Summary
Il presente protocollo descrive dettagli sperimentali concisi sulla valutazione e l'interpretazione dei dati di coppia in vivo ottenuti tramite stimolazione elettrica del nervo peroneale comune in suini anestetizzati.
Abstract
Una valutazione affidabile della forza muscolare scheletrica è probabilmente la misura di esito più importante negli studi sulle malattie neuromuscolari e muscoloscheletriche e sulle lesioni, in particolare quando si valuta l'efficacia delle terapie rigenerative. Inoltre, un aspetto critico della traduzione di molte terapie rigenerative è la dimostrazione di scalabilità ed efficacia in un modello animale di grandi dimensioni. Vari preparati fisiologici sono stati stabiliti per valutare le proprietà intrinseche della funzione muscolare negli studi scientifici di base, principalmente in modelli di piccoli animali. Le pratiche possono essere classificate come: in vitro (fibre isolate, fasci di fibre o muscolo intero), in situ (muscolo con vascolarizzazione e innervazione intatte ma tendine distale attaccato a un trasduttore di forza) e in vivo (le strutture del muscolo o dell'unità muscolare rimangono intatte). Ci sono punti di forza e di debolezza in ciascuno di questi preparativi; tuttavia, un chiaro vantaggio dei test di resistenza in vivo è la capacità di eseguire misurazioni ripetute nello stesso animale. Qui vengono presentati i materiali e i metodi per valutare in modo affidabile la coppia isometrica prodotta dai muscoli dorsiflessori posteriori in vivo in risposta alla stimolazione elettrica peroneale standard nei suini anestetizzati.
Introduction
La funzione primaria del muscolo scheletrico è quella di produrre forza, che alla fine rende possibili attività come respirare, mangiare e debulare. Le condizioni che riducono la capacità funzionale del muscolo scheletrico possono portare a una diminuzione delle prestazioni (professionali o sportive), disabilità o morte. Ad esempio, il mantenimento della massa muscolare e della funzione nelle popolazioni che invecchiano è positivamente associato alla qualità della vita e alla capacità di svolgere attività di base e strumentali della vita quotidiana 1,2. Inoltre, il declino della forza muscolare nei pazienti con distrofia muscolare di Duchenne provoca l'incapacità di deambulare e insufficienza respiratoria, contribuendo in ultima analisi alla mortalità prematura 3,4,5. Pertanto, la misurazione della forza muscolare è una misura di esito critico negli studi che coinvolgono malattie o lesioni neuromuscolari.
La coppia isometrica o isocinetica volontaria massima (e/o l'indice di fatica) è spesso usata come indice di capacità funzionale negli studi clinici6. Negli studi sugli animali, misurazioni analoghe possono essere effettuate in vivo utilizzando la stimolazione nervosa elettrica durante l'anestesia. In particolare, i preparati in vivo sono minimamente invasivi con muscolatura, tendini, vascolarizzazione e innervazione che rimangono intatti e quindi consentono ripetute valutazioni funzionali 7,8,9,10,11. Questa preparazione è comunemente usata nei modelli di piccoli roditori e in misura minore nei modelli animali più grandi come conigli12, cani13,14, pecore15 e maiali16,17. L'uso generale di tale metodologia potrebbe avere un impatto su molti studi di ricerca traslazionale, come nei modelli geneticamente modificati di atrofia muscolare spinale (SMA) suina (suino)18. Qui vengono presentati i metodi per valutare la coppia isometrica massima indotta dalla stimolazione nervosa del gruppo muscolare dorsiflessore suino in vivo. Le tecniche presentate sono state inizialmente adattate da quelle sviluppate originariamente per valutare la coppia del muscolo crurale anteriore del topo19,20 e successivamente perfezionate attraverso l'esperienza nello studio della capacità di produzione di coppia a seguito di lesioni 17,21,22,23,24,25,26,27,28 e durante lo sviluppo16 in vari modelli suini.
Questo protocollo evidenzia la misurazione isometrica della coppia in vivo utilizzando una metodologia che richiede un computer integrato con una cella di carico e uno stimolatore elettrico. I metodi qui presentati utilizzano un apparato di prova swine isometrico della pedana integrato disponibile in commercio, un apparato di piattaforma e il software corrispondente (vedere Tabella dei materiali). Tuttavia, la metodologia può essere adattata per utilizzare altri software disponibili in commercio o su misura, dispositivi di acquisizione dati e stimolatori. Questi metodi sono destinati all'uso in una suite chirurgica dedicata agli animali di grandi dimensioni piena di attrezzature standard come: tavolo chirurgico di bloccaggio, secondo tavolo di bloccaggio di uguale altezza per la piattaforma di prova, ventilatore e dispositivi di monitoraggio e tappetino riscaldante o altri dispositivi per mantenere la temperatura corporea.
I seguenti membri del team sono necessari per condurre questi metodi: un tecnico di anestesia qualificato e due personale di studio per eseguire i test funzionali. Queste persone lavoreranno insieme per la stabilizzazione iniziale dell'arto sull'apparato della piattaforma. Quindi, uno dei due membri del personale sarà responsabile del posizionamento / posizionamento dell'elettrodo e l'altro per le applicazioni informatiche durante il test.
Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con la legge sul benessere degli animali, i regolamenti sul benessere degli animali e i principi della Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. Test precedenti hanno dimostrato che questi metodi sono affidabili26 e non hanno effetti negativi sulla salute o sulla funzione degli arti del maiale. I test sono stati condotti tutte le volte alla settimana senza eventi avversi23. Inoltre, i test pre e post-chirurgici durante lo stesso giorno possono essere eseguiti senza porre uno stress spiacevole sull'animale o indurre disfunzioni neuromuscolari.
