Summary
공간 거리는 별도의 내피 및 심근 세포 세포층의 공동 배양 모델에서 저산소증 / 재 산소화 손상을 평가하는 핵심 매개 변수이며, 처음으로 공동 배양 공간 환경을 최적화하여 심근 세포 보호에서 내피 세포의 역할을 테스트하기위한 유리한 시험관 내 모델을 제공 할 필요가 있음을 시사합니다.
Abstract
허혈성 심장 질환은 전 세계적으로 사망 및 장애의 주요 원인입니다. 재관류는 허혈을 넘어 추가적인 부상을 일으킨다. 내피 세포 (ECs)는 세포 - 세포 상호 작용을 통해 재관류 손상으로부터 심근 세포 (CM)를 보호 할 수 있습니다. 공동 배양은 세포 - 세포 상호 작용의 역할을 조사하는 데 도움이 될 수 있습니다. 혼합 공동 배양은 가장 간단한 접근법이지만 단리 처리 및 단일 세포 유형의 하류 분석이 가능하지 않기 때문에 제한됩니다. ECs가 용량 의존적으로 CM 세포 손상을 감쇠시킬 수 있는지 여부와 두 세포주 사이의 접촉 거리를 변화시킴으로써 이러한 보호가 더욱 최적화될 수 있는지 여부를 조사하기 위해, 우리는 마우스 일차 관상동맥 내피 세포와 성인 마우스 심근세포를 사용하여 0.5에서 세포간 층간 거리가 변화한 세 가지 유형의 세포 배양 삽입물을 테스트했습니다. 각각 1.0 및 2.0 mm. CMs-전용에서, 락테이트 데하이드로게나제 (LDH) 방출에 의해 평가된 바와 같은 세포 손상은 저산소증 동안 그리고 거리가 0.5 및 1.0 mm에 비해 2.0 mm일 때 재산소화 시에 유의하게 증가하였다. EC와 CM이 거의 직접 접촉했을 때 (0.5mm), 저산소증에 따른 CM의 재 산소 부상의 경미한 감쇠 만있었습니다. 공간 거리가 1.0mm일 때 이러한 감쇠가 크게 증가하였다. 2.0mm 거리에서, ECs는 저산소증과 저산소증/재산소화 둘 동안 CM 손상을 감쇠시켰으며, 이는 EC가 CM과 교차하는 데 충분한 배양 거리두기가 필요함을 나타내므로, 분비된 신호 분자가 순환하고 보호 경로를 완전히 자극할 수 있다. 우리의 연구 결과는 시뮬레이션 된 허혈 / 재관류 손상에 대한 CM 보호에서 EC의 역할을 테스트하기위한 유리한 시험관 내 모델을 제공하기 위해 EC / CM 공동 배양 공간 환경을 최적화하는 것이 필요하다는 것을 처음으로 시사합니다. 이 보고서의 목표는 조사관이이 중요한 모델을 유리하게 사용할 수있는 단계별 접근 방식을 제공하는 것입니다.
Introduction
허혈성 심장 질환은 전 세계적으로 사망 및 장애의 주요 원인입니다 1,2. 그러나 재관류의 치료 과정 자체가 심근 허혈 / 재관류 (IR) 손상으로 알려진 심근 세포 사망을 유발할 수 있으며 여전히 효과적인 치료법이 없습니다3. 내피 세포 (ECs)는 파라크린 신호의 분비뿐만 아니라 세포 간 상호 작용을 통해 심근 세포 (CMs)를 보호하기 위해 제안되었습니다4.
세포 공동 배양 모델은 세포 기능 및 분화에 대한 자가분비 및/또는 파라크린 세포-세포 상호작용의 역할을 조사하기 위해 광범위하게 사용되어 왔다. 공동 배양 모델 중에서, 혼합 공동 배양은 가장 간단하며, 여기서 두 가지 유형의 세포가 원하는 세포 비율5로 단일 배양 구획 내에서 직접 접촉합니다. 그러나, 세포 유형 사이의 분리된 처리와 단일 세포 유형의 하류 분석은 혼합 집단을 고려할 때 쉽게 실현 가능하지 않다.
