch en, 48 rør) og lukk forsiktig dekslene.
MERK: Utlevering av løsningene trenger ikke å være ekstremt nøyaktig, så lenge det dispenserte volumet er flere ganger høyere enn volumet av frø. Alternativt kan du utføre dette trinnet utenfor laminær hetten (ikke-steril tilstand). - Rist rørene med en oscillasjonsfrekvens på 8,0 Hz i minst 3 minutter i en shaker.
- Fjern adapterne fra shakeren og overfør dem i kurven på en stasjonær mikrosenter.
- Spinn raskt ned frøene ved hjelp av pulsfunksjonen (finnes i de fleste sentrifuger på benken) for å nå 1880 x g (~ 15 s).
MERK: Lengre tid eller høyere sentrifugeringskrefter påvirker frøspredning negativt. - Overfør de 48 rørene fra adapterne til ett stativ og åpne alle rør under laminær strømningshette. Unngå forurensninger ved ikke å berøre den delen av dekslene som passer inn i rørene. Hvis lokkene er for nær hverandre, del rørene i to stativer for enklere håndtering.
- Monter en steril 200 μL gul spiss på akvariet ventilinntaket til den hjemmelagde aspiratoren under laminær strømningshette og slå på pumpen.
- Sett inn den gule spissen like over frønivået for å unngå å berøre frøene når du suger væsken. Alternativt kan du raskt plassere spissen nederst på røret; Hvis et frø blokkerer væskens sug, eliminerer du den gule spissen og setter inn en ny.
- Aliquot inn i hvert rør rundt 1000 μL 5% blekemiddel ved hjelp av en 10 ml steril serologisk pipette inne i laminær strømningshette.
- Lukk alle lokkene tett og legg alle rørene tilbake i shakeradapterne. Rist rørene med en oscillasjonsfrekvens på 8,0 Hz i minst 3 minutter i shakeren.
- Spinn raskt ned frøene ved hjelp av pulsfunksjonen til benkeplaten sentrifuge i den tiden som er nødvendig for å nå 1880 x g (~ 15 s).
- Monter en ny steril 200 μL gul spiss på akvarieventilen som er koblet til vakuumpumpen under laminær strømningshette, og slå på pumpen.
- Sett inn den gule spissen over frønivået for å unngå å berøre frøene når du suger blekemiddeloppløsningen.
- Aliquot inn i hvert rør rundt 1000 μL sterilisert H2O ved hjelp av en 10 ml steril serologisk pipette i laminær strømningshette.
MERK: Kombiner de to frøene for å minimere driftstiden. - Monter en ny steril 200 μL gul spiss på akvarieventilen som er koblet til vakuumpumpen under laminær strømningshette og slå på pumpen.
- Sett inn den gule spissen like over frønivået for å unngå å berøre frøene når du suger H2O.
- Aliquot inn i hvert rør rundt 500 μL sterilisert H2O ved hjelp av en 10 ml steril serologisk pipette og lukk alle lokkene i laminær strømningshette. Frøene er klare til å bli sådd. Hold om nødvendig rørene ved romtemperatur i noen timer maksimalt eller ved 4 °C over natten.
- Fyll reservoarflasken som brukes til å samle væske med tilstrekkelig mengde vann og autoklaver den. Deretter kaster du væsken i en vanlig vask.
MERK: Autoklaver væsken for å drepe alle frøene inne i reservoaret.
Figur 2: Oversikt over prosedyren og minimal tid som kreves for overflatesterilisering av Arabidopsis frø med 96 uavhengige prøver. I det presenterte eksperimentet håndteres 96 uavhengige prøver i to like store partier. Hele prosedyren er den samme for begge partiene, og de behandles parallelt, men gruppe to behandles med ett trinns forsinkelse sammenlignet med satsvis forsinkelse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
4. Plating og scoring av Arabidopsis på 1/2 MS-plater
- Overfør frøene og 300-400 μL steril H2O til en Petri-tallerken ved forsiktig pipettering med en 1000 μL pipette.
- Etter overføring av 10 rør, hell i hver plate rundt 1,5-2,0 ml smeltet 1/2 MS medium uten antibiotika.
MERK: Smelt på forhånd og hold deretter det 1/2 MS smeltede mediet i et termostatbad satt til 50-53 °C for å unngå størkning. Sørg for at temperaturen ikke overstiger 58 °C for å unngå å redusere frøenes spiringsevne. - Virvle raskt platen for å distribuere frøene inne i den. Tape platene på motsatte sider.