1. Configurazione del computer
- Assicurarsi che la serie iniziale e la calibrazione dell'apparecchio e dei componenti siano eseguite secondo le specifiche di fabbricazione (vedere Tabella dei materiali). Si consiglia la calibrazione utilizzando un intervallo di pesi da 0,2-2,5 kg.
NOTA: la coppia viene misurata da un pedale di 140 mm (0,14 m) collegato a un sensore di coppia lineare con una capacità di 50 Newton metri (N·m). Il guadagno dello strumento è impostato per scalare a 25 N·m di capacità per impostazione predefinita per adattarsi meglio alla produzione di coppia prevista. La calibrazione viene eseguita applicando una massa nota (ad esempio, 1 kg) al pedale a una distanza nota (ad esempio, 100 mm dall'asse di rotazione) e calcolando la coppia. Ad esempio, 1 kg equivale a 9,806 N applicato a 0,1 m è 0,9806 N·m di coppia. È quindi possibile stabilire una relazione tra la coppia applicata al sensore di coppia e la corrispondente uscita di tensione da parte del sensore di coppia. I sensori di coppia dell'autore hanno confermato la linearità di questa relazione da 0,2-20 kg applicata a una particolare piastra di calibrazione di 40 cm. A causa della lunghezza del pedale standard, si consiglia un intervallo di calibrazione di 0,2-2,5 kg. Questo produce abbastanza segnale per calcolare il fattore di scala mediante regressione lineare. - Accendere il computer, lo stimolatore, il sistema di trasduttori e l'interfaccia analogico-digitale circa 30 minuti prima del test per consentire la stabilizzazione dei cambiamenti di materiale legati al calore che possono influire sulle proprietà elettriche. Selezionare il dispositivo di acquisizione dati (DAQ) appropriato e connesso.
- Impostare i parametri sperimentali nel software in base alle esigenze; il software consente un modello di studio salvato. Preparare l'impostazione dell'esperimento (ad esempio, modello di studio) per creare un nuovo studio utilizzando l'opzione Crea una nuova cartella di lavoro dello studio .
NOTA: i parametri sperimentali possono essere precaricati prima di iniziare lo studio, il che comporterà la richiesta di includere ulteriori informazioni specifiche sull'esperimento come sesso, massa corporea, data di nascita, punto temporale del test, gruppo di trattamento o variabili simili secondo necessità. I parametri di configurazione dello studio possono essere salvati e utilizzati in tutto l'esperimento. - Selezionare lo studio creato in precedenza all'inizio di ogni valutazione. Aggiungi un nuovo animale se questo è il primo test per il maiale da testare e segui il prompt per le variabili inserite nello studio.
- Fare clic su Prepara esperimento una volta pronto per iniziare lo studio, che sarà necessario per ottimizzare il posizionamento degli elettrodi. Fornire contrazioni ripetute al nervo determinando il posizionamento ottimale una volta posizionati gli elettrodi (vedere il passaggio 3.6.).
- Fare clic su Configura instant stim prima, quindi regolare la frequenza dell'impulso, la larghezza dell'impulso, il numero di impulsi, la frequenza del treno e il tempo di esecuzione.
- Quindi, fai clic su Instant Sim per fornire contrazioni ripetute. In alternativa, premere il pulsante trigger manuale sull'unità Stimolatore per dare manualmente una contrazione.
- Aprire il Live Data Monitor durante il protocollo di studio quando si è pronti per iniziare l'intero esperimento per consentire l'indagine / visualizzazione in tempo reale delle contrazioni. Fare clic su Esegui esperimento quando si è pronti per iniziare l'esperimento (dopo la preparazione degli animali, vedere il passaggio 2).
2. Preparazione e manutenzione dell'anestesia
- Suini maschi o femmine veloci, 40-90 kg, durante la notte prima dell'evento di anestesia, consentono l'acqua ad libitum. Ottenere e registrare il peso corporeo corretto del maiale il giorno della procedura.
- Indurre l'anestesia con iniezioni intramuscolari di tiletamina/zolzepam (Telazol, 4-6 mg/kg), xilazina (1-3 mg/kg) e propofol (2,6 mg/kg). Inizialmente mantenere con il 5% di isoflurano tramite maschera facciale.
- Intubare il maiale con un tubo endotracheale e posizionarlo su un ventilatore automatico. Mantenere il maiale alla pressione di picco a 20 cm H2O, un volume di marea iniziale di 10 ml / kg e velocità di respirazione a 8-12 respiri / min.
- Regolare l'impostazione del ventilatore per mantenere una PCO2 di fine marea di 40 ± 5 mmHg. Mantenere l'anestesia con 1% -3% di isoflurano nel 30% -37% di O2.
- Mantenere la temperatura corporea del maiale a 37 °C per tutta la durata del protocollo. Inserire la vena dell'orecchio e i cateteri Foley per la consegna dei liquidi e la raccolta delle urine, se necessario.
NOTA: L'uso dell'anestesia piana chirurgica impedirà contrazioni secondarie durante il test, in particolare dai muscoli glutei. - Monitorare la profondità dell'anestesia tramite riflesso oculare e posizione, mancanza di tono della mascella, frequenza cardiaca (intervallo 80-150 bpm), pressione sanguigna sistolica (intervallo 120-70 mmHg) o una combinazione di tutti questi segni.
- Preparare sia gli arti posteriori destro che sinistro una volta che il maiale è completamente anestetizzato e stabile pulendo prima gli arti con acqua e sapone per rimuovere eventuali detriti e poi radere i capelli dalla pelle. Prestare molta attenzione all'area laterale del ginocchio, che verrà utilizzata per il posizionamento dell'elettrodo in seguito.
- Trasportare il maiale su un tavolo chirurgico e posizionarlo saldamente in posizione supina. Posiziona il maiale verso il piede del tavolo con i muscoli glutei all'estremità del tavolo o leggermente sopra la fine del tavolo.