이전의 연구에 따르면 저산소 및 허혈성 모욕은 젖산 탈수소 효소 (LDH)의 방출에 의해 측정 된 세포막의 완전성에 심각한 손상을 일으킨다. 이 부상은 재관류 손상6,7,8을 모방하여 재산소화시 악화됩니다. 현재 프로토콜의 목표는 EC의 존재가 저산소증 및 재산소화 (HR)로 인한 CM의 세포막 누출을 용량 의존적으로 감쇠시킬 수 있고 두 세포주 간의 접촉 거리를 변화시킴으로써 EC의 보호 효과를 최적화 할 수 있다는 가설을 테스트하는 것이 었습니다. 따라서 우리는 세 가지 유형의 세포 배양 삽입물과 마우스 일차 관상 동맥 내피 세포 및 성인 마우스 심근 세포를 사용했습니다. Corning, Merck Millipore 및 Greiner Bio-One이 브랜드 한 인서트를 통해 세포주 간 거리가 각각 0.5, 1.0 및 2.0mm인 세 가지 세포 배양 누화 조건을 만들 수있었습니다. 각 경우에 인서트당 100,000개의 EC를 도금하였다.
또한, 공동 배양에서 EC의 밀도가 이 모델에서 HR 손상 감쇠에 기여하는지 여부를 결정하기 위해, CMs에 의한 EC 농도와 LDH 방출 사이의 용량-반응 관계를 연구하였다. ECs는 2.0 mm 인서트에서 인서트당 각각 25,000, 50,000 및 100,000으로 플레이팅되었다.
이 보고서는 조사관이이 중요한 모델을 유리하게 사용할 수있는 단계별 접근 방식을 제공합니다.
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Protocol
1. 실험 준비/도금
- 제조업체의 지침에 따라 CM 및 EC를 유지 관리합니다.
- 두 세포주가 공급 업체에서 도착하면 해동하십시오. 신선한 배지로 세척 한 후 T25 플라스크에 접시를 넣으십시오. 세포를 구입 한 동일한 공급 업체로부터 각 세포 배양 배지를 구입하는 것이 좋습니다. 다음날 배지로 세포를 새로 고치고 합류 할 때 사용하십시오.
- 세포 배양 인큐베이터를 21% O2, 5% CO2, 74%N2로 37°C에서 유지하고 가습된 상태로 유지한다.
참고: 이 프로토콜에 사용된 마우스 일차 관상동맥 내피 세포는 C57BL/6 마우스의 관상동맥으로부터 분리되고, 성인 마우스 심근세포는 성인 C57BL/6J 마우스 심장으로부터 분리되고 상업적으로 수득된다( 표 참조).
- 멸균 조건 하에서 플레이트 CM을 24웰 플레이트(열등층)의 바닥에 놓습니다. 24시간 후, 플레이트 ECs를 공동배양 웰의 삽입물(또는 우수한 부분) 내로 넣는다. EC 도금 후 24시간 후, EC 삽입물을 CM 플레이트 베이스 상에 놓고, 공동 배양 기간을 시작한다. 사용 전에 세포를 적어도 12-24 시간 동안 공동 배양하도록 허용하십시오. 이러한 단계는 아래에 자세히 설명되어 있습니다.
- 광학 현미경으로 CM 세포주 합류도를 추정한다. 세포가 배양 플라스크에서 90%-100% 합류하는 것으로 보이면, 실험 플레이팅을 진행한다.
- 합류성 세포 배양물을 함유하는 플라스크에서 배지를 제거하고 T25 플라스크용 트립신/에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 3-5 mL로 트립신화한다. 플라스크를 부드럽게 교반하고, 37°C에서 2-5분 동안 인큐베이션한 다음, 광학 현미경 하에서 효소 진행을 평가한다. 세포가 둥글기 시작하면 셀 스크레이퍼를 사용하여 표면에서 세포를 분리하십시오.
- 분리 후, 트립신/세포 용액을 T25 플라스크용 배지 10mL가 들어있는 50mL 튜브에 첨가하여 트립신 용액을 불활성화시킨다. 세포 현탁액을 120 x g 에서 2분 동안 원심분리하여 연질 세포 펠릿을 얻었다. 상청액을 제거하고 펠렛을 5 mL의 배지에 재현탁시켰다.
