Summary
Bu yayın, özelleştirilebilir ışık rejimlerine sahip laboratuvar fotobiyoreaktörlerinin (PBR'ler) tasarımını açıklamaktadır. Karbon kaynağı olarak bikarbonat kullanan siyanobakterilerin veya mikroalglerin büyümesi, hacimsel oksijen üretimi ölçülerek sürekli olarak izlenir. Bu PBR'ler, deneyler sırasında çok az kullanıcı müdahalesi ile hızlı, çoğaltılmış laboratuvar büyüme karşılaştırmalarını kolaylaştırır.
Abstract
Mikroalglerin laboratuvar çalışması deneysel olarak zor olabilir. Fotosentetik olmayan mikroorganizmaların yetiştirme gereksinimlerine ek olarak, fototroflar da aydınlatma gerektirir. Rutin olarak, araştırmacılar özel ışık malzemeleri sağlamaya çalışırlar, yani ışık yoğunluğunu ve teslim edildiği zamanı değiştirirler. Bu esneklik, standart tezgah üstü ışıklarla zordur. Genellikle, yetiştirme çalışmaları deneysel tedaviler arasında büyüme karşılaştırmaları da gerektirir. Sıklıkla, büyüme uzun bir süre boyunca değerlendirilir, örneğin, bir hafta süren bir deneme boyunca günde birkaç kez. Manuel ölçümler zaman alıcı olabilir ve veri çözünürlüğünden yoksun olabilir. Bu nedenle, otomatik büyüme izleme ve özelleştirilebilir ışık beslemesine sahip fotobiyoreaktörler (PBR'ler), çoklu tedavilerle çoğaltılmış deneyler için yararlıdır. Mevcut çalışma, laboratuvar PBR'lerinin tasarımını, yapımını ve çalışmasını sunmaktadır. Malzemeler kolayca tedarik edilir ve nispeten ucuzdur. Tasarım ılımlı bir beceri ile çoğaltılabilir. Her yapının ~ 40cm2'lik bir ayak izi vardır ve üçlü çoğaltma için üç adet 1 L cam şişeye ev sahipliği yapar. Şişeler manyetik karıştırıcılar içeren platformlara dayanır ve 1 m yüksekliğinde ve 15 cm çapında polivinil klorür (PVC) boru içinde dikey olarak düzenlenir. Boru içi ışık yayan diyotlarla (LED'ler) kaplıdır. Bu LED'ler, fotosentetik olarak aktif radyasyonun (PAR) 0-2400 μmol fotonları m-2 s-1'den sürekli ışık yoğunlukları üretir. Kullanıcılar özel bir aydınlatma programı tasarlarlar. Işık yoğunluğu her saniye ayarlanabilir veya daha uzun süreler boyunca sabit tutulabilir. Fotosentezden üretilen oksijen, her şişeden tek yönlü bir volümetrik gaz sensörü aracılığıyla çıkar. Yazılım gaz sensörü verilerini kaydetmek için kullanılır. Üretilen oksijen miktarı biyokütle büyümesi ile ilişkilendirilebilir. Biyokütle örnekleri gerekiyorsa, kültürü çıkarmak için bir şırınga kullanılabilir. Yöntem, karbon kaynağı olarak bikarbonatla yetiştirilen mikroalgler için uygundur. Bu PBR'ler, çoğaltılmış deneyler, ışık rejimi esnekliği ve sürekli yüksek çözünürlüklü büyüme verileri gerektiren bir laboratuvar için değerlidir.
Introduction
Basitlik için toplu olarak mikroalgler olarak adlandırılan mikroalgler ve siyanobakteriler, sürdürülebilir biyoteknolojideki potansiyelleri nedeniyle savunulmaktadır. Hızlı büyümeleri, ekilebilir olmayan arazilerde yetiştirilebilme yetenekleri ve karbondioksitin biyokütleye dönüşümünü sağlamak için güneş ışığını kullanmaları nedeniyle cazip adaylardır 1,2,3. Mikroalgal biyokütle, petrol veya gaz şeklinde biyoenerji gibi ürünlere, gıda boyalarına ve besin takviyelerine ve biyopolimerler 1,4,5,6,7 gibi malzemelere dönüştürülebilir. Ek olarak, atık suyu arıtmak veya aşırı besin maddeleri tüketerek su kütlelerini iyileştirmek için kullanılabilirler 8,9. Bu göz önüne alındığında, mikroalgal araştırmalar yaygındır ve kurulmuştur. Toplum, mevcut üretim ve enerji üretimi yaklaşımlarının karbon yoğunluğunu ve çevresel sürdürülebilirliğini yeniden gözden geçirdikçe alan büyüyor.
Laboratuvar tabanlı mikroalgal çalışmaların üç temel gereksinimi, bir kültür kabı, ışık kaynağı ve büyümeyi ölçmek için kullanılan yöntemdir. Fotobiyoreaktör (PBR) terimi, kültür kaplarının aydınlatıldığı bir kurulumu tanımlar10. Genellikle, mikroalglerle ilgili çalışmalar, iki veya daha fazla tedavi arasındaki büyümeyi karşılaştırmayı amaçlamaktadır, örneğin, farklı büyüme ortamları, ışık rejimleri veya türler11,12,13. İstatistiksel alaka düzeyi için, her durum, örneğin tedavi ve kontrol, çoğaltılmalıdır. Kontrol ve tedavi aynı anda çalıştırılırsa, bu, bir deneme süresince birçok PBR'nin izlenmesi ve örneklenmesi gerektiği anlamına gelir. Birden fazla PBR'nin çalıştırılmasıyla ilgili zorluk iki katlıdır. İlk olarak, her PBR'ye eşit bir ışık yoğunluğu sağlamak, tekrarlanabilirlik için gereklidir, ancak zor olabilir. Gemi yüzeyindeki ışık olayının miktarı, ışık kaynağından uzaklığından, bitişik gemilerden gölgelenmesinden ve arka plan ışığı dalgalanmalarından etkilenir14. İkincisi, büyümeyi doğru bir şekilde ölçmek için bir yöntem seçilmelidir.
Büyüme genellikle hücre sayısı, optik yoğunluk (OD), klorofil A içeriği, kuru ağırlık (DW) yoğunluğu ve külsüz kuru ağırlık (AFDW) yoğunluğu15 ile ölçülür. Hücre sayımları, klorofil A içeriği ve gravimetrik yöntemler, ayrı veri noktaları üreten manuel işlemlerdir. OD, AFDW yoğunluğu15 gibi başka bir yönteme karşı iyi kalibre edilmiş olması koşuluyla, bir spektrofotometre ile sürekli ve invaziv olmayan bir şekilde ölçülebilir. Bununla birlikte, OD ölçümleri ve Klorofil A içeriği, sonuçlar farklı kültür koşulları altında, örneğin türler arasında ve büyüme döngüsü boyunca değiştiğinden güvenilmez olabilir15,16. Klorofil A için, ekstraksiyon yöntemi pigment verimini de etkileyebilir17. Klorofil A içeriği, fotosentetik olmayan organizmalar da içeren mikrobiyal topluluklar içindeki mikroalglerin büyümesini izlemede özellikle yararlıdır17,18. Büyümeyi belirlemek için bir yöntem seçerken, süspansiyonun morfolojisini dikkate almak önemlidir. Organizmalar kümelendiğinde ve iyi karışmadığında, OD ve hücre sayıları mümkün değildir15. Tek bir yöntem tüm deneysel uygulamalar için uygun değildir – araştırmacılar hangi yöntemlerin pratik ve deneysel hedefleriyle alakalı olduğuna karar vermelidir.
AFDW, çeşitli kültür koşulları arasında, özellikle türler ve kültür medyası arasında büyüme karşılaştırmaları sağlayan güvenilir bir yöntemdir15,19,20. AFDW'yi hesaplamak için, bir mikroalg kültürü örneği önce filtrasyon veya santrifüjleme yoluyla konsantre edilir ve kurutulur. Bu aşamada DW belirlenebilir. DW numunesi genellikle tuzlar ve partikül madde 15 gibi en az %8-10 oranında kül-inorganik madde içerir. DW büyüme eğilimlerini takip ediyor, ancak inorganiklerin katkısı değişirse çarpıtılabilir. AFDW yoğunluğunu belirlemek için, kuru biyokütle yüksek sıcaklıkta yakılır; bu, organik veya faydalı kısmı buharlaştırırken, külü (inorganik)19'un arkasında bırakır. AFDW'yi hesaplamak için, kül fraksiyonunun ağırlığı DW fraksiyonunkinden çıkarılır. Tipik olarak, mikroalgal süspansiyonlarda, AFDW 0.1-3 g / L12,21,22 arasında değişir. Küçük hacimli seyreltik süspansiyonlar, <10 mg olan az miktarda kuru biyokütle verir. Yanmadan sonra, kül sadece 1 mg ağırlığında olabilir. Bu nedenle, kültür yoğunluğuna bağlı olarak, bu yöntem 5-100 mL arasında hacimler ve 0.1 mg 12,15,19,22'ye kadar doğru analitik ölçekler gerektirir. Laboratuvar PBR'leri tipik olarak küçüktür, en fazla birkaç litredir, bu nedenle her sıvı numune kültür hacmini tüketir. Ayrıca, AFDW yöntemi manueldir ve 2-3 gün sürer. Çoğaltılmış ve tekrarlanan deneyler için, otomatik ve sürekli bir süreç tercih edilir.
