Summary
פרסום זה מתאר את התכנון של פוטו-ביוריאקטורים מעבדתיים (PBRs) עם משטרי אור הניתנים להתאמה אישית. הצמיחה של ציאנובקטריה או מיקרו-אצות, תוך שימוש בביקרבונט כמקור הפחמן שלהם, מנוטרת באופן רציף על ידי מדידת ייצור חמצן נפחי. PBRs אלה מאפשרים השוואות מהירות ומשוכפלות של צמיחת מעבדה עם התערבות מועטה של משתמשים במהלך ניסויים.
Abstract
מחקר המעבדה של מיקרו-אצות יכול להיות מאתגר מבחינה ניסיונית. בנוסף לדרישות הטיפוח של מיקרואורגניזמים שאינם פוטוסינתטיים, פוטוטרופים דורשים גם תאורה. באופן שגרתי, חוקרים מבקשים לספק אספקת אור מותאמת אישית, כלומר לשנות את עוצמת האור ואת הזמן שבו הוא מועבר. גמישות כזו קשה עם אורות ספסל סטנדרטיים. בדרך כלל, מחקרי טיפוח דורשים גם השוואות גדילה בין טיפולים ניסיוניים. לעתים קרובות, הצמיחה מוערכת על פני משך זמן ממושך, למשל, מספר פעמים ביום במהלך ניסוי שנמשך שבוע. מדידות ידניות יכולות לגזול זמן רב וחסרות רזולוציית נתונים. לכן, פוטו-ביוריאקטורים (PBRs) עם ניטור גדילה אוטומטי ואספקת אור הניתנת להתאמה אישית שימושיים לניסויים משוכפלים עם טיפולים מרובים. העבודה הנוכחית מציגה את התכנון, הבנייה והתפעול של PBRs במעבדה. החומרים הם ממקור קל וזולים יחסית. ניתן לשכפל את העיצוב במיומנות מתונה. לכל מבנה יש טביעת רגל של כ-40 ס"מ2 והוא מארח שלושה בקבוקי זכוכית בנפח 1 ליטר לשכפול משולש. הבקבוקים נשענים על פלטפורמות המכילות מערבלים מגנטיים ומסודרים אנכית בתוך צינור פוליוויניל כלוריד (PVC) בגובה 1 מטר ובקוטר 15 ס"מ. פנים הצינור מרופד בדיודות פולטות אור (נוריות LED). נוריות LED אלה מייצרות עוצמות אור מתמשכות של 0-2400 מיקרומול פוטונים m-2 s-1 של קרינה פעילה פוטוסינתטית (PAR). משתמשים מעצבים תוכנית תאורה מותאמת אישית. ניתן לכוונן את עוצמת האור בכל שנייה או להחזיק אותה קבועה לפרקי זמן ארוכים יותר. חמצן המופק מפוטוסינתזה יוצא מכל בקבוק באמצעות חיישן גז נפחי חד-כיווני. התוכנה משמשת לתיעוד נתוני חיישן גז. כמות החמצן המיוצרת יכולה להיות מתואמת עם צמיחת ביומסה. אם נדרשות דגימות ביומסה, ניתן להשתמש במזרק כדי לחלץ תרבית. השיטה מתאימה למיקרו-אצות הגדלות עם ביקרבונט כמקור הפחמן. PBRs אלה הם בעלי ערך למעבדה הדורשת ניסויים משוכפלים, גמישות במשטר האור ונתוני צמיחה רציפים ברזולוציה גבוהה.
Introduction
מיקרו-אצות וציאנובקטריה, הנקראות יחד מיקרו-אצות לצורך פשטות, דוגלות בפוטנציאל שלהן בביוטכנולוגיה בת-קיימא. הם מועמדים אטרקטיביים בשל צמיחתם המהירה, יכולתם להיות מעובדים על אדמה שאינה ניתנת לעיבוד, ועל השימוש שלהם באור השמש כדי להניע את ההמרה של פחמן דו חמצני לביומסה 1,2,3. ביומסה מיקרואלגלית יכולה להיות מומרת למוצרים כגון ביו-אנרגיה בצורה של נפט או גז, צבעי מזון ותוספי תזונה, וחומרים כגון ביופולימרים 1,4,5,6,7. בנוסף, הם יכולים לשמש לטיפול בשפכים או לתיקון גופי מים על ידי צריכת עודפי חומרים מזינים 8,9. בהתחשב בכך, מחקר microalgal הוא נפוץ ומבוסס. התחום גדל ככל שהחברה שוקלת מחדש את עוצמת הפחמן והקיימות הסביבתית של גישות הייצור וייצור האנרגיה הנוכחיות.
שלוש דרישות בסיסיות של מחקרים מיקרו-גלגליים מבוססי מעבדה הן כלי תרבית, מקור אור ושיטה לכימות הצמיחה. המונח פוטו-ביוריאקטור (PBR) מתאר מערך שבו כלי התרבות מוארים10. בדרך כלל, מחקרים על מיקרו-אצות שואפים להשוות צמיחה בין שני טיפולים או יותר, למשל, מדיית גדילה שונה, משטרי אור או מינים 11,12,13. עבור רלוונטיות סטטיסטית, יש לשכפל כל מצב, למשל, טיפול ובקרה. אם הבקרה והטיפול מופעלים בו-זמנית, משמעות הדבר היא שיש לנטר ולדגום PBRs רבים למשך הניסוי. האתגר בהפעלת מספר PBRs הוא כפול. ראשית, אספקת עוצמת אור אחידה לכל PBR חיונית לשכפול, אך עלולה להיות קשה. כמות תקריות האור על פני הכלי מושפעת מהמרחק שלה ממקור האור, מהצללה מכלי שיט סמוכים ומתנודות אור הרקע14. שנית, יש לבחור שיטה לכימות מדויק של הצמיחה.
גדילה נמדדת בדרך כלל על ידי ספירת תאים, צפיפות אופטית (OD), תכולת כלורופיל A, צפיפות משקל יבש (DW) וצפיפות משקל יבש ללא אפר (AFDW)15. ספירת תאים, תוכן כלורופיל A ושיטות גרבימטריות הם תהליכים ידניים המייצרים נקודות נתונים בדידות. ניתן למדוד OD באופן רציף ולא פולשני באמצעות ספקטרופוטומטר, בתנאי שהוא מכויל היטב נגד שיטה אחרת כגון צפיפות AFDW15. עם זאת, מדידות OD ותכולת כלורופיל A יכולות להיות לא אמינות מכיוון שהתוצאות משתנות בתנאי תרבית שונים, למשל, בין מינים ולאורך מחזור הגידול15,16. עבור כלורופיל A, שיטת המיצוי יכולה להשפיע גם על תפוקת הפיגמנט17. תכולת כלורופיל A שימושית במיוחד למעקב אחר צמיחתן של מיקרו-אצות בתוך קהילות מיקרוביאליות המכילות גם אורגניזמים שאינם פוטוסינתטיים17,18. בעת בחירת שיטה לקביעת הצמיחה, חיוני לשקול את המורפולוגיה של ההשעיה. כאשר אורגניזמים מתגבשים ואינם מעורבבים היטב, ספירת OD ותאים אינה אפשרית15. שיטה אחת אינה מתאימה לכל היישומים הניסוייים – על החוקרים להחליט אילו שיטות הן מעשיות ורלוונטיות למטרות הניסוי שלהם.
AFDW היא שיטה אמינה המאפשרת השוואות צמיחה בין תנאי תרבות שונים, במיוחד בין מינים לתרביות 15,19,20. כדי לחשב AFDW, דגימה של תרבית מיקרואלגלית מרוכזת תחילה, על ידי סינון או צנטריפוגה, ומיובשת. בשלב זה, ניתן לקבוע את ה- DW. בדרך כלל, דגימת ה-DW מכילה לפחות 8-10% חומר אפר-אנאורגני כגון מלחים וחומר חלקיקי15. DW עוקב אחר מגמות צמיחה אך יכול להיות מוטה אם התרומה של אנאורגניים משתנה. כדי לקבוע את צפיפות AFDW, ביומסה יבשה בוערת בטמפרטורה גבוהה; זה מאדה את החלק האורגני או השימושי תוך השארת אפר (אנאורגני) מאחורי19. כדי לחשב את ה- AFDW, משקלו של שבר האפר מופחת מזה של שבר ה- DW. בדרך כלל, במתלים מיקרו-גלגליים, AFDW נע בין 0.1-3 גרם לליטר 12,21,22. כמויות קטנות של תרחיפים מדוללים מניבות מעט ביומסה יבשה, <10 מ"ג. לאחר הבעירה, אפר עשוי לשקול רק 1 מ"ג. לכן, בהתאם לצפיפות התרבית, שיטה זו דורשת נפחים בין 5-100 מ"ל וסולמות אנליטיים מדויקים עד 0.1 מ"ג 12,15,19,22. PBRs במעבדה הם בדרך כלל קטנים, כמה ליטרים לכל היותר, ולכן כל דגימה נוזלית מדלדלת את נפח התרבית. יתר על כן, שיטת AFDW היא ידנית ונמשכת 2-3 ימים. עבור ניסויים משוכפלים וחוזרים על עצמם, עדיף תהליך אוטומטי ורציף.