- 세포 계수를 수행하고 세포 생존율을 확인하려면 재현탁 세포 10μL의 분취량과 10μL의 트리판 블루 염료를 혼합한다. 세포 계수기를 사용하여 살아있는 세포를 계산하십시오. 원하는 파종 밀도를 얻기 위해 세포를 신선한 일반 배지로 희석하십시오. 부피는 원하는 종자 밀도 및 원액의 세포 농도에 따라 계산됩니다. 모든 도금은 멸균 조건에서 수행되어야합니다.
- 웰당 300,000의 시딩 밀도에서 세포외 매트릭스로 사전 코팅된 24웰 플레이트의 바닥에 플레이트 CM을 시딩합니다. 세포를21% O2 및 5%CO2로 하룻밤 동안 37°C에서 유지시킨다.
- 24시간 후, EC를 인서트당 100,000의 최적 도금 밀도(배양 면적은 33.6mm2)로 인서트에 플레이트합니다(그림 1). EC 도금 24시간 후, EC 삽입물을 CM 웰 내부에 배치하여 공동 배양을 시작합니다. 실험을 수행하기 전에 세포를 12-24 h 동안 공동 배양하도록 허용하십시오.
- 실험이 수행될 때까지 CM과 EC가 모두 80%-90%의 합류율에 도달했는지 확인합니다.
2. 저산소증/재산소화로 허혈/재관류 손상을 체외에서 시뮬레이션하기 위한
참고: 다음 단계는 설명된 대로 수행해야 하며 중간에 일시 중지하지 마십시오.
- 50 mL 원뿔형 튜브에 ~25 mL의 배지를 부어 저산소 배지를 제조하였다. 실리콘 멤브레인으로 상단을 공기 밀봉하고 멸균 된 피펫을 사용하여 구멍을 뚫습니다. 다른 구멍을 만들면 이번에는 피펫이 미디어에 약 2/3 정도 잠겨 있습니다.
- 매체를 저산소 가스(0.0125% O2, 5%CO2, 94.99%N2)로 30L/min의 유속으로 5분 동안 플러시합니다. 이것은 저산소증이 시작될 때 매체에 용해된O2를 최소화한다(단계 2.5).
- 부착된 세포를 함유하는 24-웰 플레이트 또는 배양 인서트의 배지를 버리고 10% 인산염 완충 식염수(PBS)의 100μL/웰로 매우 부드럽게 세척한다. 그 후, 새로 준비된 저산소 배지 500 μL를 플레이트 또는 인서트의 각 웰에 첨가한다.
참고: 배지의 저산소증은 2.5단계에서 세포와 배지에 대한 진정한 저산소증이 시작되기 전에 이 단계에서 가능한 한 잠깐 중단됩니다.- normoxic 대조군에서는 원래의 배지를 포도당과 혈청을 함유 한 신선한 정상 배지로 교체하십시오.
- 챔버 내에 멸균수로 채워진 페트리 접시를 배치하여 저산소증 챔버를 가습하십시오. 다음으로, 저산소 그룹을 포함하는 플레이트를 챔버 내로 놓는다.
- 저산소증 챔버를 저산소 가스 (0.0125% O2, 5%CO2, 94.99%N2)로 30 L/min의 흐름에서 5분 동안 플러시하십시오. 챔버를 24시간 동안 37°C 인큐베이터에 놓는다.
- 저산소증 후 정상적인 조건에서 CM과 EC를 배양하십시오. 이렇게하려면 플레이트 / 인서트의 오래된 배지를 버리고 일반 배지 (포도당 및 혈청 함유; 각 웰 / 인서트의 500 μL)로 교체하고 재관류를 모방하기 위해 2 시간 동안 정상 배양 조건 (21 % O2, 5 %CO2, 74 %N2, 37 °C)하에 인큐베이터에 보관하십시오.
- 배지 대체의 효과를 조절하려면 저산소 배지가 변경되는 것과 동시에 노목산 세포의 배지를 변경하십시오.