Karbon kaynağı olarak bikarbonat kullanan mikroalgler için, iki ek büyüme metriği sürekli olarak ölçülebilir. Fotosentez bikarbonat tüketir ve oksijen üretir. Bikarbonat tüketimi orta pH23'ü yükseltir. Daldırılmış bir pH probu bu değişikliği ölçebilir. Fotosentetik oksijen üretimi, ortam doygun hale gelene kadar ortamın çözünmüş oksijen (DO) konsantrasyonunu arttırır. Doygunluğun ötesinde, oksijen kabarcıklar halinde var olur. Oksijen üretimi birçok farklı teknikle ölçülür: problar DO konsantrasyonunu ölçer, manometrik cihazlar kafa boşluğu basıncını değerlendirir, gaz kromatografisi kafa boşluğu bileşimini ölçer ve hacimsel sensörler gaz çıkışını24,25,26,27 kaydeder. Oksijen bir büyüme vekili olarak kullanıldığında, kültür damarları tamamen kapatılmalı veya sadece gaz çıkışına izin vermelidir. pH ve oksijen ölçümleri için karbon, CO2 serpme ile değil, bikarbonat formunda sağlanmalıdır. CO2 serpişmesi, orta pH23'ü azaltır ve bir gaz olarak oksijen ölçümlerini bozabilir. pH ve oksijenin optik yoğunluğa göre bir avantajı, mikroalglerin kümeler oluşturması durumunda yöntemden ödün verilmemesidir. Dolaylı olmasına rağmen, hem pH hem de oksijen, tedaviler arasındaki büyümeyi karşılaştırmada etkilidir.
Günümüzde kullanılan PBR'ler karmaşıklık bakımından çeşitlilik göstermektedir. Laboratuvarlar basit tezgah üstü şişeler, özel prototipler veya ticari olarak temin edilebilen ürünler kullanabilir. Şişelerden yükseltmek isteyen araştırma grupları için, ticari PBR'lerin maliyeti veya birçok prototip oluşturmak için gereken teknik beceri ve parça üretimi bir engel olabilir. Bu makale, bu boşluğu dolduran laboratuvar PBR'lerinin adım adım tasarımını, yapımını ve işletimini tanımlamayı amaçlamaktadır. Bu PBR'ler özelleştirilebilir bir ışık rejimine sahiptir ve hacimsel oksijen üretimini kaydederek büyümeyi sürekli olarak izler. Bu tasarım, üçlü replikasyon için üç kültür kabına ev sahipliği yapar ve orta derecede beceri ve kolay erişilebilir malzemelerle inşa edilebilir. Bu PBR, çok teknik veya pahalı ürünlere yatırım yapmadan mikroalgal araştırma kapasitesini genişletmek isteyen bir laboratuvara değerli bir katkıdır. Bir PBR edinmeyi veya inşa etmeyi seçerken, araştırmacılar bir tasarımın kültür koşullarına, finansal durumlarına ve araştırma sorularına uygunluğunu göz önünde bulundurmalıdır.
Protocol
1. PBR standının yapımı
- El tipi demir testeresi ile beş adet 380 mm uzunluğunda ve iki adet 200 mm uzunluğunda açılı oluklu çelik kesin. Bir standın tabanını oluşturmak için cıvatalar ve büyük köşe destekleri ile birbirine tutturun (Şekil 1A). Güvenlik uç kapaklarına yapıştırın.
- İki adet kesilmemiş (1220 mm) dikey uzunlukta açılı oluklu çeliği tabana bağlayın. Cıvatalar ve metal köşe körükleriyle sabitleyin (Şekil 1B). Güvenlik uç kapaklarına yapıştırın.
- Dört adet 65 mm yassı uzunlukta oluklu çelik kesin. Bunları dikey desteklere 90° açıyla cıvatalayın - her bir desteğe iki tane, tabandan biri 130 mm yukarıda (Şekil 1C) ve biri yukarıdan 60 mm aşağıda olmak üzere iki tane takın.
- Dikey destekleri, çerçevenin arkasına cıvatalanmış yatay 140 mm uzunluğunda düz oluklu çelik (çapraz kiriş) ile üstlerine sabitleyin (Şekil 2A).
2. Işık odasının yapımı
- 153 mm çapında beyaz bir polivinil klorür (PVC) borusunu 1070 mm uzunluğa kadar kesin. Boruyu bir şerit testere ile uzunlamasına ikiye bölün. Tüm kenarları zımparalayın.
- Dört alüminyum ısı emici kanalı, borunun içi ile birlikte dikey olarak eşit şekilde yerleştirin ve ortalayın. Borunun kesme kenarından 20 mm uzaktaki kanalları bağlamayın. Küçük cıvatalarla, kanalları üstlerinde ve altlarında yerlerine sabitleyin (Şekil 2B).
- Adım 1.3'te tasarlanan yatay destekleri kullanarak borunun yarısını standa cıvatalayın.
- Reaktörü yere yerleştirin ve boru yarımlarını birbirine bantlayarak yeniden birleştirin. Piyano menteşesini bir kesme çizgisi boyunca ortalayın. Menteşe deliklerini izleyin ve boruyu buna göre delin. Menteşeyi boruya sabitlemek için bir perçin tabancası ve orta uzunlukta perçinler kullanın.
- Boruyu kapalı tutmak için küçük bir bungee kablosu kullanın ( Malzeme Tablosuna bakınız) (Şekil 1C).
- LED ışıkları bağlamak ve aşağıdaki dört bileşeni kurmak için bir elektrikçiye danışın: LED sürücüsü, dijital multipleks (DMX) kod çözücü, DMX aydınlatma denetleyicisi ve anahtar kutusu (bkz. Tüm bileşenleri PBR'nin arkasına Şekil 2A'ya göre sabitleyin.
3. Şişe platformlarının yapımı
- Sert plastikten platform şekillerini (Şekil 3A), örneğin yüksek yoğunluklu polietilen (HDPE) (bkz. Malzeme Tablosu), bilgisayarlı sayısal kontrol (CNC) frezeleme kullanarak kesin. Her şekilden üç tane yapın.
NOT: Yedek üst ve alt katmanların kesilmesi önerilir. - Alt ve üst katmanı birbirine bantlayın. Her iki şekil boyunca 6 mm çapında beş küçük deliği işaretleyin ve delin (Şekil 3A). Daha büyük bir matkap ucu kullanarak, cıvata kafalarının gömülebilmesi için bu deliklerin yüzeyini dikkatlice genişletin (Şekil 3B).
- Üç platformun her biri için, borunun arka yarısına iki küçük köşe desteği cıvatalayın.
NOT: Diş tellerinin üst kısımları arasındaki mesafe 350 mm olmalıdır. - Her bir alt katmanı diş tellerinin üzerine ortalayın. Matkap deliklerinin yerini diş tellerinin altından işaretleyin. 6 mm çapında iki delik açın. Daha büyük bir matkap ucu kullanarak, cıvataların gömülebilmesi için deliklerin yüzeyini dikkatlice genişletin.
- Alt katmanları diş tellerine cıvata (Şekil 3B-C).
- 12 mm uzunluğunda 6,35 mm dış çap (OD) sert borudan on beş parça kesin. Her bir üst ve alt katman arasında beş parça sert tüp sandviç yapın. Katmanları ve boruları Şekil 3B-D'ye göre uzun dar cıvatalarla sabitleyin.
- Her platformun arkasındaki PVC boruda büyük bir delik açın. Her mikro manyetik karıştırıcıyı platformuna yerleştirin. Her karıştırıcının elektrik kablosunu bu yeni kesilmiş deliklerden geçirin (Şekil 3C-E). Her karıştırıcıyı ilgili kontrol ünitesine ve bir elektrik prizine bağlayın.
- Her platforma 1 L'lik bir şişe yerleştirin. Arka boruya şişe boynu seviyesinde göz cıvataları ekleyin. Stabilite eklemek için her bir şişe boynunun etrafına küçük bir bungee kablosu sarın (Şekil 4A).
NOT: Protokol boyunca, renk kodlama platformları, şişeler, manyetik karıştırıcılar ve ilgili tüm kablolar ve sensörler yardımcı olacaktır.
4. Sıvı örnekleme portlarının yapımı (opsiyonel)
- Üç adet 60 mm uzunluğunda 6,35 mm OD rijit boru kesin. 5 mm'lik bir matkap ucu kullanarak, her bir kauçuk tıpadan delikler açın. Sert boru uzunluklarını tıpa içinden itin.