עבור מיקרו-אצות המשתמשות בביקרבונט כמקור הפחמן, ניתן למדוד שני מדדי גדילה נוספים באופן רציף. פוטוסינתזה צורכת ביקרבונט ומייצרת חמצן. צריכת ביקרבונט מעלה את ה-pH23 הבינוני. בדיקת pH שקועה יכולה למדוד את השינוי הזה. ייצור חמצן פוטוסינתטי מעלה את ריכוז החמצן המומס (DO) של המדיום עד שהמדיום רווי. מעבר לרוויה, חמצן קיים כבועות. ייצור חמצן נמדד על ידי טכניקות רבות ושונות: בדיקות מודדות ריכוז DO, מכשירים מנומטריים מעריכים את לחץ מרחב הראש, כרומטוגרפיית גז מודדת את הרכב מרחב הראש, וחיישנים נפחיים רושמים זרימת גז 24,25,26,27. כאשר חמצן משמש כמיופה כוח לצמיחה, כלי התרבית חייבים להיות אטומים לחלוטין או לאפשר רק זרימת גז. עבור מדידות pH וחמצן, פחמן חייב להיות מסופק בצורה של ביקרבונט, לא על ידי CO2 sparging. התפשטות CO2 מפחיתה את ה-pH23 הבינוני, וכגז, עלולה להפריע למדידות החמצן. אחד היתרונות של pH וחמצן על פני צפיפות אופטית הוא שהשיטה אינה נפגעת אם מיקרו-אצות יוצרות גושים. למרות שהם עקיפים, גם pH וגם חמצן יעילים בהשוואת גדילה בין טיפולים.
PBRs בשימוש כיום טווח במורכבות. מעבדות עשויות להשתמש בבקבוקי ספסל פשוטים, באב טיפוס מותאם אישית או במוצרים הזמינים מסחרית. עבור קבוצות מחקר המבקשות לשדרג מצלוחיות, העלות של PBRs מסחריים או מיומנות טכנית וייצור חלקים הנדרשים לבניית אבות טיפוס רבים עשויים להוות מחסום. כתב יד זה נועד לתאר את התכנון, הבנייה והתפעול שלב אחר שלב של PBRs במעבדה המגשרים על פער זה. ל-PBRs אלה יש משטר אור הניתן להתאמה אישית והם מנטרים את הצמיחה באופן רציף על ידי רישום ייצור חמצן נפחי. עיצוב זה מכיל שלושה כלי תרבות לשכפול משולש וניתן לבנות אותו במיומנות מתונה ובחומרים נגישים בקלות. PBR זה הוא תוספת רבת ערך למעבדה המעוניינת להרחיב את יכולתה למחקר מיקרו-גלגלי מבלי להשקיע במוצרים טכניים מאוד או יקרים. כאשר בוחרים לרכוש או לבנות PBR, על החוקרים לשקול את התאמתו של עיצוב לתנאי התרבות שלהם, למצבם הכספי ולשאלות המחקר שלהם.
Protocol
1. בניית מעמד ה-PBR
- בעזרת מסור כף יד, חתכו חמישה אורכי 380 מ"מ ושני אורכי 200 מ"מ של פלדה מחורצת זוויתית. מהדקים יחד עם ברגים וסדים פינתיים גדולים כדי ליצור את בסיס המעמד (איור 1A). דבק על מכסי קצה בטיחות.
- חבר לבסיס שני אורכים אנכיים לא חתוכים (1220 מ"מ) של פלדה מחורצת זוויתית. אובטחו בעזרת ברגים ופינות מתכת (איור 1B). דבק על מכסי קצה בטיחות.
- חתכו ארבעה אורכים שטוחים של 65 מ"מ של פלדה מחורצת. הברג אותם בזוויות של 90° על התמיכות האנכיות – חברו שניים לכל תמיכה, אחד בקוטר 130 מ"מ למעלה מהבסיס (איור 1C) ואחד בקוטר 60 מ"מ מלמעלה.
- הדקו תמיכות אנכיות לרוחב החלק העליון שלהם באמצעות אורך אופקי של 140 מ"מ של פלדה מחורצת שטוחה (crossbeam) המוברגת לחלק האחורי של המסגרת (איור 2A).
2. בניית תא האור
- חותכים צינור פוליוויניל כלוריד לבן בקוטר 153 מ"מ (PVC) לאורך של 1070 מ"מ. חותכים את הצינור לשני אורך עם מסור. חול את כל הקצוות.
- באופן שווה שטח ומרכז ארבעה צלעות קירור מאלומיניום מתעלים אנכית יחד עם פנים הצינור. אין לחבר תעלות בטווח של 20 מ"מ מהקצה החתוך של הצינור. בעזרת ברגים קטנים, אבטחו את הערוצים במקומם בחלק העליון והתחתון שלהם (איור 2B).
- הבריח מחצית מהצינור למעמד באמצעות התמיכות האופקיות המעוצבות בשלב 1.3.
- הניחו את הכור ואחדו מחדש את חצאי הצינור על ידי הצמדתם זה לזה. מרכזים את ציר הפסנתר לאורך קו חתך אחד. עקבו אחר חורי הציר וקדחו את הצינור בהתאם. השתמש באקדח מסמרים ומסמרות באורך בינוני כדי להדק את הציר לצינור.
- השתמשו בכבל באנג'י קטן (ראו טבלת חומרים) כדי לסגור את הצינור (איור 1C).
- התייעץ עם חשמלאי כדי לחבר את נורות ה-LED ולהתקין את ארבעת הרכיבים הבאים: דרייבר LED, מפענח מולטיפלקס דיגיטלי (DMX), בקר תאורת DMX ותיבת מתגים (ראו טבלת חומרים). תקן את כל הרכיבים בחלק האחורי של ה-PBR לפי איור 2A.
3. בניית פלטפורמות הבקבוקים
- חתכו את צורות הפלטפורמה (איור 3A) מפלסטיק קשיח, למשל פוליאתילן בצפיפות גבוהה (HDPE) (ראו טבלת חומרים), באמצעות כרסום בקרה נומרית ממוחשבת (CNC). הכינו שלושה מכל צורה.
הערה: מומלץ לחתוך שכבות עליונות ותחתונות רזרביות. - הדביקו את השכבה התחתונה והעליונה יחד. סמנו וקדחו חמישה חורים קטנים, בקוטר 6 מ"מ, דרך שתי הצורות (איור 3A). באמצעות מקדחה גדולה יותר, הרחיבו בזהירות את פני השטח של החורים האלה כך שניתן יהיה לשקוע את ראשי הברגים (איור 3B).
- עבור כל אחת משלוש הפלטפורמות, הבריחו שני פלטות פינתיות קטנות לחצי האחורי של הצינור.
הערה: המרחק בין החלק העליון של הפלטה צריך להיות 350 מ"מ. - מרכזים כל שכבה תחתונה על גבי הפלטה שלה. סמן את מיקום חורי הקידוח מתחת לסד. לקדוח שני חורים בקוטר 6 מ"מ. באמצעות מקדחה גדולה יותר, הרחב בזהירות את פני השטח של החורים כך שניתן יהיה לשקוע ברגים.
- שכבות תחתונות בורגיות לסדים שלהן (איור 3B–C).
- חתכו חמש עשרה חתיכות של צינורות קשיחים באורך 12 מ"מ בקוטר חיצוני (OD). יש לכרוך חמש חתיכות של הצינור הנוקשה בין כל שכבה עליונה ותחתונה. הדקו שכבות וצינורות יחד עם ברגים צרים וארוכים לפי איור 3B–D.
- לקדוח חור גדול בצינור PVC מאחורי כל פלטפורמה. הכנס כל מערבל מיקרו מגנטי לתוך הפלטפורמה שלו. משחילים את כבל החשמל של כל מערבל דרך החורים החדשים שנחתכו (איור 3C–E). חבר כל מערבל ליחידת הבקרה המתאימה לו, כמו גם לשקע חשמל.
- הניחו בקבוק 1 ליטר על כל פלטפורמה. הוסיפו ברגי עיניים בצינור האחורי בגובה צוואר הבקבוק. עוטפים כבל באנג'י קטן סביב כל צוואר בקבוק כדי להוסיף יציבות (איור 4A).
הערה: לאורך כל הפרוטוקול, פלטפורמות קידוד צבע, בקבוקים, מערבלים מגנטיים וכל הכבלים והחיישנים הקשורים יהיו מועילים.
4. בניית יציאות הדגימה הנוזליות (אופציונלי)
- חתכו שלושה אורכי 60 מ"מ של צינורות קשיחים של 6.35 מ"מ OD. באמצעות מקדחה 5 מ"מ, לקדוח חורים דרך כל פקק גומי. לדחוף אורכי צינור נוקשה דרך הפקק.