참고: 그림 2 에서는 이 프로토콜에 대한 개략적인 개요를 제공합니다.
3. 엔드포인트 평가
- 세포 배양 배지를 24-웰 플레이트로부터 96-웰 플레이트로 옮긴다. 24-웰 플레이트의 각 웰로부터 200 μL의 배지를 사용하고, 그에 따라 96-웰 플레이트의 네 웰에 균등하게 분배한다. 노목시아 대 저산소증 대 HR에 대해 각각 하나의 플레이트를 사용하십시오.
- 세포 손상의 정도를 결정, 예를 들어, 제조자의 지시에 따라 세포독성 분석 키트를 사용하여 LDH에 대한 흡광도를 측정한다. 분석 프로토콜에 지시된 대로 96-웰 플레이트에서 검정을 수행한다.
4. 통계
- 파라메트릭 데이터를 평균/표준 편차로 표시하고 비모수 데이터를 중앙값/사분위수 범위의 상자 플롯으로 표시합니다. 유형 1 오류의 가능성을 줄이기 위해 허용되는 사후 테스트를 사용하여 적절한 파라메트릭 대 비모수 다중 비교 테스트를 수행해야 합니다. 유의성은 일반적으로 0.05의 알파(두 꼬리)로 설정됩니다.
- 현재 연구에서 수행 된 모든 실험에 대해 하나의 실험 내에서 적어도 세 번의 웰 반복실험을 수행하십시오. 통계 분석에 사용된 각 실험의 반복은 서너 번이었다.
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Representative Results
이 실험에 사용된 세 가지 유형의 삽입물(A, B, C)은 모두 0.4 μm의 동일한 기공 크기를 갖는다. 이들 사이의 유일한 차이점은 인서트-베이스 높이인데, 이는 두 공동 배양된 세포층 사이의 거리가 각각 0.5, 1.0 및 2.0mm가 되도록 허용하고(그림 3), 서로 다른 공급업체에서 온 것이라는 점입니다(자세한 내용은 재료 표 참조).
IR 손상을 시뮬레이션하기 위해 HR을 겪는 두 세포주의 분리된 층과 함께 시험관내 공동 배양 모델을 확립하기 위해, ECs의 유무에 관계없이 공동 배양된 CMs의 세포막 무결성을 조사하였다. CM 층 위의 다양한 거리에 배치 할 수있는 EC에 대한 별도의 삽입물을 활용함으로써 CM의 막 손상의 심각성에 대한 세포층 거리의 차등 효과를 평가할 수있었습니다. 별도의 실험 세트에서 우리는 EC의 밀도와 EC와 CM의 비율을 다양화했습니다. 또한, 모의 허혈을 모의 IR 손상으로부터 분화시키기 위해, 실험은 1) 노르목시아, 2) 저산소증만, 및 3) HR의 조건 하에서 수행되었다. 이 모델에서는 24 시간 저산소증을 사용한 다음 2 시간 재산소화를 사용했습니다.
가변 거리
세포층 사이의 0.5mm 거리(인서트 A)
CM을 단독으로 배양했을 때, 저산소증은 우리의 이전 연구와 일치하는 노르목시아에 비해 LDH 방출을 유의하게 증가시켰다 (그림 4A)6. 그러나, LDH는 저산소증 전용 그룹에 비해 2h 재산소화 시에 단지 약간 더 증가하였다. ECs 및 CM을 0.5 mm 거리에서 함께 공동 배양했을 때, 저산소증에 의한 LDH 방출의 증가는 단지 감쇠되지 않았으며, 이는 ECs가 어떠한 보호 효과도 나타내지 않았음을 나타낸다(저산소증 전용 조건하의 CM 단독군과 비교하여). 그러나 EC는 HR 기간 동안 CM에 대해 경미하지만 상당한 보호를 가했습니다.