- Üç adet 60 mm uzunluğunda 3,18 mm OD rijit boru kesin. Bunları, her bir tıpanın alt tarafındaki çıkıntılı boruya düz bir redüktör ile bağlayın.
- Her bir durdurucu yüzeyindeki çıkıntılı tüpe tek yönlü bir durdurma valfi (örneğin, port 1 = dişi Luer, port 2 = erkek kayma Luer) yerleştirin (Şekil 4A).
- 3,18 mm OD esnek borunun üç adet 30 mm uzunluğunda kesin. Her iki uca da Luer bağlantı parçaları (örneğin, erkek Luer'den hortum dikenine ve dişi Luer'den hortum dikenine) yerleştirin.
- Adım 4.4'te yapılan parçaları, her bir kauçuk tıpanın yüzeyindeki durdurma valflerine bağlayın (Şekil 4A).
NOT: Birçok stopcock ve Luer bağlantı parçası kombinasyonu aynı sonucu verebilir. Tasarım, sıvının bir şırınga yoluyla çekilmesine veya yerleştirilmesine izin vermelidir.
5. Volumetrik gaz sensörlerinin bağlanması
- Gaz sensörlerini üreticinin talimatlarına göre hazırlayın.
NOT: Bu, esas olarak gaz sensörlerinin ambalaj sıvısı ile doldurulmasını içerir (Şekil 4B). - Gaz hatlarını yapmak için, 3,18 mm OD esnek borunun üç adet 1000 mm uzunluğunda kesin.
- Arka PVC boruya 4 mm çapında üç delik açın. Menteşenin yanındaki delikleri şişe boynu yüksekliğinde konumlandırın. Bu deliklerden geçen iplik gazı hatları (Şekil 4A).
- PVC borunun içindeki gaz hattının sonuna bir Luer bağlantısı ekleyin (örneğin, erkek Luer'e hortum diken) ve tek yönlü bir stopcock valfi bağlayın (örneğin, port 1 = dişi Luer, port 2 = erkek Luer).
NOT: Vana yalnızca sıvı numune alma portları da takıldığında gereklidir. - Gaz hattının diğer ucunu, düz bir redüktör kullanarak gaz sensörünün giriş portuna bağlayın. Bu bağlantıyı fermuarlı bir bağ ile sabitleyin.
- Tüm gaz sensörlerini jak fişi kablolarıyla dijital giriş modülüne (DIM) ve DIM'i yakındaki bir bilgisayara bağlayın.
- Veri toplama yazılımını (bkz. Malzeme Tablosu) bir Windows işletim sistemine yükleyin ve lisans anahtarı dongle'ını takın. Sensör kalibrasyon dosyalarını yazılımın kalibrasyon dizinine ekleyin.
6. Işık rejiminin programlanması
- Arka açma/kapama düğmesini kullanarak PBR'yi açın ve DMX aydınlatma denetleyicisini bir mikro USB kablosuyla bir bilgisayara bağlayın.
- Mağaza Yükseltme Araçları (SUT) ve LED kontrol yazılımını indirin (bkz. DMX aydınlatma kontrol cihazını çevrimiçi olarak kaydedin.
- LED kontrol yazılımını açın ve USB-DMX arabirimiyle çalışmak için buraya tıklayın: SUSHI-RB-RJ'yi seçin.
- ScanLibrary kutusundaki Kurulum sekmesi altında, Genel klasörü ve Tek Kanal'ı seçin. ScanLibrary ayarlarını DMX evren 1, fikstür sayısını 4 ve dizin numarasını 1 olarak değiştirin. Sağ üst köşede, açılan kutuyu Liste Görünümü olarak değiştirin. Son olarak, Yama'ya tıklayın (Ek Şekil 1).
NOT: DMX evreninde, bir kutu karartma düğmelerini kaydırarak veya metin kutusuna sayısal bir değer girerek her LED şeridin kontrolünü test eder. - Aydınlatma kontrol yazılımındaki dijital ışık ayarını, PVC borunun merkezinde yaşanan ışık yoğunluğuyla ilişkilendiren standart bir eğri oluşturun (Şekil 5). PVC borunun ortasına asılı küçük bir küresel prob ( bkz. Malzeme Tablosu) ile iç ışık yoğunluğunu ölçün.
- Düzenleyici sekmesine ilerleyin. Özel bir ışık programı oluşturmak için yeni bir Sahne oluşturun ve Adımlar eklemeye başlayın. Örnek 16:8 saat günlük program için Ek Tablo 1'e bakın. Sahneyi döngüye ayarlayın.
NOT: Adımlar, sahneleri her biri farklı ışık yoğunluğuna ayarlanabilen zaman bloklarına ayırır. Adımlar 1 s ile 43 dakika arasında değişir. Burada, 30 dakikalık adımlar en uygun olanıdır. Bir DMX aydınlatma kontrol cihazına birden fazla sahne yüklenebilir. - Hemen tanınabilen ek bir yardımcı sahne oluşturun, örneğin dört LED'den ikisi yanar.
NOT: Sahneler, DMX aydınlatma kontrol cihazının yan tarafındaki düğme kullanılarak manuel olarak değiştirilebilir. İstenilen ışık programı gece boyunca başlarsa, ışık programının zaten başlamış olup olmadığını ayırt etmek imkansız olacaktır. Yardımcı sahne, DMX aydınlatma denetleyicisinin doğru çalıştığının bir göstergesi olarak işlev görür. - Sahneleri kaydedin ve Tek Başına sekmesine ilerleyin. DMX aydınlatma kontrol cihazının belleğini yazın ve cihazın bilgisayarla bağlantısını kesin.
- DMX aydınlatma kontrol cihazını bir mikro USB kullanarak güç kaynağına bağlayın.
- Bir deneye başlamadan önce, 24 saatlik bir süre boyunca dahili ışık yoğunluğunu kaydederek ışık programını test edin. Sıvı sıcaklığı ilgi çekiciyse, bunu batık bir sıcaklık probu ile aynı anda kaydedin (Şekil 6).
7. Deneme başlatma
- Ortamları, şişeleri, karıştırma çubuklarını, kauçuk tıpaları, numune alma portlarını, dişli açıklıklı vidalı kapakları ve boruları sterilize edin.
NOT: Bu tasarımda kullanılan tüm bileşenler, vanalar ve Luer bağlantı parçaları hariç otoklavlanabilir - diğer üreticilerin otoklavlanabilir alternatifleri vardır. - Veri toplama yazılımını açın ve yapılandırma sayfasını doldurun (Ek Şekil 2). Kalibrasyon dosyalarını ilgili sensörlere atayın.
- Dizin Dosya Adı altında karşılık gelen DIM bağlantı noktası numarası klasörünü seçin. Geçerli Klasör'e tıklayın ve tüm bağlantı noktaları için tekrarlayın.
- Günlük sayfasına geçmek için Tamam'a tıklayın.
- Şişeleri yetiştirme ortamı ile istenilen hacme kadar doldurun (Ek Tablolar 2,3).
NOT: Bu şişelerin her biri, küçük bir kafa boşluğu (gaz hattı dahil ~ 80 mL) ile maksimum ~ 1.1 L tutacaktır. - Üç pelet elde etmek için stok kültürünü üç dengeli 50 mL tüpte 4500 x g'de 15 dakika boyunca santrifüj yapın. Her şişeye bir pelet ekleyin – serolojik pipet ve taze bir ortam ile pelet halinde yıkayın.
NOT: 0. günün kültür yoğunluğu, başlangıç biyokütle konsantrasyonu (IBC) olarak da bilinir. IBC'yi gAFDW cinsinden ölçmek için. L-1, ek bir 50 mL tüp adım 7.6'da santrifüj edilebilir. Elde edilen pelet daha sonra kurutulabilir veyakılabilir 15,19. Adım 7.6 büyük olasılıkla kullanıcıların bireysel amaçlarına ve denemelerine göre değişiklik yapılmasını gerektirecektir. - Her şişeye 25 x 8 mm'lik manyetik bir karıştırıcı bırakın.
- Her şişe açıklığını kauçuk bir tıpa ve dişli açıklıklı vidalı kapakla kapatın (Şekil 4A). İsteğe bağlı örnekleme portları takılıysa, vanaları kapatın.
- PVC borunun içindeki her gaz hattının ucunu bulun (adım 5.4'te yerleşik) ve valfin erkek Luer portuna bir iğne takın.
- Her bir kauçuk tıpayı karşılık gelen iğneyle delerek her şişeyi gaz sensörüne bağlayın.
- Ekranın sol tarafındaki onay kutusunu işaretleyerek, Başlat'a tıklayarak ve bir dosya adı girerek her gaz sensörünü ayrı ayrı başlatın. Tamam'ı tıklatın ve tüm sensörler için tekrarlayın (Ek Şekil 3).