- Pakk platene i en plast- eller aluminiumsfolie og legg dem deretter i kjøleskap (4 °C) i 3 dager i mørket for å oppnå jevn spiring.
- Overfør platene til et vekstkammer satt til 23 °C under lange dagers forhold (16 t lys/8 t mørkt) med en lysintensitet på 100-120 μmol·m-2·s-1 og 60% relativ fuktighet.
- Etter to dager, score plantene ved tilstedeværelse av radicles. Oppdag radicle fremveksten og grønn cotyledon formasjon (full åpning av de to cotyledons) for å evaluere frø spiring.
5. Statistiske analyser
MERK: Her ble Tukeys parvisetest brukt til statistiske analyser.
- Se på P-verdiene under 0,01 som statistisk signifikante. Utfør alle forsøkene minst med fem biologiske repliker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å vurdere tiden som kreves for hele frøsteriliseringsprosedyren, ble tidsforskjellene for væskehåndtering 96 prøver i den nåværende protokollen beregnet og sammenlignet med tradisjonelle pipetteringsmetoder. Resultatet indikerer at den gjeldende protokollen sparer tid, og kutter væskehåndteringstiden til en fjerdedel av den med de tradisjonelle protokollene (Tabell 1). Tabellen fremhever videre at væskefjerningstiden i den nåværende protokollen sparer mer tid enn de tradisjonelle metodene, med en samlet reduksjon på åtte ganger.
Valg av tidsrom for frøsterilisering
Lengre steriliseringstrinn minimerer forurensningshastigheten, men kan påvirke frøspredningen negativt. For å bestemme det beste tidsområdet for frøsterilisering med de høyeste spiringsratene uten forurensning, ble forskjellige varigheter av hvert steriliseringstrinn testet, og vurderte både frøspredning og grønne cotyledon-fremveksten. Spiringsanalysene utført fra dag 2 til dag 4 og på dag 7 indikerte ingen signifikante forskjeller mellom tidsintervallet fra 10 min til 40 min 70% etanolsterilisering. Fra 40 min behandling med 70 % etanol gikk imidlertid spiringsraten ned (figur 3). Tilsvarende gikk de grønne cotyledon-fremveksten ned (figur 4). Ettersom kortere steriliseringstider kan øke gjennomstrømningen, men øke forurensningsraten, ble den minimale tiden som trengs for å sterilisere 96 forskjellige frøprøver i to grupper på 48 prøver vurdert. I tillegg, gitt det foretrukne oppsettet med risting utført i en shaker, testet vi den minimale tiden som trengs for frøsterilisering ved å håndtere 96 prøver i to grupper på 48 prøver hver. Den minimale tiden som kreves for å håndtere 48 prøver samtidig var 3 min, slik at det andre settet med 48 prøver kunne behandles umiddelbart etter det første settet uten ventetid. Dermed ble 3 min for 70% etanol og 3 min i 5% blekemiddel påført som minimumstid for sterilisering av frøene (punkt (a) i figur 3). Disse analysene resulterte i spiringsrater som ligner de høyeste uten forurensning og tap av frø vitalitet (Figur 3).
Oppsummert er de egnede tidsområdene for å opprettholde den høyeste prosentandelen av frøspredning uten forurensning avledet fra tilstrekkelig eliminering av mikroorganismer mellom 3-30 min i 70% etanol og mellom 3-22,5 min for 5% blekemiddel.
For å demonstrere at frøene vi brukte opprinnelig var forurenset med mikroorganismer, ble de ikke-sterile frøene sådd direkte på MS-plater. Sopp dukket opp på platene etter to-dagers såing og spredt over platene etter syv-dagers spiring (Supplemental Figure 1).
Evaluering av krysskontaminering mellom ulike genotyper av frø
For å sjekke om bruk av en enkelt steril pipettespiss for å behandle forskjellige frøprøver kan resultere i krysskontaminering og for å vurdere mengden av slik krysskontaminering, ble to forskjellige genotyper av frø (Col-0 wild-type, følsom for kanamycin og Arabidopsis transgen linje AdoIspS-79, motstandsdyktig mot kanamycin24) vekslet under steriliseringsprosedyren. Etter standard frøsterilisering ble de sådd i halvfaste MS solide plater supplert uten eller med 50 mg/l kanamycin. Eksperimentene ble replikert fem ganger. Disse analysene indikerte at rundt 96% av frøene spiret i MS-plater som inneholder kanamycin, men ingen grønne cotyledoner ble observert på den7. Parallelt viste Col-0 frø sådd i MS-plater rundt 94% spiring, og alle cotyledoner var grønne etter 7-dagers spiring. Disse resultatene indikerer ingen overføring av forurensning mellom prøver til tross for bruk av en enkelt pipettespiss for å fjerne den sterile løsningen.