세포층 사이의 거리 1.0 mm (인서트 B)
두 세포층 사이의 거리가 1.0 mm로 증가한 것을 제외하고는 위와 동일한 실험을 수행하였다(도 4B). 우리는 LDH 방출이 저산소증에 의해서만 CMs에서만 유의하게 증가한다는 것을 발견했다. 그러나, 0.5 mm 인서트에서와 달리, CMs의 LDH 증가는 저산소증에 대해서만 HR에 의해 강화되었다. 더욱이, 이러한 강화는 CM 전용 그룹에 비해 재산소화 동안 ECs의 존재에 의해 더 억제되고 거의 폐지되었다.
세포층 사이의 거리 2.0 mm (인서트 C)
두 세포주 사이에 2.0 mm의 거리를 만드는 공동 배양 삽입물 (도 4C)을 사용했을 때, 우리는 또한 저산소증 동안에만 CMs에 의한 LDH 방출의 현저한 증가를 발견하였고, 0.5 mm- 및 1.0 mm-실험에서와 동일한 정도까지 관찰하였다. 그러나 흥미롭게도, 재산소화에 의한 LDH 방출의 추가적인 증가는 1.0mm 실험에서보다 훨씬 더 뚜렷했다. 이 두 가지 증가는 EC의 존재에 의해 폐지되지는 않았지만 감쇠되었으며, 이는 0.5 또는 1.0mm 인서트를 사용하는 것과 다른 것을 나타내는 EC는 저산소증 전용 및 HR 조건 모두에서 CM을 부상으로부터 크게 보호했습니다.
가변 EC 강도
상이한 실험 세트에서, 2.0 mm 인서트에 플레이팅된 ECs의 농도는 인서트 당 각각 25,000, 50,000 및 100,000 셀로 적정되었다. LDH 방출은 24시간 저산소증에 이어 2시간 재산소화 후에 측정되었다. 우리의 결과는 공동 배양에서 EC 강도의 증가가 HR에 의한 LDH 방출의 용량 의존적 감쇠를 초래한다는 것을 보여주었다 (도 5); 규범 적 조건에서는 그러한 효과가 나타나지 않았습니다.
그림 1: 우물 내부 삽입의 개략도. EC가 있는 인서트(인서트당 최대 100,000개의 셀)는 바닥에 CM(웰당 300,000개)이 있는 24웰 플레이트로 전송됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 실험 설계. 세포는 정상 산소 조건 (21%O2) 하에서 배양되고, 이어서 두 그룹으로 나뉘어진다: 노목산 대조군은 또 다른 24 시간 동안 정상 조건 하에서 계속 배양될 것이고, 반면에 저산소증 그룹은 단지 0.01% O2 와 글루코스가 없는 24 h 동안 저산소증 챔버에서 배양될 것이다. 이들 24시간 개입 후에, 두 그룹의 세포는 배지로 리프레시되고, 결국 종점 분석(들), 예를 들어, LDH 분석을 수행하기 전에 또 다른 2시간, 재산소화 단계 동안 21% O2 환경에서 지속적으로 배양된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 세 가지 인서트의 이미지 및 회로도. 인서트의 내피 세포와 웰의 바닥에있는 심근 세포 사이의 거리는 다른 삽입물을 사용하여 달라질 수 있습니다. 여기에 사용된 세 가지 유형의 인서트는 모두 0.4μm의 동일한 기공 크기를 갖는다. 이들 사이의 유일한 차이점은 인서트-투-베이스 높이이며, 이는 두 개의 공동-배양된 세포층 사이의 거리가 각각 0.5(A), 1.0(B) 및 2.0 mm(C)가 될 수 있게 한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 심근세포 단독(CM; 흰색), 내피 세포 단독(EC; 검정) 및 CM과 EC(확인 패턴)의 공동 배양에 대한 노목산(왼쪽), 저산소증만(중앙) 및 저산소증/재산소화 조건(오른쪽)에서 젖산 탈수소효소(LDH; 흡광도 단위[au])의 방출을 평가할 때 세 가지 유형의 배양 삽입물을 비교한 결과, (c) 두 개의 상이한 세포층 사이의 2.0 mm 거리. ECs는 인서트 당 100,000 셀의 밀도로, CMs를 웰 당 300,000 셀의 밀도로 도금하였다. 