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Neuroscience

पूर्व विवो रेटिना ऊतक नमूनों में माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन और ग्लाइकोलाइसिस का निर्धारण

Published: August 4, 2021 doi: 10.3791/62914
Automatic Translation
1, 1, 1
1Neurobiology, Neurodegeneration & Repair Laboratory, National Eye Institute, National Institutes of Health

Summary

यहाँ वर्णित एक वाणिज्यिक bioanalyzer का उपयोग कर पूर्व विवो रेटिना ऊतक के नमूनों में माइटोकॉन्ड्रियल तनाव परख और ग्लाइकोलाइटिक दर परख प्रदर्शन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल है.

Abstract

माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन सभी कोशिकाओं में एक महत्वपूर्ण ऊर्जा पैदा करने वाला मार्ग है, विशेष रूप से रेटिना फोटोरिसेप्टर जो अत्यधिक सक्रिय चयापचय के अधिकारी हैं। इसके अलावा, फोटोरिसेप्टर भी कैंसर कोशिकाओं की तरह उच्च एरोबिक ग्लाइकोलाइसिस का प्रदर्शन करते हैं। इन चयापचय गतिविधियों के सटीक माप शारीरिक परिस्थितियों में और रोग राज्यों में सेलुलर होमियोस्टैसिस में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं। उच्च थ्रूपुट माइक्रोप्लेट-आधारित assays माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन और जीवित कोशिकाओं में विभिन्न चयापचय गतिविधियों को मापने के लिए विकसित किया गया है। हालांकि, इनमें से अधिकांश सुसंस्कृत कोशिकाओं के लिए विकसित किए गए हैं और बरकरार ऊतक नमूनों के लिए और पूर्व विवो के आवेदन के लिए अनुकूलित नहीं किए गए हैं। यहां वर्णित एक विस्तृत चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल है, माइक्रोप्लेट-आधारित प्रतिदीप्ति तकनीक का उपयोग करके, सीधे माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन के संकेतक के रूप में ऑक्सीजन की खपत दर (ओसीआर) को मापने के लिए, साथ ही साथ ग्लाइकोलाइसिस के संकेतक के रूप में बाह्य कोशिकीय अम्लीकरण दर (ईसीएआर) बरकरार पूर्व विवो रेटिना ऊतक में। इस विधि का उपयोग वयस्क माउस रेटिना में चयापचय गतिविधियों का सफलतापूर्वक आकलन करने और उम्र बढ़ने और बीमारी के सेलुलर तंत्र की जांच में इसके आवेदन को प्रदर्शित करने के लिए किया गया है।

Introduction

माइटोकॉन्ड्रिया आवश्यक ऑर्गेनेल हैं जो सेलुलर चयापचय, सिग्नलिंग, होमियोस्टैसिस और एपोप्टोसिस को कई महत्वपूर्ण शारीरिक प्रक्रियाओं का समन्वय करके नियंत्रित करते हैं। माइटोकॉन्ड्रिया ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन (OXPHOS) के माध्यम से एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) उत्पन्न करने के लिए सेल में पावरहाउस के रूप में कार्य करता है और ऊर्जा प्रदान करता है जो लगभग सभी सेलुलर घटनाओं का समर्थन करता है। सेलुलर ऑक्सीजन का अधिकांश हिस्सा माइटोकॉन्ड्रिया में चयापचय किया जाता है, जहां यह एरोबिक श्वसन के दौरान इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला (ईटीसी) में अंतिम इलेक्ट्रॉन स्वीकर्ता के रूप में कार्य करता है। एटीपी की कम मात्रा को साइटोसोल में ग्लाइकोलाइसिस से भी उत्पादित किया जा सकता है, जहां ग्लूकोज को पाइरूवेट में परिवर्तित किया जाता है, जिसे आगे लैक्टेट में परिवर्तित किया जा सकता है या माइटोकॉन्ड्रिया में ले जाया जा सकता है और एसिटाइल-सीओए में ऑक्सीकरण किया जा सकता है, जो ट्राइकार्बोक्सिलिक एसिड चक्र (टीसीए चक्र) में एक सब्सट्रेट है।

रेटिना स्तनधारियों में सबसे अधिक चयापचय रूप से सक्रिय ऊतकों में से एक है2, जो माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन के उच्च स्तर और अत्यधिक उच्च ऑक्सीजन खपत को प्रदर्शित करता है3। रॉड और शंकु फोटोरिसेप्टर में माइटोकॉन्ड्रिया 4 का उच्च घनत्व होता है, और OXPHOS रेटिना 5 में अधिकांश एटीपी उत्पन्न करता है। इसके अलावा, रेटिना भी एरोबिक ग्लाइकोलाइसिस 6,7 पर ग्लूकोज को लैक्टेट 5 में परिवर्तित करके बहुत अधिक निर्भर करता है। माइटोकॉन्ड्रियल दोष विभिन्न न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों से जुड़े होते हैं8,9; और अपनी अद्वितीय उच्च ऊर्जा मांगों के साथ, रेटिना विशेष रूप से चयापचय दोषों के लिए कमजोर है, जिसमें माइटोकॉन्ड्रियल OXPHOS4 और ग्लाइकोलाइसिस 10 को प्रभावित करने वाले लोग शामिल हैं। माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन और ग्लाइकोलाइसिस में दोष रेटिना 11,12 और धब्बेदार 13 अपक्षयी रोगों, उम्र से संबंधित धब्बेदार अध: पतन 10,14,15,16, और मधुमेह रेटिनोपैथी 17,18 में फंसे हुए हैं। इसलिए, माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन और ग्लाइकोलाइसिस के सटीक माप रेटिना की अखंडता और स्वास्थ्य का आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण पैरामीटर प्रदान कर सकते हैं।

माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन को ऑक्सीजन खपत दर (ओसीआर) के निर्धारण के माध्यम से मापा जा सकता है। यह देखते हुए कि ग्लूकोज का पाइरूवेट में रूपांतरण और बाद में लैक्टेट के परिणामस्वरूप प्रोटॉन के एक्सट्रूज़न और बाह्य कोशिकीय वातावरण के अम्लीकरण में परिणाम होता है, बाह्य कोशिकीय अम्लीकरण दर (ईसीएआर) के माप ग्लाइकोलाइसिस फ्लक्स का संकेत प्रदान करते हैं। चूंकि रेटिना अंतरंग संबंधों और सक्रिय तालमेल के साथ कई सेल प्रकारों से बना है, जिसमें सब्सट्रेट्स 6 का आदान-प्रदान शामिल है, इसलिए बरकरार लैमिनेशन और सर्किटरी के साथ पूरे रेटिना ऊतक के संदर्भ में माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन और चयापचय का विश्लेषण करना अनिवार्य है। पिछले कई दशकों से, क्लार्क प्रकार के O2 इलेक्ट्रोड और अन्य ऑक्सीजन माइक्रोइलेक्ट्रोड का उपयोग रेटिना 19,20,21 में ऑक्सीजन की खपत को मापने के लिए किया गया है। इन ऑक्सीजन इलेक्ट्रोड की संवेदनशीलता में प्रमुख सीमाएं होती हैं, एक बड़ी नमूना मात्रा की आवश्यकता होती है, और निलंबित नमूने की निरंतर सरगर्मी की आवश्यकता होती है, जो आमतौर पर सेलुलर और ऊतक संदर्भ के विघटन की ओर जाता है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल को एक माइक्रोप्लेट-आधारित, प्रतिदीप्ति तकनीक का उपयोग करके विकसित किया गया था ताकि ताजा विच्छेदित पूर्व विवो माउस रेटिना ऊतक में माइटोकॉन्ड्रियल ऊर्जा चयापचय को मापा जा सके। यह ओसीआर और ईसीएआर दोनों के मध्य-थ्रूपुट वास्तविक समय माप की अनुमति देता है, साथ ही पूर्व विवो रेटिना ऊतक के एक छोटे से नमूने (1 मिमी पंच) का उपयोग करके निलंबन और निरंतर सरगर्मी की आवश्यकता से बचता है।

यहाँ प्रदर्शित माइटोकॉन्ड्रियल तनाव परख और ताजा विच्छेदित रेटिना पंच डिस्क पर ग्लाइकोलाइटिक दर परख के लिए प्रयोगात्मक प्रक्रिया है. यह प्रोटोकॉल एक पूर्व विवो ऊतक संदर्भ में माइटोकॉन्ड्रिया से संबंधित चयापचय गतिविधियों के माप की अनुमति देता है। सुसंस्कृत कोशिकाओं का उपयोग करके किए गए assays से अलग, यहां प्राप्त रीडिंग ऊतक स्तर पर संयुक्त ऊर्जा चयापचय को प्रतिबिंबित करते हैं और ऊतक के भीतर विभिन्न सेल प्रकारों के बीच बातचीत से प्रभावित होते हैं। प्रोटोकॉल को पहले से प्रकाशित संस्करण 22,23 से संशोधित किया गया है ताकि आइलेट कैप्चर प्लेट के साथ Agilent Seahorse extracellular flux 24-wells (XFe24) विश्लेषक की नई पीढ़ी के अनुकूल हो सके। परख माध्यम, इंजेक्शन यौगिक सांद्रता, और परख चक्र की संख्या / अवधि भी रेटिना ऊतक के लिए अनुकूलित किया गया है। रेटिना पंच डिस्क की तैयारी के लिए एक विस्तृत चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल दिया गया है। प्रोग्राम सेटअप और डेटा विश्लेषण के बारे में अधिक जानकारी निर्माता के उपयोगकर्ता गाइड 24,25,26 से प्राप्त की जा सकती है।

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Protocol

सभी माउस प्रोटोकॉल को राष्ट्रीय नेत्र संस्थान (एनईआई एएसपी # 650) की पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। चूहों को 12 घंटे की प्रकाश-अंधेरे परिस्थितियों में रखा गया था और प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड, प्रयोगशाला पशु संसाधन संस्थान और प्रयोगशाला जानवरों की मानवीय देखभाल और उपयोग पर सार्वजनिक स्वास्थ्य सेवा नीति की सिफारिशों का पालन करके देखभाल की गई थी।

1. हाइड्रेटिंग सेंसर कारतूस और परख माध्यम की तैयारी

  1. प्रयोग से एक दिन पहले, उपयोगिता प्लेट के प्रत्येक कुएं में अंशांकन माध्यम का 1 एमएल जोड़ें। शीर्ष पर हाइड्रो बूस्टर कवर रखें और कवर पर खोलने के माध्यम से सेंसर कारतूस को कम करें। यह सुनिश्चित करने के लिए जाँचें कि सेंसर अंशांकन माध्यम में डूबा हुआ है. Fluorophores को सक्रिय करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक CO2-मुक्त इनक्यूबेटर में रात भर सेंसर कारतूस इनक्यूबेट करें।
    नोट: वाष्पीकरण को रोकने के लिए, इनक्यूबेटर को अंदर पानी की ट्रे रखकर ह्यूमिडिफाइड किया जाता है, और सेंसर कारतूस कैसेट को स्पष्ट प्लास्टिक रैप के साथ लपेटा जाता है।
  2. वांछित सांद्रता के लिए ग्लूकोज, पाइरूवेट, और ग्लूटामाइन के अलावा के साथ Seahorse DMEM माध्यम का पुनर्गठन करके परख माध्यम तैयार करें। इस लेख में रिपोर्ट किए गए assays में, परख माध्यम में substrates की अंतिम एकाग्रता कर रहे हैं: ग्लूकोज के 6 mM, पाइरूवेट के 0.12 mM, और ग्लूटामाइन के 0.5 mM. प्रत्येक परख प्लेट के लिए, परख माध्यम के 40 mL प्रयोग के दिन पर ताजा तैयार किया जाता है.
  3. निर्माता के निर्देश 26 के बाद विश्लेषक में परख कार्यक्रम सेट करें। परख में यहाँ प्रदर्शित, प्रोटोकॉल के रूप में निम्नानुसार सेट किया गया है: आधार रेखा के लिए माप के 5 चक्र, तो इंजेक्ट पोर्ट ए, माप के 4 चक्रों के बाद, तो इंजेक्ट पोर्ट बी और माप के 4 चक्रों के बाद. प्रत्येक चक्र मिश्रण (3 मिनट), प्रतीक्षा (2 मिनट) और माप (3 मिनट) से बना है।