- חותכים שלושה אורכי 60 מ"מ של צינורות קשיחים OD של 3.18 מ"מ. חברו אותם באמצעות מפחית ישר לצינור הבולט בחלק התחתון של כל פקק.
- הכנס שסתום עצירה חד-כיווני (לדוגמה, יציאה 1 = Luer נקבה, יציאה 2 = החלקה זכרית Luer) בצינור הבולט על כל משטח פקק (איור 4A).
- חתכו שלושה אורכי 30 מ"מ של צינורות גמישים OD בגודל 3.18 מ"מ. הכנס אביזרי Luer (למשל, Luer זכר כדי צינור barb ו נקבה Luer כדי צינור barb) משני הצדדים.
- חברו את החלקים שיוצרו בשלב 4.4 לשסתומי ה-stopcock על פני השטח של כל פקק גומי (איור 4A).
הערה: שילובים רבים של סטופקוק ואביזרי לואר יכולים להפיק את אותה תוצאה. העיצוב צריך לאפשר שליפה או החדרה של נוזלים באמצעות מזרק.
5. חיבור חיישני גז נפחיים
- הכן חיישני גז על פי הוראות היצרן.
הערה: זה כולל בעיקר מילוי חיישני גז בנוזל אריזה (איור 4B). - כדי להפוך את קווי הגז, חתכו שלושה אורכי 1000 מ"מ של צינורות גמישים של 3.18 מ"מ OD.
- לקדוח שלושה חורים בקוטר 4 מ"מ בצינור PVC האחורי. מקם חורים ליד הציר בגובה צוואר הבקבוק. השחלת קווי גז דרך החורים האלה (איור 4A).
- עד סוף קו הגז בתוך צינור ה-PVC, הוסיפו מתקן Luer (לדוגמה, מוט צינור ל-Luer זכר) וכתבו שסתום עצירה חד-כיווני (לדוגמה, יציאה 1 = נקבה Luer, יציאה 2 = לואר זכר).
הערה: השסתום נדרש רק כאשר מותקנות גם יציאות דגימה נוזליות. - חברו את הקצה השני של קו הגז ליציאת הכניסה של חיישן הגז באמצעות מפחית ישר. אבטח חיבור זה באמצעות עניבת רוכסן.
- חבר את כל חיישני הגז למודול הקלט הדיגיטלי (DIM) באמצעות כבלי תקע שקע ואת ה-DIM למחשב סמוך.
- התקן את תוכנת רכישת הנתונים (ראה טבלת חומרים) במערכת הפעלה של Windows וחבר את פלאג מפתח הרישוי. הוסף קבצי כיול חיישנים לספריית הכיול של התוכנה.
6. תכנות משטר האור
- באמצעות מתג ההפעלה/כיבוי האחורי, הפעל את ה-PBR וחבר את בקר התאורה DMX למחשב באמצעות כבל micro-USB.
- הורד את כלי השדרוג של החנות (SUT) ואת תוכנת בקרת ה- LED (ראה טבלת חומרים). רשום את בקר התאורה DMX באופן מקוון.
- פתח את תוכנת בקרת ה- LED ובחר לחץ כאן כדי לעבוד עם ממשק USB-DMX: SUSHI-RB-RJ.
- תחת הכרטיסיה הגדרה בתיבה ScanLibrary , בחר את התיקיה הכללית ואת ערוץ יחיד. שנה את הגדרות ScanLibrary ליקום DMX 1, את מספר האביזרים ל-4 ואת מספר האינדקס ל-1. בפינה השמאלית העליונה, שנה את התיבה הנפתחת לתצוגת רשימה. לבסוף, לחץ על תיקון (איור משלים 1).
הערה: ביקום DMX, תיבה אחת בודקת את השליטה של כל רצועת LED על-ידי החלקת לחצני העמעם או הזנת ערך מספרי לתוך תיבת הטקסט. - צרו עקומה סטנדרטית המקשרת את הגדרת האור הדיגיטלי בתוכנת בקרת התאורה לעוצמת האור שנחווית במרכז שפופרת ה-PVC (איור 5). מדוד את עוצמת האור הפנימית באמצעות גשושית כדורית קטנה (ראו טבלת חומרים) התלויה במרכז צינור ה-PVC.
- התקדם לכרטיסיה 'עורך '. כדי לבנות תוכנית תאורה מותאמת אישית, צור סצנה חדשה והתחל להוסיף שלבים. עיין בטבלה משלימה 1 לקבלת תוכנית יומית לדוגמה של 16:8 שעות. הגדר את הסצנה ללולאה.
הערה: שלבים מפרקים סצנות לגושי זמן, שכל אחד מהם יכול להיות מוגדר לעוצמת אור שונה. המדרגות נעות בין 1 שניות ל -43 דקות. כאן, צעדים של 30 דקות הם הנוחים ביותר. ניתן לטעון סצנות מרובות על התקן בקר תאורת DMX אחד. - צור סצנת עוזר נוספת הניתנת לזיהוי מיידי, למשל, שתיים מתוך ארבע נוריות ה- LED המופעלות.
הערה: ניתן לסרוק את הסצנות באופן ידני באמצעות הכפתור בצד בקר התאורה DMX. אם תוכנית האור הרצויה מתחילה במהלך הלילה, לא ניתן יהיה להבחין אם תוכנית האור כבר החלה. סצנת העוזר משמשת כאינדיקטור לכך שבקר התאורה DMX פועל כראוי. - שמור את הסצנות והתקדם לכרטיסייה 'עומד לבד '. כתוב את הזיכרון של בקר התאורה DMX ונתק את ההתקן מהמחשב.
- חבר את בקר התאורה DMX למקור החשמל שלו באמצעות מיקרו-USB.
- לפני תחילת הניסוי, בדקו את תוכנית האור על ידי רישום עוצמת האור הפנימית למשך 24 שעות. אם הטמפרטורה הנוזלית מעניינת, רשמו זאת בו-זמנית עם בדיקת טמפרטורה שקועה (איור 6).
7. התחלת ניסוי
- לעקר מדיה, בקבוקים, מוטות ערבוב, פקקי גומי, יציאות דגימה, פקקי צמצם מושחלים וצינורות.
הערה: כל הרכיבים המשמשים בעיצוב זה ניתנים לטיפול אוטומטי, למעט השסתומים ואביזרי Luer - קיימות חלופות הניתנות להתאמה אוטומטית מיצרנים אחרים. - פתחו את תוכנת רכישת הנתונים ומלאו את דף התצורה (איור משלים 2). הקצה קבצי כיול לחיישנים המתאימים להם.
- תחת שם קובץ הספריה בחר את תיקיית מספר יציאת DIM המתאימה. לחץ על התיקיה הנוכחית וחזור על הפעולה עבור כל היציאות.
- לחץ על אישור כדי לעבור לדף הרישום.
- יש למלא את הבקבוקים לנפח הרצוי במדיום הטיפוח (טבלאות משלימות 2,3).
הערה: כל אחד מבקבוקים אלה יכיל מקסימום ~ 1.1 ליטר עם מרווח ראש קטן (~ 80 מ"ל, כולל קו הגז). - צנטריפוגה של תרבות המניות בשלושה צינורות מאוזנים של 50 מ"ל למשך 15 דקות ב-4500 x g כדי להניב שלושה כדורים. מוסיפים כדור אחד לכל בקבוק – שוטפים בכדורים עם פיפטה סרולוגית ומדיום טרי.
הערה: צפיפות התרבית של היום 0 ידועה גם כריכוז הביומסה הראשוני (IBC). כדי למדוד את ה- IBC ב- gAFDW. L-1, צינור נוסף של 50 מ"ל עשוי להיות צנטריפוגה בשלב 7.6. לאחר מכן ניתן לייבש את הכדור שנוצר ולהבעיראותו 15,19. שלב 7.6 ידרוש ככל הנראה שינוי בהתבסס על המטרות האישיות של המשתמשים והניסויים שלהם. - שחררו מערבל מגנטי, 25 x 8 מ"מ, לכל בקבוק.
- אטמו כל פתח בקבוק באמצעות פקק גומי ופקק בורג בעל פתח צמצם מושחל (איור 4A). אם מותקנות יציאות דגימה אופציונליות, סגור את השסתומים.
- אתרו את הקצה של כל קו גז בתוך צינור ה-PVC (המובנה בשלב 5.4) והצמידו מחט ליציאת Luer הזכרית של השסתום.
- חבר כל בקבוק לחיישן הגז שלו על ידי פירסינג כל פקק גומי עם המחט המתאימה.
- הפעל כל חיישן גז בנפרד על-ידי סימון תיבת הסימון בצד שמאל של המסך, לחיצה על התחל והזנת שם קובץ. לחץ על אישור וחזור על הפעולה עבור כל החיישנים (איור משלים 3).