데이터는 평균 ± 표준 편차이며, 그룹당 n=4이다. 통계: ANOVA에 이어 Student-Newman-Keuls 사후 시험이 이어졌습니다. P < 0.05 (두 꼬리)는 각각의 비교된 쌍 사이의 수평 막대로 표시된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 공동 배양된 내피 세포의 농도(EC; 25: 삽입물당 25,000개 세포; 삽입물당 50:50,000개 세포; 100: 삽입물당 100,000개 세포) 젖산 탈수소효소의 방출에 의해 입증된 노르폭스 조건(왼쪽)과 비교하여 저산소증/재산소화 손상에 대한 심근세포(CM)의 용량의존적 보호(오른쪽)(오른쪽). EC는 노목스 조건 하에서 LDH 방출에 아무런 영향을 미치지 않았다. 데이터는 평균 ± 표준 편차이며, 그룹당 n=4이다. 통계: ANOVA에 이어 Student-Newman-Keuls 사후 시험이 이어졌습니다. P < 0.05 (두 꼬리)는 각각의 비교된 쌍 사이의 수평 막대로 표시된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
프로토콜의 중요한 단계
세포 공동 배양 모델은 심장 보호의 세포 메커니즘을 연구하기 위해 사용되어 왔습니다. 따라서 두 개의 서로 의미있는 거리를 가진 두 개의 개별 레이어를 만드는 방법은 적절한 공동 문화 모델을 개발하는 데 중요합니다. 시뮬레이션 된 IR, 즉 HR을 연구 할 때의 도전은 허혈 (저산소증) 자체뿐만 아니라 재관류 (재 산소화)가 세포 기능 장애를 악화시킨다는 것입니다. 따라서 현실적인 모델은 예를 들어 저산소증만과는 달리 저산소증에 따른 재산소화에 의한 부상이 충분히 증가했음을 입증함으로써 이러한 특성을 반영해야하지만 세포 보호 약물 또는 우리의 경우 EC의 존재와 같은 전략으로 부상의 감쇠를 허용해야합니다. 흥미롭게도, 두 세포층 사이의 거리는 적합한 공동배양 모델을 개발하는데 중요한 역할을 하는 것으로 보인다. 우리는 EC와 CM 사이의 1.0mm와 2.0mm 거리가 예상되는 HR 손상 반응을 허용한다는 것을 입증 할 수 있었지만, 더 중요한 것은 2.0mm만이 저산소 및 HR 조건 모두에서 EC의 존재에 의한 세포 손상 보호에 지속적으로 유리한 결과를 산출했다는 것입니다.
방법의 수정 및 문제 해결
공동 배양 모델에서의 세포-세포 상호작용은 별개의 공동 배양 집단의 수, 세포 유형의 유사성의 정도, 이들 사이의 물리적 분리의 정도, 집단 지역 환경의 차이, 배양의 양 및 공동 배양의 시기 고려와 같은 다수의 변수에 의해 영향을 받는다 9,10,11,12 . 이러한 요인들 사이에는 절충점이 존재합니다. 이러한 상호 작용은 환경에 의해 크게 영향을 받으며, 이는 프로토콜 및 설정에 의해 결정됩니다. 복제 가능하고 측정 가능하며 비교할 수 있는 실험 모델을 개발하는 것이 중요합니다. 우리의 접근법은 세 개의 상이한 세포 배양 삽입물을 제외하고 두 개의 공동 배양 세포주, 동일한 부피의 세포 배양 배지 및 분석 시약 등을 사용하여 정확한 수의 세포를 도금함으로써 상이한 시간에 수행된 상이한 실험으로부터 수득된 데이터의 일관성을 방해할 수 있는 변수의 수를 조절하고 제한하는 것이었다.