2. आइलेट कैप्चर माइक्रोप्लेट के कोटिंग जाल आवेषण

  1. 0.1 एम सोडियम बाइकार्बोनेट के 171 μL और 1 M NaOH के 9 μL के साथ सेल अनुलग्नक माध्यम (जैसे, सेल-टाक) के 20 μL के संयोजन से कोटिंग मिश्रण तैयार करें।
  2. कैसेट के ढक्कन को खोलें जिसमें जाल आवेषण होता है। पिपेट 8 μL कोटिंग मिश्रण के प्रत्येक जाल आवेषण करने के लिए. एक पिपेट टिप का उपयोग करें धीरे से स्मीयर / चारों ओर बूंद को फैलाने के लिए कोटिंग मिश्रण को समान रूप से पूरे जाल डालने में वितरित करने के लिए।
  3. कैसेट को बंद करें और सोखना के लिए कम से कम 25 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करने के लिए जाल आवेषण की अनुमति दें।
  4. सीधे जाल आवेषण पर परख माध्यम के 4 मिलीलीटर pipetting द्वारा जाल डालने धोएं. धीरे कैसेट हिला यह सुनिश्चित करने के लिए कि सभी जाल आवेषण परख माध्यम के साथ धोया जाता है।
  5. जाल डालने को एक तरफ रखें। यह उपयोग करने के लिए तैयार है।

3. इंजेक्शन यौगिकों की तैयारी

  1. Bam15 (10 mM), Rotenone (10 mM), Antimycin A (10 mM) और 2-DG (500 mM) के स्टॉक एलीकोट को -80 °C फ्रीजर से बाहर निकालें और कमरे के तापमान पर पिघल जाएं।
    नोट: 2-DG स्टॉक का उपयोग करने के लिए तैयार है। अन्य दवाओं को काम करने वाले स्टॉक में पतला करने की आवश्यकता है।
  2. एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में परख माध्यम के 10 मिलीलीटर गर्म.
  3. एक दो कदम कमजोर पड़ने की प्रक्रिया का उपयोग कर 50 μM काम कर स्टॉक करने के लिए 10 mM Bam15 स्टॉक पतला: 5 mM मध्यवर्ती स्टॉक प्राप्त करने के लिए DMSO के 20 μL के साथ 10 mM स्टॉक के 20 μL मिश्रण। तो फिर मिश्रण 5 mM मध्यवर्ती स्टॉक के ऊपर 5 mM मध्यवर्ती स्टॉक के 990 μL के साथ पूर्व गर्म परख माध्यम के अंतिम 50 μM काम कर स्टॉक पाने के लिए.
  4. पतला और 10 mM Rotenone और 10 mM Antimycin 10 μM Rotenone / Antimycin A (Rot / AA) कमजोर पड़ने के दो चरणों से काम कर स्टॉक करने के लिए एक स्टॉक को गठबंधन: मिश्रण 10 μL 10 mM Rotenone और 10 mM Antimycin के प्रत्येक 80 μL DMSO के साथ एक स्टॉक 1 mM Rot / AA मध्यवर्ती स्टॉक प्राप्त करने के लिए। तो फिर मिश्रण ऊपर 1 mM मध्यवर्ती स्टॉक के 990 μL के साथ 990 μL के साथ पूर्व गर्म परख माध्यम अंतिम 10 μM रोट /
  5. प्रयोग के दिन इंजेक्शन यौगिकों के उपर्युक्त काम करने वाले स्टॉक को ताजा तैयार करें और सेंसर कारतूस के इंजेक्शन बंदरगाहों में लोड होने तक उन्हें कमरे के तापमान पर अलग रखें।

4. रेटिना विच्छेदन और रेटिना पंच तैयारी

  1. इच्छामृत्यु 27 पर AVMA दिशानिर्देशों के बाद CO2 श्वासावरोध द्वारा एक माउस euthanize.
    नोट: इच्छामृत्यु के लिए आवश्यक समय से अधिक समय तक CO2 कक्ष में जानवर को न छोड़ें।
  2. Enucleate आँखें और एक पेट्री-डिश में बर्फ पुराने 1x PBS बफर में जगह और फिर यह एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत जगह है.
  3. ध्यान से निकालें, microscissors के साथ काटने से, अतिरिक्त rectus मांसपेशियों नेत्रगोलक के बाहर संलग्न और ऑप्टिक तंत्रिका काट दिया.
  4. कॉर्निया (लिम्बस) के किनारे पर एक छेद को पंच करने के लिए 30 जी सुई का उपयोग करें; यह microscissors के लिए सम्मिलन साइट के रूप में कार्य करता है. फिर, कॉर्निया के किनारे के साथ एक परिपत्र कटौती करने के लिए एक ठीक विच्छेदन माइक्रोसिस्सर का उपयोग करें, इसे पीछे की आंखों के कप से अलग करें।
  5. कॉर्निया, लेंस, और आंखों के कप से दूर विट्रियस हास्य को हटाने के लिए तेज विच्छेदन संदंश का उपयोग करें।
  6. आंखों के कप के रिम पर स्क्लरल परत पर कई छोटे कटौती करने के लिए ठीक विच्छेदन microscissors का उपयोग करें। रेटिना की परत काटने से बचें। कट के प्रत्येक तरफ स्क्लेरल ऊतक को पकड़ने के लिए दो तेज विच्छेदन संदंश का उपयोग करें और तंत्रिका रेटिना से इसे हटाने के लिए स्क्लरल परत पर बहुत सावधानी से खींचें। इसे आंखों के कप के चारों ओर तब तक दोहराएं जब तक कि सभी स्क्लेरा को हटा नहीं दिया जाता है और एक बरकरार रेटिना कप प्राप्त नहीं किया जाता है।
  7. विच्छेदन microscissors का उपयोग करें और रेटिना कप पर रेडियल कटौती करने के लिए इसे समतल और कई अलग-अलग वर्गों को उत्पन्न करने के लिए।
    नोट: ताजा रेटिना ऊतक को संभालने में व्यक्ति के विच्छेदन कौशल और अनुभव के आधार पर, रेटिना कप को 3 से 5 अलग-अलग वर्गों को उत्पन्न करने के लिए काटा जा सकता है।
  8. चपटे रेटिना कप के प्रत्येक अनुभाग से एक रेटिना डिस्क को काटने के लिए 1 मिमी व्यास बायोप्सी पंचर का उपयोग करें।
    नोट: ऑप्टिक तंत्रिका सिर से समान दूरी पर रेटिना डिस्क को छिद्रित करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए।
  9. विच्छेदन पेट्री-डिश में पूर्व-लेपित जाल आवेषण को स्थानांतरित करने के लिए संदंश का उपयोग करें। दो सुपरफाइन आईलैश ब्रश की मदद से, रेटिना पंच डिस्क को जाल डालने पर रखें। रेटिना पंच डिस्क को जाल डालने के केंद्र में रखा जाता है जिसमें गैंग्लियन सेल लेयर साइड नीचे जाल और फोटोरिसेप्टर परत को छूने के साथ ऊपर का सामना करना पड़ता है।
    नोट: अक्सर, कुछ RPE कोशिकाएं फोटोरिसेप्टर से जुड़ी रहती हैं, और इन कोशिकाओं के रंजकता का उपयोग रेटिना पंच डिस्क ओरिएंटेशन के संकेतक के रूप में किया जा सकता है।