הערה: בעת ההרשמה, אל תצא מחלון רכישת הנתונים. הגדר את הגדרות החשמל והשינה של המחשב כך שלעולם לא ידחו את עדכוני המחשב למשך הניסוי. - הפעילו את ה-PBR וודאו שבקר התאורה DMX מחובר לספק כוח. הסצנה המתוכנתת הראשונה תתחיל באופן אוטומטי. עיין בשלב 6.7 כדי לוודא שבקר התאורה DMX פועל כראוי.
8. דגימת בקבוקים (אופציונלי)
- הכן 500 מ"ל נוספים של המדיום הטרי לפני תחילת הניסוי (טבלה משלימה 2).
הערה: אם תוכנית אור של 24 שעות עם מחזור יומי של 16:8 שעות החלה בשעה 9 בבוקר, זמני הדגימה לפני רדת החשכה והשחר היו יורדים בשעה 8 בבוקר ובשעה 16:00 (טבלה משלימה 1). כאן, שחר ושקיעה מתייחסים לצעדים של 30 דקות שמעברים אורות ממצב מופעל לכיבוי ולהיפך. - סגור את השסתום על קו הגז.
- חברו מזרק (10 מ"ל) לשסתום יציאת הדגימה (איור 4A).
- פתח את שסתום יציאת הדגימה ומשך 8 מ"ל של תרבות.
הערה: מומלץ בין 5-10 מ"ל. הסרת נוזל יוצרת ואקום במרחב הראש, מה שהופך נפחים >10 מ"ל קשים לחילוץ. - סגור את שסתום יציאת הדגימה ונתק את המזרק.
- חברו מזרק המכיל 8 מ"ל של מדיום טרי (משלב 8.1) לשסתום יציאת הדגימה.
- פתח את שסתום יציאת הדגימה והזריק מדיום טרי.
הערה: החלפת נפח התרבית הנדגמת במדיום טרי משמשת לשמירה על נפח ולחץ מרווח ראש שווים ולשטיפת קו יציאת הדגימה. - סגור את שסתום יציאת הדגימה לפני ניתוק המזרק.
- חזור על שלבים 8.2-8.8 בכל זמן דגימה.
9. סיום ניסוי
- בדוק את כל תיבות הסימון של יציאות פעילות בחלון רכישת הנתונים ולחץ על עצור.
- כדי לייצא נתונים, בחר קובץ ונתונים לא מקוונים. בחר את כל קבצי יומן הרישום הרלוונטיים. ייצא את הנתונים לתוכנת גיליון אלקטרוני ושמור.
- עבור כל בקבוק, המירו את נפח החמצן הכולל הנמדד במ"ל לשומות באמצעות חוק הגז האידיאלי. חזו את משקל הביומסה שגדלה (gAFDW) אם נוצרת שומה של 1.05 שומה של O2 עבור כל שומה של ביומסה המיוצרת. קח את המשקל הטוחן של ביומסה כמו 24.6 גרם מול-1.
- אצור באופן ידני את נתוני קצב הזרימה. השתמש ביחידות של mL/h וממוצע נע של 3 נקודות.
Representative Results
כאן קצב זרימת החמצן הוא מדד לקצב הפוטוסינתזה של התרבית. שיעורים גבוהים יותר של פוטוסינתזה, ומכאן קיבוע פחמן, מתורגמים לשיעורי גדילה גבוהים יותר. משמעות הדבר היא שהמשתמש יכול להשוות את קצב זרימת החמצן בין טיפולים שונים לבין ימי פעילות כפרוקסי לצמיחה. בקצרה, חיישן הגז פועל על-ידי לכידה ושחרור של בועות גז בתא מדידה דו-תאי (איור 4B). בועות גז מהכניסה שבבסיס החיישן נעות מעלה דרך נוזל האריזה. בועות מצטברות בתא אחד של תא המדידה לנפח של כ-3.2 מ"ל. ברגע שמגיעים לסף זה, קצות תאי המדידה. פעולה זו משחררת את הגז ומאפסת את המערכת. כל טיפ נרשם על ידי תוכנת רכישת הנתונים.
בנתונים לדוגמה, הושוו קצב הצמיחה של שלושה טיפולים בעלי עוצמות משתנות של אור יום וריכוזי ביומסה ראשוניים (IBCs). טיפולים אלה נבחרו באופן שרירותי למטרות הפגנה. הם היו (A) 300 μmolפוטונים m-2 s-1 ו-0.03 גרםAFDW L-1, (B) 600μmol פוטונים m-2 s-1 ו-0.13 gAFDW L-1, ו-(C) 600 μmolפוטונים m-2 s-1 ו-0.40 גרםAFDW L-1. הקרנות אלה נמדדו באמצעות בדיקה כדורית במרכז צינור ה-PVC לפני שהונחו בקבוקים על הרציפים. עומק התרבית והצפיפות משפיעים על הנחתת האור. מכאן שעוצמת האור הממשית שחוותה מיקרו-אצות יכולה להיות שונה מאלו שדווחו. כל טיפול בוצע במשולש – בתוך PBR אחד שהכיל שלושה בקבוקים.
כאן, ניסוי מוצלח התאפיין בדפוסים יומיים משוכפלים היטב של הפקת גז (איור 7A–C). בשעות המוארות (ביום), תפוקת הגז עלתה בהתמדה, ובמשך שעות שאינן מוארות (לילה), הופסקה הפקת הגז (איור 7A–C). שני גזים מיוצרים על ידי מיקרו-אצות, חמצן מפוטוסינתזה ופחמן דו-חמצני מנשימה28. הפוטוסינתזה מוגבלת לשעות מוארות, ואילו הנשימה מתרחשת ברציפות אך היא פעילה ביותר בלילה28. הפוטוסינתזה נבנית, ואילו הנשימה מזרזת את הביומסה28. בתחילה, הרכב הגז של מרחב הראש זהה לזה של האטמוספרה. עם כל היפוך של תא המדידה, O2 מזיז את הגז האטמוספרי. לכן, קריאות חיישני גז יוחסו לייצור O2 גם אם הגז היוצא לא היה O2 טהור. לחץ כניסת הגז המינימלי עבור חיישן הגז הוא נמוך ביותר, 8-9 mbar, מה שהופך את הלחץ על ראש הבקבוק רק מעט מעל האטמוספירה (1.01 בר בגובה פני הים). לפיכך, קריאות חיישני גז מתחילות זמן קצר לאחר שבועות O2 עוזבות את המדיום.
CO2 המשתחרר מנשימה אינו תורם לקריאות חיישני גז משתי סיבות. ראשית, בתווך האלקליין, CO2 מגיב לביקרבונט, ומפחית את ה-pH (איור 8). שנית, אם CO2 אכן בורח, חיישן הגז האורז את הנוזל, Silox, ממיס בועות CO2 לפני שהן יכולות להגיע לתא המדידה, ומוציא את CO2 במשטחהנוזלי 29. זה נתמך על ידי היעדר קריאות חיישן גז לילה. אלה שכן התרחשו תועדו זמן קצר לאחר כיבוי האורות, מה שמצביע על כך שקריאות מייצגות שחרור חמצן שיורי בשעות היום (איור 7).
במערך הניסוי (תוך שימוש בנתוני טמפרטורה ולחץ מקומיים), מרחב ראש של 80 מ"ל בלחץ סביבתי דרש 340 מ"ל של O2 מפוקח כדי ליצור לחץ חלקי O2 של 99%. כאן, הנפח הכולל של חמצן המיוצר במשך 4 ימים נע בין 316 (SEM ± 11) מ"ל בטיפול A ל 902 (SEM ± 51) מ"ל בטיפול C (טבלה 1). לכן, עד סוף הניסוי, מרחב הראש של כל הבקבוקים היה מכיל בעיקר O2. הריכוז המוגבר של מרחב הראש O2, ובכך הירידה בריכוז של N2, היו משפיעים על הלחץ והרוויה החלקיים של גזים אלה. עם מרחב ראש של 99% O2 , חושבה עלייה של פי 5 ב-DO. עבור תרבויות 1.1 L, זה תורגם ל-23 מ"ל נוספים של DO. לעומת זאת, ההערכה הייתה שהמעבר למרחב ראש של 1% N2 היה גורם ל-15 מ"ל של N2 להשתחרר. משמעות הדבר היא שתחת מרחב ראש חמצן כמעט טהור, יותר O2 מומס מאשר N2 נעקר. לפיכך, מכיוון שנותר יותר O2 בתווך, השפעה זו הייתה מובילה להערכות חסר קלות בכמות החמצן הפוטוסינתזתי המיוצר.