방법의 제한 사항
우리의 모델은 ECs 및 CM과 잘 작동하며, 심혈관 시스템에서 EC가 유비쿼터스로 존재하기 때문일 수 있습니다. 잠재적으로 관심있는 다른 유형의 세포주가 CM, 뉴런 또는 시험관내에서 연구될 관심있는 다른 세포주와 얼마나 잘 상호작용하는지는 상이한 세포주가 공동 배양 환경에서 다르게 상호작용할 수 있기 때문에 아직 평가되지 않았다. 공동 배양된 세포 집단 사이의 한 가지 차이점은 그들의 생태학적 관계일 수 있는데, 예를 들어, 그들이 자연적 경쟁자 또는 협력자인 경우이다. 또한, 다른 모든 시험관내 세포 모델에서와 같이, 실험에서 생성된 세포 손상은 생체내에서 손상의 실제 병리생리학적 상태를 나타내지 않을 수 있다. 또한 0.5, 1.0 및 2.0mm의 EC와 CM 사이의 테스트 된 거리가 생체 내에서 간격을 재현하지 않는다는 것을 인정합니다. 주어진 시험관내 모델에 대해; 그러나 우리의 결과는이 기술을 활용하고자하는 과학자들에 의해 연구 될 두 세포층 사이의 최적의 거리 두기의 의미를 설명합니다.
기존 / 대체 방법과 관련된 방법의 중요성
기존/대안적인 공동 배양 방법은 세포주를 직접 혼합하거나 트랜스웰 플레이트(13), 미세유체 플랫폼(14) 또는 3차원 스캐폴드(15)를 사용하는 것과 같은 분리된 정도의 분리된 환경을 만드는 것을 포함하며, 그 중 트랜스웰 플레이트는 가장 저렴하고 가장 쉽게 이용가능하다. 자연적인 한계에도 불구하고, 공동 배양은 생체 유사 조직 모델에서 더 대표적인 것을 제공하고 세포-세포 상호작용에 대한 약물 효과의 높은 처리량 테스트 및 심층 모니터링을 허용하기 때문에 약물 연구에 매우 관련이 있다(16). 우리의 모델은 두 가지 유형의 셀이 완전하고 제어되지 않은 혼합물 대신 EC와 CM 사이의 잘 정의 된 공간 거리를 사용하여 정확하게 보정되었습니다. 또한,이 모델은 별도의 치료를 허용하고 세포의 개별 유형을 분석, 이는 생체에서 말할 것도없이 혼합 공동 배양에서 달성하기가 불가능합니다. IR 손상은 별도의 HR 과정을 포함하기 때문에이 모델은 허혈 / 저산소증 대 재관류 / 재 산소 공급 손상의 세포 메커니즘을 별도로 연구하는 데 적합합니다. 우리의 데이터는 시뮬레이션 된 IR 손상 연구에 사용되는 매우 가치 있고 효율적인 세포 공동 배양 모델 일 수 있음을 시사합니다. 우리의 관찰은 EC가이 특정 공동 배양 모델에서 CM과 교차 대화하기 위해 최적의 공간 거리 (우리의 경우 2.0mm)가 필요하므로 EC에 의해 잠재적으로 분비 된 신호 분자가 효과적으로 순환하여 저산소증 전용 및 / 또는 HR에 의한 손상으로부터 CM을 불법적으로 보호 할 수 있음을 분명히 나타냅니다.
특정 연구 분야에서 방법의 중요성과 잠재적 인 적용
우리의 모델은 HR 손상에 대한 보호 조치의 조사를 개선하기 위해 마우스 관상 동맥 EC와 마우스 CM을 결합하는 것의 중요성을 나타냅니다. 공동 문화의 공간적 거리를 다양하게하는 것은 HR에 의한 CM 손상에 대한 EC의 보호 작용에 영향을 미치는 공간 조건을 더 잘 이해하는 효과적인 방법을 보여줍니다. ECs의 밀도 또는 EC-to-CM 비율은 HR 손상에 대한 보호 범위와 긍정적 인 상관 관계가 있습니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작업은 부분적으로 미국 재향 군인 사무국 생물 의학 실험실 R & D 서비스 (I01 BX003482)와 M.L.R.에 대한 기관 기금에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adult Mouse Cardiomyocytes (CMs) | Celprogen Inc | 11041-14 | Isolated from adult C57BL/6J mouse cardiac tissue |
| Automated Cell Counter Countess II | Invitrogen | A27977 | Cell counting for calculating cell numbers |
| Bio-Safety Cabinet | Nuaire | NU425400 | Cell culture sterile hood |
| Cell Culture Freezing Medium | Cell Biologics Inc | 6916 | Used for cell freezing for long term cell line storage |
| Cell Culture Incubator | Nuaire | Nu-5500 | To provide normal cell living condition (21%O2, 5%CO2, 74%N2, 37°C, humidified) |
| Cell Culture Incubator Gas Tank | A-L Compressed Gases | UN1013 | Gas needed for cell culture incubator |
| Cell Culture Inserts A (0.5 mm) | Corning Inc | 353095 | Used for EC-CM co-culture |
| Cell Culture Inserts B (1.0 mm) | Millicell Millipore | PIHP01250 | Used for EC-CM co-culture |
| Cell Culture Inserts C (2.0 mm) | Greiner Bio-One | 662640 | Used for EC-CM co-culture |
| Centrifuge | Anstel Enterprises Inc | 4235 | For cell culture plating and passaging |
| CMs Cell Culture Flasks T25 | Celprogen Inc | E11041-14 | Used for CMs regular culture, coated by manufacturer |