5. सेंसर कारतूस इंजेक्शन बंदरगाहों और अंशांकन लोड हो रहा है

  1. हाइड्रेटेड सेंसर कारतूस प्लेट कैसेट 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर से बाहर ले लो। हाइड्रो बूस्टर कवर निकालें और उपयोगिता प्लेट पर वापस सेंसर कारतूस जगह.
  2. उपयुक्त बंदरगाहों में इंजेक्शन यौगिक काम स्टॉक समाधान की वांछित मात्रा लोड करें। पिपेट टिप को 45 ° कोण पर पकड़ो। इंजेक्शन बंदरगाह के विपरीत दीवार के खिलाफ टिप के बेवेल के साथ एक इंजेक्शन पोर्ट में आधे रास्ते में पिपेट टिप डालें और धीरे से प्रत्येक बंदरगाह में यौगिक लोड करें। हवा के बुलबुले पेश करने से बचें।
  3. एक विशिष्ट परख के लिए प्रत्येक इंजेक्शन बंदरगाह में लोड यौगिक की मात्रा के लिए साधन उपयोगकर्ता गाइड को देखें। इस पेपर में प्रस्तुत प्रयोगों में, 50 μM Bam15 काम स्टॉक (माइटोकॉन्ड्रियल तनाव परख के लिए) या 10 μM Rot / AA काम कर स्टॉक (ग्लाइकोलाइटिक दर परख के लिए) के 68 μL के 68 μL बंदरगाह ए में लोड किया गया है; 10 μM Rot / AA काम स्टॉक (माइटोकॉन्ड्रियल तनाव परख के लिए) के 75 μL या 500 mM 2-DG काम स्टॉक (ग्लाइकोलाइटिक दर परख के लिए) के 75 μL पोर्ट बी में लोड किया गया है।
  4. उचित इंजेक्शन सुनिश्चित करने के लिए पृष्ठभूमि सुधार कुओं और खाली कुओं सहित प्लेट के सभी कुओं के लोड इंजेक्शन बंदरगाहों। पृष्ठभूमि सुधार कुओं के लिए प्रत्येक पोर्ट में संबंधित यौगिक समाधान लोड करें। परख माध्यम को बैंक कुओं के बंदरगाहों में से प्रत्येक में यौगिक समाधान के बजाय प्रतिस्थापित किया जा सकता है।
  5. लोड किए गए सेंसर कारतूस प्लेट, ढक्कन के साथ, विश्लेषक मशीन में परख चलाने से पहले अंशांकन शुरू करने के लिए जगह। अंशांकन खत्म होने के बाद, प्रोग्राम स्वचालित रूप से रुक जाएगा, रेटिना घूंसे युक्त आइलेट कैप्चर प्लेट के साथ उपयोगिता प्लेट के प्रतिस्थापन की प्रतीक्षा कर रहा है।

6. आइलेट कैप्चर प्लेट लोड हो रहा है और परख चलाने शुरू

  1. आइलेट कैप्चर प्लेट के प्रत्येक कुएं के लिए परख माध्यम के 607 μL जोड़ें
  2. शीर्ष पर रेटिना पंच डिस्क युक्त जाल डालने के रिम को हड़पने के लिए संदंश का उपयोग करें और इसे पेट्री-डिश से बाहर निकालें। अतिरिक्त तरल को हटाने के लिए एक अवशोषित पोंछे ऊतक पर मेष डालने के नीचे हल्के से टैप करें और इसे आइलेट कैप्चर प्लेट के कुएं में डालें। इस चरण को तब तक दोहराएं जब तक कि रेटिना घूंसे के साथ सभी जाल आवेषण को आइलेट कैप्चर प्लेट में नहीं रखा जाता है। खाली जाल आवेषण के साथ पृष्ठभूमि सुधार कुओं और खाली कुओं को भरें।
  3. ध्यान से और धीरे से प्रत्येक जाल डालने के रिम प्रेस करने के लिए दो Graefe संदंश का उपयोग करें और सुनिश्चित करें कि ये सुरक्षित रूप से आइलेट कैप्चर प्लेट के नीचे डाला जाता है।
  4. लोड किए गए आइलेट कैप्चर प्लेट को गर्म करने के लिए 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें।
  5. अंशांकन पूरा होने के बाद उपयोगिता प्लेट को बाहर निकालें और इसे एक के साथ बदलें और इसे आइलेट कैप्चर प्लेट के साथ बदलें, ढक्कन बंद के साथ, जिसमें रेटिना घूंसे होते हैं।
  6. परख चलाने को फिर से शुरू करें.

7. समाप्ति और डेटा भंडारण चलाएँ

  1. रन पूरा होने के बाद, रेटिना घूंसे युक्त सेंसर कारतूस और आइलेट कैप्चर प्लेट को बाहर निकालें। डेटा स्वचालित रूप से .asyr फ़ाइल के रूप में सहेजा जाता है.
  2. निर्माता के उपयोगकर्ता guide26 के बाद डेटा को देखने और विश्लेषण करने के लिए संबद्ध डेटा विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें.
  3. डेटा की .xslx फ़ाइल निर्यात करने के लिए निर्यात फ़ंक्शन का उपयोग करें, जिसे स्प्रेडशीट सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके देखा और विश्लेषण किया जा सकता है.

8. रेटिना पंच नमूना की बचत

  1. परख के बाद, मशीन से प्लेट बाहर ले लो, सेंसर कारतूस को हटाने और धीरे से एक पिपेट का उपयोग कर प्रत्येक अच्छी तरह से से परख माध्यम को हटाने.
  2. कवर को वापस लागू करें और पैराफिल्म स्ट्रिप के साथ प्लेट के किनारों को सील करें।
  3. -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  4. सामान्यीकरण के लिए, प्रत्येक कुएं में पंच की कुल डीएनए या प्रोटीन सामग्री को निर्धारित करें।