האתגר העיקרי של שיטה זו התעורר כאשר התרבויות נעשו צפופות. עם יותר ביומסה, ומכאן יותר נשימה, הביקוש ל-O2 גדל. צריכת O2 בלילה יצרה מרחב לחץ. זה גרם לנוזל אריזת חיישן גז לנוע למעלה דרך קו הגז. כאשר ייצור O2 התחדש, היה צורך להחזיר את נוזל האריזה לחיישני הגז. זה גרם לעיכוב בקריאת חיישן הגז הראשון. עם זאת, בלילה הרביעי, עוצמת הלחץ התת-לחץ הזה גרמה לנוזל האריזה להגיע ולטפטף לשניים משלושת השכפולים של טיפול B, ויצרה חלקלקות של שמן פני השטח. בשל רמת נוזל האריזה המופחתת, חיישני הגז התקצרו, ושחררו O2 לא מדיד ישירות לאטמוספרה. זה גרם לאיסוף הנתונים להיות שטוח (איור 7B).
תת-לחץ יכול להיגרם גם על ידי התכווצות הנגרמת על ידי טמפרטורה של נפח מרחב הראש. עם זאת, ההשפעה כאן הייתה מינימלית. תעלות קירור וזרימת אוויר פיזרו כראוי את עודפי החום. מבין שני משטרי האור שנבדקו, שינוי הטמפרטורה המרבי הפחית את נפח מרחב הראש ב-1% או פחות, שווה ערך לתזוזת נוזל אריזה של 800 μL במרחב ראש של 80 מ"ל. תנופת הטמפרטורה היומית המרבית הייתה 1.4 מעלות צלזיוס עבורמשטרי הפוטונים m-2 s-1 של 300 מיקרומול (איור 6) ו-3.2 מעלות צלזיוס עבורמשטרי הפוטונים m-2 s-1 של 600 מיקרומול. עליית הטמפרטורה הממוצעת בשעות היום עבור 300 ו 600 מיקרומולפוטונים m-2 s-1 משטרים היה 0.7 ו 1.8 מעלות צלזיוס, בהתאמה. טמפרטורות התרבית חזרו לנקודת ההתחלה במהלך הלילה (איור 6).
נתוני קצב צמיחה ברזולוציה גבוהה יכולים לחשוף מגמות שאחרת עלולות להיעלם מעיניהם. שקול טיפולים B ו- C. למרות ה-IBCs השונים שלהם, שניהם יצרו את אותה כמות של ביומסה כוללת (gAFDW), מה שגרם לשינוי זהה ב-pH הבינוני (טבלה 1). בהינתן רק נקודות נתונים התחלתיות וסופיות, אדם יכול להניח בצדק שאין הבדל בקצב הצמיחה הממוצע בין שני הטיפולים (טבלה 1). עם זאת, נתוני קצב זרימת חמצן מקוונים גילו כי לכל טיפול היו שיעורי גדילה יומיים משתנים. וריאציות אלה באו לידי ביטוי גם במדידות pH פעמיים ביום (איור 8). ביום הראשון, קצב הגדילה של טיפול ב' היה נמוך מזה של טיפול ג'. ביום השלישי, זה התהפך כאשר קצב הגדילה של טיפול B עלה על זה של טיפול C (איור 7B,C). נתוני קצב זרימת החמצן הצביעו על כך שקצב הגדילה הגבוה ביותר התרחש ביום השלישי בטיפול B (איור 7B).
נפח החמצן הכולל שנוצר על ידי כל בקבוק בשלושת הטיפולים שימש להערכת השינוי שלהם בסך הכל ביומסה (gAFDW). זה הושג באמצעות משוואה גנרית לסינתזת ביומסה פוטוסינתטית: CO2 + 0.2 NH3 + 0.6 H2O = CH1.8 O0.5 N0.2 + 1.05 O2. העלייה בלחץ החלקי של מרחב הראש O2 והעלייה ברוויה ב-DO בעקבותיה היו צפויות לגרום להערכת חסר קלה של צמיחת הביומסה. זה היה נכון לגבי חמש מתוך שבע דוגמאות (טבלה 2). בממוצע, צמיחת הביומסה המשוערת הייתה בטווח של 10% מצמיחת הביומסה שנמדדה. חלק מההערכות היו שונות רק ב-1-3 מ"ג מהצמיחה הנמדדת. שתי דוגמאות להערכת יתר של צמיחה, כלומר הופק יותר חמצן מכפי שצמיחת ביומסה יכולה להסביר. כל O2 הנצרך על ידי נשימה בן לילה צריך לבוא לידי ביטוי בפיגור בייצור O2 למחרת. כאן, הניסויים הופסקו בסוף הלילה. בדרך זו, קטבוליזם ביומסה בן לילה במהלך 8 השעות האחרונות של כל ניסוי אינו נמדד. זה עלול לגרום להערכות יתר של צמיחת ביומסה, במיוחד בתרבויות צפופות. לפיכך, מומלץ להפסיק את הניסויים בתום השעות המוארות.
איור 1: בסיס מעמד הכור. (A) ממדים של רכיבי הבסיס במ"מ. (B) כיוון של זיזי פינות מתכת המאבטחים את שתי התמיכות האנכיות. (C) אחד מארבעה אורכי פלדה קצרים מחבר את החצי האחורי של צינור ה-PVC לעמדת הכור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: רכיבים חשמליים. (A) מבט אחורי של ה-PBR המציג את הקורה הצולבת העליונה ואת התצורה של הרכיבים החשמליים. (B) מבט קדמי של PBR לאחר התקנת אור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: פרטי פלטפורמת הבקבוק. (A) מידות השכבה העליונה והתחתונה במ"מ. (B) ראשי בריחים שקועים בשתי השכבות. (C) סוגריים מסולסלים מחברים את השכבה התחתונה ישירות לחצי האחורי של צינור ה-PVC. (D) חמישה חלקים קצרים של צינורות קשיחים המותקנים מעל ברגים צרים מפרידים בין השכבות העליונות והתחתונות. (E) כאשר פלטפורמת הבקבוק הושלמה, המשטח צריך להיות סמוק. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: קו גז ויציאת דגימה אופציונלית. אם יש צורך ביציאת הדגימה, קווי הגז צריכים לכלול שסתום חד-כיווני במורד הזרם של המחט. (B) חיישן גז נפחי. רמת האריזה הנוזלית צריכה לגעת בבורג העקיבה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: עקומה סטנדרטית המקשרת בין הגדרות תוכנת בקרת LED לעוצמת האור הפנימית. עיגולים לבנים ומשולשים אפורים מייצגים כל אחד PBR בודד. עבור כל הגדרת תאורה, כל ארבעת גופי התאורה הוגדרו לערך זהה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 6: שינוי טמפרטורת התרבית עבור 300μmol פוטונים m-2 s-1 משטרי אור. במהלך התוכנית היומית של 24 שעות, 16:8 שעות, נוריות LED העלו את טמפרטורת התרבית בשעות היום. החץ הכחול מציין את ההבדל בין הטמפרטורה המינימלית למקסימום. שגיאת תוכנית אור גרמה לירידת הטמפרטורה לפני רדת החשכה; זה תוקן לפני תחילת הניסוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 7: ייצור חמצן לשלושה תנאי ניסוי ייחודיים. כל כור קיבל שילוב שונה של עוצמת האור וריכוז הביומסה הראשוני (IBC); (A) 300פוטונים מיקרומול m-2 s-1 ו- IBC 0.03 גרםAFDW L-1, (B) 600פוטונים מיקרומול m-2 s-1 ו- IBC 0.13 גרםAFDW L-1, (C) 600פוטונים מיקרומול m-2 s-1 ו- IBC 0.40 גרםAFDW L-1. הגרפים העליונים מציגים את תפוקת החמצן המצטברת (mL) ואת קצב זרימת הגז (mL/h). קווים שחורים מוצקים, קווים כחולים מקווקווים וקווים אדומים מנוקדים הם העתקים משוכפלים. זמן הריצה של כל ניסוי היה 104 שעות, שכלל ארבעה מחזורי יום-לילה מלאים של 16:8 שעות. הצללה כתומה כהה מייצגת שעות לילה ושעות יום כתומות בהירות. שימו לב שבטיפול ב', ייצור חמצן שטוח ביום 4 עבור שניים משלושת השכפולים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 8: תגובת pH. כל כור קיבל שילוב שונה של עוצמת אור ו-IBC; (יהלומים ירוקים) 300 μmolפוטונים m-2 s-1 ו- IBC 0.03 gAFDW L-1, (משולשים אדומים) 600פוטונים μmol m2 s-1 ו- IBC 0.13 gAFDW L-1, (עיגולים סגולים) 600 μmolפוטונים m-2 s-1 ו- IBC 0.40 גרםAFDW L-1 . הצללה כתומה כהה מייצגת שעות לילה ושעות יום כתומות בהירות. פסי שגיאה מייצגים את שגיאת התקן של הממוצע. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
| טיפול | עוצמת האור (מיקרומול פוטונים m-2 s-1) | IBC (gAFDW L-1) | Δ סך הכל ביומסה (gAFDW) | Δ pH | סה"כ חמצן המיוצר (מ"ל) |
| A | 300 | 0.031 | 0.289 (± 0.01) | 0.15 (± 0.01) | 316.2 (±11.4) |
| B | 600 | 0.130 | 0.674 (± 0.02) | 0.52 (± 0.27) | 834.6* |
| C | 600 | 0.400 | 0.675 (± 0.02) | 0.55 (± 0.03) | 902.2 (±50.5) |
| * רק אחד משלושת ההעתקים הצליח | |||||
טבלה 1: שינוי מדד הצמיחה משעה 0 ל-104. סוגריים מרובעים מייצגים את השגיאה הסטנדרטית של הממוצע.
