Summary
이 간행물은 맞춤형 조명 체계를 갖춘 실험실 광생물 반응기 (PBR)의 설계에 대해 설명합니다. 중탄산염을 탄소원으로 사용하는 시아노박테리아 또는 미세조류의 성장은 용적 산소 생산을 측정함으로써 지속적으로 모니터링됩니다. 이러한 PBR은 실험 중 사용자 개입이 거의없는 신속하고 복제 된 실험실 성장 비교를 용이하게합니다.
Abstract
미세조류에 대한 실험실 연구는 실험적으로 어려울 수 있습니다. 비 광합성 미생물의 재배 요구 사항 외에도 광영양은 조명이 필요합니다. 일상적으로, 연구자들은 맞춤형 조명 공급, 즉 그것이 전달되는 빛의 강도와 시간을 다양하게하기 위해 노력합니다. 이러한 유연성은 표준 벤치 탑 조명에서는 어렵습니다. 일반적으로 재배 연구는 실험 치료 간의 성장 비교가 필요합니다. 종종, 성장은 연장 된 기간에 걸쳐, 예를 들어, 일주일 동안의 시험에 걸쳐 하루에 여러 번 평가됩니다. 수동 측정은 시간이 많이 걸리고 데이터 분해능이 부족할 수 있습니다. 따라서 자동 성장 모니터링 및 사용자 정의 가능한 광 공급을 갖춘 광생물 반응기 (PBR)는 여러 처리로 복제 된 실험에 유용합니다. 현재 연구는 실험실 PBR의 설계, 건설 및 운영을 제시합니다. 재료는 쉽게 공급되고 상대적으로 저렴합니다. 디자인은 적당한 기술로 복제 될 수 있습니다. 각 구조물은 ~ 40cm2의 풋 프린트를 가지고 있으며 삼중 복제를위한 세 개의 1L 유리 병을 보유하고 있습니다. 병은 자기 교반기가 들어있는 플랫폼 위에 놓여 있으며 높이 1m, 직경 15cm 폴리 염화 비닐 (PVC) 파이프 내에 수직으로 배열됩니다. 파이프 내부에는 발광 다이오드(LED)가 늘어서 있습니다. 이 LED는 광합성 활성 방사 (PAR)의 0-2400 μmol 광자 m-2 s-1에서 연속 광 강도를 생성합니다. 사용자는 맞춤형 조명 프로그램을 설계합니다. 광 강도는 매초마다 조정되거나 더 긴 기간 동안 일정하게 유지 될 수 있습니다. 광합성에서 생성 된 산소는 단방향 체적 가스 센서를 통해 각 병을 빠져 나옵니다. 소프트웨어는 가스 센서 데이터를 기록하는 데 사용됩니다. 생성된 산소의 양은 바이오매스 성장과 상관관계가 있을 수 있다. 바이오매스 샘플이 필요한 경우, 주사기를 사용하여 배양물을 추출할 수 있습니다. 이 방법은 중탄산염을 탄소원으로 하여 성장한 미세조류에 적합하다. 이러한 PBR은 복제된 실험, 광 체계 유연성 및 지속적인 고해상도 성장 데이터가 필요한 실험실에 유용합니다.
Introduction
단순성을 위해 미세조류라고 통칭하는 미세조류와 시아노박테리아는 지속가능한 생명공학에서의 잠재력을 옹호하고 있다. 그들은 급속한 성장, 경작 할 수없는 땅에서 재배 할 수있는 능력, 이산화탄소를 바이오 매스 1,2,3으로 전환시키는 햇빛을 사용하기 때문에 매력적인 후보자입니다. 미세조류 바이오매스는 오일 또는 가스 형태의 바이오 에너지, 식품 염료 및 영양 보충제, 바이오폴리머 1,4,5,6,7과 같은 재료와 같은 제품으로 전환될 수 있다. 또한, 그들은 폐수를 처리하거나 과도한 영양소 8,9를 섭취하여 수역을 개선하는 데 사용할 수 있습니다. 이를 감안할 때, 미세 조류 연구는 널리 퍼져 있고 확립되어 있습니다. 이 분야는 사회가 현재의 제조 및 에너지 생성 접근법의 탄소 강도와 환경 지속 가능성을 재고함에 따라 성장합니다.
실험실 기반 미세조류 연구의 세 가지 기본 요구 사항은 배양 용기, 광원 및 성장을 정량화하는 방법입니다. 용어 광생물반응기(PBR)는 배양 용기가 조명되는 셋업(10)을 기술한다. 일반적으로, 미세조류에 대한 연구는 둘 이상의 치료, 예를 들어, 상이한 성장 매질, 광정권 또는 종 11,12,13 사이의 성장을 비교하는 것을 목표로 한다. 통계적 관련성을 위해, 각 조건, 예를 들어, 치료 및 제어는 복제되어야 한다. 대조군과 치료가 동시에 실행된다면, 이는 실험 기간 동안 많은 PBR을 모니터링하고 샘플링해야 함을 의미합니다. 여러 PBR을 작동해야 하는 과제는 두 가지입니다. 첫째, 각 PBR에 균일한 광도를 공급하는 것은 재현성을 위해 필수적이지만 어려울 수 있습니다. 용기 표면에 입사되는 광의 양은 광원으로부터의 거리, 인접한 선박으로부터의 음영, 및 배경광 변동(14)에 의해 영향을 받는다. 둘째, 성장을 정확하게 정량화하는 방법을 선택해야합니다.
성장은 일반적으로 세포 수, 광학 밀도 (OD), 엽록소 A 함량, 건조 중량 (DW) 밀도, 및 무회분 건조 중량 (AFDW) 밀도15에 의해 측정된다. 세포 수, 엽록소 A 함량 및 중량 측정 방법은 개별 데이터 포인트를 생성하는 수동 프로세스입니다. OD는 AFDW 밀도15와 같은 다른 방법에 대해 잘 교정된다면 분광 광도계로 연속적으로 그리고 비침습적으로 측정될 수 있다. 그러나, OD 측정 및 엽록소 A 함량은 상이한 배양 조건, 예를 들어, 종간 및 성장 주기15,16에 걸쳐 결과가 변하기 때문에 신뢰할 수 없다. 엽록소 A의 경우, 추출 방법은 또한 안료 수율17에 영향을 줄 수 있습니다. 엽록소 A 함량은 또한 비광합성 유기체(17,18)를 함유하는 미생물 군집 내의 미세조류의 성장을 추적하는데 특히 유용하다. 성장을 결정하는 방법을 선택할 때, 현탁액의 형태를 고려하는 것이 필수적입니다. 유기체가 뭉쳐서 잘 섞이지 않을 때, OD와 세포 수는 불가능합니다15. 단일 방법이 모든 실험 응용 분야에 적합한 것은 아니며 연구자는 어떤 방법이 실용적이고 실험 목표와 관련이 있는지 결정해야합니다.
AFDW는 다양한 배양 조건, 특히 종과 배양 배지 15,19,20 사이의 성장 비교를 가능하게하는 신뢰할 수있는 방법입니다. AFDW를 계산하기 위해, 미세조류 배양물의 샘플을 먼저 여과 또는 원심분리에 의해 농축하고, 건조시킨다. 이 단계에서 DW를 결정할 수 있습니다. 일반적으로 DW 샘플에는 염 및 미립자 물질 15와 같은 최소8-10 %의 회분 무기 물질이 포함되어 있습니다. DW는 성장 추세를 추적하지만 무기물의 기여도가 다를 경우 왜곡 될 수 있습니다. AFDW 밀도를 결정하기 위해, 건조 바이오매스는 고온에서 연소된다; 이것은 유기 또는 유용한 부분을 기화시키면서 재 (무기물)를19 뒤에 남겨 둡니다. AFDW를 계산하기 위해 회분 분율의 가중치를 DW 분율의 무게에서 뺍니다. 일반적으로 미세조류 현탁액에서 AFDW의 범위는 0.1-3 g/L12,21,22입니다. 소량의 묽은 현탁액은 <10mg의 건조 바이오매스를 거의 생성하지 않습니다. 연소 후, 재의 무게는 1mg에 불과합니다. 따라서 배양 밀도에 따라이 방법은 5-100 mL 사이의 부피와 0.1 mg 12,15,19,22까지 정확한 분석 척도가 필요합니다. 실험실 PBR은 일반적으로 작고 최대 몇 리터이므로 모든 액체 샘플은 배양량을 고갈시킵니다. 또한 AFDW 방법은 수동이며 2-3 일이 걸립니다. 복제되고 반복적인 실험의 경우 자동화되고 지속적인 프로세스가 바람직합니다.