Figur 3: Frøspredningsprosent etter 2-, 3-, 4- og 7-dagers arabidopsisfrø såing med forskjellige steriliseringstider angitt med forskjellige bokstaver. a: 3 min 70% etanol og 3 min 5% blekemiddel, b: 10 min 70% etanol og 7,5 min 5% blekemiddel, c: 20 min 70% etanol og 15 min 5% blekemiddel, d: 30 min 70% etanol og 22,5 min 5% blekemiddel, e: 40 min 70% etanol og 30 min 5% blekemiddel, e: 40 min 70% etanol og 30 min 5% blekemiddel, e: 40 min 70% etanol og 30 min 5% blekemiddel, e: 40 min 70% etanol og 30 min 5% blekemiddel, e: 40 min 70% etanol og 30 min 5% blekemiddel, e: 40 min 70% etanol og 30 min 5% blekemiddel, e: 40 min 70% etanol og 30 min 5% blekemiddel, e: 40 min 70% etanol og 30 min 5% blekemiddel, e: 40 min 70% etanol og 30 min 5% blekemiddel, e: 40 min 70% etan f: 50 min 70% etanol og 37,5 min 5% blekemiddel, g: 70 min 70% etanol og 52,5 min 5% blekemiddel. To stjerner indikerer signifikante forskjeller i henhold til Tukeys parvise test (p < 0,01). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Grønn cotyledonprosent etter 7-dagers arabidopsisfrø såing med forskjellige steriliseringstider angitt med forskjellige bokstaver. a: 3 min 70% etanol og 3 min 5% blekemiddel, b: 10 min 70% etanol og 7,5 min 5% blekemiddel, c: 20 min 70% etanol og 15 min 5% blekemiddel, d: 30 min 70% etanol og 22,5 min 5% blekemiddel, e: 40 min 70% etanol og 30 min 5% blekemiddel, e: 40 min 70% etanol og 30 min 5% blekemiddel, e: 40 min 70% etanol og 30 min 5% blekemiddel, e: 40 min 70% etanol og 30 min 5% blekemiddel, e: 40 min 70% etanol og 30 min 5% blekemiddel, e: 40 min 70% etanol og 30 min 5% blekemiddel, e: 40 min 70% etanol og 30 min 5% blekemiddel, e: 40 min 70% etanol og 30 min 5% blekemiddel, e: 40 min 70% etanol og 30 min 5% blekemiddel, e: 40 min 70% etan f: 50 min 70% etanol og 37,5 min 5% blekemiddel, g: 70 min 70% etanol og 52,5 min 5% blekemiddel. To stjerner indikerer signifikante forskjeller i henhold til Tukeys parvise test (p < 0,01). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Krysskontamineringsanalyse mellom col-0 villtype og AdoIspS-79 frø. Kol-0 spiring i halv styrke MS-plater (venstre), Col-0 i halv styrke MS plate supplert med 50 mg / L kanamycin (midten) og AdoIspS-79 i halv styrke MS plate supplert med 50 mg / L kanamycin (høyre), scalebar = 1 cm. Et representativt bilde av en av de fem replikeringene vises i figuren. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Prosedyre | Gjeldende protokoll (min) | Tradisjonell pipettering (min) |
| Tilsett væske 1 | 12 | 24 |
| Fjerne væske 1 | 6 | 48 |
| TOTAL | 18 | 72 |
Tabell 1: Oppsummering av den minimale tiden som kreves for væskehåndtering under sterilisering av 96 frøprøver. Tabellen viser den totale tiden (min) som kreves for å legge til og fjerne væsken gjennom hovedtrinnene for frøoverflatesterilisering ved hjelp av gjeldende protokoll og en protokoll der tradisjonell pipettering brukes.
Supplerende figur 1: Forurensningsdeteksjon etter 7-dagers arabidopsisfrøsåing. Bildet viser graden av forurensning av ikke-sterile frø (skyllet med vann; venstre) og sterile frø (utsatt for overflatesterilisering som beskrevet i hovedteksten; høyre). Scalebar = 1 cm. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sterilisering av frø er det grunnleggende trinnet for funksjonelle studier i Arabidopsis. Selv om det ofte utføres for mange forskjellige formål, er begrensede studier på høygjennomstrømning frø overflatesterilisering i Arabidopsis tilgjengelig.