| טיפול | עוצמת האור (מיקרומולפוטונים m-2 s-1) | IBC (gAFDW L-1) | צמיחת ביומסה נמדדה (gAFDW) | צמיחת ביומסה חזויה (gAFDW) | לזלזל (%) |
| A | 300 | 0.031 | 0.289 | 0.288 | 0.5 |
| A | 300 | 0.031 | 0.311 | 0.270 | 13.1 |
| A | 300 | 0.031 | 0.268 | 0.247 | 7.9 |
| B | 600 | 0.13 | 0.708 | 0.705 | 0.4 |
| C | 600 | 0.4 | 0.718 | 0.796 | -10.9 |
| C | 600 | 0.4 | 0.640 | 0.830 | -29.7 |
| C | 600 | 0.4 | 0.668 | 0.659 | 1.3 |
טבלה 2: אומדני צמיחה המבוססים על סך החמצן הנמדד. רק שכפול אחד מתוך 300 μmolפוטונים m-2 s-1 ו- IBC = 0.13 גרםAFDW L-1 טיפול רץ להשלמה.
איור משלים 1: צילום מסך מתוכנת בקרת LED. ניתן לשלוט בכל אחד מארבעת גופי התאורה באופן עצמאי על-ידי הזזת לחצני העמעם או הזנת ערך מספרי לתוך תיבת הטקסט. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
איור משלים 2: צילום מסך של חלון התצורה של תוכנת רכישת הנתונים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
איור משלים 3: צילום מסך של חלון הרישום של תוכנת רכישת הנתונים. מלבנים ירוקים בהירים מציינים חיישני גז מקוונים. הנתונים מוצגים בזמן אמת. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
טבלה משלימה 1: דוגמה למשטר אור של 24 שעות. עבור תוכנית יומית של 16:8 שעות, יש 48 סטים של 30 דקות כל אחד. כוכביות מציינות זמני דגימה מוצעים. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה משלימה 2: אלקליניות גבוהה הרכב בינוני pH גבוה. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה משלימה 3: פתרון רכיב מעקב. הוסיפו לריכוז סופי של 1 מ"ל/ל' למדיום הבסיס. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
Discussion
בתוך פרוטוקול זה, התמקדות בשלבים הבאים מגדילה את הסבירות ליצירת נתונים הניתנים לשחזור ובאיכות גבוהה. בעת בניית מעמד הכור (שלב 1), הבסיס חייב להיות יציב עם תמיכות אנכיות חתומות היטב. פלדה מחורצת יש קצוות חדים, ולכן תוספת של מכסי בטיחות היא חיונית. משטחי פלטפורמה של בקבוקים צריכים להיות שטוחים לחלוטין, הממערבל המגנטי וראשי הבריחים צריכים לשבת שניהם מתחת למשטח השכבה העליונה (שלבים 3.2-3.6). על פי הוראת היצרן, יש למלא את נוזל אריזת חיישן הגז ל"בורג המעקב אחר רמת הנוזל" למדידות מדויקות של חמצן. יש לבדוק רמה נוזלית זו באופן קבוע, שכן אידוי של נוזל האריזה יכול לקצר את תא המדידה. כל שלושת קווי הגז שנעשו בשלב 5.2 צריכים להיות באותו אורך; זה קורה שלשכפולים יש נפחי מרחב ראש זהים. לפני תחילת הניסוי, מומלץ לבחון את משטר האור המתוכנת על ידי רישום עוצמת האור על פני תקופה של 24 שעות (שלב 6.11). אם יש חשש לעלייה בטמפרטורה הנוזלית, בדיקה זו צריכה לכלול גם בקבוק אטום עם בדיקת טמפרטורה פנימית (שלב 6.11). בעת הרישום, אל תצא מחלון התוכנה לרכישת נתונים; פעולה זו תסיים את הרישום. אם אתם לוקחים דגימות תרבית, היזהרו שלא לשחרר גז מרחב ראש על ידי פתיחת שסתומים ברצף הלא נכון (שלבים 8.2-8.8). בעת סקירת נתונים ניסיוניים יש לשים לב שתוכנת רכישת הנתונים מייצרת באופן אוטומטי ממוצע נע של קצב הזרימה. זה מנפח את הערך של קריאת קצב זרימה אחת או שתיים שנוצרו בן לילה. צור יומנים של חיישני גז באופן ידני כדי לתקן זאת.
המכשול הנפוץ ביותר בשיטה זו הוא הפוטנציאל לקצר את חיישן הגז אם רמת האריזה הנוזלית יורדת. ישנן שתי דרכים שבהן זה יכול להתרחש. ראשית, אידוי יכול להפחית לאט את רמת הנוזל. עם זאת, זה לא סביר על פני ניסוי קצר טווח (<7 ימים)29. שנית, קצבי נשימה גבוהים יכולים למשוך חמצן לתוך התמיסה וליצור מרחב לחץ. כאשר אנרגיית האור אינה זמינה, מיקרו-אצות משתמשות בנשימה אירובית כדי לספק את האנרגיה הדרושה לתחזוקה ותיקוןתאיים 28. לפיכך, בתרביות צפופות בשעות שאינן מוארות, צריכת החמצן, וכתוצאה מכך תת-לחץ, יכולה להיות משמעותית. זה שואב נוזל אריזה מחיישני הגז לתוך קו הגז. המרחק שעובר נוזל האריזה פרופורציונלי לכמות הנשימה הלילית. אם נוזל האריזה נכנס לבקבוקים, הדבר יוצר חלקלק שמן על פני השטח הנוזליים.
אם צפויים שיעורי נשימה גבוהים בלילה, ניתן לבצע שינויים בפרוטוקול. הדרך הפשוטה ביותר להימנע מלחץ חסר היא להשאיר את מרווחי הבקבוק פתוחים למשך הלילה. יש לכך גם יתרון של הקלה ברמות DO על ידי הפחתת לחץ מרחב הראש החלקי של O2. מאמינים כי ריכוזי DO גבוהים מזיקים לצמיחה מכיוון ש-O2 יכול לעכב את פעילות הרוביסקו ועלול לגרום לעקה חמצונית30,31. זה לא נדיר עבור השעיות תרבות להגיע 4x oversaturation גם כאשר במגע עם האטמוספרה25,32. כדי לפתוח את מרחב הראש, נתקו את קו הגז מהמחט המשתרעת על פקק הגומי. שעות הלילה יכולות לשמש כחלון לטעינת חיישני גז לאריזת נוזלים או למניפולציה של ניסויים רציפים עם השפעה מועטה על איסוף הנתונים. לדוגמה, ניתן לשנות את צפיפות התרבית, לרענן חומרים מזינים, להוסיף תיקון או להכניס פתוגן. יש לאטום מחדש את הבקבוקים, ולחבר מחדש את קו חיישני הגז לפני שהאורות נדלקים מחדש. מדידות החמצן שייאספו מניסויים עם מרחבים ליליים סגורים לעומת פתוחים יהיו שונות.
כאשר בקבוקים נשארים אטומים, צריכת החמצן בלילה מפחיתה את מספר השומות של O2 במרחב הראש. זה גורם לנוזל אריזה לזחול במעלה קו חיישני הגז כדי לשמור על לחץ מרחב הראש. כאשר האורות נדלקים, ייצור החמצן מתחדש. יש לדחוף את נוזל האריזה בחזרה לתוך חיישן הגז לפני תחילת הקריאות בקצב הזרימה. פיגור זה הוא אפוא פרופורציונלי למידת הנשימה הלילית. בדרך זו, כאשר מרחב הראש נשאר סגור, קריאות O2 מייצגות ייצור O2 נטו (ייצור פוטוסינתטי - צריכה נשימתית). לעומת זאת, כאשר מרחב הראש פתוח בלילה, גז אטמוספרי מחליף את מרחב הראש O2 נצרך, ושום נוזל אריזה לא נכנס לקו הגז. התוצאה היא שצריכת O2 נשימתית אינה נלקחת בחשבון בנתוני הייצור של O2 . זה עשוי להפחית את הדיוק של הערכות הצמיחה של ביומסה AFDW. עם זאת, זה לא אמור להשפיע על התועלת של שימוש בייצור O2 בשעות היום כמדד להשוואת הצמיחה בין הטיפולים.