NOTA: Ciò consentirà al tavolo chirurgico e al tavolo che tiene l'apparato di prova di abut. - Estubare il maiale dopo il test e consentire loro di recuperare. Il cibo e l'acqua standard per suini dovrebbero essere sostituiti una volta che il maiale è completamente recuperato e può deambulare liberamente all'interno della gabbia.
NOTA: l'analgesia post-procedura non è necessaria per il solo test in vivo ; tuttavia, carprofene e/o buprenorfina SR possono essere forniti secondo raccomandazione veterinaria. È incoraggiata la consultazione con un veterinario locale. L'anestesia e i farmaci elencati qui sono solo a scopo indicativo e sono attualmente approvati presso l'Università del Minnesota. Il mantenimento dell'anestesia con isoflurano è stato scelto in base alla sua rapida insorgenza e offset e al suo impatto minimo sulla stimolazione nervosa in vivo evocata coppia29. Fare attenzione ad avere coerenza nei parametri di anestesia tra gli studi. Durante il protocollo, la valutazione e la registrazione dell'anestesia vengono condotte a intervalli di 15 minuti; la registrazione viene effettuata sulla base delle linee guida e dei requisiti locali del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) e del Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti (USDA).
3. Valutazione della coppia isometrica in vivo
- Posizionare il piede sulla pedana del trasduttore di forza. Utilizzare una benda coesiva flessibile per fissare il piede alla pedana.
NOTA: è necessario un intero ruolo per piede; idealmente, il ruolo di 4 pollici x 5 iarde è adeguato. - Tenere il piede in posizione sulla pedana con la caviglia in posizione neutra (A) e fissare il piede alla piastra avvolgendo la benda coesiva attorno al piede e alla piastra del piede nello stile di una nastratura alla caviglia a cestello chiuso (B).
NOTA: I due membri del personale di studio saranno tenuti a svolgere contemporaneamente i singoli compiti (A) e (B). - Posizionare la caviglia ad angolo retto una volta fissato il piede alla pedana, definita come 0° o neutra per riferimento di gradi di flessione plantare o dorsiflessione.
Figura 1: Le immagini da vari punti di osservazione mostrano l'attaccamento del maiale alla pedana e l'allineamento anatomico sul telaio. Si notano punti di riferimento anatomici per i muscoli del compartimento anteriore, la testa fibulare, il ginocchio, il plateau tibiale e il femore. Si noti il posizionamento di coppie di elettrodi subdermici sul lato laterale della gamba. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
- Stabilizzare il ginocchio e la caviglia ad angolo retto.
- Innanzitutto, posizionare le barre di serraggio degli arti vicino alle posizioni necessarie. Quando è pronto, iniziando dall'aspetto mediale dell'arto, allineare la barra di serraggio dell'arto a circa l'altopiano tibiale.
- Quindi, allineare la barra di serraggio dell'arto laterale alla testa distale del femore.
NOTA: Tra l'estremità di ogni arto, la barra di serraggio utilizza un tampone di garza 4 x 4 piegato per proteggere la pelle adiacente alla barra. - Stabilizzare saldamente le barre utilizzando le viti a pollice di bloccaggio.
NOTA: Le barre di serraggio degli arti non saranno in linea tra loro ma si allineeranno con l'anatomia del maiale. - Pulire la pelle intorno alla testa fibulare applicando il 70% di alcol tramite una garza pulita in cerchi concentrici a partire dal centro del posizionamento dell'elettrodo previsto e spostandosi verso l'esterno. Posizionare l'ago percutaneo sterile (50 mm, 26 G monopolare) e gli elettrodi di tipo elettromiografico (EMG) (vedere Tabella dei materiali) sul nervo peroneale. Impiantare elettrodi per via subdermica, circa 5-10 mm.
- Ottimizzare il posizionamento dell'elettrodo utilizzando ampiezze di corrente crescenti, regolate sullo stimolatore. Iniziare a 100 mA e aumentare secondo necessità.
NOTA: 300-500 mA sono solitamente necessari per la coppia di contrazione di picco. - Visualizza la magnitudine della coppia di contrazione sulla vista dei dati in tempo reale e sul compartimento anteriore del maiale; anche gli zoccoli possono ondeggiare e muoversi verso l'alto.
- Assicurarsi che il compartimento posteriore, o nervo tibiale, non sia attivato durante la stimolazione. Ispezionare visivamente e palpare la contrazione del compartimento posteriore e il movimento verso il basso degli zoccoli durante la stimolazione.
- Ispezionare la regione di plateau della contrazione tetanica dal tracciamento del tempo di coppia vivo nei passaggi seguenti per la mancanza di reclutamento muscolare antagonista (cioè flessione plantare per questo protocollo).
- Ottenere la massima coppia teometrica isometrica utilizzando i seguenti parametri di stimolazione: 100 Hz, larghezza di impulso di 0,1 ms, oltre un treno di 800 ms17, una volta ottimizzato il posizionamento dell'elettrodo e le ampiezze di stimolazione.
NOTA: questi parametri possono essere utilizzati per varie valutazioni contrattili.
4. Protocollo per l'analisi dell'angolo coppia-giunto
- Misurare la coppia tetanica isometrica massima in una gamma di posizioni della caviglia che vanno dal neutro agli intervalli vicini di flessione plantare o 0-50 ° di flessione plantare.
NOTA: l'utilizzo di incrementi di 10° richiederà sei contrazioni e la modifica incrementale può essere regolata per domande sperimentali specifiche. - Iniziare ad allentare entrambe le viti di bloccaggio dello stadio del goniometro per spostarsi tra gli angoli di giunzione. Assicurarsi che entrambe le viti di bloccaggio siano serrate prima della contrazione successiva.