중탄산염을 탄소원으로 사용하는 미세조류의 경우, 두 가지 추가적인 성장 지표를 지속적으로 측정할 수 있다. 광합성은 중탄산염을 소비하고 산소를 생성합니다. 중탄산염 소비는 중간 pH23을 증가시킵니다. 침지된 pH 프로브는 이러한 변화를 측정할 수 있다. 광합성 산소 생산은 배지가 포화될 때까지 배지의 용존 산소(DO) 농도를 증가시킨다. 포화를 넘어 산소는 거품으로 존재합니다. 산소 생산은 프로브 게이지 DO 농도, 기동 장치 평가 헤드 스페이스 압력, 가스 크로마토그래피 측정 헤드 스페이스 조성 및 체적 센서 기록 가스 유출24,25,26,27 등 다양한 기술로 측정됩니다. 산소가 성장 프록시로 사용되는 경우, 배양 용기는 완전히 밀봉되거나 가스 유출 만 허용해야합니다. pH 및 산소 측정을 위해, 탄소는CO2 스퍼징이 아닌 중탄산염의 형태로 공급되어야 한다. CO2 스파징은 배지 pH23을 감소시키고, 가스로서 산소 측정을 방해할 수 있다. 광학 밀도에 비해 pH 및 산소의 한 가지 장점은 미세조류가 덩어리를 형성하는 경우 방법이 손상되지 않는다는 것입니다. 간접적이지만 pH와 산소 모두 치료 간의 성장을 비교하는 데 효과적입니다.
현재 사용 중인 PBR은 복잡성이 다양합니다. 실험실은 간단한 벤치탑 플라스크, 맞춤형 프로토 타입 또는 상업적으로 이용 가능한 제품을 사용할 수 있습니다. 플라스크에서 업그레이드하려는 연구 그룹의 경우 많은 프로토 타입을 제작하는 데 필요한 상업용 PBR 또는 기술 기술 및 부품 제작 비용이 장벽이 될 수 있습니다. 이 원고는 이러한 격차를 해소하는 실험실 PBR의 단계별 설계, 건설 및 운영을 설명하는 것을 목표로합니다. 이 PBR은 사용자 정의 가능한 광 체계를 가지며 체적 산소 생산을 기록하여 지속적으로 성장을 모니터링합니다. 이 설계에는 삼중 복제를위한 세 개의 배양 용기가 있으며 적당한 기술과 쉽게 접근 할 수있는 재료로 구축 할 수 있습니다. 이 PBR은 매우 기술적이거나 값 비싼 제품에 투자하지 않고 미세 조류 연구 능력을 확장하고자하는 실험실에 귀중한 추가 자료입니다. PBR을 획득하거나 구축하기로 선택할 때 연구원은 문화 조건, 재무 상태 및 연구 질문에 대한 설계의 적합성을 고려해야합니다.
Protocol
1. PBR 스탠드 건설
- 휴대용 쇠톱으로 다섯 개의 380mm 길이와 두 개의 200mm 길이의 각진 슬롯 강철을 자릅니다. 볼트와 큰 코너 중괄호를 함께 고정하여 스탠드의 받침대를 만듭니다(그림 1A). 안전 엔드 캡에 접착제.
- 두 개의 절단되지 않은(1220mm) 수직 길이의 각진 슬롯형 강재를 베이스에 연결합니다. 볼트와 금속 모서리 거셋으로 고정하십시오(그림 1B). 안전 엔드 캡에 접착제.
- 슬롯형 강철의 65mm 플랫 길이 네 개를 자릅니다. 수직 지지대에 90° 각도로 볼트를 고정하여 각 지지대에 두 개를 부착하고, 하나는 베이스에서 위로 130mm(그림 1C), 위쪽에서 60mm 아래로 한 개를 부착합니다.
- 수직 지지대를 프레임 뒷면에 볼트로 고정한 가로 140mm 길이의 플랫 슬롯형 강철(크로스빔)로 위쪽에 고정합니다(그림 2A).
2. 가벼운 약실의 건축
- 흰색 153mm 직경의 폴리 염화 비닐 (PVC) 파이프를 길이 1070mm로 자릅니다. 띠톱으로 파이프를 절반 길이로 자릅니다. 모래 모든 가장자리.
- 네 개의 알루미늄 방열판 채널을 파이프 내부와 함께 수직으로 고르게 공간하고 중앙에 배치합니다. 파이프의 절단면에서 20mm 이내의 채널을 부착하지 마십시오. 작은 볼트로 채널을 위쪽과 아래쪽에 고정합니다(그림 2B).
- 파이프의 절반을 스탠드에 볼트로 고정하여 1.3 단계에서 유행한 수평 지지대를 사용합니다.
- 반응기를 내려 놓고 파이프 반쪽을 함께 테이핑하여 재결합하십시오. 피아노 힌지를 하나의 컷라인을 따라 가운데에 맞춥니다. 힌지 구멍을 추적하고 그에 따라 파이프를 드릴링합니다. 리벳 건과 중간 길이 리벳을 사용하여 힌지를 파이프에 고정하십시오.
- 작은 번지 코드( 재료 표 참조)를 사용하여 파이프를 닫아 둡니다(그림 1C).
- 전기 기술자에게 문의하여 LED 조명에 배선하고 LED 드라이버, 디지털 멀티플렉스(DMX) 디코더, DMX 조명 컨트롤러 및 스위치 박스의 네 가지 구성 요소를 설치합니다( 재료 표 참조). 그림 2A에 따라 모든 구성 요소를 PBR 뒷면에 고정합니다.
3. 병 플랫폼 구축
- 컴퓨터 수치 제어(CNC) 밀링을 사용하여 플랫폼 형상(그림 3A)을 경질 플라스틱(예: 고밀도 폴리에틸렌(HDPE)( 재료 표 참조)으로 절단합니다. 각 도형을 세 개로 만듭니다.
참고: 예비 상단 및 하단 레이어를 절단하는 것이 좋습니다. - 아래쪽과 위쪽 레이어를 함께 테이프로 붙입니다. 두 모양 모두를 통해 지름 6mm의 작은 구멍 다섯 개를 표시하고 드릴합니다(그림 3A). 더 큰 드릴 비트를 사용하여 볼트 헤드가 오목해질 수 있도록 이러한 구멍의 표면을 조심스럽게 확장합니다(그림 3B).
- 세 플랫폼 각각에 대해 두 개의 작은 모서리 중괄호를 파이프의 뒤쪽 절반에 볼트로 고정합니다.
참고: 중괄호 상단 사이의 거리는 350mm여야 합니다. - 각 하단 레이어를 중괄호 위에 가운데에 맞춥니다. 중괄호 아래에서 드릴 구멍의 위치를 표시합니다. 직경 6mm 구멍 두 개를 뚫습니다. 더 큰 드릴 비트를 사용하여 볼트가 움푹 들어간 부분이 될 수 있도록 구멍 표면을 조심스럽게 확장하십시오.
- 바닥층을 중괄호에 볼트로 고정합니다(그림 3B–C).
- 길이 12mm 길이 6.35mm 외경(OD) 경질 튜브 15개를 자릅니다. 각 상단과 하단 층 사이에 단단한 튜브의 다섯 조각을 샌드위치. 그림 3B–D에 따라 레이어와 튜브를 길고 좁은 볼트로 함께 고정합니다.
- 각 플랫폼 뒤의 PVC 파이프에 큰 구멍을 뚫습니다. 각 마이크로 마그네틱 교반기를 플랫폼에 삽입합니다. 각 교반기의 전기 케이블을 새로 절단한 구멍에 꽂습니다(그림 3C–E). 각 교반기를 전원 콘센트뿐만 아니라 해당 제어 장치에 연결합니다.
- 각 플랫폼에 1L 병을 놓습니다. 병 목 높이의 후면 파이프에 눈 볼트를 추가하십시오. 안정성을 높이기 위해 각 병 목에 작은 번지 코드를 감쌉니다(그림 4A).
참고: 프로토콜 전반에 걸쳐 컬러 코딩 플랫폼, 병, 마그네틱 교반기 및 모든 관련 케이블 및 센서가 도움이 될 것입니다.
4. 액체 샘플링 포트의 건설 (선택 사항)
- 6.35mm OD 강성 튜브의 60mm 길이 세 개를 자릅니다. 5mm 드릴 비트를 사용하여 각 고무 마개를 통해 구멍을 뚫습니다. 마개를 통해 단단한 튜브 길이를 밀어 넣습니다.
- 60mm 길이의 3.18mm OD 강성 튜브 세 개를 자릅니다. 이들을 직선 감속기로 각 마개의 아래쪽에있는 돌출 된 튜브에 연결하십시오.