כל ה- PBRs במעבדה סובלים מאותה מגבלה; אורות מלאכותיים אינם יכולים לשכפל את ספקטרום השמש. מיקרו-אצות משתמשות באורכי גל של אור בין 400 ל-700 ננומטר לצורך פוטוסינתזה. אזור זה מכונה קרינה פעילה פוטוסינתטית (PAR)33. אור השמש והאור המלאכותי נבדלים זה מזה בתרומתם היחסית של אורכי הגל בטווח זה. עובדה זו, לצד טמפרטורות חיוביות ואספקת אור קבועה, פירושה שלעתים קרובות לא ניתן לאבחן באופן אמין את נתוני הצמיחה במעבדה לתנאי חוץ. עם זאת, PBRs אלה יכולים לטפל באחת המגבלות של אספקת אור PBR במעבדה. עוצמת אור השמש משתנה מאוד במהלך היום, כאשר כיסוי העננים יוצר תנודות חולפות בתקריות PAR. תוכנת בקרת התאורה ובקר התאורה DMX יכולים לספק עוצמות אור מ-0 עד 2400 μmolפוטונים m-2 s-1 ואילך. ניתן לפרק משטרים קלים למרווחים בודדים הקצרים עד 1 שניות. עוצמת האור הניתנת לכוונון מאפשרת למשתמש לחקות תבניות אור חיצוניות באופן הדוק יותר מהגדרות PBR סטנדרטיות. כאן, מרווחי שחר ושקיעה מדומים של 30 דקות דוהים יחד מחזורי יום ולילה (טבלה משלימה 1).
למרות שצפיפות AFDW הפכה למדד הצמיחה הסטנדרטי, שיטה זו יכולה לדרוש נפחי תרבית משמעותיים, תקופת עיבוד של 2-3 ימים, ומייצרת נקודת נתונים אחת בכל פעם. יתר על כן, אם התנאים הופכים שליליים והתאים מתים, צפיפות AFDW אינה מבחינה בין תאים שעושים פוטוסינתזה פעילה לבין תאים שמתפרקים. כימות קצב ייצור החמצן הפוטוסינתזי משמש כפרוקסי צמיחה חלופי. תכנון PBR זה יכול להקליט ייצור חמצן באופן רציף עם התערבות מועטה של המשתמש תוך שמירה על נפח התרבית. ניתן לשפר את רזולוציית הנתונים על-ידי בחירת חיישן גז עם נפח תא מדידה נמוך יותר, למשל, 1 מ"ל. יתר על כן, אם תרבויות מעורבות היטב, משתמשים עשויים להחליט להתקין ספקטרופוטומטר עבור קריאות צפיפות אופטיות מתמשכות. אם רוצים בקרת טמפרטורה של המדיום, ניתן להוסיף צ'ילר משחזר. PBRs אלה הם תוספת רבת ערך למעבדה המעוניינת להרחיב את יכולת המחקר המיקרו-אלית שלה ללא השקעה כספית כבדה. הם מתאימים במיוחד לאנשים שעובדים עם אלקליות גבוהה, מינים עם pH גבוה כמו ספירולינה. PBRs אלה מציעים גמישות במשטר האור והם תקפים להשוואות מהירות, משוכפלות, של צמיחה מעבדתית.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי המועצה למחקר במדעי הטבע וההנדסה (NSERC), קרן קנדה לחדשנות (CFI), קרן המצוינות המחקרית הראשונה של קנדה (CFREF), אלברטה אינובייטס, קרן סר ג'ון מונאש הכללית, ממשלת אלברטה ואוניברסיטת קלגרי. תודה נמסרת למארק טונן על העבודה החשמלית ולויליאם ריצ'רדסון על חישובי המסיסות.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum channels Imperial: 0.90” x 39.37” Metric: 2.3 cm x 100 cm Quantity: 4 |
LED World | AC-AR1-1M | Required as a heat sink |
| Bungee cords, small Quantity: 5 |
- | - | To secure bottles |
| Computer - desktop/laptop Quantity: 1 |
- | - | - |
| Data Logger, HOBO U30 USB Weather Station Quantity: 1 |
HOBO, Hoskin | U30-NRC-VIA-10-S100-000 | Records light sensor information |
| Digital interface module, Rigamo, 4-channel Quantity: 1 |
Ritter | N/A | This is to transmit gas sensor data to the computer |
| DMX decoder, 12~24 VDC, DMX-CV-4X5A Quantity: 1 |
LITECH, LED World | LT-840-6A | Transmit messages which alter the light pattern |
| DMX lighting controller, SUSHI-RB-RJ Quantity: 1 |
Arcolis, Nicolaudie America Inc. | SUSHI-RB-RJ DMX | Encodes the lighting program |
| Gas sensor packing liquid (Silox) Quantity: 1 L |
Ritter | https://www.ritter.de/en/data-sheets/silox | |
| Gas sensor, volumetric Quantity: 3 |
Ritter | MGC-1 V3.4 PMMA (https://www.ritter.de/downloads/mgc-milligascounter-en) | Measures oxygen production |
| Glass bottles, round 1 L with GL45 neck Quantity: 3 |
Corning, Capitol Scientific | 1395-1L | Culture vessels |
| Hardware - end caps for slotted steel Quantity: 10 |
Paulin, Home Depot | 142-612 | To cover sharp edges of slotted steel |
| Hardware - eye hooks Quantity: 6 |
- | - | To secure bottles |
| Hardware - metal corner braces (large) Imperial: 4" x 4" Metric: 10 cm x 10 cm Quantity: 8 |
- | - | Larger brackets to construct metal stand |
| Hardware - metal corner braces (small) Imperial: 2 1/2" x 2 1/2" Metric: 6.4 cm x 6.4 cm Quantity: 6 |
- | - | Small brackets to connect bottle platforms to PVC pipe |
| Hardware - metal corner gussets Imperial: 3" x 3" Metric: 7.6 cm x 7.6 cm Quantity: 6 |
Paulin, Home Depot | 142-616 | Flat brackets to construct metal stand |
| Hardware - piano hinge Imperial: 36" Metric: 91 cm Quantity: 1 |
- | - | Connects two halves of PVC pipe |
| Hardware - rivets Quantity: 40 |
- | - | To attach piano hinge to PVC tubing |
| Hardware - set of bolts, nuts, washers Quantity: 60 |
- | - | Long thin bolts are required to secure bottle platforms around magentic stirrers |
| Hardware - set of bolts, nuts, washers Quantity: 30 |
- | - | Larger shorter bolts are required to build the metal stand |
| LED driver, constant voltage, 96W 24VDC UL Listed IP65 Driver Class 2 regulated power supply Quantity: 1 |
Magnitude Lighting, LED World | CVN96L24DC | Regulates power to the lights |
| LED lights, Cinco Bright LED Flex Strip Quantity: 4 m roll |
EvenBright, LED World | FA128M57-4M-24V-X | Roll is trimmed into 4 x 1 m lengths and secured inside the PVC tube |
| Light meter, handheld with submersible sperical probe Quantity: 1 |
LI-COR | LA-250A | Calibrate the reactors light intensity |
| Light sensors Photosynthetic Light (PAR) Smart Sensor Quantity: 2 |
HOBO, Hoskin | S-LIA-M003 | Only one is required however two would be good practice in case one malfunctioned |
| Magnetic stirrers (MIXdrive 1 XS) with external control units and power supply (MIXcontrol eco) Quantity: 3 |
2Mag, 2MAG USA | MF 40300 | Stirrers sit sandwiched in bottle platforms |
| Metal plate Imperial: 24" x 8" Metric: 61 cm x 20.3 cm Quantity: 1 |
- | - | This is a surface on which to secure electronics, it is attached to the back of the reactor |
| Pipe, white PVC Imperial: 6" diameter x 42" high Metric: 15.2 cm x 106.7 cm Quantity: 1 |
- | - | Cut lengthwise in two halves, used to house lights and bottles |
| Plastic (HDPE) sheets Imperial: 4" x 4" x 1/4" Metric: 10 cm x 10 cm x 1 cm Quantity: 6 |
Inventables | 30291-01 | For bottle platforms which house magentic stirrers |
| Rubber stoppers - GL45 size Quantity: 3 |
Duran, VWR | 76289-760 | Seals culture vessels |
| Screw caps - with aperture and GL45 neck Quantity: 3 |
Corning, Capitol Scientific | 1395-45HTSC | Generates seal of culture vessels |
| Slotted angle steel lengths Imperial: 1-1/2" X 48" x 0.074" Metric: 3.8 cm x 122 cm x 0.19 cm Quantity: 6 |
Paulin, Home Depot | 142-202 | Makes up the body of the metal stand |
| Slotted flat steel lenghts Imperial: 1-3/8" x 48" x 0.074" Metric: 3.5 cm x 122 cm x 0.19 cm Quantity: 3 |
Paulin, Home Depot | 142-222 | Makes up the body of the metal stand |
| Software - Easy Stand Alone (ESA) | https://www.dmxsoft.com/#apps | AKA LED control software | |
| Software - Rigamo v3.1 | AKA data acquisition software | ||
| Software - Storage Upgrade Tools (SUT) | https://store.dmxsoft.com// | ||
| Stir bar Imperial: 1" x 5/16" Metric: 2.5 cm x 0.8 cm Quantity: 3 |
Fisherbrand | 14-513-59 | Stirs culture |
| Switch box Quantity: 1 |
- | - | Turns power on/off to reactor |
| Syringe, 10 mL Quantity: Multiple |
- | - | Optional if you wish to extract culture |
| Tube adaptor fittings, plastic - Stopcock 1-way Quantity: 6 |
Masterflex, Cole Palmer | RK-12023-33 | Close/open culture vessel line |
| Tube adaptor fittings, plastic - variety of male and female luer lock fittings Imperial: to fit 1/16" and 1/8" ID tubing Metric: to fit 1.59 mm and 3.18 mm tubing Quantity: Multiple packets |
Masterflex, Cole Palmer | RK-30800-16; RK-30800-18; RK-45518-26; RK-45501-00; RK-45501-04 | Many different combinations can achieve the same end result, best to order a variety of fittings |
| Tube adaptor fittings, plastic - variety of straight connectors Imperial: to fit 1/16" and 1/8" ID tubing Metric: to fit 1.59 mm and 3.18 mm tubing Quantity: Multiple packets |
Masterflex, Cole Palmer | RK-40616-04 | Many different combinations can achieve the same end result, best to order a variety of fittings |
| Tubing, flexible, transparent Imperial: ID=1/16", OD=1/8" Metric: ID = 1.59 mm, 0D = 3.18 mm Quantity: 4 m |
Masterflex, Cole Palmer | RK-06422-02 | Line from culture vessel to gas sensor |
| Tubing, flexible, transparent Imperial: ID=1/8", OD=1/4" Metric: ID = 3.18 mm, 0D = 6.35 mm Quantity: 2 m |
Masterflex, Cole Palmer | RK-06422-05 | Gas sensor standard tubing size |
| Tubing, rigid, transparent Imperial: ID=1/16", OD=1/8" Metric: ID = 1.59 mm, 0D = 3.18 mm Quantiy: 1 m |
Masterflex, Cole Palmer | RK-06605-27 | Spans rubber stopper allowing gas to exit |
| Tubing, rigid, transparent Imperial: ID=1/8", OD=1/4" Metric: ID = 3.18 mm, 0D = 6.35 mm Quantity: 1 m |
Masterflex, Cole Palmer | RK-06605-30 | Spans rubber stopper allowing gas to exit |
| Zip ties, small Quantity: 1 packet |
Secure tube fittings |
References
- Benemann, J. R. Opportunities and challenges in algae biofuels production. A position paper in line with Algae World. , (2008).