NOTA: Il goniometro è scritto con segni di gradi per consentire un allineamento preciso. È probabile 0° di flessione plantare, che è sfalsata di 180° sul goniometro. Prestare attenzione per garantire il posizionamento previsto. - Determinare sperimentalmente il tempo tra le contrazioni; tuttavia, 2 minuti sono sufficienti per evitare l'affaticamento.
NOTA: poiché l'angolo dell'articolazione della caviglia viene modificato in modo incrementale, gli elettrodi ad ago possono spostarsi. Potrebbe essere necessario confermare il posizionamento degli elettrodi con contrazioni a contrazione, come notato sopra (vedere il passaggio 3.8).
5. Protocollo per l'analisi coppia-frequenza
- Posizionare la caviglia all'angolo articolare desiderato. Avere cura, sperimentalmente, di condurre test allo stesso angolo di giunzione ogni volta.
NOTA: In genere, le analisi coppia-frequenza vengono eseguite a un singolo angolo di giunzione corrispondente alla coppia isometrica di picco derivata dall'analisi dell'angolo di coppia-giunto. La coppia di picco viene prodotta a ~ 30-35 ° di flessione plantare. - Misurare la coppia isometrica massima su una gamma di frequenze di stimolazione che inducono treni non fusi di contrazioni fino e oltre quelli che inducono tetani completamente fusi.
NOTA: questo può essere ottenuto stimolando a 10, 20, 40, 60 e 100 Hz (0,1 ms di larghezza di impulso; 800 ms di treno) con 2 minuti tra ogni contrazione per evitare affaticamento. A seconda delle domande sperimentali esatte e dei modelli suini specifici, le frequenze possono essere adattate. Il substrato bioenergetico più probabilmente utilizzato durante una contrazione di 800 ms per mantenere l'ATP intracellulare è la fosfocreatina30 e la risintesi della fosfocreatina si basa sulla navetta fosfocreatina31. La cinetica di recupero della fosfocreatina indica un recupero notevole del 90% o più tra 90-120 s dopo che la contrazione terminaa 30. Pertanto, gli intervalli di riposo raccomandati tra le contrazioni sono 90-120 s. Tuttavia, questo può essere influenzato da disegni sperimentali, tra cui malattie muscolari, lesioni e / o invecchiamento.
6. Analisi dei dati
- Fare clic su Analizza risultati se ancora nel software per aprire la finestra Analisi. In alternativa, aprire direttamente il programma di analisi.
- Che si tratti di una piattaforma dati automatizzata o di un'analisi manuale, calcolare le diverse variabili nell'analisi delle singole forme d'onda isometriche.
NOTA: Queste variabili includono: coppia di contrazione massima, coppia tetanica massima e proprietà contrattili relative a contrazioni e tetani, ad esempio tempo al picco e mezzo rilassamento. Molte variabili sperimentali possono normalizzare la forza, ad esempio il peso corporeo, il volume muscolare determinato dalla risonanza magnetica (risonanza magnetica) o dalla TC (tomografia computerizzata) o il peso muscolare terminale. Vengono presentate sia la coppia assoluta (N·m) che la coppia normalizzata alla massa corporea (N·m/kg). La coppia di riposo posizionata sulla pedana differirà tra gli esperimenti. È necessario applicare una correzione di base per la coppia a riposo per garantire che vengano registrate le vere contrazioni massime e le coppie tetaniche. La coppia di base a ciascun angolo di giunzione viene registrata e può indicare variazioni della coppia passiva.
Representative Results
L'affidabilità e l'ottimizzazione dei parametri di prova in vivo del compartimento anteriore del maiale sono state precedentemente riportate26. Sono stati riportati anche dati comparativi tra roditori e suini per la frequenza di coppia27.
Durante la valutazione in vivo , è necessaria la visualizzazione della forma d'onda della coppia in tempo reale per garantire un'adeguata attivazione del compartimento anteriore. Le forme d'onda dovrebbero riflettere solo la dorsiflessione. Le forme d'onda dovrebbero avere un aspetto liscio e arrotondato e un apparente plateau tetanico (Figura 2A). Incongruenze o perturbazioni della forma d'onda indicano varie limitazioni sperimentali, come una stimolazione inadeguata, un posizionamento improprio degli elettrodi o una profondità inadeguata dell'anestesia (Figura 2B).
La Figura 3A è un tracciamento del tempo di coppia a contrazione con una freccia che indica la coppia massima del 50%. La contrazione time-to-peak dovrebbe iniziare all'inizio dello stimolatore e terminare quando viene raggiunta la coppia massima di contrazione (le barre temporali rappresentative sono mostrate sotto il tracciamento). Il mezzo rilassamento per una contrazione dovrebbe iniziare alla coppia di contrazione massima e terminare al 50% della coppia di contrazione massima (le barre temporali rappresentative sono mostrate sotto il tracciamento). La Figura 3B è un tracciamento tetanico del tempo di coppia con una freccia che indica il 50% della coppia massima. A differenza delle contrazioni che sono ideali in termini di coppia massima definitiva e tempestiva, le contrazioni tetaniche hanno una maggiore variabilità nella fasatura della coppia massima per quanto riguarda quando lo stimolatore inizia e finisce, richiedendo un approccio più sfumato all'analisi della proprietà contrattile. La contrazione time-to-peak dovrebbe iniziare con l'avvio dello stimolatore e fermarsi da qualche parte tra il 90% e il 100% della coppia massima. Le barre temporali nella Figura 3B mostrano un limite di coppia massima del 95%. Ciò è utile in casi come i dati rappresentativi selezionati perché la coppia massima non viene raggiunta fino alla fine della fase di plateau. Un'analisi complementare al time-to-peak è il tasso medio di contrazione. Le barre tratteggiate sull'arto ascendente del tracciamento del tempo di coppia rappresentano un intervallo di coppia massima del 30% -70%. Il tasso medio di contrazione dovrebbe essere avviato all'inizio della stimolazione e catturare la variazione media della velocità tra il 30% e il 70% di coppia massima. Questi sono intervalli raccomandati e singoli gruppi di ricerca possono determinare l'intervallo ideale intorno al 50% (ad esempio, ±10%). La parte importante è essere coerenti all'interno e tra gli studi. In contrasto con la contrazione, il semi-rilassamento della contrazione tetanica dovrebbe iniziare alla fine della stimolazione invece della coppia massima per lo stesso motivo sopra menzionato con il time-to-peak. Le barre temporali nella Figura 3B rappresentano il tempo tra la fine della stimolazione e il raggiungimento del 50% di rilassamento. Un'analisi complementare al semi-rilassamento è il tasso medio di rilassamento. Le barre tratteggiate sull'arto discendente del torque-tracing rappresentano lo stesso intervallo di coppia massima del 30%-70% dell'arto ascendente. Il tasso medio di rilassamento dovrebbe iniziare alla fine della stimolazione e catturare il tasso medio di variazione tra il 30% e il 70% di coppia massima. Ancora una volta, questi sono intervalli consigliati. Una nota critica: non confondere il tasso medio di contrazione/rilassamento con il tasso massimo di contrazione/rilassamento. Il tasso massimo rappresenta la singola variazione di velocità più notevole tra due punti dati adiacenti e può essere ampiamente variabile.