- 각 스토퍼 표면의 돌출된 튜브에 단방향 스톱콕 밸브(예: 포트 1 = 암 루어, 포트 2 = 수형 슬립 루어)를 삽입합니다(그림 4A).
- 30mm 길이의 3.18mm OD 플렉시블 튜브 세 개를 절단합니다. 양쪽 끝에 Luer 피팅(예: 남성 루어를 호스 바브에, 여성 루어를 호스 바브에 삽입합니다)을 삽입합니다.
- 단계 4.4에서 만든 조각을 각 고무 마개 표면의 스톱콕 밸브에 연결합니다(그림 4A).
참고: 스토콕과 루어 피팅의 많은 조합은 동일한 결과를 생성할 수 있습니다. 디자인은 액체가 주사기를 통해 꺼내거나 삽입 될 수 있도록해야합니다.
5. 체적 가스 센서 연결
- 제조업체의 지침에 따라 가스 센서를 준비합니다.
참고: 이것은 주로 가스 센서를 포장액으로 채우는 것과 관련이 있습니다(그림 4B). - 가스 라인을 만들려면 3.18mm OD 플렉시블 튜브의 1000mm 길이 세 개를 자릅니다.
- 후면 PVC 파이프에 직경 4mm 구멍 세 개를 뚫습니다. 경첩 옆에 있는 구멍을 병 목 높이에 놓습니다. 이러한 구멍을 통과하는 스레드 가스 라인(그림 4A).
- PVC 파이프 내부의 가스 라인의 끝에 루어 피팅(예를 들어, 호스 바브에서 남성 루어까지)을 추가하고 단방향 스톱콕 밸브(예: 포트 1 = 암 루어, 포트 2 = 수컷 루어)를 연결합니다.
참고: 밸브는 액체 샘플링 포트도 설치할 때만 필요합니다. - 직선 감속기를 사용하여 가스 라인의 다른 쪽 끝을 가스 센서의 입구 포트에 결합하십시오. 지퍼 타이로 이 연결을 고정하십시오.
- 잭 플러그 케이블을 사용하여 모든 가스 센서를 디지털 입력 모듈(DIM)에 연결하고 DIM을 가까운 컴퓨터에 연결합니다.
- Windows 운영 체제에 데이터 수집 소프트웨어( 자료 표 참조)를 설치하고 라이선스 키 동글을 연결합니다. 센서 교정 파일을 소프트웨어의 교정 디렉토리에 추가합니다.
6. 빛 정권의 프로그래밍
- 후면 켜기/끄기 스위치를 사용하여 PBR을 켜고 micro-USB 케이블을 통해 DMX 조명 컨트롤러를 컴퓨터에 연결합니다.
- SUT(스토어 업그레이드 도구) 및 LED 제어 소프트웨어를 다운로드 합니다(자료 표 참조). DMX 조명 컨트롤러를 온라인으로 등록합니다.
- LED 제어 소프트웨어를 열고 여기를 클릭하여 USB-DMX 인터페이스인 SUSHI-RB-RJ로 작업합니다.
- ScanLibrary 상자의 설정 탭에서 일반 폴더 및 단일 채널을 선택합니다. ScanLibrary 설정을 DMX 유니버스 1로, 픽스처 수를 4로, 인덱스 번호를 1로 변경합니다. 오른쪽 위 모서리에서 드롭다운 상자를 목록 보기로 변경합니다. 마지막으로 패치를 클릭합니다(추가 그림 1).
참고: DMX 유니버스에서 하나의 박스는 디머 버튼을 슬라이딩하거나 텍스트 상자에 숫자 값을 입력하여 각 LED 스트립의 컨트롤을 테스트합니다. - 조명 제어 소프트웨어의 디지털 조명 설정을 PVC 튜브의 중앙에서 경험하는 광도와 관련시키는 표준 곡선을 만듭니다(그림 5). PVC 파이프의 중앙에 현탁 된 작은 구형 프로브 ( 재료 표 참조)로 내부 광 강도를 측정하십시오.
- 편집기 탭으로 이동합니다. 커스텀 라이트 프로그램을 빌드하려면 새 씬을 만들고 스텝 추가를 시작합니다. 예를 들어 16:8 h 일주일 프로그램에 대해서는 보충 표 1을 참조하십시오. 장면을 루프로 설정합니다.
참고: 단계는 장면을 시간 블록으로 나눠서 각 장면을 다른 광도로 설정할 수 있습니다. 단계 범위는 1초에서 43분까지입니다. 여기서 30 분 단계가 가장 편리합니다. 하나의 DMX 조명 컨트롤러 장치에 여러 장면을 로드할 수 있습니다. - 즉시 인식할 수 있는 추가 도우미 장면(예: 네 개의 LED 중 두 개가 켜짐)을 생성합니다.
참고: 장면은 DMX 조명 컨트롤러 측면에 있는 버튼을 사용하여 수동으로 순환할 수 있습니다. 원하는 조명 프로그램이 밤에 시작되면 조명 프로그램이 이미 시작되었는지 여부를 구별하는 것이 불가능합니다. 도우미 장면은 DMX 조명 컨트롤러가 올바르게 작동하고 있음을 나타내는 역할을 합니다. - 장면을 저장하고 독립 실행형 탭으로 이동합니다. DMX 조명 컨트롤러의 메모리를 쓰고 컴퓨터에서 장치를 분리합니다.
- 마이크로 USB를 사용하여 DMX 조명 컨트롤러를 전원에 연결합니다.
- 실험을 시작하기 전에 24시간 동안 내부 조명 강도를 기록하여 조명 프로그램을 테스트합니다. 액체 온도가 관심이 있는 경우 침수 온도 프로브와 동시에 기록하십시오(그림 6).
7. 실험 시작
- 매체, 병, 교반 바, 고무 마개, 샘플링 포트, 나사 조리개 나사 캡 및 튜브를 멸균하십시오.
참고: 이 설계에 사용되는 모든 부품은 밸브 및 Luer 피팅을 제외하고 오토클레이브가 가능하며 다른 제조업체의 오토클레이브 가능한 대안이 있습니다. - 데이터 수집 소프트웨어를 열고 구성 페이지를 입력합니다(보충 그림 2). 교정 파일을 해당 센서에 할당합니다.
- 디렉토리 파일 이름에서 해당 DIM 포트 번호 폴더를 선택합니다. 현재 폴더를 클릭하고 모든 포트에 대해 반복하십시오.
- 확인을 클릭하여 로깅 페이지로 이동합니다.
- 원하는 부피로 병을 재배 배지로 채웁니다 (보충 표 2,3).
참고 :이 병들 각각은 작은 헤드 스페이스 (가스 라인을 포함하여 ~ 80 mL)로 최대 ~ 1.1 L를 보유합니다. - 스톡 배양물을 4500 x g 에서 15분 동안 세 개의 균형 잡힌 50 mL 튜브에서 원심분리하여 3개의 펠렛을 수득하였다. 각 병에 하나의 펠렛을 넣고 혈청 학적 피펫과 신선한 배지로 펠렛으로 씻으십시오.
참고: 제0일의 배양 밀도는 초기 바이오매스 농도(IBC)로도 알려져 있다. IBC를AFDWg 로 측정한다. L-1, 추가 50 mL 튜브는 단계 7.6에서 원심분리될 수 있다. 이어서, 생성된 펠릿은15,19를 건조 및 연소시킬 수 있다. 7.6 단계에서는 사용자의 개별 목표와 실험에 따라 수정이 필요할 수 있습니다. - 마그네틱 교반기 25 x 8 mm를 각 병에 떨어 뜨립니다.
- 각 병 개구부를 고무 마개와 나사식 조리개 나사 캡으로 밀봉합니다(그림 4A). 샘플링 포트(옵션)가 설치된 경우 밸브를 닫으십시오.
- PVC 파이프 내부의 각 가스 라인의 끝 부분(단계 5.4에서 내장)을 찾아 밸브의 수 루어 포트에 바늘을 부착합니다.
- 각 고무 마개를 해당 바늘로 관통하여 각 병을 가스 센서에 연결하십시오.
- 화면 왼쪽의 체크 박스를 선택하고 시작을 클릭하고 파일 이름을 입력하여 각 가스 센서를 개별적으로 실행하십시오. 확인을 클릭하고 모든 센서에 대해 반복합니다(추가 그림 3).