NOT: Günlük kaydı yaparken, veri toplama penceresinden çıkmayın. Bilgisayarın güç ve uyku ayarlarını hiçbir zaman olmayacak şekilde ayarlayın ve deneme süresince bilgisayar güncellemelerini erteleyin. - PBR'yi açın ve DMX aydınlatma kontrol cihazının bir güç kaynağına takılı olduğundan emin olun. Programlanan ilk sahne otomatik olarak başlayacaktır. DMX aydınlatma kontrol cihazının düzgün çalıştığını onaylamak için adım 6.7'ye bakın.
8. Şişe numune alma (isteğe bağlı)
- Deneye başlamadan önce 500 mL'lik ek bir taze ortam hazırlayın (Ek Tablo 2).
NOT: 16:8 saatlik günlük döngüye sahip 24 saatlik bir ışık programı sabah 9'da başlatıldıysa, alacakaranlıktan ve şafaktan önceki örnekleme zamanları sabah 8'de ve akşam 4'te düşecektir (Ek Tablo 1). Burada, şafak ve alacakaranlık, ışıkları AÇIK'tan KAPALI'ya ve tam tersi yönde değiştiren 30 dakikalık adımları ifade eder. - Gaz hattındaki vanayı kapatın.
- Numune alma portu vanasına bir şırınga (10 mL) bağlayın (Şekil 4A).
- Numune alma portu valfini açın ve 8 mL kültür çekin.
NOT: 5–10 mL arasında tavsiye edilir. Sıvının uzaklaştırılması, kafa boşluğunda bir vakum oluşturur ve >10 mL'lik hacimlerin çıkarılmasını zorlaştırır. - Örnekleme portu valfini kapatın ve şırınganın bağlantısını kesin.
- 8 mL taze ortam (adım 8.1'den itibaren) içeren bir şırıngayı numune alma portu vanasına bağlayın.
- Numune alma portu valfini açın ve taze ortam enjekte edin.
NOT: Numune alınan kültürün hacminin taze ortamla değiştirilmesi, eşit bir kafa boşluğu hacmini ve basıncını korumaya ve numune alma port hattını temizlemeye yarar. - Şırınganın bağlantısını kesmeden önce örnekleme portu valfini kapatın.
- Her örnekleme zamanında 8,2-8,8 arasındaki adımları yineleyin.
9. Bir denemeyi sonlandırma
- Veri toplama penceresindeki tüm etkin bağlantı noktası onay kutularını işaretleyin ve Durdur'a tıklayın.
- Verileri dışarı aktarmak için Dosya ve Çevrimdışı Veriler'i seçin. İlgili tüm günlük dosyalarını seçin. Verileri elektronik tablo yazılımına aktarın ve kaydedin.
- Her şişe için, mL cinsinden ölçülen toplam oksijen hacmini, ideal gaz yasasını kullanarak mollere dönüştürün. Üretilen her bir biyokütle molü için 1.05 molO2 üretilirse, yetiştirilen biyokütlenin ağırlığını (gAFDW) tahmin edin. Biyokütlenin molar ağırlığını 24.6 g mol-1 olarak alın.
- Akış hızı verilerini manuel olarak düzenleyin. mL/s birimleri ve 3 noktalı hareketli ortalama kullanın.
Representative Results
Burada oksijen akış hızı, kültürün fotosentetik hızının bir ölçüsüdür. Daha yüksek fotosentez oranları ve dolayısıyla karbon fiksasyonu, daha yüksek büyüme oranlarına dönüşür. Bu, kullanıcının farklı tedaviler ve operasyonel günler arasındaki oksijen akış hızlarını büyüme için bir vekil olarak karşılaştırabileceği anlamına gelir. Kısaca, gaz sensörü çift odacıklı bir ölçüm hücresinde gaz kabarcıklarını yakalayarak ve serbest bırakarak çalışır (Şekil 4B). Sensörün tabanındaki girişten çıkan gaz kabarcıkları, ambalaj sıvısından yukarı doğru hareket eder. Kabarcıklar, ölçüm hücresinin bir odasında ~ 3.2 mL'lik bir hacme kadar birikir. Bu eşiğe ulaşıldığında ölçüm hücresi uçları. Bu, gazı serbest bırakır ve sistemi sıfırlar. Her ipucu veri toplama yazılımı tarafından kaydedilir.
Örnek verilerde, değişen gündüz ışık yoğunluklarına ve başlangıç biyokütle konsantrasyonlarına (IBC'ler) sahip üç tedavinin büyüme hızı karşılaştırılmıştır. Bu tedaviler gösteri amaçlı olarak keyfi olarak seçildi. Bunlar (A) 300 μmol fotonlar m-2 s-1 ve 0.03 g AFDW L-1, (B) 600 μmol fotonlar m-2 s-1 ve 0.13 g AFDW L-1 ve (C) 600 μmol fotonlar m-2 s-1 ve 0.40 gAFDW L-1 idi. Bu ışınımlar, şişeler platformlara yerleştirilmeden önce PVC borunun merkezinde küresel bir prob ile ölçüldü. Kültür derinliği ve yoğunluğu ışık zayıflamasını etkiler. Bu nedenle, mikroalglerin yaşadığı gerçek ışık yoğunluğu, bildirilenlerden farklı olabilir. Her tedavi üçlü olarak gerçekleştirildi - üç şişe içeren bir PBR içinde.
Burada, başarılı bir deney, gaz üretiminin yakından çoğaltılmış günlük kalıpları ile karakterize edildi (Şekil 7A-C). Işıklı saatlerde (gündüz), gaz üretimi istikrarlı bir şekilde artmış ve aydınlatılmamış saatlerde (gece) gaz üretimi durmuştur (Şekil 7A-C). Mikroalgler, fotosentezden oksijen ve solunumdan karbondioksit tarafından iki gaz üretilir28. Fotosentez aydınlatılmış saatlerle sınırlıdır, oysa solunum sürekli olarak gerçekleşir, ancak en çok gece28'de aktiftir. Fotosentez inşa edilirken, solunum biyokütleyi katabolize eder28. Başlangıçta, kafa boşluğu gazının bileşimi atmosferinkiyle aynıdır. Ölçüm hücresinin her dönüşünde,O2 atmosferik gazın yerini alır. Bu nedenle, gaz sensörü okumaları, giden gaz safO2 olmasa bileO2 üretimine atfedilmiştir. Gaz sensörü için minimum gaz giriş basıncı son derece düşüktür, 8-9 mbar, şişe kafa boşluğu basıncını atmosferik (deniz seviyesinde 1,01 bar) sadece biraz fazla yapar. Bu nedenle, gaz sensörü okumalarıO2 kabarcıkları ortamdan ayrıldıktan kısa bir süre sonra başlar.
Solunumdan salınan CO2, iki nedenden dolayı gaz sensörü okumalarına katkıda bulunmaz. İlk olarak, alkali ortamda, CO2 bikarbonata tepki göstererek pH'ı düşürür (Şekil 8). İkincisi, CO 2 kaçarsa, sıvı ambalajlayan gaz sensörü Silox, CO 2 kabarcıklarını ölçüm hücresine ulaşmadan önce çözer ve sıvı yüzey29'da CO 2'yi gazdan çıkarır. Bu, gece boyunca gaz sensörü okumalarının olmaması ile desteklenir. Meydana gelenler, ışıklar kapatıldıktan kısa bir süre sonra kaydedildi, bu da okumaların artık gündüz oksijen salınımını temsil ettiğini gösteriyor (Şekil 7).
Deney düzeneğinde (yerel sıcaklık ve basınç verilerini kullanarak), ortam basıncında 80 mL'lik bir kafa boşluğu,% 99'luk bir O2 kısmi basıncı oluşturmak için 340 mL çözünmüşO2 gerektirmiştir. Burada, 4 gün boyunca üretilen toplam oksijen hacmi, A tedavisinde 316 (SEM ± 11) mL ile C tedavisinde 902 (SEM ± 51) mL arasında değişmiştir (Tablo 1). Bu nedenle, deneyin sonunda, tüm şişelerin kafa boşluğu öncelikleO2'yi içerecekti. Kafa boşluğuO2'nin artan konsantrasyonu ve dolayısıyla N2 konsantrasyonunun azalması, bu gazların kısmi basıncını ve doygunluğunu etkileyecekti. % 99O2 kafa boşluğu ile, DO'da 5 kat artış hesaplandı. Tersine, % 1 N 2 kafa boşluğuna kaymanın 15 mLN 2'nin çözünmesine neden olacağı tahmin edilmektedir. Bu, neredeyse saf oksijen kafa boşluğunun altında, N2'den daha fazla çözünmüşO2'nin yer değiştirdiği anlamına gelir. Bu nedenle, ortamda daha fazlaO2 kaldığı için, bu etki üretilen fotosentetik oksijen miktarında hafif hafife almalara yol açacaktı.