Diverse proprietà di contrazione e contrattile possono essere analizzate per ottenere informazioni sul tipo di fibra e sugli attributi di accoppiamento eccitazione-contrazione dei muscoli scheletrici10,32. Si avverte un'interpretazione eccessiva delle proprietà di contrazione e contrattile; rappresentano suggerimenti e motivazioni per ulteriori interrogatori a livello cellulare e non sono necessariamente indicativi. In generale, i tassi di contrattilità possono riflettere il rilascio di calcio del reticolo sarcoplasmatico e il tasso enzimatico delle isoforme a catena pesante della miosina. Al contrario, i tassi di rilassamento possono riflettere la velocità dell'enzima ATPasi e l'isoforma del calcio del reticolo sarco(endo)plasmatico. Queste proprietà possono essere influenzate da affaticamento, danni muscolari, allenamento fisico e numerose patologie (ad esempio, atrofia da disuso).
La Figura 4 illustra i valori rappresentativi per le relazioni coppia-frequenza e coppia-angolo di giunzione per gli arti non danneggiati. Questi dati sono rappresentativi di un'ampia gamma di dimensioni di suini.
Un'analisi rappresentativa e sperimentale dell'EMG di superficie è stata condotta durante l'analisi muscolare in vivo (Figura 5) per dimostrare il controllo sperimentale della codifica della velocità e dell'attività muscolare totale. Gli elettrodi EMG adesivi sono stati posizionati a metà del perimetro del peroneo tertius. Un elettrodo di terra è stato posizionato sul ginocchio per ridurre al minimo l'artefatto di stimolazione e gli aghi dell'elettrodo di stimolazione sono stati posizionati attorno al nervo peroneale prossimale alla posizione muscolare. Le registrazioni simultanee di coppia ed EMG sono state effettuate a frequenze di stimolazione di 20, 60 e 100 Hz. Il numero di impulsi stimolatori (barre rosse nella Figura 5) riflette il quoziente della durata della stimolazione e del tempo tra gli impulsi. Ad esempio, una frequenza di stimolazione di 20 Hz significa un impulso ogni 50 ms; pertanto, la durata della stimolazione di 400 ms divisa per 50 ms tra gli impulsi equivale a otto impulsi erogati (Figura 5A). Gli impulsi stimolatori vengono erogati all'assone nervoso tramite il posizionamento dell'elettrodo ad ago percutaneo e producono un numero simile di impulsi muscolari elettrici (cioè 20 Hz equivale a 8 registrazioni EMG), dimostrando il controllo sperimentale della frequenza del potenziale d'azione del gruppo muscolare di interesse. Le registrazioni EMG grezze possono essere convertite tramite analisi root-mean-square (EMG RMS) per visualizzare l'attività muscolare totale con frequenza di stimolazione crescente. L'analisi dell'area sotto la curva (AUC) è un modo per quantificare l'EMG RMS per determinare i cambiamenti nell'intera attività muscolare. Vengono fornite AUC rappresentative per ogni frequenza di stimolazione EMG RMS (Figura 5A-C).