참고: 로깅하는 동안 데이터 수집 창을 종료하지 마십시오. 컴퓨터의 전원 및 절전 설정을 절대 로 설정하고 실험 기간 동안 컴퓨터 업데이트를 연기합니다. - PBR을 켜고 DMX 조명 컨트롤러가 전원 공급 장치에 꽂혀 있는지 확인합니다. 첫 번째 프로그래밍된 장면이 자동으로 시작됩니다. 6.7단계를 참조하여 DMX 조명 컨트롤러가 올바르게 작동하는지 확인합니다.
8. 병 샘플링 (선택 사항)
- 실험을 시작하기 전에 신선한 배지 500 mL를 추가로 준비한다(보충 표 2).
참고 : 16 : 8 시간 일주주기가있는 24 시간 조명 프로그램이 오전 9시에 시작된 경우 황혼과 새벽 이전의 샘플링 시간은 오전 8 시부 터 오후 4 시까 지 떨어집니다 (보충 표 1). 여기서 새벽과 황혼은 조명을 ON에서 OFF로 또는 그 반대로 전환하는 30 분 단계를 나타냅니다. - 가스 라인의 밸브를 닫습니다.
- 주사기(10mL)를 샘플링 포트 밸브에 연결합니다(그림 4A).
- 샘플링 포트 밸브를 열고 배양물 8mL를 인출합니다.
참고: 5-10 mL 사이를 권장합니다. 액체를 제거하면 헤드 스페이스에 진공이 생겨 >10mL의 부피를 추출하기가 어렵습니다. - 샘플링 포트 밸브를 닫고 주사기를 분리하십시오.
- 신선한 배지 8mL가 들어있는 주사기(단계 8.1부터)를 샘플링 포트 밸브에 연결합니다.
- 샘플링 포트 밸브를 열고 신선한 매체를 주입하십시오.
참고: 샘플링된 배양물의 부피를 신선한 배지로 대체하는 것은 동일한 헤드스페이스 부피와 압력을 유지하고 샘플링 포트 라인을 플러시하는 역할을 한다. - 주사기를 분리하기 전에 샘플링 포트 밸브를 닫으십시오.
- 각 샘플링 시간에 8.2~8.8단계를 반복합니다.
9. 실험 종료
- 데이터 수집 창에서 모든 활성 포트 체크 박스를 선택하고 중지를 클릭하십시오.
- 데이터를 내보내려면 파일 및 오프라인 데이터를 선택합니다. 모든 관련 로그 파일을 선택합니다. 데이터를 스프레드시트 소프트웨어로 내보내고 저장합니다.
- 각 병에 대해 mL로 측정 된 산소의 총 부피를 이상적인 가스 법칙을 사용하여 두더지로 변환하십시오. 생산된 바이오매스의 각 몰에 대해 1.05몰의O2 가 생성된다면 바이오매스 성장(gAFDW)의 중량을 예측한다. 바이오매스의 몰 중량을 24.6 g mol-1로 취한다.
- 유량 데이터를 수동으로 큐레이트합니다. mL/h 단위와 3점 이동 평균을 사용합니다.
Representative Results
여기서 산소 유량은 배양물의 광합성 속도를 측정한 것이다. 광합성의 높은 비율, 따라서 탄소 고정은 더 높은 성장률로 변환됩니다. 즉, 사용자는 성장을위한 프록시로서 다른 치료와 작동 일 사이의 산소 유량을 비교할 수 있습니다. 간단히 말해서, 가스 센서는 이중 챔버 측정 셀에 가스 버블을 포집하고 방출하여 작동합니다(그림 4B). 센서 바닥의 입구에서 나오는 가스 거품은 포장 액체를 통해 올라갑니다. 기포는 ~3.2 mL의 부피로 측정 셀의 한 챔버에 축적된다. 이 임계값에 도달하면 측정 셀 팁이 결정됩니다. 이렇게 하면 가스가 방출되고 시스템이 재설정됩니다. 각 팁은 데이터 수집 소프트웨어에 의해 기록됩니다.
실시예 데이터에서, 다양한 주간 광도 및 초기 바이오매스 농도(IBCs)를 갖는 세 가지 처리의 성장률을 비교하였다. 이러한 치료법은 입증 목적으로 임의로 선택되었습니다. 이들은 (A) 300 μmol 광자 m-2 s-1 및 0.03 g AFDW L-1, (B) 600 μmol 광자 m-2 s-1 및 0.13 g AFDW L-1, 및 (C) 600 μmol광자 m-2 s-1 및 0.40 gAFDW L-1이었다. 이러한 조도는 병이 플랫폼에 놓이기 전에 PVC 파이프의 중앙에 구형 프로브로 측정되었습니다. 배양 깊이와 밀도는 빛의 감쇠에 영향을 미칩니다. 따라서 미세조류가 경험하는 실제 광도는 보고된 것과 다를 수 있다. 각 처리는 세 병을 함유하는 하나의 PBR 내에서 삼중으로 수행되었다.
여기서 성공적인 실험은 가스 생산의 밀접하게 복제 된 일주일 패턴을 특징으로했습니다 (그림 7A-C). 조명 시간(낮) 동안에는 가스 생산이 꾸준히 증가했고, 조명이 없는 시간(야간)에는 가스 생산이 중단되었습니다(그림 7A–C). 두 개의 가스는 미세조류, 광합성으로부터의 산소 및 호흡(28)으로부터의 이산화탄소에 의해 생성된다. 광합성은 조명 시간으로 제한되는 반면, 호흡은 지속적으로 발생하지만야간 28에서 가장 활동적입니다. 광합성은 만들어지는 반면, 호흡은 바이오매스(28)를 촉매한다. 처음에는 헤드 스페이스 가스의 조성이 대기의 구성과 동일합니다. 측정 셀의 각 플립으로,O2는 대기 가스를 대체한다. 따라서, 가스 센서 판독값은 나가는 가스가 순수한O2가 아니더라도O2의 생성에 기인하였다. 가스 센서의 최소 가스 유입 압력은 8-9mbar로 매우 낮기 때문에 병 헤드 스페이스 압력이 대기보다 약간 높습니다 (해수면에서 1.01 bar). 따라서, 가스 센서 판독값은O2 기포가 매체를 떠난 직후에 시작된다.
호흡으로부터 방출된CO2는 두 가지 이유로 가스 센서 판독에 기여하지 않는다. 첫째, 알칼리성 매질에서,CO2는 중탄산염에 반응하여, pH를 감소시킨다(도 8). 둘째로, CO2가 빠져나간다면, 가스 센서 패킹 액체인 실록스는 측정 셀에 도달하기 전에 CO2 기포를 용해시켜 액체 표면(29)에서CO2를 방출한다. 이는 야간 가스 센서 판독값이 부족하여 지원됩니다. 발생한 수치는 조명이 꺼진 직후에 기록되었으며, 이는 판독값이 잔류 주간 산소 방출을 나타냄을 나타냅니다(그림 7).
실험 셋업(국소 온도 및 압력 데이터 사용)에서, 주위 압력에서 80mL의 헤드스페이스는 99%의 O2 분압을 확립하기 위해 340mL의 용해된O2가 필요했다. 여기서, 4일에 걸쳐 생성된 산소의 총 부피는 처리 C에서 처리 A에서 316 (SEM ± 11) mL 내지 902 (SEM ± 51) mL의 범위였다 (표 1). 따라서, 실험이 끝날 때까지, 모든 병의 헤드 스페이스는 주로O2를 포함했을 것이다. 헤드스페이스O2의 증가된 농도, 따라서N2의 농도 감소는 이들 가스의 분압 및 포화에 영향을 미쳤을 것이다. 99%O2 헤드스페이스로, DO의 5배 증가가 계산되었다. 1.1 L 배양물의 경우, 이것은 추가의 23 mL의 DO로 번역되었다. 반대로, 1% N2 헤드스페이스로의 이동은 15 mL의N2가 용해되도록 했을 것으로 추정되었다. 이는 거의 순수한 산소 헤드스페이스 하에서, N2보다 더 많은O2가 용해되어 변위되었다는 것을 의미한다. 따라서, 더 많은O2가 배지에 남아 있기 때문에, 이러한 효과는 생성된 광합성 산소의 양에서 약간의 과소 평가로 이어졌을 것이다.
이 방법의 주된 도전은 문화가 밀집되었을 때 발생했습니다. 더 많은 바이오매스, 따라서 더 많은 호흡으로,O2에 대한 요구가 증가하였다. 야간O2 소비는 헤드 스페이스 저압을 생성하였다. 이로 인해 가스 센서 포장 액체가 가스 라인을 통해 위로 이동했습니다. O2 생산이 재개되었을 때, 포장액은 가스 센서로 다시 구동되어야 했다. 이로 인해 첫 번째 가스 센서 판독이 지연되었습니다. 그러나 넷째 날 밤,이 저압의 크기로 인해 포장 액체가 도달하여 처리 B의 세 번의 반복실험 중 두 개로 떨어지면서 표면 오일이 매끄럽게 생성되었습니다. 감소된 패킹 액체 레벨로 인해, 가스 센서는 단락되어, 측정되지 않은O2를 대기로 직접 방출한다. 이로 인해 데이터 수집이 플랫라인으로 전환되었습니다(그림 7B).