9. डेटा विश्लेषण

  1. माइटोकॉन्ड्रियल तनाव परख
    नोट: मापा OCR मान (totalOCR) ऊतक द्वारा कुल ऑक्सीजन की खपत का प्रतिनिधित्व करता है। Bam15 (uncoupler) इंजेक्शन के बाद, OCR बेसल स्तर (totalOCRbasal) से अधिकतम स्तर (totalOCRmax) तक बढ़ जाता है और Rot / AA इंजेक्शन के बाद नीचे चला जाता है। रोट / एए इंजेक्शन (totalOCRRot / AA) के बाद अवशिष्ट OCR मान गैर-माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीजन खपत का प्रतिनिधित्व करता है।
    1. माइटोकॉन्ड्रिया से संबंधित ऑक्सीजन की खपत की गणना करें:
      Equation 1 (Eq. 1) 28
    2. माइटोकॉन्ड्रियल आरक्षित क्षमता (MRC) की गणना इस प्रकार करें:
      Equation 2 (Eq. 2) 29
      नोट: Bam15 इंजेक्शन से पहले 5 मापों के बीच अंतिम पढ़ने को "बेसल" मान (totalOCRbasal और mitoOCRbasal के लिए) के रूप में लिया जाता है। Bam15 इंजेक्शन के बाद 4 मापों के बीच उच्चतम पढ़ने का उपयोग "अधिकतम" मान (totalOCRmax और mitoOCRmax के लिए) के रूप में किया जाता है। Rot/AA इंजेक्शन के बाद 4 मापों में से सबसे कम पढ़ने का उपयोग totalOCRRot/AA के रूप में किया जाता है।
  2. ग्लाइकोलाइटिक दर परख
    नोट: मापा ECAR मान (totalECAR) ऊतक की चयापचय गतिविधि द्वारा माध्यम के कुल अम्लीकरण का प्रतिनिधित्व करता है। सामान्य तौर पर, बाह्य कोशिकीय सूक्ष्म वातावरण का अम्लीकरण मुख्य रूप से ग्लाइकोलाइटिक उत्पाद, लैक्टेट के बाहर निकालना द्वारा होता है। माइटोकॉन्ड्रियल टीसीए चक्र में सब्सट्रेट के अपचय के परिणामस्वरूप सीओ 2 का उत्पादन होता है, जो बाइकार्बोनेट के लिए जलयोजन के माध्यम से बाह्य कोशिकीय माध्यम को भी अम्लीकृत करता है।
    1. Substract mitochondrial ने ग्लाइकोईसीएआर प्राप्त करने के लिए totalECAR से मध्यम अम्लीकरण (mitoECAR) का योगदान दिया।
      Equation 3 (Eq. 3) 28
      नोट: माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन और टीसीए चक्र दृढ़ता से युग्मित प्रक्रियाएं हैं। माइटोकॉन्ड्रिया से CO2 का उत्पादन OXPHOS की दर का एक कार्य है, जो mitoOCR द्वारा औसत दर्जे का है।
    2. mitoECAR की गणना के रूप में करें:
      Equation 4 (Eq. 4) 28
      जहां, सीसीएफ (सीओ 2 योगदान कारक) एक अनुभवजन्य रूप से गणना अनुपात मूल्य है, जो सीओ 2-मध्यस्थता अम्लीकरण बनाम OXPHOS से प्रत्येक O2 खपत से एच + योगदान की मात्रा का प्रतिनिधित्व करता है। इस प्रणाली के लिए सीसीएफ 0.6028 होने के लिए पूर्व निर्धारित है। मध्यम अम्लीकरण का सटीक माप माध्यम की बफर क्षमता, उपकरण पीएच सेंसर की संवेदनशीलता और प्रभावी माप कक्ष क्षमता द्वारा निर्धारित किया जाता है। यहां, बीएफ (बफर फैक्टर) इन सीटू प्रयोगात्मक बफर क्षमता का एक पैरामीटर है, जो एच + या ओएच की मात्रा का प्रतिनिधित्व करता है - पीएच स्तर को 1 इकाई से बदलने के लिए प्रभावी माप कक्ष में जोड़ा जाता है। जब अनुकूलित परख माध्यम का उपयोग किया जाता है, तो बीएफ को बफर फैक्टर प्रोटोकॉल 30 के बाद परख माध्यम में एसिड की ज्ञात मात्रा को टाइट करके निर्धारित किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले सीहोर्स डीएमईएम मध्यम पीएच 7.4 में 2.60 mmol H + / L / pH का पूर्व-निर्धारित बीएफ है। इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली आइलेट कैप्चर प्लेट में एक Volmicrochamber = 16.6 μL31 है। वॉल्यूम स्केलिंग कारक, Kvol, एक अनुभवजन्य रूप से निर्धारित स्थिरांक है। Kvol मान आइलेट कैप्चर प्लेट के लिए उपलब्ध नहीं है, लेकिन माइक्रोप्लेट 28 के मूल्य से गणना की जा सकती है, उनके माइक्रोचैंबर्स में मात्रा अंतर के लिए लेखांकन, 0.41 होने के लिए।
      नोट: रोट / एए का इंजेक्शन माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन को बंद कर देता है और ऊतक को एटीपी उत्पादन के लिए ग्लाइकोलाइसिस पर स्विच करने के लिए मजबूर करता है, जिससे उच्च लैक्टेट एक्सट्रूज़न और ईसीएआर माप में वृद्धि होती है। ग्लाइकोलाइसिस को 2-डीजी इंजेक्शन के साथ बंद कर दिया जाता है, और अवशिष्ट ईसीएआर माप से माध्यम के गैर-ग्लाइकोलाइटिक और गैर-माइटोकॉन्ड्रियल अम्लीकरण का पता चलता है।
    3. ग्लाइकोलाइटिक आरक्षित क्षमता (GRC) की गणना इस प्रकार करें:
      Equation 5 (Eq. 5) 32
      जहां, रोट / एए इंजेक्शन से पहले 5 मापों के बीच अंतिम रीडिंग को "बेसल" मूल्य (ग्लाइकोईसीएआरबीसल) के रूप में लिया जाता है। Rot / AA इंजेक्शन के बाद 4 मापों के बीच उच्चतम पढ़ने का उपयोग "अधिकतम" मान (ग्लाइकोईकारमैक्स) के रूप में किया जाता है। 2-डीजी इंजेक्शन के बाद 4 मापों में से सबसे कम पढ़ने का उपयोग ग्लाइकोईसीएआर 2-डीजी के रूप में किया जाता है।
  3. सामान्यीकरण
    नोट: सामान्यीकरण आवश्यक है जब विभिन्न आयु समूहों के रेटिना ऊतकों से रीडिंग की तुलना या जंगली-प्रकार और पैथोलॉजिकल / अपक्षयी नमूनों के बीच होती है, जो सेल संख्याओं में भिन्न हो सकते हैं।
    1. प्रत्येक रेटिना पंच डिस्क 33,34 में डीएनए सामग्री का आकलन करने के लिए वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग करें।
    2. वैकल्पिक रूप से, रेटिना पंच से कुल प्रोटीन निकालने और सामान्यीकरण के लिए प्रोटीन सामग्री का उपयोग करने के लिए रेडियोइम्यूनोप्रिसिपेशन परख बफर (आरआईपीए बफर) का उपयोग करें।
      नोट: एक वयस्क माउस रेटिना का सतह क्षेत्र पहले लगभग 20 मिमी 2 निर्धारित किया गया है, और प्रत्येक रेटिना में ~ 6.5 मिलियन कोशिकाएं 35 होती हैं। इसलिए, प्रत्येक 1 मिमी व्यास रेटिना पंच एक रेटिना का ~ 1/25 है और इसमें ~ 260K कोशिकाएं होती हैं। एक रेटिना पंच से डेटा की तुलना अन्य ऊतक नमूनों या सुसंस्कृत कोशिकाओं से उन लोगों के लिए करते समय इन संख्याओं को संदर्भित कर सकता है,