Figura 2: Forme d'onda rappresentative di alta e bassa qualità. (A) Forme d'onda isometriche presenti in un aspetto a onda quadra, con un notevole plateau fluido. (B) Le forme d'onda di bassa qualità possono essere dovute a una stimolazione inadeguata o a un posizionamento improprio degli elettrodi. In questi casi, è necessario riposizionare gli elettrodi. Sia per A che per B, sono indicati gli impulsi stimolatori (barre rosse). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Twitch e analisi delle proprietà contrattili tetaniche. (A) Le contrazioni rappresentative (1 Hz) e (B) tetaniche (100 Hz) di coppia-tempo sono modificate per dettagliare le proprietà contrattili. La freccia rossa su ogni grafico mostra il 50% di coppia massima. Le barre blu e nere sotto i tracciati mostrano rispettivamente la durata del tempo di picco e del tempo di mezzo rilassamento. Le barre tratteggiate sugli arti ascendenti e discendenti del tracciamento tetanico del tempo di coppia rappresentano un intervallo di coppia massima del 30% -70% che può essere utilizzato per determinare il tasso medio di contrazione o rilassamento. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Dati di esempio dell'angolo di coppia-giunto e della frequenza di coppia. I dati forniti provengono da una gamma di suini femmina della Yorkshire Cross a 2,9-6,3 mesi; 39,4-75,4 kg di massa corporea; tutti considerati un sano controllo al momento della valutazione. Durante tutti i test, la temperatura corporea interna è stata mantenuta a 37 °C. (A) La coppia normalizzata alla massa corporea viene valutata alle articolazioni della caviglia di 0-50 ° di flessione plantare; si noti che la coppia di picco è determinata a 30°. (B) La coppia normalizzata alla massa corporea viene valutata a varie frequenze di stimolazione da 10-100 Hz; si noti che queste valutazioni sono state condotte con l'articolazione della caviglia a 30° di flessione plantare. (C) Sono stati valutati i singoli tracciamenti della coppia per ciascuna delle frequenze di stimolazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Misurazioni simultanee isometriche in vivo della coppia e dell'EMG. Registrazioni simultanee di EMG e coppia a frequenze di stimolazione rappresentative di (A) 20, (B) 60 e (C) 100 Hz raccolte da una femmina di maiale dello Yorkshire (~ 90 kg di massa corporea). Gli impulsi dello stimolatore (barre rosse) sono stati erogati in base alla frequenza di stimolazione impostata. Le registrazioni EMG grezze sono state convertite in root-mean-square (EMG RMS) per visualizzare l'attività muscolare totale con frequenza di stimolazione crescente. Le curve EMG RMS rappresentative sono state analizzate per l'area sotto la curva (AUC) e le AUC sono fornite per ogni frequenza di stimolazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussion
Passaggi critici, modifiche e risoluzione dei problemi
Per ridurre al minimo la variabilità dei dati e massimizzare il successo dell'approccio, vengono evidenziati i seguenti passaggi critici.
Stimolazione nervosa ottimale
Questo approccio sperimentale inizia con la depolarizzazione degli assoni nervosi e si basa sul corretto posizionamento degli elettrodi e sulla stimolazione elettrica ottimizzata. Un'analisi post-mortem dell'anatomia nervosa correlata ai punti di riferimento ossei può aiutare a visualizzare il corretto posizionamento dell'elettrodo durante il test. L'acquisizione della coppia di contrazione massima aiuta a determinare la corrente appropriata (in milliampere; mA) erogata all'assone nervoso. Ci sono due valori da tenere a mente quando si ottimizza la stimolazione nervosa all'inizio del test: (1) il rapporto contrazione-tetanico è ~ 1: 5, ad esempio, ~ 2 N·m di coppia di contrazione corrisponde a una coppia tetanica di 10 N·m (Figura 3); e (2) la coppia tipica per la massa corporea è ~ 0,3 N·m per kg di massa corporea (Figura 4). Se le coppie di contrazione di picco appaiono basse, rimuovere gli elettrodi e tentare un altro posizionamento. Assicurarsi di controllare le impostazioni dello stimolatore, le connessioni BNC e le connessioni degli elettrodi. Il riposizionamento dell'elettrodo può essere necessario tra le contrazioni se c'è troppo movimento durante il posizionamento dell'arto tra gli angoli articolari, come notato sopra (Figura 2). Si prega di notare che gli approcci sperimentali e interventistici potrebbero avere un impatto su questi valori.
Corretto allineamento biomeccanico
La lunghezza muscolare iniziale influenza la forza contrattile muscolare (la relazione lunghezza-tensione) e la lunghezza muscolare può cambiare in base all'allineamento dell'articolazione dell'anca, del ginocchio e della caviglia. Gli angoli articolari devono essere standardizzati tra gli arti e tra i maiali. Un angolo di articolazione della caviglia di 90 ° è fortemente raccomandato per l'anca e il ginocchio. Una posizione della caviglia leggermente plantare (~ 30 ° dall'angolo neutro dell'articolazione della caviglia di 0 °) è ottimale per la forza di picco. Riflette la naturale posizione anatomica dell'articolazione della caviglia sia nei maiali che nei cani mentre si è in piedi. Tutti i giunti devono anche essere paralleli al pedale e ai torsiometri per evitare la perdita di coppia misurabile dovuta al contributo di un vettore di coppia perpendicolare. Si consiglia vivamente di ispezionare gli angoli dell'articolazione anca-ginocchio-caviglia e l'allineamento piede-pedale-articolazione dopo aver fissato il piede al pedale e aver fissato l'articolazione del ginocchio con le barre di bloccaggio degli arti (Figura 1). Se c'è un disallineamento, sbloccare e rimuovere le barre e riposizionare il maiale sul tavolo chirurgico. Mentre standardizzare gli angoli articolari tra gli studi è fondamentale per ridurre al minimo la varianza dei dati, ci sono limitazioni all'allineamento biomeccanico che sono notevoli, discusse di seguito.
Importanza rispetto ai metodi esistenti o alternativi
Esempi alterativi di valutazioni clinicamente rilevanti e non invasive della funzione muscolare che potrebbero essere utilizzate per i modelli suini includono la distanza a piedi del tapis roulant, l'EMG e l'elettrografia attiva dell'onda di taglio muscolare. Come il test di camminata di 6 minuti negli esseri umani, un test di camminata sul tapis roulant può valutare la progressione della malattia e il successo dell'intervento in animali di grandi dimensioni 33,34,35. Tipicamente, dopo un periodo di acclimatazione, gli animali vengono camminati fino alla fine della conformità a diverse velocità del tapis roulant e / o livelli di pendenza. Le ricompense alimentari sono spesso necessarie per raggiungere la massima motivazione. Tuttavia, i risultati della camminata sul tapis roulant offrono solo interpretazioni indirette della funzione contrattile muscolare a causa di limitazioni come la motivazione del soggetto, il reclutamento di unità motorie non massimali e la co-dipendenza intrinseca da altri sistemi corporei come i sistemi cardiovascolare, scheletrico e respiratorio.