저압은 또한 헤드 스페이스 부피의 온도 유도 수축으로 인해 발생할 수 있습니다. 그러나 여기의 효과는 미미했습니다. 히트 싱크 채널과 공기 흐름은 과도한 열을 적절하게 방출했습니다. 시험된 두 개의 광 정권 중 최대 온도 변화는 헤드 스페이스 부피를 1% 이하로 줄였으며, 이는 80mL 헤드스페이스에서 800μL 패킹 액체 변위와 동일합니다. 최대 일주일 온도 스윙은 300 μmol 광자 m-2 s-1 정권에 대해 1.4°C(도 6) 및 600 μmol광자 m-2 s-1 정권에 대해 3.2°C였다. 300 및 600 μmol광자 m-2 s-1 정권에 대한 평균 주간 온도 상승은 각각 0.7 및 1.8°C였다. 배양 온도는 하룻밤 사이에 기준선으로 돌아왔습니다(그림 6).
고해상도 성장률 데이터는 그렇지 않으면 눈에 띄지 않을 수있는 추세를 나타낼 수 있습니다. 치료 B와 C를 고려하십시오. 그들의 상이한 IBC들에도 불구하고, 둘 다 동일한 양의 총 바이오매스(gAFDW)를 생성하였고, 이는 중간 pH에서 동일한 변화를 일으켰다(표 1). 시작 및 최종 데이터 포인트만을 감안할 때, 개인은 두 치료 사이의 평균 성장률에 차이가 없다고 올바르게 가정할 수 있다(표 1). 그러나 온라인 산소 유량 데이터는 각 치료가 매일 성장률이 다르다는 것을 보여주었습니다. 이러한 변화는 또한 매일 두 번 pH 측정에 반영되었습니다 (그림 8). 첫날, 치료 B의 성장률은 치료 C의 성장률보다 낮았다. 셋째 날까지, 이것은 치료 B의 성장률이 치료 C의 성장률을 능가하면서 반전되었다 (그림 7B, C). 산소 유량 데이터는 가장 높은 성장률이 처리 B에서 셋째 날에 발생했음을 나타내었다 (도 7B).
세 번의 처리에서 각 병에 의해 생성된 산소의 총 부피는 총 바이오매스(gAFDW)에서의 각각의 변화를 추정하는데 사용되었다. 이것은 광합성 바이오매스 합성을 위한 일반적인 방정식을 사용하여 달성되었다: CO2 +0.2NH3 + 0.6H2O =CH1.8O0.5N0.2 + 1.05O2. 헤드스페이스O2 분압의 증가 및 DO 포화도의 후속 상승은 바이오매스 성장의 약간의 과소 평가가 야기될 것으로 예상되었다. 이것은 일곱 가지 예 중 다섯 가지에 대해 사실이었습니다 (표 2). 평균적으로 추정된 바이오매스 성장은 측정된 바이오매스 성장의 10% 이내였다. 일부 추정치는 측정 된 성장과 1-3mg으로 만 달랐습니다. 두 가지 예는 성장을 과대 평가했는데, 즉, 바이오매스 성장이 설명할 수 있는 것보다 더 많은 산소가 생성되었다. 하룻밤 사이에 호흡에 의해 소비된 임의의 O2는 다음날O2 생산에서의 지연에 반영되어야 한다. 여기에서, 실험은 밤의 끝에서 종료되었다. 이런 식으로, 각 실험의 최종 8 h 동안 하룻밤 동안 바이오매스 이화작용은 측정되지 않고 진행된다. 이것은 특히 조밀 한 문화에서 바이오 매스 성장의 과대 평가를 일으킬 수 있습니다. 따라서 조명이 켜진 시간이 끝날 때 실험을 종료하는 것이 좋습니다.
그림 1: 반응기 스탠드 베이스. (A) mm 단위의 베이스 부품의 치수. (B) 두 개의 수직 지지대를 고정하는 금속 코너 거셋의 방향. (C) 네 개의 짧은 강철 길이 중 하나는 PVC 파이프의 뒤쪽 절반을 반응기 스탠드에 연결합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 전기 부품. (A) 상단 크로스 빔 및 전기 부품의 구성을 보여주는 PBR의 백미러. (B) 조명 설치 후 PBR의 정면도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 병 플랫폼 세부 정보 . (A) 상단 및 하단 레이어의 치수(mm. B) 볼트 헤드를 두 레이어로 오목하게 합니다. (C) 중괄호는 PVC 파이프의 후면 절반에 직접 바닥층을 연결합니다. (D) 좁은 볼트 위에 장착 된 다섯 개의 짧은 단단한 튜브 조각은 상단과 하단 층을 분리합니다. (E) 병 플랫폼이 완성되면 표면이 플러시되어야합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 가스 라인 및 샘플링 포트(옵션)입니다 . (A) 가스 라인은 각 병 헤드 스페이스를 외부 가스 센서에 연결합니다. 샘플링 포트가 필요한 경우, 가스 라인은 바늘의 바로 하류에 단방향 밸브를 포함해야합니다. (B) 체적 가스 센서. 액체 포장 수준은 추적 나사에 닿아야합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: LED 제어 소프트웨어 설정과 내부 조명 강도와 관련된 표준 곡선. 흰색 원과 회색 삼각형은 각각 개별 PBR을 나타냅니다. 각 조명 설정에 대해 네 개의 조명기구가 모두 동일한 값으로 설정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 6: 300 μmol광자 m-2 s-1 광정권에 대한 배양 온도 변화. 24 시간, 16:8-h 일주일 프로그램 동안, LED는 주간 배양 온도를 증가시켰다. 파란색 화살표는 최소 온도와 최대 온도의 차이를 나타냅니다. 가벼운 프로그램 오류로 인해 황혼 전에 온도 하락이 발생했습니다. 이것은 실험이 시작되기 전에 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 세 가지 독특한 실험 조건에 대한 산소 생산. 각각의 반응기는 광강도와 초기 바이오매스 농도(IBC)의 상이한 조합을 받았다; (A) 300 μmol 광자 m-2 s-1 및 IBC 0.03 g AFDW L-1, (B) 600 μmol 광자 m-2 s-1 및 IBC 0.13 g AFDW L-1, (C) 600 μmol 광자 m-2 s-1 및 IBC 0.40 gAFDW L-1. 상단 그래프는 누적 산소 생산(mL) 및 가스 유량(mL/h)을 표시합니다. 검은 실선, 파란 파선 및 빨간색 점선은 반복실험입니다. 각 실험의 런타임은 104시간이었으며, 여기에는 4개의 완전한 16:8시간 주야간 사이클이 포함되었습니다. 짙은 주황색 음영은 야간 시간과 밝은 주황색 주간 시간을 나타냅니다. 치료 B에서, 세 번의 반복실험 중 두 차례에 대해 4일째에 산소 생산 플랫라인이 생성된다는 점에 유의한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 8: pH 반응. 각각의 반응기는 광강도와 IBC의 상이한 조합을 받았다; (녹색 다이아몬드) 300 μmol 광자 m-2 s-1 및 IBC 0.03 g AFDW L-1, (적색 삼각형) 600 μmol 광자m2 s-1 및 IBC 0.13 g AFDW L-1, (보라색 원) 600 μmol 광자 m-2 s-1 및 IBC 0.40 gAFDW L-1 . 짙은 주황색 음영은 야간 시간과 밝은 주황색 주간 시간을 나타냅니다. 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 치료 | 광도 (μmol 광자 m-2 s-1) | IBC (gAFDW L-1) | Δ 총 바이오매스 (gAFDW) | Δ pH | 총 산소 생성 (mL) |
| A | 300 | 0.031 | 0.289(± 0.01) | 0.15(± 0.01) | 316.2 (±11.4) |
| B | 600 | 0.130 | 0.674(± 0.02) | 0.52(± 0.27) | 834.6* |
| C | 600 | 0.400 | 0.675(± 0.02) | 0.55(± 0.03) | 902.2 (±50.5) |
| * 세 번의 반복실험 중 하나만 성공했습니다. | |||||
표 1: 성장 메트릭이 시간 0에서 104로 이동. 대괄호는 평균의 표준 오차를 나타냅니다.
| 치료 | 광도 (μmol광자 m-2 s-1) | IBC (gAFDW L-1) | 바이오매스 성장 측정(gAFDW) | 바이오매스 성장 예측(gAFDW) | 과소 평가 (%) |
| A | 300 | 0.031 | 0.289 | 0.288 | 0.5 |
| A | 300 | 0.031 | 0.311 | 0.270 | 13.1 |
| A | 300 | 0.031 | 0.268 | 0.247 | 7.9 |
| B | 600 | 0.13 | 0.708 | 0.705 | 0.4 |
| C | 600 | 0.4 | 0.718 | 0.796 | -10.9 |
| C | 600 | 0.4 | 0.640 | 0.830 | -29.7 |
| C | 600 | 0.4 | 0.668 | 0.659 | 1.3 |
표 2: 총 측정된 산소를 기준으로 한 성장 추정치. 300 μmol광자 m-2 s-1 및 IBC = 0.13 gAFDW L-1 처리로부터 단 하나의 복제만이 완료되었다.