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Representative Results

यहां रिपोर्ट किए गए डेटा प्रतिनिधि माइटोकॉन्ड्रियल तनाव परख ओसीआर ट्रेस (चित्रा 1) और ग्लाइकोलाइटिक दर परख ओसीआर ट्रेस और ईसीएआर ट्रेस (चित्रा 2) दिखा रहे हैं, जो 4 महीने पुराने ट्रांसजेनिक एनआरएल-एल-ईजीएफपी mice36 (C57B / L6 पृष्ठभूमि) से ताजा विच्छेदित 1 मिमी रेटिना पंच डिस्क का उपयोग करके किए गए थे। ये चूहे सामान्य रेटिना विकास, हिस्टोलॉजी और शरीर विज्ञान को बदलने के बिना विशेष रूप से रॉड फोटोरिसेप्टर में जीएफपी व्यक्त करते हैं और रेटिना अनुसंधान में जंगली-प्रकार के नियंत्रण के रूप में व्यापक रूप से उपयोग किए जाते हैं। दो Nrl-L-GFP littermate चूहों का उपयोग यहां प्रस्तुत assays में किया गया था। Nrl-L-GFP चूहों में व्यक्त GFP इस प्रोटोकॉल में OCR और ECAR के माप के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है। प्रत्येक रेटिना से पांच रेटिना घूंसे लिए गए थे। रेटिना घूंसे के दस माइटोकॉन्ड्रियल तनाव परख के लिए इस्तेमाल किया गया था और अन्य 10 ग्लाइकोलाइटिक दर परख के लिए इस्तेमाल किया गया था। सीहोर्स XF DMEM माध्यम, पीएच 7.4 (6 mM ग्लूकोज, 0.12 mM पाइरूवेट, और 0.5 mM ग्लूटामाइन के साथ गठित) और Seahorse XFe24 आइलेट कैप्चर प्लेटों का उपयोग प्रयोगों में किया गया था। यहां प्रस्तुत प्रतिनिधि डेटा एक ही 1 मिमी व्यास पंचर का उपयोग करके प्राप्त किए गए थे, लेकिन डीएनए / प्रोटीन सामग्री के संबंध में सामान्यीकृत नहीं किया गया था।

माइटोकॉन्ड्रियल तनाव परख में, uncoupler Bam1537 OCR बेसलाइन की स्थापना के बाद इंजेक्ट किया गया था, जिससे अधिकतम स्तर पर ओसीआर को बढ़ाया गया था। रोटेनोन और एंटीमाइसिन ए को क्रमशः जटिल I और जटिल III में माइटोकॉन्ड्रिया श्वसन को बाधित करने के लिए इंजेक्ट किया गया था, जिसके परिणामस्वरूप ओसीआर न्यूनतम स्तर (चित्रा 1) तक गिर गया था। ओसीआर के अधिकतम स्तर और बेसल ओसीआर स्तर के अंतिम माप के बीच का अंतर माइटोकॉन्ड्रियल रिजर्व क्षमता (एमआरसी) को दर्शाता है। MRC की गणना Eq. 2 का उपयोग करके 19.2% ±3.4% होने के लिए की जाती है, जो पिछली पीढ़ी के सीहॉर्स XF24 विश्लेषक 22,38 का उपयोग करके ~ 3 महीने पुराने Nrl-L-EGFP चूहों के रेटिना में पहले से मापा गया एमआरसी मूल्यों के अनुरूप है।

ग्लाइकोलाइटिक दर परख में, Rotenone और Antimycin एक कुल ECAR के लिए आधार रेखा की स्थापना के बाद इंजेक्शन थे. OXPHOS से एटीपी के उत्पादन को रोकने के साथ, ऊतक को ऊर्जा के लिए ग्लाइकोलाइसिस पर भरोसा करने के लिए मजबूर किया जाता है, और लैक्टेट की बाहरी रिहाई में वृद्धि ईसीएआर को अधिकतम स्तर तक ले जाती है। ग्लाइकोलाइसिस को 2-डीजी के इंजेक्शन द्वारा बंद कर दिया जाता है, जो हेक्सोकिनेज बाइंडिंग के लिए ग्लूकोज के साथ प्रतिस्पर्धा करता है, जिससे ईसीएआर न्यूनतम स्तर (चित्रा 2) तक गिर जाता है। माइटोकॉन्ड्रिया योगदान ECAR (mitoECAR) की गणना mitoOCR मान (Eq. 4) से की जा सकती है। ग्लाइकोलाइसिस योगदान ECAR ग्लाइकोईसीआर की गणना की जाती है और टोटलईसीएआर से mitoECAR को घटाकर प्लॉट किया जाता है। ग्लाइकोईसीएआर के अधिकतम स्तर और ग्लाइकोईसीएआर बेसल स्तर के अंतिम माप के बीच का अंतर ग्लाइकोलाइसिस रिजर्व क्षमता (जीआरसी) को दर्शाता है। यहां, GRC की गणना Eq. 5 का उपयोग करके 35.7% ± 3.4% है।