Bu yöntemin temel zorluğu, kültürler yoğunlaştığında ortaya çıktı. Daha fazla biyokütle ve dolayısıyla daha fazla solunum ileO2'ye olan talep arttı. GeceO2 tüketimi, basınç altında bir kafa boşluğu yarattı. Bu, gaz sensörü paketleme sıvısının gaz hattından yukarı çıkmasına neden oldu. O2 üretimi yeniden başladığında, ambalaj sıvısının gaz sensörlerine geri sürülmesi gerekiyordu. Bu, ilk gaz sensörü okumasında gecikmeye neden oldu. Bununla birlikte, dördüncü gece, bu düşük basıncın büyüklüğü, ambalaj sıvısının B işleminin üç kopyasından ikisine ulaşmasına ve damlamasına neden oldu ve bir yüzey yağı kayganlığı oluşturdu. Ambalajlama sıvısı seviyesinin azalması nedeniyle, gaz sensörleri kısa devre yaparak ölçülmemişO2'yi doğrudan atmosfere saldı. Bu, veri toplamanın düz çizgiye gelmesine neden oldu (Şekil 7B).
Düşük basınç, kafa boşluğu hacminin sıcaklığa bağlı bir daralmasından da kaynaklanabilir. Ancak, buradaki etki çok azdı. Isı emici kanallar ve hava akımı aşırı ısıyı yeterince dağıttı. Denenen iki ışık rejiminden maksimum sıcaklık değişimi, kafa boşluğu hacmini% 1 veya daha az azalttı, bu da 80 mL'lik bir kafa boşluğunda 800 μL'lik bir ambalaj sıvısı deplasmanına eşdeğerdi. Maksimum günlük sıcaklık salınımı 300 μmol fotonlar m-2 s-1 rejimleri için 1.4 ° C ve 600 μmolfotonlar m-2 s-1 rejimleri için 3.2 ° C idi. 300 ve 600 μmolfotonlar m-2 s-1 rejimleri için ortalama gündüz sıcaklık artışı sırasıyla 0.7 ve 1.8 ° C idi. Kültür sıcaklıkları bir gecede taban çizgisine geri döndü (Şekil 6).
Yüksek çözünürlüklü büyüme oranı verileri, aksi takdirde fark edilmeyebilecek eğilimleri ortaya çıkarabilir. B ve C tedavilerini düşünün. Farklı IBC'lerine rağmen, her ikisi de aynı miktarda toplam biyokütle (gAFDW) üretti ve bu da orta pH'ta aynı kaymaya neden oldu (Tablo 1). Sadece başlangıç ve son veri noktaları göz önüne alındığında, bir birey haklı olarak iki tedavi arasındaki ortalama büyüme hızında bir fark olmadığını varsayabilir (Tablo 1). Bununla birlikte, çevrimiçi oksijen akış hızı verileri, her tedavinin değişen günlük büyüme oranlarına sahip olduğunu ortaya koymuştur. Bu varyasyonlar günde iki kez pH ölçümlerine de yansımıştır (Şekil 8). İlk gün, B tedavisinin büyüme hızı C tedavisinden daha düşüktü. Üçüncü güne gelindiğinde, bu durum B tedavisinin büyüme hızının C tedavisini aşmasıyla tersine döndü (Şekil 7B, C). Oksijen akış hızı verileri, en yüksek büyüme hızının B tedavisinde üçüncü günde meydana geldiğini göstermiştir (Şekil 7B).
Üç tedavide her bir şişe tarafından üretilen toplam oksijen hacmi, toplam biyokütledeki (gAFDW) ilgili değişimlerini tahmin etmek için kullanıldı. Bu, fotosentetik biyokütle sentezi için jenerik bir denklem kullanılarak elde edildi: CO 2 + 0.2 NH3 + 0.6 H 2 O = CH 1.8 O0.5 N 0.2 + 1.05 O 2. Kafa boşluğuO2 kısmi basıncındaki artış ve ardından DO doygunluğundaki artışın, biyokütle büyümesinin hafif bir şekilde hafife alınmasına neden olması bekleniyordu. Bu, yedi örnekten beşi için geçerliydi (Tablo 2). Ortalama olarak, tahmini biyokütle büyümesi, ölçülen biyokütle büyümesinin% 10'u içerisindeydi. Bazı tahminler, ölçülen büyümeden sadece 1-3 mg farklıydı. İki örnek büyümeyi abarttı, yani biyokütle büyümesinin açıklayabileceğinden daha fazla oksijen üretildi. Gece boyunca solunum yoluyla tüketilen herhangi bir O2, ertesi günO2 üretimindeki gecikmeye yansıtılmalıdır. Burada, deneyler gece sonunda sonlandırıldı. Bu şekilde, her deneyin son 8 saati boyunca bir gecede biyokütle katabolizması ölçülmez. Bu, özellikle yoğun kültürlerde biyokütle büyümesinin abartılmasına neden olabilir. Bu nedenle, aydınlatılmış saatlerin sonunda deneylerin sonlandırılması önerilir.
Resim 1: Reaktör standı tabanı . (A) Baz bileşenlerinin mm cinsinden boyutları (B) İki dikey desteği sabitleyen metal köşe körüklerinin oryantasyonu. (C) Dört kısa çelik uzunluktan biri, PVC borunun arka yarısını reaktör standına bağlar. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Elektrikli bileşenler . (A) PBR'nin üst çapraz kirişini ve elektrikli bileşenlerin konfigürasyonunu gösteren arka görünümü. (B) Işık kurulumundan sonra PBR'nin önden görünümü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Şişe platformu detayları . (A) Üst ve alt tabakanın mm cinsinden boyutları. (B) Cıvata kafalarını her iki katmana gömme. (C) Diş telleri alt tabakayı doğrudan PVC borunun arka yarısına bağlar. (D) Dar cıvataların üzerine monte edilmiş beş kısa sert boru parçası, üst ve alt katmanları birbirinden ayrı tutar. (E) Şişe platformu tamamlandığında, yüzey aynı hizada olmalıdır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Gaz hattı ve isteğe bağlı numune alma portu . (A) Gaz hatları, her şişe kafa boşluğunu dış gaz sensörlerine bağlar. Numune alma portu gerekliyse, gaz hatları iğnenin hemen aşağısında tek yönlü bir valf içermelidir. (B) Volumetrik gaz sensörü. Sıvı ambalaj seviyesi izleme vidasına temas etmelidir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: LED kontrol yazılımı ayarlarını dahili ışık yoğunluğuyla ilişkilendiren standart eğri. Beyaz daireler ve gri üçgenlerin her biri ayrı bir PBR'yi temsil eder. Her ışık ayarı için, dört armatürün tümü aynı değere ayarlandı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: 300 μmolfotonlar m-2 s-1 ışık rejimleri için kültür sıcaklığı değişimi. 24 saat, 16:8 saat günlük program sırasında, LED'ler gündüz kültür sıcaklığını arttırdı. Mavi ok, minimum ve maksimum sıcaklık arasındaki farkı gösterir. Bir ışık programı hatası, alacakaranlıktan önce sıcaklığın düşmesine neden oldu; bu, deney başlamadan önce düzeltildi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Üç benzersiz deney koşulu için oksijen üretimi. Her reaktör farklı bir ışık yoğunluğu ve başlangıç biyokütle konsantrasyonu (IBC) kombinasyonu aldı; (A) 300 μmol fotonlar m-2 s-1 ve IBC 0.03 g AFDW L-1, (B) 600 μmol fotonlar m-2 s-1 ve IBC 0.13 g AFDW L-1, (C) 600 μmolfotonlar m-2 s-1 ve IBC 0.40 g AFDW L-1. Üst grafikler kümülatif oksijen üretimini (mL) ve gaz akış hızını (mL / s) gösterir. Düz siyah çizgiler, kesikli mavi çizgiler ve noktalı kırmızı çizgiler çoğaltılır. Her deney için çalışma zamanı, dört tam 16: 8 saat gündüz-gece döngüsünü içeren 104 saat idi. Koyu turuncu gölgelendirme gece saatlerini ve açık turuncu gündüz saatlerini temsil eder. B tedavisinde, oksijen üretiminin üçünden ikisi için 4. günde düzleştirildiğini unutmayın. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8: pH yanıtı. Her reaktör farklı bir ışık yoğunluğu ve IBC kombinasyonu aldı; (yeşil elmaslar) 300 μmol fotonlar m-2 s-1 ve IBC 0.03 g AFDW L-1, (kırmızı üçgenler) 600 μmol fotonlar m 2 s-1 ve IBC 0.13 g AFDW L-1, (mor daireler) 600 μmolfotonlar m-2 s-1 ve IBC 0.40 g AFDW L-1 . Koyu turuncu gölgelendirme gece saatlerini ve açık turuncu gündüz saatlerini temsil eder. Hata çubukları, ortalamanın standart hatasını temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Muamele | Işık Yoğunluğu (μmol fotonlar m-2 s-1) | IBC (gAFDW L-1) | Δ toplam biyokütle (gAFDW) | Δ pH | Üretilen toplam oksijen (mL) |
| A | 300 | 0.031 | 0.289 (± 0.01) | 0.15 (± 0.01) | 316,2 (±11,4) |
| B | 600 | 0.130 | 0.674 (± 0.02) | 0.52 (± 0.27) | 834.6* |
| C | 600 | 0.400 | 0.675 (± 0.02) | 0.55 (± 0.03) | 902.2 (±50.5) |
| * Üç kopyadan yalnızca biri başarılı oldu | |||||
Tablo 1: Büyüme metriği saat 0'dan 104'e kayıyor. Parantezler, ortalamanın standart hatasını temsil eder.