보충 그림 1: LED 제어 소프트웨어의 스크린샷. 네 개의 조명 기구 각각은 조광기 버튼을 슬라이딩하거나 텍스트 상자에 숫자 값을 입력하여 독립적으로 제어할 수 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 2: 데이터 수집 소프트웨어 구성 창의 스크린샷입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 3: 데이터 수집 소프트웨어 로깅 창의 스크린샷입니다. 밝은 녹색 사각형은 온라인 가스 센서를 나타냅니다. 데이터는 실시간으로 표시됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 1: 실시예 24 h 라이트 정권. 16:8 시간 일주 프로그램의 경우 각각 30 분의 48 세트가 있습니다. 별표는 제안된 샘플링 시간을 나타냅니다. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 2: 높은 알칼리도 높은 pH 배지 조성. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 3: 미량 원소 용액. 기본 배지에 1 mL/L의 최종 농도를 첨가하십시오. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
이 프로토콜 내에서 다음 단계에 초점을 맞추면 재현 가능한 고품질 데이터가 생성될 가능성이 높아집니다. 반응기 스탠드를 건설할 때(단계 1), 베이스는 잘 어울리는 수직 지지대와 함께 견고해야 합니다. 슬롯형 강철은 날카로운 모서리를 가지고 있으므로 안전 캡을 추가하는 것이 필수적입니다. 병 플랫폼 표면은 완전히 평평해야하며 마그네틱 교반기와 볼트 헤드는 모두 최상층 표면 아래에 있어야합니다 (3.2-3.6 단계). 제조업체의 지시에 따라 가스 센서 포장 액체는 정확한 산소 측정을 위해 "액체 레벨 추적 나사"에 채워야합니다. 이 액체 수준은 포장 액체의 증발이 측정 셀을 단락시킬 수 있으므로 정기적으로 점검해야합니다. 단계 5.2에서 만들어진 세 개의 가스 라인은 모두 동일한 길이여야 한다; 이것은 복제물이 동일한 헤드 스페이스 볼륨을 갖는 것을 유인합니다. 실험을 시작하기 전에 24시간 동안 광도를 기록하여 프로그래밍된 조명 체계를 테스트하는 것이 좋습니다(단계 6.11). 액체 온도의 증가가 우려되는 경우, 이 시험은 또한 내부 온도 프로브가 있는 밀봉된 병을 포함해야 한다(단계 6.11). 로깅할 때 데이터 수집 소프트웨어 창을 종료하지 마십시오. 이렇게 하면 로깅이 종료됩니다. 배양 샘플을 채취하는 경우, 잘못된 순서로 밸브를 열어 헤드 스페이스 가스를 방출하지 않도록주의하십시오 (단계 8.2-8.8). 실험 데이터를 검토할 때 데이터 수집 소프트웨어는 유량의 이동 평균을 자동으로 생성한다는 것을 알려야 한다. 이것은 하룻밤 사이에 생성 된 하나 또는 두 개의 유량 판독 값의 값을 팽창시킵니다. 큐레이트 가스 센서는 이를 수정하기 위해 수동으로 로그를 기록합니다.
이 방법의 가장 일반적인 단점은 액체 포장 수준이 감소하면 가스 센서가 단락 될 가능성이 있다는 것입니다. 이 문제가 발생할 수 있는 방법에는 두 가지가 있습니다. 첫째, 증발은 천천히 액체 수준을 감소시킬 수 있습니다. 그러나, 이것은 단기(<7일) 실험29에 걸쳐 있을 가능성은 거의 없다. 둘째, 높은 호흡률은 용액으로 산소를 끌어 들여 압력 하에서 헤드 스페이스를 생성 할 수 있습니다. 빛 에너지를 사용할 수 없을 때, 미세조류는 호기성 호흡을 사용하여 세포 유지 및 복구에 필요한 에너지를 공급합니다(28). 따라서 조명되지 않은 시간 동안 조밀 한 문화에서 산소 소비 및 이로 인한 저압은 상당 할 수 있습니다. 이것은 가스 센서에서 가스 라인으로 포장 액체를 빨아들입니다. 포장액이 이동하는 거리는 야간 호흡량에 비례합니다. 포장 액체가 병에 들어가면 액체 표면에 기름이 매끄럽게 생성됩니다.
높은 야간 호흡률이 예상되는 경우 프로토콜을 수정할 수 있습니다. 저압을 피하는 가장 간단한 방법은 병 헤드 스페이스를 밤새 열어 두는 것입니다. 이는 또한O2의 부분적인 헤드스페이스 압력을 감소시킴으로써 DO 레벨을 완화시키는 이점을 갖는다. 높은 DO 농도는O2가 루비스코의 활성을 방해할 수 있고 산화 스트레스(30,31)를 유발할 수 있기 때문에 성장에 해로운 것으로 여겨진다. 문화 현탁액이 대기25,32와 접촉 할 때에도 4x 과포화에 도달하는 것은 드문 일이 아닙니다. 헤드 스페이스를 열려면 고무 마개를 가로 지르는 바늘에서 가스 라인을 분리하십시오. 야간 시간은 가스 센서 포장 액체를 보충하거나 데이터 수집에 거의 영향을 미치지 않고 지속적인 실험을 조작하는 창 역할을 할 수 있습니다. 예를 들어, 배양 밀도를 변경하거나, 영양소를 새로 고치거나, 수정을 추가하거나, 병원균을 도입 할 수 있습니다. 병은 다시 밀봉해야 하며, 조명이 다시 켜지기 전에 가스 센서 라인을 다시 연결해야 합니다. 닫힌 야간 헤드 스페이스와 개방 된 야간 헤드 스페이스를 사용한 실험에서 수집 된 산소 측정은 다를 것입니다.
병이 밀봉 된 채로 남아있을 때, 야간 산소 소비는 헤드 스페이스에서O2의 두더지 수를 감소시킵니다. 이로 인해 포장 액체가 가스 센서 라인으로 기어 올라 헤드 스페이스 압력을 유지합니다. 조명이 켜지면 산소 생산이 재개됩니다. 포장 액체는 유량 판독이 시작되기 전에 가스 센서로 다시 밀어 넣어야합니다. 따라서이 지연은 야간 호흡의 정도에 비례합니다. 이러한 방식으로, 헤드스페이스가 닫힌 채로 남아있을 때, O2 판독값은 순O2 생산(광합성 생산 - 호흡 소비)을 나타낸다. 반대로, 헤드 스페이스가 밤에 열리면 대기 가스가 헤드 스페이스O2가 소비되는 것을 대체하고 포장 액체가 가스 라인에 들어 가지 않습니다. 그 결과 호흡기 O2 소비는O2 생산 데이터에서 설명되지 않는다. 이것은 AFDW 바이오매스 성장 추정치의 정확도를 감소시킬 수 있다. 그러나, 주간O2 생산을 치료 간의 성장을 비교하기 위한 메트릭으로서 사용하는 유용성에 영향을 미치지 않아야 한다.