एक अत्यधिक ग्लाइकोलाइटिक ऊतक के रूप में, रेटिना से लैक्टेट उत्पादन बाह्य कोशिकीय अम्लीकरण के एक प्रमुख स्रोत के लिए खाता है, जैसा कि कुल आईसीएआर से ग्लाइकोईसीएआर के छोटे अंतर से पता चला है। दिलचस्प बात यह है कि ईसीएआर माप रोट / एए इंजेक्शन के तुरंत बाद पठार नहीं करता है, लेकिन दूसरे माप के बाद गिर जाता है। रेटिना पंच डिस्क एक बरकरार पूर्व विवो प्रणाली है जो विभिन्न सेल प्रकारों से बना है, जिसमें मुलर ग्लिया कोशिकाएं भी शामिल हैं, जो फोटोरिसेप्टर्स 6 से जारी लैक्टेट (ग्लाइकोलाइसिस एंड प्रोडक्ट) प्राप्त करने के लिए जानी जाती हैं। इसलिए, रोट / एए इंजेक्शन के बाद ईसीएआर माप में गिरावट को संभवतः अंतरकोशिकीय स्थान से लैक्टेट को हटाने में वृद्धि करके समझाया गया है, माध्यम में इसकी रिहाई को धीमा / रोकना।

Figure 1
चित्रा 1: माइटोकॉन्ड्रियल तनाव परख. प्लॉट किया गया ग्राफ सीहोर्स एक्सएफ डीएमईएम बफर में 1 मिमी रेटिना पंच डिस्क से ओसीआर ट्रेस दिखाता है, जो ग्लूकोज के 6 एमएम, पाइरूवेट के 0.12 एमएम और ग्लूटामाइन के 0.5 एमएम के साथ पूरक है। प्रत्येक डेटा बिंदु 10 कुओं से माप के औसत का प्रतिनिधित्व करता है। त्रुटि पट्टी = मानक त्रुटि। MRC की गणना 19.2% ±3.4% है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: ग्लाइकोलाइटिक दर परख. प्लॉट किया गया ग्राफ मापा OCR ट्रेस, ECAR ट्रेस (totalECAR) को दिखाता है, और परिकलित ग्लाइकोलाइसिस ने सीहोर्स XF DMEM बफर में 1 मिमी रेटिना पंच डिस्क से ECAR (ग्लाइकोईसीएआर) का योगदान दिया, जो ग्लूकोज के 6 mM, पाइरूवेट के 0.12 mM, और ग्लूटामाइन के 0.5 mM के साथ पूरक है। प्रत्येक डेटा बिंदु 10 कुओं से माप के औसत का प्रतिनिधित्व करता है। त्रुटि पट्टी = मानक त्रुटि। GRC की गणना 35.7% ±3.4% होने के लिए की जाती है , कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

प्रदान की गई है कि यहां पूर्व विवो, ताजा विच्छेदित रेटिना पंच डिस्क का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन और ग्लाइकोलाइसिस गतिविधि के माइक्रोप्लेट-आधारित assays प्रदर्शन करने के लिए विस्तृत निर्देश दिए गए हैं। प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया गया है: 1) पूर्व विवो रेटिना ऊतक के लिए एक उपयुक्त परख माध्यम का उपयोग सुनिश्चित करें; 2) ओसीआर और ईसीएआर रीडिंग प्राप्त करने के लिए रेटिना पंच डिस्क के उचित आकार को नियोजित करें जो मशीन की इष्टतम पता लगाने की सीमा के भीतर आते हैं; 3) कोटिंग जाल आवेषण मापने चक्र के दौरान स्थिर पढ़ने के लिए रेटिना पंच की चिपकने की क्षमता को बढ़ाने के लिए; 4) प्रत्येक इंजेक्शन दवा यौगिकों की इष्टतम एकाग्रता का उपयोग; और 5) प्रत्येक चरण में माइटोकॉन्ड्रियल राज्यों के पठार तक पहुंचने के लिए परिवर्तित चक्र की लंबाई सुनिश्चित करें। अभिकर्मकों और प्रोटोकॉल को नई पीढ़ी के सीहोर्स XFe24 मशीन के अनुकूल होने के लिए पहले से प्रकाशित संस्करण 23 से संशोधित किया गया है। पिछले प्रोटोकॉल 23 में उपयोग किए जाने वाले एम्स के बफर के बजाय, ग्लूकोज, ग्लूटामाइन और पाइरूवेट को अलग से जोड़कर ईंधन स्रोत के कस्टम संविधान की अनुमति देने के लिए यहां एक बुनियादी सीहॉर्स डीएमईएम माध्यम का उपयोग किया जाता है। यह विभिन्न assays जहां एक विशिष्ट ईंधन सब्सट्रेट की आपूर्ति की जाती है या माध्यम से वंचित किया जाता है प्रदर्शन करने के लिए भी संभव बनाता है। यहां प्रस्तुत assays में, माध्यम ग्लूकोज (6 mM), glutamine (0.5 mM), और पाइरूवेट (0.12 mM) की एक ही एकाग्रता के लिए गठित किया गया था जैसा कि एम्स के बफर में है, जो रेटिना ऊतक के लिए उपयुक्त साबित होते हैं। एम्स के बफर (22.6 एमएम NaHCO3 के साथ) पर इस माध्यम (5 mM HEPES के साथ) का एक और लाभ इसकी कम बफर क्षमता है, जो ECAR28 के संवेदनशील और सटीक माप को सुनिश्चित करता है।

माइटोकॉन्ड्रियल तनाव और ग्लाइकोलाइटिक दर assays दोनों को उच्च परिशुद्धता के साथ यहां वर्णित प्रोटोकॉल का पालन करते हुए किया जा सकता है, जैसा कि कुओं की प्रतिकृति के बीच तंग मानक त्रुटि मूल्यों से स्पष्ट है। हालांकि, उन कारकों को नोट करना सार्थक है जो डेटा परिवर्तनशीलता में योगदान कर सकते हैं। रेटिना ऊतक में कोशिका मृत्यु से बचें। पूरी विच्छेदन प्रक्रिया को बर्फ-ठंडे 1x पीबीएस में किया जाना चाहिए, और मशीन में रेटिना पंच युक्त आइलेट कैप्चर प्लेट डालने के लिए आंखों के न्यूक्लिएशन से प्रक्रिया 2 घंटे से अधिक नहीं होनी चाहिए। रेटिना ऊतक को किसी भी नुकसान से बचने के लिए रेटिना कप के विच्छेदन के दौरान सावधानी बरतनी चाहिए, और विच्छेदन द्वारा क्षतिग्रस्त क्षेत्रों से घूंसे नहीं लिए जाने चाहिए। प्रत्येक प्रयोग में नए, तेज बायोप्सी पंचर का उपयोग किया जाना चाहिए, और 1 मिमी व्यास पर रेटिना घूंसे काटने में स्थिरता और सटीकता सुनिश्चित करने के लिए किनारे के सुस्त या मुड़ने पर पंचर को बदलना चाहिए। क्षेत्रीय विविधताओं (केंद्र बनाम परिधीय) से बचने के लिए ऑप्टिक तंत्रिका सिर से समान दूरी पर रेटिना डिस्क को छिद्रित करने का प्रयास करें। परख के बाद, रेटिना पंच के किसी भी संकेत के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से जांच जाल डालने से अलग किया जा रहा है. जब एक रेटिना पंच में माप के दौरान जाल डालने या अलग करने पर खराब आसंजन होता है, तो सेंसर जांच से ऊतक तक की दूरी बदल जाएगी, जिससे रीडिंग प्रभावित होगी। अलग रेटिना पंच के साथ इस तरह के कुओं से डेटा को छोड़ दें।