| CMs Cell Culture Medium Complete | Celprogen Inc | M11041-14S | CMs culture complete medium |
| CMs Cell Culture Medium Complete Phenol free | Celprogen Inc | M11041-14PN | CMs culture medium without phenol red used during LDH measurement |
| CMs Cell Culture Plates 96 well | Celprogen Inc | E11041-14-96well | Used for experiments of LDH measurement, coated by manufacturer |
| CMs Hypoxia Cell Culture Medium | Celprogen Inc | M11041-14GFPN | CMs cell culture under hypoxic condition (glucose- and serum-free) |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | Counting slides used for cell counter |
| Cyquant LDH Cytotoxicity Kit | Thermo Scientific | C20301 | LDH measurement kit |
| ECs Cell Culture Flasks T25 | Fisher Scientific | FB012935 | Used for ECs regular culture |
| ECs Cell Culture Medium Complete | Cell Biologics Inc | M1168 | ECs culture complete medium |
| ECs Cell Culture Medium Complete Phenol free | Cell Biologics Inc | M1168PF | ECs culture medium without phenol red used during LDH measurement |
| ECs Cell Culture Plates 96 well | Fisher Scientific (Costar) | 3370 | Used for experiments of LDH measurement |
| ECs Culture Gelatin-Based Coating Solution | Cell Biologics Inc | 6950 | Used for coating flasks and plates for ECs |
| ECs Hypoxia Cell Culture Medium | Cell Biologics Inc | GPF1168 | ECs cell culture under hypoxic condition (glucose- and serum-free) |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | MT35011CV | FBS-HI USDA-approved for cell culture and maintenance |
| Hypoxia Chamber | StemCell Technologies | 27310 | To create a hypoxic condition with 0.01%O2 environment |
| Hypoxia Chamber Flow Meter | StemCell Technologies | 27311 | To connect with hypoxic gas tank for a consistent gas flow speed |
| Hypoxic Gas Tank (0.01%O2 Cylinder) | A-L Compressed Gases | UN1956 | Used to flush hypoxic medium and chamber (0.01%O2/5%CO2/94.99N2) |
| Microscope | Nikon | TMS | To observe cell condition |
| Mouse Primary Coronary Artery Endothelial Cells (ECs) | Cell Biologics Inc | C57-6093 | Isolated from coronary artery of C57BL/6 mice |
| NUNC 15ML CONICL Tubes | Fisher Scientific | 12565269 | For cell culture process, experiments, solution preparation etc. |
| NUNC 50ML CONICL Tubes | Fisher Scientific | 12565271 | For cell culture process, experiments, solution preparation etc. |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | Used for cell washing during culture or experiments |
| Plate Reader | BioTek Instrument | 11120533 | Colorimetric or fluorometric plate reading |
| Reaction 96 Well Palte (clear no lid) | Fisher Scientific | 12565226 | Used for LDH measurement plate reading |
| Trypsin/EDTA for CMs | Celprogen Inc | T1509-014 | 1 x sterile filtered and tissue culture tested |
| Trypsin/EDTA for ECs | Cell Biologics Inc | 6914/0619 | 0.25%, cell cuture-tested |
References
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