모든 실험실 PBR은 동일한 제한에 의해 고통 받고 있습니다. 인공 조명은 태양 스펙트럼을 복제 할 수 없습니다. 미세조류는 광합성을 위해 400-700nm 사이의 빛의 파장을 사용합니다. 이 영역을 광합성 활성 방사(PAR)33이라고 한다. 햇빛과 인공 빛은이 범위 내에서 파장의 상대적 기여도에 따라 다릅니다. 이것은 유리한 온도와 일정한 광 공급과 함께 실험실 성장 데이터가 종종 실외 조건에 안정적으로 외삽 될 수 없다는 것을 의미합니다. 그러나 이러한 PBR은 실험실 PBR 전등 공급의 한계 중 하나를 해결할 수 있습니다. 햇빛 강도는 하루 종일 매우 가변적이며, 구름 덮개는 입사 PAR에서 일시적인 변동을 일으 킵니다. 조명 제어 소프트웨어 및 DMX 조명 컨트롤러는 0 ~ 2400 μmol광자 m-2 s-1 이상의 광도를 제공 할 수 있습니다. 빛의 체계는 1 초만큼 짧은 개별 증분으로 나눌 수 있습니다. 조정 가능한 광도를 통해 사용자는 표준 PBR 설정보다 실외 조명 패턴을 더 가깝게 모방 할 수 있습니다. 여기서, 시뮬레이션된 30분 새벽과 황혼 간격은 낮과 밤의 사이클을 함께 퇴색시킨다(보충표 1).
AFDW 밀도가 성장의 표준 척도가 되었지만, 이 방법은 상당한 배양량, 2-3일의 처리 기간을 필요로 할 수 있으며, 한 번에 하나의 데이터 포인트를 생성할 수 있다. 또한, 조건이 불리해지고 세포가 죽으면 AFDW 밀도는 적극적으로 광합성 세포와 분해되는 세포를 구별하지 않습니다. 광합성 산소 생산의 속도를 정량화하는 것은 대안적인 성장 프록시로서 작용한다. 이 PBR 설계는 배양량을 보존하면서 사용자 개입 없이 지속적으로 산소 생산을 기록할 수 있습니다. 데이터 분해능은 더 낮은 측정 셀 부피를 갖는 가스 센서, 예를 들어, 1 mL를 선택함으로써 개선될 수 있다. 또한, 문화권이 잘 혼합되어 있다면, 사용자는 연속적인 광학 밀도 판독을 위해 분광 광도계를 설치하기로 결정할 수 있다. 매체의 온도 제어가 필요한 경우 재순환 냉각기를 추가 할 수 있습니다. 이 PBR은 막대한 재정적 투자없이 미세 조류 연구 능력을 확장하고자하는 실험실에 귀중한 추가 요소입니다. 그들은 스피루리나와 같은 높은 알칼리도, 높은 pH 종으로 일하는 사람들에게 특히 적합합니다. 이 PBR은 가벼운 정권 유연성을 제공하며 신속하고 복제된 실험실 성장 비교에 유효합니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 자연 과학 및 공학 연구위원회 (NSERC), 캐나다 혁신 재단 (CFI), 캐나다 최초의 연구 우수 기금 (CFREF), 앨버타 이노바테스, 존 모나쉬 재단 (John Monash Foundation) 장군, 앨버타 정부 및 캘거리 대학의 지원을 받았다. 전기 작업에 대한 Mark Toonen과 용해도 계산에 대한 William Richardson에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum channels Imperial: 0.90” x 39.37” Metric: 2.3 cm x 100 cm Quantity: 4 |
LED World | AC-AR1-1M | Required as a heat sink |
| Bungee cords, small Quantity: 5 |
- | - | To secure bottles |
| Computer - desktop/laptop Quantity: 1 |
- | - | - |
| Data Logger, HOBO U30 USB Weather Station Quantity: 1 |
HOBO, Hoskin | U30-NRC-VIA-10-S100-000 | Records light sensor information |
| Digital interface module, Rigamo, 4-channel Quantity: 1 |
Ritter | N/A | This is to transmit gas sensor data to the computer |
| DMX decoder, 12~24 VDC, DMX-CV-4X5A Quantity: 1 |
LITECH, LED World | LT-840-6A | Transmit messages which alter the light pattern |
| DMX lighting controller, SUSHI-RB-RJ Quantity: 1 |
Arcolis, Nicolaudie America Inc. | SUSHI-RB-RJ DMX | Encodes the lighting program |
| Gas sensor packing liquid (Silox) Quantity: 1 L |
Ritter | https://www.ritter.de/en/data-sheets/silox | |
| Gas sensor, volumetric Quantity: 3 |
Ritter | MGC-1 V3.4 PMMA (https://www.ritter.de/downloads/mgc-milligascounter-en) | Measures oxygen production |
| Glass bottles, round 1 L with GL45 neck Quantity: 3 |
Corning, Capitol Scientific | 1395-1L | Culture vessels |
| Hardware - end caps for slotted steel Quantity: 10 |
Paulin, Home Depot | 142-612 | To cover sharp edges of slotted steel |
| Hardware - eye hooks Quantity: 6 |
- | - | To secure bottles |
| Hardware - metal corner braces (large) Imperial: 4" x 4" Metric: 10 cm x 10 cm Quantity: 8 |
- | - | Larger brackets to construct metal stand |
| Hardware - metal corner braces (small) Imperial: 2 1/2" x 2 1/2" Metric: 6.4 cm x 6.4 cm Quantity: 6 |
- | - | Small brackets to connect bottle platforms to PVC pipe |
| Hardware - metal corner gussets Imperial: 3" x 3" Metric: 7.6 cm x 7.6 cm Quantity: 6 |
Paulin, Home Depot | 142-616 | Flat brackets to construct metal stand |
| Hardware - piano hinge Imperial: 36" Metric: 91 cm Quantity: 1 |
- | - | Connects two halves of PVC pipe |
| Hardware - rivets Quantity: 40 |
- | - | To attach piano hinge to PVC tubing |
| Hardware - set of bolts, nuts, washers Quantity: 60 |
- | - | Long thin bolts are required to secure bottle platforms around magentic stirrers |
| Hardware - set of bolts, nuts, washers Quantity: 30 |
- | - | Larger shorter bolts are required to build the metal stand |
| LED driver, constant voltage, 96W 24VDC UL Listed IP65 Driver Class 2 regulated power supply Quantity: 1 |
Magnitude Lighting, LED World | CVN96L24DC | Regulates power to the lights |
| LED lights, Cinco Bright LED Flex Strip Quantity: 4 m roll |
EvenBright, LED World | FA128M57-4M-24V-X | Roll is trimmed into 4 x 1 m lengths and secured inside the PVC tube |
| Light meter, handheld with submersible sperical probe Quantity: 1 |
LI-COR | LA-250A | Calibrate the reactors light intensity |
| Light sensors Photosynthetic Light (PAR) Smart Sensor Quantity: 2 |
HOBO, Hoskin | S-LIA-M003 | Only one is required however two would be good practice in case one malfunctioned |
| Magnetic stirrers (MIXdrive 1 XS) with external control units and power supply (MIXcontrol eco) Quantity: 3 |
2Mag, 2MAG USA | MF 40300 | Stirrers sit sandwiched in bottle platforms |
| Metal plate Imperial: 24" x 8" Metric: 61 cm x 20.3 cm Quantity: 1 |
- | - | This is a surface on which to secure electronics, it is attached to the back of the reactor |
| Pipe, white PVC Imperial: 6" diameter x 42" high Metric: 15.2 cm x 106.7 cm Quantity: 1 |
- | - | Cut lengthwise in two halves, used to house lights and bottles |
| Plastic (HDPE) sheets Imperial: 4" x 4" x 1/4" Metric: 10 cm x 10 cm x 1 cm Quantity: 6 |
Inventables | 30291-01 | For bottle platforms which house magentic stirrers |
| Rubber stoppers - GL45 size Quantity: 3 |
Duran, VWR | 76289-760 | Seals culture vessels |
| Screw caps - with aperture and GL45 neck Quantity: 3 |
Corning, Capitol Scientific | 1395-45HTSC | Generates seal of culture vessels |
| Slotted angle steel lengths Imperial: 1-1/2" X 48" x 0.074" Metric: 3.8 cm x 122 cm x 0.19 cm Quantity: 6 |
Paulin, Home Depot | 142-202 | Makes up the body of the metal stand |
| Slotted flat steel lenghts Imperial: 1-3/8" x 48" x 0.074" Metric: 3.5 cm x 122 cm x 0.19 cm Quantity: 3 |
Paulin, Home Depot | 142-222 | Makes up the body of the metal stand |
| Software - Easy Stand Alone (ESA) | https://www.dmxsoft.com/#apps | AKA LED control software | |
| Software - Rigamo v3.1 | AKA data acquisition software | ||
| Software - Storage Upgrade Tools (SUT) | https://store.dmxsoft.com// | ||
| Stir bar Imperial: 1" x 5/16" Metric: 2.5 cm x 0.8 cm Quantity: 3 |
Fisherbrand | 14-513-59 | Stirs culture |
| Switch box Quantity: 1 |
- | - | Turns power on/off to reactor |
| Syringe, 10 mL Quantity: Multiple |
- | - | Optional if you wish to extract culture |
| Tube adaptor fittings, plastic - Stopcock 1-way Quantity: 6 |
Masterflex, Cole Palmer | RK-12023-33 | Close/open culture vessel line |
| Tube adaptor fittings, plastic - variety of male and female luer lock fittings Imperial: to fit 1/16" and 1/8" ID tubing Metric: to fit 1.59 mm and 3.18 mm tubing Quantity: Multiple packets |
Masterflex, Cole Palmer | RK-30800-16; RK-30800-18; RK-45518-26; RK-45501-00; RK-45501-04 | Many different combinations can achieve the same end result, best to order a variety of fittings |
| Tube adaptor fittings, plastic - variety of straight connectors Imperial: to fit 1/16" and 1/8" ID tubing Metric: to fit 1.59 mm and 3.18 mm tubing Quantity: Multiple packets |
Masterflex, Cole Palmer | RK-40616-04 | Many different combinations can achieve the same end result, best to order a variety of fittings |
| Tubing, flexible, transparent Imperial: ID=1/16", OD=1/8" Metric: ID = 1.59 mm, 0D = 3.18 mm Quantity: 4 m |
Masterflex, Cole Palmer | RK-06422-02 | Line from culture vessel to gas sensor |
| Tubing, flexible, transparent Imperial: ID=1/8", OD=1/4" Metric: ID = 3.18 mm, 0D = 6.35 mm Quantity: 2 m |
Masterflex, Cole Palmer | RK-06422-05 | Gas sensor standard tubing size |
| Tubing, rigid, transparent Imperial: ID=1/16", OD=1/8" Metric: ID = 1.59 mm, 0D = 3.18 mm Quantiy: 1 m |
Masterflex, Cole Palmer | RK-06605-27 | Spans rubber stopper allowing gas to exit |
| Tubing, rigid, transparent Imperial: ID=1/8", OD=1/4" Metric: ID = 3.18 mm, 0D = 6.35 mm Quantity: 1 m |
Masterflex, Cole Palmer | RK-06605-30 | Spans rubber stopper allowing gas to exit |
| Zip ties, small Quantity: 1 packet |
Secure tube fittings |
References
- Benemann, J. R. Opportunities and challenges in algae biofuels production. A position paper in line with Algae World. , (2008).