D'altra parte, EMG offre una valutazione diretta leggermente migliore del sistema muscolare scheletrico, poiché gli elettrodi EMG sono posizionati direttamente sul gruppo muscolare di interesse 36,37,38. Gli elettrodi EMG misurano quindi l'attività muscolare collettiva (fibre muscolari depolarizzate). Questa attività muscolare si basa sul reclutamento dell'unità motoria e sulla codifica del tasso (la frequenza dei potenziali d'azione inviati alle unità motorie reclutate). Tuttavia, separare i contributi relativi del reclutamento dell'unità motoria rispetto alla codifica dei tassi è impossibile con l'EMG di superficie. Inoltre, l'EMG si basa sulla volontà del soggetto di generare contrazioni massime e questo livello di cooperazione è improbabile nei modelli di animali di grandi dimensioni. Mentre può essere informativo valutare i cambiamenti nell'EMG durante il ciclo dell'andatura, questi dati non rappresentano una capacità funzionale massima del gruppo muscolare scheletrico di interesse. L'imaging basato su ultrasuoni che utilizza la modalità B e l'elastografia ad onda di taglio è un'altra modalità non invasiva utilizzata per valutare la funzione muscolare. Esiste una buona correlazione tra il modulo di Young misurato mediante elastografia e l'aumento dei carichi muscolari39,40. L'elastografia ad onde di taglio è stata convalidata e utilizzata come misura quantitativa della rigidità passiva del tessuto 41,42,43,44,45, anche in un modello di danno da perdita muscolare volumetrica suina23. Può anche essere usato come misura indiretta della produzione di forza muscolare attiva39. Tuttavia, sono ancora presenti limitazioni simili all'EMG per la volontà del soggetto e la cooperazione di eseguire contrazioni.
Il protocollo in vivo qui descritto, in contrasto con la distanza a piedi del tapis roulant e l'EMG, fornisce una valutazione affidabile, riproducibile e massima della funzione muscolare. Questo protocollo evoca le contrazioni muscolari in modo controllato, quantificabile e indipendente dalla motivazione. In particolare, gli elettrodi percutanei vengono utilizzati per stimolare gli assoni nervosi bypassando il sistema nervoso centrale. La depolarizzazione degli assoni nervosi impegna tutte le unità motorie eliminando la variabilità associata al reclutamento delle unità motorie. Inoltre, lo sperimentatore controlla la codifica della velocità (frequenza di stimolazione). La fisiologia neuromuscolare risultante che si applica a questo approccio inizia con l'attivazione del canale del sodio voltaggio-dipendente ai nodi di Ranvier. Tutta la fisiologia successiva (o a valle) è impegnata, compreso l'accoppiamento eccitazione-contrazione e il ciclo cross-bridge. Un vantaggio significativo dell'analisi muscolare non invasiva in vivo è che la funzione muscolare contrattile può essere misurata ripetutamente, ad esempio settimanalmente, per monitorare la forza muscolare dopo un infortunio, un intervento o una progressione della malattia.
Limitazioni del metodo
L'apparecchiatura in vivo descritta in questo protocollo consente una coppia isometrica passiva e attiva in funzione dell'angolo articolare e della frequenza di stimolazione. L'apparato di prova utilizzato non supporta la misurazione delle contrazioni dinamiche (ad esempio, contrazioni eccentriche o concentriche isocinetiche). L'apparecchio consente un intervallo di movimento di 105° per caratterizzare il rapporto coppia-angolo di giunzione e utilizza una cella di carico con un intervallo di coppia massimo di ~50 N·m. Domande sperimentali specifiche possono richiedere caratteristiche prestazionali al di fuori di queste specifiche. In particolare, la cella di carico su questo apparecchio descritto può essere sostituita con intervalli di coppia più ampi, se necessario.
Il protocollo qui descritto per misurare la massima forza neuromuscolare in vivo presenta notevoli limitazioni. In primo luogo, questo metodo richiede l'anestesia, che può essere condotta in modo diverso per protocolli e risorse della struttura animale. Gli anestetici sono noti per avere effetti variabili sulla funzione neuromuscolare e hanno dimostrato di alterare la produzione di coppia dorsiflessore in vivo di topo in modo anestetico e dose-dipendente29. Gli effetti differenziali degli anestetici sulla coppia in vivo di grandi animali non sono chiari; pertanto, i gruppi di controllo e sperimentali devono avere gli stessi agenti di anestesia (ad esempio, tutti i gruppi a cui è stata somministrata ketamina) per controllare questa variabilità. In secondo luogo, la dipendenza da modelli di diffusione in vivo limita l'esplorazione dei meccanismi cellulari della disfunzione contrattile e della tossicità acuta dei farmaci. Ad esempio, la caffeina può essere utilizzata durante il test del bagno d'organo in vitro di un muscolo isolato per stimolare il rilascio di calcio del reticolo sarcoplasmatico, bypassando direttamente l'accoppiamento eccitazione-contrazione46 . La quantità di caffeina per indurre questo effetto (mM) è letale in un ambiente in vivo . Le influenze farmacologiche su tutto il corpo (ad esempio, lo stress renale / epatico) e i fattori successivi secreti in circolazione dovranno essere considerati se questo approccio viene utilizzato per lo screening farmacologico sulla forza muscolare acuta23. In terzo luogo, l'uso della massima stimolazione nervosa elettrica si discosta dalle strategie di reclutamento volontario, come discusso sopra, e quindi non riflette i cambiamenti di forza che possono essere dovuti ad adattamenti di reclutamento neuromuscolare.