Så langt bruker en av metodene med høyest gjennomstrømning klorgass generert ved å blande blekemiddel med konsentrert HCl. Selv om denne metoden krever begrenset praktisk tid, bruker den en gass som er svært giftig for mennesker27. I tillegg må antall frø som skal overflatesteriliseres og varigheten av overflatefrøsterilisering kontrolleres nøye. Hvis frøene er for mange, vil doseringen av klorgass ikke være tilstrekkelig til å fullstendig drepe mikroorganismer som er tilstede på frøbelegget, noe som resulterer i utbredt forurensning av frøpartiene. På den annen side, hvis varigheten av overflatesterilisering er for lang, vil frøene bli drept. Til tross for noen fordeler er fumigering derfor ikke favorittmetoden for frøoverflatesterilisering i Arabidopsis.
Til sammenligning er det en rekke væskebaserte metoder for overflatesterilisering av Arabidopsis frø tilgjengelig28,29,30. Hovedbegrensningen for disse metodene er imidlertid at de utelukkende kan brukes til et lavt antall prøver, og de er ikke optimalisert for gjennomstrømning. Så vidt vi vet, ble den eneste studien om høygjennomstrømning overflatesterilisering av Arabidopsis frø beskrevet av Lindsey, B. E. et al.31. I denne studien foreslo forfatterne to forskjellige metoder. I tillegg til en tilnærming med klorgass nevnt ovenfor, foreslo forfatterne en væskebasert overflatesteriliseringsmetode ved hjelp av en konsentrert blekemiddelløsning påført for 5-10 min sterilisering. Selv om denne metoden ga den første systematiske studien for overflatefrøsterilisering med forskjellige konsentrasjoner av blekemiddel for forskjellige tider og analysert den tilsvarende utgangen, kan protokollen fortsatt forbedres. Først av alt brukte denne metoden svært konsentrert blekemiddel, noe som kan være skadelig for operatøren og miljøet. For det andre, på grunn av bruken av høyt konsentrert blekemiddel, er den beste frøoverflatesteriliseringstidspunktet bare mellom 5-10 min, og gir dermed et smalt tidsvindu for ferdigstillelse av protokollen. I tillegg, for å eliminere blekemiddelet, var det nødvendig med mange vasketrinn, noe som gjorde protokollen både tids- og arbeidsintensiv og begrenset gjennomstrømningen i et så kort tidsområde av overflatesteriliseringstrinnet.
For å overvinne alle disse begrensningene og kombinere de beste aspektene ved tidligere verk, ble metoden beskrevet her utført med 70% teknisk etanol etterfulgt av et ytterligere skritt med en lav prosentandel blekemiddel (5%) som reduserte toksisiteten og de arbeidsintensive vasketrinnene. I tillegg ga de systematiske analysene av frøspredning et bredere tidsområde mellom 3-30 min for frøoverflatesterilisering uten å påvirke spiringshastighetene. Dette gir høyere fleksibilitet til å organisere arbeidsflyten, slik at den kan regulere overflatesteriliseringstiden i henhold til samtidig arbeid. Enda viktigere er at den arbeidsintensive pipetteringsprosedyren ble erstattet av flere dispensering med en serologisk pipette for å legge til væskene, og viktigst av alt, ved en veldig rask aspirasjonsmetode assistert av en enkel, men ytelsesmessig hjemmelaget sugeenhet som ikke krever tipsutveksling mellom prøver. Gitt tilstedeværelsen av en reservoarflaske, ble det ikke observert krysskontaminering blant linjer eksperimentelt, da frø som utilsiktet kan aspireres med pipettespissen, dekanteres i flasken. Ventilen som brukes som adapter mellom den sterile spissen og slangen ble spesielt valgt for å garantere at væsken aspireres inn i oppsamlingsflasken uten å strømme tilbake til røret som inneholder frø. Dermed forbedret denne metoden frøoverflatens steriliseringsprosedyre dramatisk med enkel håndtering og tidsbesparende.