- Laurens, L. M. L. State of technology review - algae bioenergy. An IEA bioenergy inter-task strategic project. IEA Bioenergy. , (2017).
- Robertson, D. E., et al. A new dawn for industrial photosynthesis. Photosynthesis Research. 107, 269-277 (2011).
- Troschl, C., Meixner, K., Drosg, B. Cyanobacterial PHA production-review of recent advances and a summary of three years' working experience running a pilot plant. Bioengineering. 4 (2), (2017).
- Rizwan, M., Mujtaba, G., Memon, S. A., Lee, K., Rashid, N. Exploring the potential of microalgae for new biotechnology applications and beyond: a review. Renewable and Sustainable Energy Reviews. 92, 394-404 (2018).
- Niesa, F., et al. Characterization of Phormidium lacuna strains from the North Sea and the Mediterranean Sea for biotechnological applications. Process Biochemistry. 59, 194-206 (2017).
- Laurens, L. M. L., Chen-Glasser, M., McMillan, J. D. A perspective on renewable bioenergy from photosynthetic algae as feedstock for biofuels and bioproducts. Algal Research. 24, 261-264 (2017).
- Barreiro-Vescovo, S., Barbera, E., Bertucco, A., Sforza, E. Integration of microalgae cultivation in a biogas production process from organic municipal solid waste: From laboratory to pilot scale. ChemEngineering. 4 (2), 26 (2020).
- Zurano, A. S., et al. Year-long assessment of a pilot-scale thin-layer reactor for microalgae wastewater treatment. Variation in the microalgae-bacteria consortium and the impact of environmental conditions. Algal Research. 50, (2020).
- Deprá, M. C., Severo, I. A., Dias, R. R., Zepka, L. Q., Jacob-Lopes, E. Photobioreactor design for microalgae culture. Microalgae. , Elsevier. 35-61 (2021).
- Osburn, F. S., Wagner, N. D., Scott, J. T. Biological stoichiometry and growth dynamics of a diazotrophic cyanobacteria in nitrogen sufficient and deficient conditions. Harmful Algae. 103, (2021).
- Eustance, E., Badvipour, S., Wray, J. T., Sommerfeld, M. R. Biomass productivity of two Scenedesmus strains cultivated semi-continuously in outdoor raceway ponds and flat-panel photobioreactors. Journal of Applied Phycology. 28 (3), 1471-1483 (2016).
- Qiang, H., Richmond, A., Zarmi, Y. Combined effects of light intensity, light-path and culture density on output rate of spirulina platensis (cyanobacteria). European Journal of Phycology. 33 (2), 165-171 (1998).
- Ooms, M. D., Dinh, C. T., Sargent, E. H., Sinton, D. Photon management for augmented photosynthesis. Nature Communications. 7, 1-13 (2016).
- Moheimani, N. R., Borowitzka, M. A., Isdepsky, A., Sing, S. F. Standard methods for measuring growth of algae and their composition. Algae for biofuels and energy. , Springer. Dordrecht. 265-284 (2013).
- Griffiths, M. J., Garcin, C., van Hille, R. P., Harrison, S. T. L. Interference by pigment in the estimation of microalgal biomass concentration by optical density. Journal of Microbiological Methods. 85 (2), 119-123 (2011).
- Schumann, R., Häubner, N., Klausch, S., Karsten, U. Chlorophyll extraction methods for the quantification of green microalgae colonizing building facades. International Biodeterioration and Biodegradation. 55 (3), 213-222 (2005).
- Pinckney, J. L., Richardson, T. L., Millie, D. F., Paerl, H. W. Application of photopigment biomarkers for quantifying microalgal community composition and in situ growth rates. Organic Geochemistry. 32 (4), 585-595 (2001).
- Van Wychen, S., Laurens, L. M. L. Determination of total solids and ash in algal biomass: laboratory analytical procedure (LAP). National Renewable Energy Laboratory. , Golden, CO. (2015).
- Davis, R., Laurens, L. Algal biomass production via open pond algae farm cultivation: 2019 state of technology and future research. National Renewable Energy Laboratory. , Golden, CO. (2020).
- Borovkov, A. B., Gudvilovich, I. N., Avsiyan, A. L. Scale-up of Dunaliella salina cultivation: from strain selection to open ponds. Journal of Applied Phycology. 32 (3), 1545-1558 (2020).
- Davies, F. K., et al. Microbiota associated with the large-scale outdoor cultivation of the cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002. Algal Research. 58, (2021).
- Ataeian, M., et al. Direct capture and conversion of CO2 from air by growing a cyanobacterial consortium at pH up to 11.2. Biotechnology and Bioengineering. 116 (7), 1604-1611 (2019).
- Fu, F., et al. Sustained photosynthesis and oxygen generation of microalgae-embedded silk fibroin hydrogels. ACS Biomaterials Science & Engineering. , (2021).
- Rearte, T. A., et al. Photosynthetic performance of Chlorella vulgaris R117 mass culture is moderated by diurnal oxygen gradients in an outdoor thin layer cascade. Algal Research. 54, (2021).
- Poughon, L., et al. Limnospira indica PCC8005 growth in photobioreactor: model and simulation of the ISS and ground experiments. Life Sciences in Space Research. 25, 53-65 (2020).
- Yen, U. C., Huang, T. C., Yen, T. C. Observation of the circadian photosynthetic rhythm in cyanobacteria with a dissolved-oxygen meter. Plant Science. 166 (4), 949-952 (2004).
- Vermaas, W. F.
- Ritter, MilliGascounter Type MGC-1 Operation Instructions V 3.4. , (2017).
- Sousa, C., De Winter, L., Janssen, M., Vermuë, M. H., Wijffels, R. H. Growth of the microalgae Neochloris oleoabundans at high partial oxygen pressures and sub-saturating light intensity. Bioresource Technology. 104, 565-570 (2012).
- Latifi, A., Ruiz, M., Zhang, C. C.
- Morillas-España, A., Lafarga, T., Gómez-Serrano, C., Acién-Fernández, F. G., González-López, C. V. Year-long production of Scenedesmus almeriensis in pilot-scale raceway and thin-layer cascade photobioreactors. Algal Research. 51, (2020).
- Melis, A. Solar energy conversion efficiencies in photosynthesis: minimizing the chlorophyll antennae to maximize efficiency. Plant Science. 177 (4), 272-280 (2009).