Le misurazioni della coppia in vivo possono anche essere limitate per quanto riguarda la definizione di un meccanismo specifico per le osservazioni sperimentali. Ad esempio, la coppia intorno all'articolazione della caviglia dipende non solo dalla produzione di forza muscolare, ma anche dal tendine e dalle proprietà articolari e del tessuto connettivo. Inoltre, la forza è generata da gruppi di muscoli, in particolare i flessori plantari (muscoli gastrocnemio, soleo e plantare) e i dorsiflessori (muscoli peroneus tertius, tibialis e digitorum) nei suini. Pertanto, le interpretazioni dei dati massimi di coppia in vivo richiedono la considerazione di potenziali cambiamenti muscolotendinei e anatomici e sono limitate ai gruppi muscolari, non ai singoli muscoli. In relazione a ciò, i gruppi muscolari sono spesso costituiti da una miscela di fibre muscolari prevalentemente veloci e lente, come il muscolo gastrocnemio e il muscolo soleo, rispettivamente, dei flessori plantari. Le proprietà contrattili come il tasso di contrazione e rilassamento (o la contrazione time-to-peak e il tempo di semi-rilassamento) non sono indicatori affidabili della fisiologia del tipo di fibra utilizzando preparazioni muscolari in vivo rispetto a quelle isolate, come i protocolli di test in vitro o in situ 47. I preparati muscolari isolati sono anche superiori nella comprensione dell'influenza dei parametri biomeccanici sulla funzione muscolare perché proprietà come la lunghezza muscolare possono essere controllate con precisione; è importante sottolineare che la relazione angolo-coppia articolare non è direttamente equivalente alla relazione lunghezza-forza muscolare, poiché le proprietà tendinee (ad esempio, rilassamento), muscolo (ad esempio, angolo di pennazione, sovrapposizione sarcomero) e articolazione (ad esempio, braccio momento) che contribuiscono alla produzione di coppia dipendono dall'angolo articolare. A tal fine, i test funzionali in situ per animali di grandi dimensioni48 potrebbero costituire una preziosa aggiunta ai test in vivo, tenendo presente che i test in situ sono un esperimento terminale. Altri progressi al protocollo attuale che potrebbero essere esplorati in futuro per migliorare l'intuizione meccanicistica dei risultati sperimentali includono l'uso dell'imaging a ultrasuoni in modalità B per misurare le proprietà architettoniche muscolari e tendinee e l'impianto di un trasduttore di forza tendinea per misurare la forza muscolare durante le contrazioni volontarie ed elettricamente stimolate49.
Importanza e potenziali applicazioni del metodo
Questo protocollo valuta in vivo la capacità di produzione di coppia del gruppo muscolare dorsiflessore suino, dimostrando un metodo non invasivo per valutare il guadagno o la perdita della funzione muscolare in un contesto fisiologico. Poiché la metodologia non è terminale per il maiale, può anche essere utilizzata per valutare la funzione muscolare negli stessi soggetti longitudinalmente durante la progressione di una malattia, o prima, durante e dopo una strategia di trattamento. Pertanto, una progettazione sperimentale di misure ripetute può consentire solidi confronti statistici con maggiore potenza e meno animali rispetto a misure indipendenti. Inoltre, la disfunzione del muscolo scheletrico è una componente saliente di vari processi e condizioni patologiche, come lo spreco muscolare cronico associato a malattie (ad esempio, insufficienza cardiaca, insufficienza renale, AIDS, cancro, ecc.), Distrofia muscolare, malattie neurodegenerative (ad esempio, SMA o sclerosi laterale amiotrofica; SLA), invecchiamento (cioè sarcopenia) e tossicità dei farmaci. La capacità funzionale del muscolo scheletrico è una misura di esito primario critico per interventi come l'esercizio fisico, la nutrizione e le terapie farmacologiche e di medicina rigenerativa. Pertanto, il protocollo qui descritto per valutare in modo affidabile la capacità di produzione di coppia suina in vivo può essere utilizzato in numerose applicazioni di studio. Può essere strumentale nell'acquisizione di ampi dati sugli animali per la traduzione di terapie in via di sviluppo.
Disclosures
Le opinioni o le asserzioni qui contenute sono le opinioni private degli autori. Non devono essere interpretati come ufficiali o come riflesso delle opinioni del Dipartimento dell'Esercito, del Dipartimento della Difesa o del Governo degli Stati Uniti.
La produzione dell'articolo video e la disponibilità di Open Access sono state sponsorizzate da Aurora Scientific, Inc. Matthew Borkowski è impiegato da Aurora Scientific Inc. Questa azienda può potenzialmente beneficiare dei risultati della ricerca.
Acknowledgments
Il lavoro e i dati presentati sono stati ampiamente supportati dall'US Army Medical Research and Material Command a BTC e SMG (#MR140099; #C_003_2015_USAISR; #C_001_2018_USAISR); e il Dipartimento degli affari dei veterani, l'Amministrazione sanitaria dei veterani, l'Ufficio di ricerca e sviluppo (I21 RX003188) a JAC e al Dr. Luke Brewster. Gli autori riconoscono con gratitudine il servizio veterinario USAISR e i rami di patologia comparativa e il centro di imaging preclinico avanzato UMN per l'assistenza tecnica nel completamento di questi studi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 615A Dynamic Muscle Control LabBook and Analysis Software Suite | Aurora Scientific Inc. | 615A | Compatible Win Vista/7/10 |
| 892A Swine Isometric Footplate Test Apparatus | Aurora Scientific Inc. | 892A | Includes Isometric Load Cell, Pig Footplate, Goniometer stage and positioners |
| Calibration Weights | Ohaus or similar | 80850116 | |
| Computer | Aurora Scientific or any vendor | 601A | Computer must include data acquisition card and interface for software |
| Gauze pad | Various vendors | 4 by 4 squares or similar | |
| Monopolar Needle Electrodes | Chalgren, Electrode Store, or similar vendor | 242-550-24TP, or DTM-2.00SAF | |
| Non-adhesive Flexiable Tape | 3M, Coflex, or similar | 4 inch by 5 yard role | |
| Stimulator | Aurora Scientific or comparable | 701C | Must include constant current stimulation mode |
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