| Muamele | Işık Yoğunluğu (μmolfotonlar m-2 s-1) | IBC (gAFDW L-1) | Biyokütle büyümesi ölçüldü (gAFDW) | Biyokütle büyümesi tahmin edildi (gAFDW) | Küçümseme (%) |
| A | 300 | 0.031 | 0.289 | 0.288 | 0.5 |
| A | 300 | 0.031 | 0.311 | 0.270 | 13.1 |
| A | 300 | 0.031 | 0.268 | 0.247 | 7.9 |
| B | 600 | 0.13 | 0.708 | 0.705 | 0.4 |
| C | 600 | 0.4 | 0.718 | 0.796 | -10.9 |
| C | 600 | 0.4 | 0.640 | 0.830 | -29.7 |
| C | 600 | 0.4 | 0.668 | 0.659 | 1.3 |
Tablo 2: Toplam ölçülen oksijene dayalı büyüme tahminleri. 300 μmolfotonlardan sadece bir replika m-2 s-1 ve IBC = 0.13 gAFDW L-1 tedavisi tamamlandı.
Ek Şekil 1: LED kontrol yazılımından ekran görüntüsü. Dört ışık armatürünün her biri, karartma düğmelerini kaydırarak veya metin kutusuna sayısal bir değer girerek bağımsız olarak kontrol edilebilir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil 2: Veri toplama yazılımı yapılandırma penceresinin ekran görüntüsü. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil 3: Veri toplama yazılımı günlük penceresinin ekran görüntüsü. Parlak yeşil dikdörtgenler çevrimiçi gaz sensörlerini gösterir. Veriler gerçek zamanlı olarak görüntülenir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Tablo 1: Örnek 24 saat ışık rejimi. 16:8 saatlik günlük program için, her biri 30 dakikalık 48 set vardır. Yıldız işaretleri önerilen örnekleme sürelerini gösterir. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Tablo 2: Yüksek alkaliniteli yüksek pH orta bileşim. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Tablo 3: İz element çözeltisi. Baz ortama 1 mL/L'lik son konsantrasyona ekleyin. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Discussion
Bu protokol içinde, aşağıdaki adımlara odaklanmak, yeniden üretilebilir, yüksek kaliteli veriler oluşturma olasılığını artırır. Reaktör standını inşa ederken (adım 1), taban iyi tutuşmuş dikey desteklerle sağlam olmalıdır. Oluklu çelik keskin kenarlara sahiptir, bu nedenle emniyet kapaklarının eklenmesi esastır. Şişe platformu yüzeyleri tamamen düz olmalıdır, manyetik karıştırıcı ve cıvata kafalarının her ikisi de üst tabaka yüzeyinin altına oturmalıdır (adım 3.2-3.6). Üreticinin talimatına göre, gaz sensörü ambalaj sıvısı, doğru oksijen ölçümleri için "sıvı seviyesi için izleme vidasına" doldurulmalıdır. Bu sıvı seviyesi düzenli olarak kontrol edilmelidir, çünkü ambalaj sıvısının buharlaşması ölçüm hücresine kısa devre yapabilir. Adım 5.2'de yapılan üç gaz hattının tümü aynı uzunlukta olmalıdır; çoğalan bu enures aynı kafa boşluğu hacimlerine sahiptir. Bir deneye başlamadan önce, programlanmış ışık rejimini 24 saatlik bir süre boyunca ışık yoğunluğunu kaydederek test etmeniz önerilir (adım 6.11). Sıvı sıcaklığındaki artışlar endişe vericiyse, bu test aynı zamanda dahili sıcaklık problu kapalı bir şişe içermelidir (adım 6.11). Günlük tutarken, veri toplama yazılımı penceresinden çıkmayın; bu, günlüğü sonlandırır. Kültür örnekleri alıyorsanız, valfleri yanlış sırada açarak kafa boşluğu gazını serbest bırakmamaya dikkat edin (adım 8.2-8.8). Deneysel verileri incelerken, veri toplama yazılımının otomatik olarak akış hızının hareketli bir ortalamasını oluşturduğu unutulmamalıdır. Bu, bir gecede üretilen bir veya iki akış hızı okumasının değerini şişirir. Bunu düzeltmek için gaz sensörü günlüklerini manuel olarak düzenleyin.
Bu yöntemdeki en yaygın aksilik, sıvı paketleme seviyesinin düşmesi durumunda gaz sensörünün kısa devre yapma potansiyelidir. Bunun iki yolu vardır. İlk olarak, buharlaşma sıvı seviyesini yavaşça azaltabilir. Bununla birlikte, bu kısa süreli (<7 gün) bir deney29 boyunca olası değildir. İkincisi, yüksek solunum hızları oksijeni çözeltiye çekebilir ve basınç altında bir kafa boşluğu oluşturabilir. Işık enerjisi mevcut olmadığında, mikroalgler hücresel bakım ve onarım için gereken enerjiyi sağlamak için aerobik solunum kullanır28. Bu nedenle, aydınlatılmamış saatlerde yoğun kültürlerde, oksijen tüketimi ve bunun sonucunda ortaya çıkan düşük basınç önemli olabilir. Bu, ambalaj sıvısını gaz sensörlerinden gaz hattına emer. Ambalaj sıvısının kat ettiği mesafe, gece solunum miktarı ile orantılıdır. Ambalaj sıvısı şişelere girerse, bu sıvı yüzeyinde bir yağ kayması oluşturur.
Yüksek gece solunum hızları bekleniyorsa, protokolde değişiklikler yapılabilir. Düşük basınçtan kaçınmanın en basit yolu, şişe boşluklarını gece boyunca açık bırakmaktır. Bu aynı zamandaO2'nin kısmi kafa boşluğu basıncını azaltarak DO seviyelerini hafifletme avantajına sahiptir. Yüksek DO konsantrasyonlarının büyümeye zararlı olduğuna inanılmaktadır, çünküO2 Rubisco'nun aktivitesini engelleyebilir ve oksidatif stresi tetikleyebilir30,31. Kültür süspansiyonlarının atmosferle temas halinde bile 4x aşırı doygunluğa ulaşması nadir değildir25,32. Kafa boşluğunu açmak için, gaz hattını kauçuk tıpayı kapsayan iğneden ayırın. Gece saatleri, gaz sensörü ambalaj sıvısını doldurmak veya veri toplama üzerinde çok az etkiyle sürekli deneyleri manipüle etmek için bir pencere görevi görebilir. Örneğin, kültür yoğunluğunu değiştirebilir, besinleri yenileyebilir, bir değişiklik ekleyebilir veya bir patojen getirebilir. Şişeler yeniden kapatılmalı ve ışıklar tekrar açılmadan önce gaz sensörü hattı yeniden bağlanmalıdır. Kapalı ve açık gece kafa boşlukları ile yapılan deneylerden toplanan oksijen ölçümleri farklı olacaktır.
Şişeler kapalı kaldığında, gece oksijen tüketimi kafa boşluğundakiO2 mollerinin sayısını azaltır. Bu, ambalaj sıvısının, kafa boşluğu basıncını korumak için gaz sensörü hattını sürünmesine neden olur. Işıklar yandığında, oksijen üretimi devam eder. Ambalaj sıvısı, akış hızı okumaları başlamadan önce gaz sensörüne geri itilmelidir. Bu gecikme bu nedenle gece solunum derecesi ile orantılıdır. Bu şekilde, kafa boşluğu kapalı kaldığında, O2 okumaları netO2 üretimini (fotosentetik üretim - solunum tüketimi) temsil eder. Tersine, kafa boşluğu geceleri açık olduğunda, atmosferik gaz,O2'nin tüketildiği kafa boşluğunun yerini alır ve gaz hattına hiçbir ambalaj sıvısı girmez. Sonuç olarak, solunum yolu O2 tüketimiO2 üretim verilerinde hesaba katılmamaktadır. Bu, AFDW biyokütle büyüme tahminlerinin doğruluğunu azaltabilir. Bununla birlikte, tedaviler arasındaki büyümeyi karşılaştırmak için gündüzO2 üretimini bir metrik olarak kullanmanın faydasını etkilememelidir.