- Laurens, L. M. L. State of technology review - algae bioenergy. An IEA bioenergy inter-task strategic project. IEA Bioenergy. , (2017).
- Robertson, D. E., et al. A new dawn for industrial photosynthesis. Photosynthesis Research. 107, 269-277 (2011).
- Troschl, C., Meixner, K., Drosg, B. Cyanobacterial PHA production-review of recent advances and a summary of three years' working experience running a pilot plant. Bioengineering. 4 (2), (2017).
- Rizwan, M., Mujtaba, G., Memon, S. A., Lee, K., Rashid, N. Exploring the potential of microalgae for new biotechnology applications and beyond: a review. Renewable and Sustainable Energy Reviews. 92, 394-404 (2018).
- Niesa, F., et al. Characterization of Phormidium lacuna strains from the North Sea and the Mediterranean Sea for biotechnological applications. Process Biochemistry. 59, 194-206 (2017).
- Laurens, L. M. L., Chen-Glasser, M., McMillan, J. D. A perspective on renewable bioenergy from photosynthetic algae as feedstock for biofuels and bioproducts. Algal Research. 24, 261-264 (2017).
- Barreiro-Vescovo, S., Barbera, E., Bertucco, A., Sforza, E. Integration of microalgae cultivation in a biogas production process from organic municipal solid waste: From laboratory to pilot scale. ChemEngineering. 4 (2), 26 (2020).
- Zurano, A. S., et al. Year-long assessment of a pilot-scale thin-layer reactor for microalgae wastewater treatment. Variation in the microalgae-bacteria consortium and the impact of environmental conditions. Algal Research. 50, (2020).
- Deprá, M. C., Severo, I. A., Dias, R. R., Zepka, L. Q., Jacob-Lopes, E. Photobioreactor design for microalgae culture. Microalgae. , Elsevier. 35-61 (2021).
- Osburn, F. S., Wagner, N. D., Scott, J. T. Biological stoichiometry and growth dynamics of a diazotrophic cyanobacteria in nitrogen sufficient and deficient conditions. Harmful Algae. 103, (2021).
- Eustance, E., Badvipour, S., Wray, J. T., Sommerfeld, M. R. Biomass productivity of two Scenedesmus strains cultivated semi-continuously in outdoor raceway ponds and flat-panel photobioreactors. Journal of Applied Phycology. 28 (3), 1471-1483 (2016).
- Qiang, H., Richmond, A., Zarmi, Y. Combined effects of light intensity, light-path and culture density on output rate of spirulina platensis (cyanobacteria). European Journal of Phycology. 33 (2), 165-171 (1998).
- Ooms, M. D., Dinh, C. T., Sargent, E. H., Sinton, D. Photon management for augmented photosynthesis. Nature Communications. 7, 1-13 (2016).
- Moheimani, N. R., Borowitzka, M. A., Isdepsky, A., Sing, S. F. Standard methods for measuring growth of algae and their composition. Algae for biofuels and energy. , Springer. Dordrecht. 265-284 (2013).
- Griffiths, M. J., Garcin, C., van Hille, R. P., Harrison, S. T. L. Interference by pigment in the estimation of microalgal biomass concentration by optical density. Journal of Microbiological Methods. 85 (2), 119-123 (2011).
- Schumann, R., Häubner, N., Klausch, S., Karsten, U. Chlorophyll extraction methods for the quantification of green microalgae colonizing building facades. International Biodeterioration and Biodegradation. 55 (3), 213-222 (2005).
- Pinckney, J. L., Richardson, T. L., Millie, D. F., Paerl, H. W. Application of photopigment biomarkers for quantifying microalgal community composition and in situ growth rates. Organic Geochemistry. 32 (4), 585-595 (2001).
- Van Wychen, S., Laurens, L. M. L. Determination of total solids and ash in algal biomass: laboratory analytical procedure (LAP). National Renewable Energy Laboratory. , Golden, CO. (2015).
- Davis, R., Laurens, L. Algal biomass production via open pond algae farm cultivation: 2019 state of technology and future research. National Renewable Energy Laboratory. , Golden, CO. (2020).
- Borovkov, A. B., Gudvilovich, I. N., Avsiyan, A. L. Scale-up of Dunaliella salina cultivation: from strain selection to open ponds. Journal of Applied Phycology. 32 (3), 1545-1558 (2020).
- Davies, F. K., et al. Microbiota associated with the large-scale outdoor cultivation of the cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002. Algal Research. 58, (2021).
- Ataeian, M., et al. Direct capture and conversion of CO2 from air by growing a cyanobacterial consortium at pH up to 11.2. Biotechnology and Bioengineering. 116 (7), 1604-1611 (2019).
- Fu, F., et al. Sustained photosynthesis and oxygen generation of microalgae-embedded silk fibroin hydrogels. ACS Biomaterials Science & Engineering. , (2021).
- Rearte, T. A., et al. Photosynthetic performance of Chlorella vulgaris R117 mass culture is moderated by diurnal oxygen gradients in an outdoor thin layer cascade. Algal Research. 54, (2021).
- Poughon, L., et al. Limnospira indica PCC8005 growth in photobioreactor: model and simulation of the ISS and ground experiments. Life Sciences in Space Research. 25, 53-65 (2020).
- Yen, U. C., Huang, T. C., Yen, T. C. Observation of the circadian photosynthetic rhythm in cyanobacteria with a dissolved-oxygen meter. Plant Science. 166 (4), 949-952 (2004).
- Vermaas, W. F.
- Ritter, MilliGascounter Type MGC-1 Operation Instructions V 3.4. , (2017).
- Sousa, C., De Winter, L., Janssen, M., Vermuë, M. H., Wijffels, R. H. Growth of the microalgae Neochloris oleoabundans at high partial oxygen pressures and sub-saturating light intensity. Bioresource Technology. 104, 565-570 (2012).
- Latifi, A., Ruiz, M., Zhang, C. C.
- Morillas-España, A., Lafarga, T., Gómez-Serrano, C., Acién-Fernández, F. G., González-López, C. V. Year-long production of Scenedesmus almeriensis in pilot-scale raceway and thin-layer cascade photobioreactors. Algal Research. 51, (2020).
- Melis, A. Solar energy conversion efficiencies in photosynthesis: minimizing the chlorophyll antennae to maximize efficiency. Plant Science. 177 (4), 272-280 (2009).