Til slutt gir denne protokollen det vitenskapelige samfunnet en trygg, svært tidsfleksibel, lavarbeid og tidsbesparende tilnærming for overflatesterilisering av Arabidopsis frø, som er billig og enkelt satt opp i ethvert laboratorium. Videre kan metoden også brukes på overflatesterilisering av andre typer små frø ved til slutt å endre den sterile spissen, adapteren og slangen i henhold til frøstørrelsene. Spesielt ble denne metoden vellykket brukt uten modifikasjon for flere Brassicaceae-arter (f.eks. cardamin utålmodige L., Berteroa incana (L.) DC., Capsella bursa-pastoris (L.) Medicus, Alliaria petiolata (M. Bieberstein) Cavara et Grande, etc.), samt for Nicotiana benthamiana Domin og Nicotiana tabacum L. frø. Metoden kan også brukes på enda mindre frø, som orkideer, så lenge presis bestemmelse av hastighet / tid for sentrifugering og lengde på overflatesteriliseringsbehandling kan etableres32.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfattere erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Denne forskningen ble finansiert av den autonome provinsen Trento gjennom kjernefinansiering av Ecogenomics-gruppen av Fondazione E. Mach.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aquarium valve | Amazon | B074CYC5SD | Kit including 2 valves and thin-walled tubings. The valve prevents the liquids to go back to the sterile tip |
| Arabidopsis Col-0 wild-type seeds | Nottingham Arabidopsis Stock Center | N1093 | Wild type seeds (sensitive to kanamycin) |
| Arabidopsis transgenic line AdoIspS-79 seeds | NA | NA | Transgenic line overexpressing an isoprene synthase gene from Arundo donax transformed in the Col-0 background, resistant to kanamycin (Li et al. (2017) Mol. Biol. Evol., 34, 2583–2599). Available on request from the authors |
| Microcentrifuge | Eppendorf | EP022628188 | Benchtop microcentrifuge used for spinning down the seeds |
| Murashige & Skoog medium including vitamins | Duchefa | M0222 | Standard medium for plant sterile culture |
| Pipette controller | Brand | 26300 | Used to operate the serological pipette |
| Polyethylene tube 1 | Roth | 9591.1 | Tube for connection from vacuum pump to decantation bottle (inner diameter: 7 mm; outer diameter: 9 mm) |
| Polyethylene tube 2 | Roth | 9587.1 | Tube for connection from decantation bottle to the aquarium valve (inner diameter: 5 mm; outer diameter: 7 mm) |
| Screw cap with connectors | Roth | PY86.1 | 2-way dispenser screw cap GL45 in polypropylene for decanting bottle |
| Serological pipette | Brand | 27823 | Graduated glass (reusable) serological pipette. Disposable pipettes can be used instead |
| Shakeret al. | Qiagen | 85300 | TissueLyser II bead mill used normally for tissue homogenization. Without the addition of beads to the tubes it works as shaker. |
| Technical ethanol | ITW Reagents (Nova Chimica Srl) | 212800 | Ethanol 96% v/v partially denatured technical grade |
| Tween 20 | Merck Millipore | 655205 | Non-ionic detergent acting as surfactant |
| Universal tubing connectors | Roth | Y523.1 | Can be used to improve/simplify tubing connections |
| Vacuum pump | Merck Millipore | WP6222050 | Used for making the suction device |
References
- Somerville, C., Koornneef, M. A fortunate choice: The history of Arabidopsis as a model plant. Nature Reviews Genetics. 3 (11), 883-889 (2002).
- Koornneef, M., Meinke, D. The development of Arabidopsis as a model plant. Plant Journal. 61 (6), 909-921 (2010).
- Initiative, T. A. G. Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana. Nature. 408 (6814), 796-815 (2000).
- Krysan, P. J., Young, J. C., Sussman, M. R. T-DNA as an insertional mutagen in Arabidopsis. Plant Cell. 11 (12), 2283-2290 (1999).
- Speulman, E., et al. A two-component enhancer-inhibitor transposon mutagenesis system for functional analysis of the arabidopsis genome. Plant Cell. 11 (10), 1853-1866 (1999).
- Jander, G., et al. Ethylmethanesulfonate saturation mutagenesis in Arabidopsis to determine frequency of herbicide resistance. Plant Physiology. 131 (1), 139-146 (2003).
- Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. -S., Niu, Q. -W., Chua, N. -H. Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nature Protocols. 1 (2), 641-646 (2006).
- Togninalli, M., et al. AraPheno and the AraGWAS catalog 2020: A major database update including RNA-Seq and knock-out mutation data for Arabidopsis thaliana. Nucleic Acids Research. 48 (1), 1063-1068 (2020).