Tüm laboratuvar PBR'leri aynı sınırlamadan etkilenir; yapay ışıklar güneş spektrumunu kopyalayamaz. Mikroalgler, fotosentez için 400-700 nm arasındaki ışık dalga boylarını kullanır. Bu bölge fotosentetik olarak aktif radyasyon (PAR)33 olarak adlandırılır. Güneş ışığı ve yapay ışık, bu aralıktaki dalga boylarının göreceli katkılarına göre değişir. Bu, uygun sıcaklıklar ve sabit bir ışık kaynağının yanı sıra, laboratuvar büyüme verilerinin genellikle dış mekan koşullarına güvenilir bir şekilde tahmin edilemeyeceği anlamına gelir. Ancak bu PBR'ler, laboratuvar PBR ışık beslemesinin sınırlamalarından birini ele alabilir. Güneş ışığı yoğunluğu gün boyunca oldukça değişkendir ve bulut örtüsü olay PAR'da geçici dalgalanmalara neden olur. Aydınlatma kontrol yazılımı ve DMX aydınlatma kontrolörü, 0 ila 2400 μmolfotonlar m-2 s-1 ve ötesinde ışık yoğunlukları sağlayabilir. Işık rejimleri, 1 s kadar kısa bireysel artışlara ayrılabilir. Ayarlanabilir ışık yoğunluğu, kullanıcının dış mekan ışık desenlerini standart PBR kurulumlarından daha yakından taklit etmesini sağlar. Burada, simüle edilmiş 30 dakikalık şafak ve alacakaranlık aralıkları gündüz ve gece döngülerini birlikte soluyor (Ek Tablo 1).
AFDW yoğunluğu büyümenin standart ölçüsü haline gelmiş olsa da, bu yöntem önemli kültür hacimleri, 2-3 günlük bir işlem süresi gerektirebilir ve her seferinde bir veri noktası oluşturur. Ayrıca, koşullar elverişsiz hale gelirse ve hücreler ölürse, AFDW yoğunluğu aktif olarak fotosentez yapan hücreler ile ayrışan hücreler arasında ayrım yapmaz. Fotosentetik oksijen üretim hızının ölçülmesi, alternatif bir büyüme vekili olarak hizmet eder. Bu PBR tasarımı, kültür hacmini korurken çok az kullanıcı müdahalesiyle oksijen üretimini sürekli olarak kaydedebilir. Veri çözünürlüğü, daha düşük ölçüm hücresi hacmine sahip bir gaz sensörü seçilerek geliştirilebilir, örneğin 1 mL. Ayrıca, kültürler iyi karıştırılmışsa, kullanıcılar sürekli optik yoğunluk okumaları için bir spektrofotometre kurmaya karar verebilirler. Ortamın sıcaklık kontrolü isteniyorsa, devridaim yapan bir soğutucu eklenebilir. Bu PBR'ler, ağır finansal yatırım yapmadan mikroalgal araştırma kapasitesini genişletmek isteyen bir laboratuvara değerli bir katkıdır. Özellikle Spirulina gibi yüksek alkalinite, yüksek pH'lı türlerle çalışanlar için uygundurlar. Bu PBR'ler ışık rejimi esnekliği sunar ve hızlı, çoğaltılmış, laboratuvar büyüme karşılaştırmaları için geçerlidir.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma, Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC), Kanada İnovasyon Vakfı (CFI), Kanada İlk Araştırma Mükemmellik Fonu (CFREF), Alberta Innovates, General Sir John Monash Vakfı, Alberta Hükümeti ve Calgary Üniversitesi tarafından desteklenmiştir. Elektrik işleri için Mark Toonen'e ve çözünürlük hesaplamaları için William Richardson'a teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum channels Imperial: 0.90” x 39.37” Metric: 2.3 cm x 100 cm Quantity: 4 |
LED World | AC-AR1-1M | Required as a heat sink |
| Bungee cords, small Quantity: 5 |
- | - | To secure bottles |
| Computer - desktop/laptop Quantity: 1 |
- | - | - |
| Data Logger, HOBO U30 USB Weather Station Quantity: 1 |
HOBO, Hoskin | U30-NRC-VIA-10-S100-000 | Records light sensor information |
| Digital interface module, Rigamo, 4-channel Quantity: 1 |
Ritter | N/A | This is to transmit gas sensor data to the computer |
| DMX decoder, 12~24 VDC, DMX-CV-4X5A Quantity: 1 |
LITECH, LED World | LT-840-6A | Transmit messages which alter the light pattern |
| DMX lighting controller, SUSHI-RB-RJ Quantity: 1 |
Arcolis, Nicolaudie America Inc. | SUSHI-RB-RJ DMX | Encodes the lighting program |
| Gas sensor packing liquid (Silox) Quantity: 1 L |
Ritter | https://www.ritter.de/en/data-sheets/silox | |
| Gas sensor, volumetric Quantity: 3 |
Ritter | MGC-1 V3.4 PMMA (https://www.ritter.de/downloads/mgc-milligascounter-en) | Measures oxygen production |
| Glass bottles, round 1 L with GL45 neck Quantity: 3 |
Corning, Capitol Scientific | 1395-1L | Culture vessels |
| Hardware - end caps for slotted steel Quantity: 10 |
Paulin, Home Depot | 142-612 | To cover sharp edges of slotted steel |
| Hardware - eye hooks Quantity: 6 |
- | - | To secure bottles |
| Hardware - metal corner braces (large) Imperial: 4" x 4" Metric: 10 cm x 10 cm Quantity: 8 |
- | - | Larger brackets to construct metal stand |
| Hardware - metal corner braces (small) Imperial: 2 1/2" x 2 1/2" Metric: 6.4 cm x 6.4 cm Quantity: 6 |
- | - | Small brackets to connect bottle platforms to PVC pipe |
| Hardware - metal corner gussets Imperial: 3" x 3" Metric: 7.6 cm x 7.6 cm Quantity: 6 |
Paulin, Home Depot | 142-616 | Flat brackets to construct metal stand |
| Hardware - piano hinge Imperial: 36" Metric: 91 cm Quantity: 1 |
- | - | Connects two halves of PVC pipe |
| Hardware - rivets Quantity: 40 |
- | - | To attach piano hinge to PVC tubing |
| Hardware - set of bolts, nuts, washers Quantity: 60 |
- | - | Long thin bolts are required to secure bottle platforms around magentic stirrers |
| Hardware - set of bolts, nuts, washers Quantity: 30 |
- | - | Larger shorter bolts are required to build the metal stand |
| LED driver, constant voltage, 96W 24VDC UL Listed IP65 Driver Class 2 regulated power supply Quantity: 1 |
Magnitude Lighting, LED World | CVN96L24DC | Regulates power to the lights |
| LED lights, Cinco Bright LED Flex Strip Quantity: 4 m roll |
EvenBright, LED World | FA128M57-4M-24V-X | Roll is trimmed into 4 x 1 m lengths and secured inside the PVC tube |
| Light meter, handheld with submersible sperical probe Quantity: 1 |
LI-COR | LA-250A | Calibrate the reactors light intensity |
| Light sensors Photosynthetic Light (PAR) Smart Sensor Quantity: 2 |
HOBO, Hoskin | S-LIA-M003 | Only one is required however two would be good practice in case one malfunctioned |
| Magnetic stirrers (MIXdrive 1 XS) with external control units and power supply (MIXcontrol eco) Quantity: 3 |
2Mag, 2MAG USA | MF 40300 | Stirrers sit sandwiched in bottle platforms |
| Metal plate Imperial: 24" x 8" Metric: 61 cm x 20.3 cm Quantity: 1 |
- | - | This is a surface on which to secure electronics, it is attached to the back of the reactor |
| Pipe, white PVC Imperial: 6" diameter x 42" high Metric: 15.2 cm x 106.7 cm Quantity: 1 |
- | - | Cut lengthwise in two halves, used to house lights and bottles |
| Plastic (HDPE) sheets Imperial: 4" x 4" x 1/4" Metric: 10 cm x 10 cm x 1 cm Quantity: 6 |
Inventables | 30291-01 | For bottle platforms which house magentic stirrers |
| Rubber stoppers - GL45 size Quantity: 3 |
Duran, VWR | 76289-760 | Seals culture vessels |
| Screw caps - with aperture and GL45 neck Quantity: 3 |
Corning, Capitol Scientific | 1395-45HTSC | Generates seal of culture vessels |
| Slotted angle steel lengths Imperial: 1-1/2" X 48" x 0.074" Metric: 3.8 cm x 122 cm x 0.19 cm Quantity: 6 |
Paulin, Home Depot | 142-202 | Makes up the body of the metal stand |
| Slotted flat steel lenghts Imperial: 1-3/8" x 48" x 0.074" Metric: 3.5 cm x 122 cm x 0.19 cm Quantity: 3 |
Paulin, Home Depot | 142-222 | Makes up the body of the metal stand |
| Software - Easy Stand Alone (ESA) | https://www.dmxsoft.com/#apps | AKA LED control software | |
| Software - Rigamo v3.1 | AKA data acquisition software | ||
| Software - Storage Upgrade Tools (SUT) | https://store.dmxsoft.com// | ||
| Stir bar Imperial: 1" x 5/16" Metric: 2.5 cm x 0.8 cm Quantity: 3 |
Fisherbrand | 14-513-59 | Stirs culture |
| Switch box Quantity: 1 |
- | - | Turns power on/off to reactor |
| Syringe, 10 mL Quantity: Multiple |
- | - | Optional if you wish to extract culture |
| Tube adaptor fittings, plastic - Stopcock 1-way Quantity: 6 |
Masterflex, Cole Palmer | RK-12023-33 | Close/open culture vessel line |
| Tube adaptor fittings, plastic - variety of male and female luer lock fittings Imperial: to fit 1/16" and 1/8" ID tubing Metric: to fit 1.59 mm and 3.18 mm tubing Quantity: Multiple packets |
Masterflex, Cole Palmer | RK-30800-16; RK-30800-18; RK-45518-26; RK-45501-00; RK-45501-04 | Many different combinations can achieve the same end result, best to order a variety of fittings |
| Tube adaptor fittings, plastic - variety of straight connectors Imperial: to fit 1/16" and 1/8" ID tubing Metric: to fit 1.59 mm and 3.18 mm tubing Quantity: Multiple packets |
Masterflex, Cole Palmer | RK-40616-04 | Many different combinations can achieve the same end result, best to order a variety of fittings |
| Tubing, flexible, transparent Imperial: ID=1/16", OD=1/8" Metric: ID = 1.59 mm, 0D = 3.18 mm Quantity: 4 m |
Masterflex, Cole Palmer | RK-06422-02 | Line from culture vessel to gas sensor |
| Tubing, flexible, transparent Imperial: ID=1/8", OD=1/4" Metric: ID = 3.18 mm, 0D = 6.35 mm Quantity: 2 m |
Masterflex, Cole Palmer | RK-06422-05 | Gas sensor standard tubing size |
| Tubing, rigid, transparent Imperial: ID=1/16", OD=1/8" Metric: ID = 1.59 mm, 0D = 3.18 mm Quantiy: 1 m |
Masterflex, Cole Palmer | RK-06605-27 | Spans rubber stopper allowing gas to exit |
| Tubing, rigid, transparent Imperial: ID=1/8", OD=1/4" Metric: ID = 3.18 mm, 0D = 6.35 mm Quantity: 1 m |
Masterflex, Cole Palmer | RK-06605-30 | Spans rubber stopper allowing gas to exit |
| Zip ties, small Quantity: 1 packet |
Secure tube fittings |
References
- Benemann, J. R. Opportunities and challenges in algae biofuels production. A position paper in line with Algae World. , (2008).