बरकरार रेटिना ऊतक में वास्तविक समय के माइटोकॉन्ड्रियल चयापचय के माप में व्यापक अनुप्रयोग हैं और विभिन्न अध्ययनों के लिए उपयोगी जानकारी प्रदान कर सकते हैं। इन assays का उपयोग विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि के चूहों से रेटिना ऊतकों में माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन को मापने के लिए किया गया है ताकि माइटोकॉन्ड्रियल गतिविधि 39,40 में उनके आंतरिक अंतर को प्रकट किया जा सके। इसका उपयोग रेटिना 38 की उम्र बढ़ने के दौरान माइटोकॉन्ड्रियल ऊर्जा चयापचय में परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए भी किया गया था। विभिन्न ईंधन सब्सट्रेट प्रदान करके और विभिन्न चयापचय मार्गों को लक्षित करने वाले विभिन्न अवरोधकों का उपयोग करके, यह कुछ ईंधन स्रोतों पर सेल / ऊतक की वरीयता के लिए अंतर्दृष्टि प्रदान करता है22,38। इसके अलावा, जंगली प्रकार के माउस और विरासत में मिले रेटिना अध: पतन के माउस मॉडल के बीच ओसीआर और एमआरसी पर तुलना रेटिना 22 को कम करने में माइटोकॉन्ड्रियल दोषों का सबूत प्रदान कर सकती है।

इस तकनीक की सीमाएं हैं। इन assays में इस्तेमाल किया आइलेट कैप्चर प्लेट केवल 24 कुओं शामिल हैं; इसलिए, यह केवल मध्य-थ्रूपुट विश्लेषण प्रदान करने में सक्षम है। इस विधि से डेटा की गुणवत्ता रेटिना पंच डिस्क की गुणवत्ता और कोशिकाओं की व्यवहार्यता पर निर्भर करती है। इसके अलावा, रेटिना विच्छेदन और रेटिना पंच डिस्क तैयारी एक समय लेने वाली प्रक्रिया है, जो 96-अच्छी तरह से प्लेटें उपलब्ध होने पर भी लाइव एक्स वीवो रेटिना ऊतकों पर उच्च-थ्रूपुट विश्लेषण के लिए कम संभव है। सुसंस्कृत कोशिकाओं के एक मोनोलेयर की तुलना में, रेटिना ऊतक में दवा यौगिक का प्रवेश भी डेटा रीडआउट को प्रभावित करता है। इसके अलावा, मापा OCR और ECAR मान पूरे ऊतक के कुल प्रदर्शन का प्रतिनिधित्व करते हैं, जो कई अलग-अलग सेल प्रकारों द्वारा बनाया गया है; इसलिए, किसी को डेटा की व्याख्या करते समय रेटिना में विभिन्न न्यूरोनल और ग्लियल कोशिकाओं के बीच संबंध और बातचीत पर विचार करने की आवश्यकता है। विशिष्ट प्रयोगात्मक डिजाइनों को प्रत्येक परियोजना के लिए सिलाई द्वारा लागू किया जाना चाहिए। यह अनुशंसा की जाती है कि किसी में 3 से 5 रेटिना घूंसे (एक ही आंख या एक ही माउस से) शामिल हैं, जो तकनीकी प्रतिकृति के रूप में हैं और जैविक प्रतिकृति के रूप में 3 या अधिक चूहों के नमूनों का उपयोग करते हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

यह काम राष्ट्रीय नेत्र संस्थान (ZIAEY000450 और ZIAEY0000546) के इंट्राम्यूरल रिसर्च प्रोग्राम द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1X PBS Thermo Fisher 14190-144
2-Deoxy glucose (2-DG), 500 mM stock solution Sigma D6134 Dissolve in Seahorse XF DMEM medium, prepare ahead of time
30-gauge needle BD Precision Glide 305106
Antimycin A, 10 mM stock solution Sigma A8674 Dissolve in DMSO, prepare ahead of time
Bam15, 10 mM stock solution TimTec ST056388 Dissolve in DMSO, prepare ahead of time
Biopsy puncher, 1 mm Integra Miltex 33-31AA
Cell-Tak Corning Life Sciences CB40240
CO2 asphyxiation chamber
Dissection forceps-Dumont #5 Fine Science Tools 11251-10 Stright tip
Dissection forceps-Dumont #7 Fine Science Tools 11274-20 Curved tip
Dissection microscope
DMSO Sigma D2438
Graefe forceps Fine Science Tools 11051-10 Curved, Serrated tip
Microscissors Fine Science Tools 15004-08 Curved tip
NaOH solution, 1 M Sigma-Aldrich S8263 Aqueous solution, prepare ahead of time
Rotenone, 10 mM stock solution Sigma R8875 Dissolve in DMSO, prepare ahead of time
Seahorse calibration medium Agilent 100840-000
Seahorse XF 1.0 M glucose Agilent 103577-100
Seahorse XF 100 mM pyruvate Agilent 103578-100
Seahorse XF 200 mM glutamine Agilent 103579-100
Seahorse XF DMEM medium Agilent 103575-100 pH 7.4, with 5 mM HEPES
Seahorse XFe24 Islet Capture FluxPak Agilent 103518-100 Containing Sensor Cartridge and Islet Capture microplate
Seahorse XFe24, Extra Cellular Flux Analyzer Agilent
Sodium bicarbonate solution, 0.1 M Sigma-Aldrich S5761 Aqueous solution, prepare ahead of time
Superfine eyelash brush Ted Pella 113

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 174
<em>पूर्व विवो</em> रेटिना ऊतक नमूनों में माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन और ग्लाइकोलाइसिस का निर्धारण
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Jiang, K., Nellissery, J., Swaroop,… More

Jiang, K., Nellissery, J., Swaroop, A. Determination of Mitochondrial Respiration and Glycolysis in Ex Vivo Retinal Tissue Samples. J. Vis. Exp. (174), e62914, doi:10.3791/62914 (2021).

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