- Lan, Y., et al. AtMAD: Arabidopsis thaliana multi-omics association database. Nucleic Acids Research. 49 (1), 1445-1451 (2021).
- Xu, J., Trainotti, L., Li, M., Varotto, C. Overexpression of isoprene synthase affects ABA-and drought-related gene expression and enhances tolerance to abiotic stress. International Journal of Molecular Sciences. 21 (12), 1-21 (2020).
- Czarnecki, O., et al. Simultaneous knock-down of six non-family genes using a single synthetic RNAi fragment in Arabidopsis thaliana. Plant Methods. 12 (1), 1-11 (2016).
- Yan, L., et al. high-efficiency genome editing in arabidopsis using YAO promoter-driven CRISPR/Cas9 system. Molecular Plant. 8 (12), 1820-1823 (2015).
- Liu, Y., Gao, Y., Gao, Y., Zhang, Q. Targeted deletion of floral development genes in Arabidopsis with CRISPR/Cas9 using the RNA endoribonuclease Csy4 processing system. Horticulture Research. 6 (1), (2019).
- Grefen, C., et al. Subcellular localization and in vivo interactions of the Arabidopsis thaliana ethylene receptor family members. Molecular Plant. 1 (2), 308-320 (2008).
- Gazzani, S., et al.
- Lee, S., Korban, S. S. Transcriptional regulation of Arabidopsis thaliana phytochelatin synthase (AtPCS1) by cadmium during early stages of plant development. Planta. 215 (4), 689-693 (2002).
- Long, Y., et al. In vivo FRET-FLIM reveals cell-type-specific protein interactions in Arabidopsis roots. Nature. 548 (7665), 97-102 (2017).
- Freire-Rios, A., et al. Architecture of DNA elements mediating ARF transcription factor binding and auxin-responsive gene expression in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (39), 24557-24566 (2020).
- Rivero, L., et al. Handling arabidopsis plants: Growth, preservation of seeds, transformation, and genetic crosses. Methods in Molecular Biology. 1062, 3-25 (2014).
- Chen, J. H., et al. Drought and salt stress tolerance of an arabidopsis glutathione S-transferase U17 knock-out mutant are attributed to the combined effect of glutathione and abscisic acid. Plant Physiology. 158 (1), 340-351 (2012).
- Li, D. Z., et al. Comparative analysis of a large dataset indicates that internal transcribed spacer (ITS) should be incorporated into the core barcode for seed plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (49), 19641-19646 (2011).
- Mathur, J., Koncz, C. Establishment and maintenance of cell suspension cultures. Arabidopsis Protocols. Methods in Molecular Biology. 82, Humana Press. 27-30 (1998).
- Li, M., Cappellin, L., Xu, J., Biasioli, F., Varotto, C. High-throughput screening for in planta characterization of VOC biosynthetic genes by PTR-ToF-MS. Journal of Plant Research. 133 (1), 123-131 (2020).
- Li, M., et al. In planta recapitulation of isoprene synthase evolution from ocimene synthases. Molecular Biology and Evolution. 34 (10), 2583-2599 (2017).
- Li, M., et al. Evolution of isoprene emission in Arecaceae (palms). Evolutionary Applications. 14, 902-914 (2020).
- Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum. 15 (3), 473-497 (1962).
- Bent, A. Arabidopsis thaliana floral dip transformation method. Methods in Molecular Biology. 343, Clifton, N.J. 87-104 (2006).
- Lundberg, D. S., et al. Defining the core Arabidopsis thaliana root microbiome. Nature. 488 (7409), 86-90 (2012).
- Tkacz, A., Cheema, J., Chandra, G., Grant, A., Poole, P. S. Stability and succession of the rhizosphere microbiota depends upon plant type and soil composition. ISME Journal. 9 (11), 2349-2359 (2015).
- Singh, N., Gaddam, S. R., Singh, D., Trivedi, P. K. Regulation of arsenic stress response by ethylene biosynthesis and signaling in Arabidopsis thaliana. Environmental and Experimental Botany. 185, 104408 (2021).
- Lindsey, B. E., Rivero, L., Calhoun, C. S., Grotewold, E., Brkljacic, J. Standardized method for high-throughput sterilization of Arabidopsis seeds. Journal of Visualized Experiments: JOVE. (128), e56587 (2017).
- Acemi, A., Özen, F. Optimization of in vitro asymbiotic seed germination protocol for Serapias vomeracea. The EuroBiotech Journal. 3 (3), 143-151 (2019).