- Laurens, L. M. L. State of technology review - algae bioenergy. An IEA bioenergy inter-task strategic project. IEA Bioenergy. , (2017).
- Robertson, D. E., et al. A new dawn for industrial photosynthesis. Photosynthesis Research. 107, 269-277 (2011).
- Troschl, C., Meixner, K., Drosg, B. Cyanobacterial PHA production-review of recent advances and a summary of three years' working experience running a pilot plant. Bioengineering. 4 (2), (2017).
- Rizwan, M., Mujtaba, G., Memon, S. A., Lee, K., Rashid, N. Exploring the potential of microalgae for new biotechnology applications and beyond: a review. Renewable and Sustainable Energy Reviews. 92, 394-404 (2018).
- Niesa, F., et al. Characterization of Phormidium lacuna strains from the North Sea and the Mediterranean Sea for biotechnological applications. Process Biochemistry. 59, 194-206 (2017).
- Laurens, L. M. L., Chen-Glasser, M., McMillan, J. D. A perspective on renewable bioenergy from photosynthetic algae as feedstock for biofuels and bioproducts. Algal Research. 24, 261-264 (2017).
- Barreiro-Vescovo, S., Barbera, E., Bertucco, A., Sforza, E. Integration of microalgae cultivation in a biogas production process from organic municipal solid waste: From laboratory to pilot scale. ChemEngineering. 4 (2), 26 (2020).
- Zurano, A. S., et al. Year-long assessment of a pilot-scale thin-layer reactor for microalgae wastewater treatment. Variation in the microalgae-bacteria consortium and the impact of environmental conditions. Algal Research. 50, (2020).
- Deprá, M. C., Severo, I. A., Dias, R. R., Zepka, L. Q., Jacob-Lopes, E. Photobioreactor design for microalgae culture. Microalgae. , Elsevier. 35-61 (2021).
- Osburn, F. S., Wagner, N. D., Scott, J. T. Biological stoichiometry and growth dynamics of a diazotrophic cyanobacteria in nitrogen sufficient and deficient conditions. Harmful Algae. 103, (2021).
- Eustance, E., Badvipour, S., Wray, J. T., Sommerfeld, M. R. Biomass productivity of two Scenedesmus strains cultivated semi-continuously in outdoor raceway ponds and flat-panel photobioreactors. Journal of Applied Phycology. 28 (3), 1471-1483 (2016).
- Qiang, H., Richmond, A., Zarmi, Y. Combined effects of light intensity, light-path and culture density on output rate of spirulina platensis (cyanobacteria). European Journal of Phycology. 33 (2), 165-171 (1998).
- Ooms, M. D., Dinh, C. T., Sargent, E. H., Sinton, D. Photon management for augmented photosynthesis. Nature Communications. 7, 1-13 (2016).
- Moheimani, N. R., Borowitzka, M. A., Isdepsky, A., Sing, S. F. Standard methods for measuring growth of algae and their composition. Algae for biofuels and energy. , Springer. Dordrecht. 265-284 (2013).
- Griffiths, M. J., Garcin, C., van Hille, R. P., Harrison, S. T. L. Interference by pigment in the estimation of microalgal biomass concentration by optical density. Journal of Microbiological Methods. 85 (2), 119-123 (2011).
- Schumann, R., Häubner, N., Klausch, S., Karsten, U. Chlorophyll extraction methods for the quantification of green microalgae colonizing building facades. International Biodeterioration and Biodegradation. 55 (3), 213-222 (2005).
- Pinckney, J. L., Richardson, T. L., Millie, D. F., Paerl, H. W. Application of photopigment biomarkers for quantifying microalgal community composition and in situ growth rates. Organic Geochemistry. 32 (4), 585-595 (2001).
- Van Wychen, S., Laurens, L. M. L. Determination of total solids and ash in algal biomass: laboratory analytical procedure (LAP). National Renewable Energy Laboratory. , Golden, CO. (2015).
- Davis, R., Laurens, L. Algal biomass production via open pond algae farm cultivation: 2019 state of technology and future research. National Renewable Energy Laboratory. , Golden, CO. (2020).
- Borovkov, A. B., Gudvilovich, I. N., Avsiyan, A. L. Scale-up of Dunaliella salina cultivation: from strain selection to open ponds. Journal of Applied Phycology. 32 (3), 1545-1558 (2020).
- Davies, F. K., et al. Microbiota associated with the large-scale outdoor cultivation of the cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002. Algal Research. 58, (2021).
- Ataeian, M., et al. Direct capture and conversion of CO2 from air by growing a cyanobacterial consortium at pH up to 11.2. Biotechnology and Bioengineering. 116 (7), 1604-1611 (2019).
- Fu, F., et al. Sustained photosynthesis and oxygen generation of microalgae-embedded silk fibroin hydrogels. ACS Biomaterials Science & Engineering. , (2021).
- Rearte, T. A., et al. Photosynthetic performance of Chlorella vulgaris R117 mass culture is moderated by diurnal oxygen gradients in an outdoor thin layer cascade. Algal Research. 54, (2021).
- Poughon, L., et al. Limnospira indica PCC8005 growth in photobioreactor: model and simulation of the ISS and ground experiments. Life Sciences in Space Research. 25, 53-65 (2020).
- Yen, U. C., Huang, T. C., Yen, T. C. Observation of the circadian photosynthetic rhythm in cyanobacteria with a dissolved-oxygen meter. Plant Science. 166 (4), 949-952 (2004).
- Vermaas, W. F.
- Ritter, MilliGascounter Type MGC-1 Operation Instructions V 3.4. , (2017).
- Sousa, C., De Winter, L., Janssen, M., Vermuë, M. H., Wijffels, R. H. Growth of the microalgae Neochloris oleoabundans at high partial oxygen pressures and sub-saturating light intensity. Bioresource Technology. 104, 565-570 (2012).
- Latifi, A., Ruiz, M., Zhang, C. C.
- Morillas-España, A., Lafarga, T., Gómez-Serrano, C., Acién-Fernández, F. G., González-López, C. V. Year-long production of Scenedesmus almeriensis in pilot-scale raceway and thin-layer cascade photobioreactors. Algal Research. 51, (2020).
- Melis, A. Solar energy conversion efficiencies in photosynthesis: minimizing the chlorophyll antennae to maximize efficiency. Plant Science. 177 (4), 272-280 (2009).
