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Neuroscience

Determinación de la respiración mitocondrial y la glucólisis en muestras de tejido retiniano ex vivo

Published: August 4, 2021 doi: 10.3791/62914
Automatic Translation
1, 1, 1
1Neurobiology, Neurodegeneration & Repair Laboratory, National Eye Institute, National Institutes of Health

Summary

Aquí se describe un protocolo detallado para realizar el ensayo de estrés mitocondrial y el ensayo de velocidad glucolítica en muestras de tejido retiniano ex vivo utilizando un bioanalizador comercial.

Abstract

La respiración mitocondrial es una vía crítica de generación de energía en todas las células, especialmente en los fotorreceptores de la retina que poseen un metabolismo altamente activo. Además, los fotorreceptores también exhiben una alta glucólisis aeróbica como las células cancerosas. Las mediciones precisas de estas actividades metabólicas pueden proporcionar información valiosa sobre la homeostasis celular en condiciones fisiológicas y en estados de enfermedad. Se han desarrollado ensayos basados en microplacas de alto rendimiento para medir la respiración mitocondrial y diversas actividades metabólicas en células vivas. Sin embargo, una gran mayoría de estos están desarrollados para células cultivadas y no han sido optimizados para muestras de tejido intacto y para su aplicación ex vivo. Aquí se describe un protocolo detallado paso a paso, utilizando tecnología de fluorescencia basada en microplacas, para medir directamente la tasa de consumo de oxígeno (OCR) como indicador de la respiración mitocondrial, así como la tasa de acidificación extracelular (ECAR) como indicador de glucólisis, en tejido retiniano ex vivo intacto. Este método se ha utilizado para evaluar con éxito las actividades metabólicas en la retina del ratón adulto y demostrar su aplicación en la investigación de los mecanismos celulares del envejecimiento y la enfermedad.

Introduction

Las mitocondrias son orgánulos esenciales que regulan el metabolismo celular, la señalización, la homeostasis y la apoptosis mediante la coordinación de múltiples procesos fisiológicos cruciales1. Las mitocondrias sirven como la fuente de energía en la célula para generar trifosfato de adenosina (ATP) a través de la fosforilación oxidativa (OXPHOS) y proporcionar energía que soporta casi todos los eventos celulares. La mayoría del oxígeno celular se metaboliza en las mitocondrias, donde sirve como el aceptor final de electrones en la cadena de transporte de electrones (ETC) durante la respiración aeróbica. También se pueden producir bajas cantidades de ATP a partir de la glucólisis en el citosol, donde la glucosa se convierte en piruvato, que puede convertirse en lactato o transportarse a las mitocondrias y oxidarse a acetil-CoA, un sustrato en el ciclo del ácido tricarboxílico (ciclo TCA).

La retina es uno de los tejidos metabólicamente más activos en mamíferos2, mostrando altos niveles de respiración mitocondrial y un consumo de oxígeno extremadamente alto3. Los fotorreceptores de bastón y cono contienen una alta densidad de mitocondrias4, y OXPHOS genera la mayor cantidad de ATP en la retina5. Además, la retina también depende en gran medida de la glucólisis aeróbica6,7 al convertir la glucosa en lactato5. Los defectos mitocondriales se asocian a diversas enfermedades neurodegenerativas8,9; y con sus altas demandas energéticas únicas, la retina es especialmente vulnerable a los defectos metabólicos, incluidos los que afectan a OXPHOS4 mitocondrial y la glucólisis10. La disfunción mitocondrial y los defectos de la glucólisis están implicados en enfermedades degenerativas de retinal11,12 y macular13, degeneración macular asociada a la edad10,14,15,16 y retinopatía diabética17,18. Por lo tanto, las mediciones precisas de la respiración mitocondrial y la glucólisis pueden proporcionar parámetros importantes para evaluar la integridad y la salud de la retina.

La respiración mitocondrial se puede medir a través de la determinación de la tasa de consumo de oxígeno (OCR). Dado que la conversión de glucosa en piruvato y posteriormente en lactato da como resultado la extrusión de protones y la acidificación del entorno extracelular, las mediciones de la tasa de acidificación extracelular (ECAR) proporcionan una indicación del flujo de glucólisis. Como la retina está compuesta por múltiples tipos de células con relaciones íntimas y sinergia activa, incluido el intercambio de sustratos6, es imperativo analizar la función mitocondrial y el metabolismo en el contexto de todo el tejido retiniano con laminación y circuitos intactos. Durante las últimas décadas, los electrodos de O2 tipo Clark y otros microelectrodos de oxígeno se han utilizado para medir el consumo de oxígeno en la retina19,20,21. Estos electrodos de oxígeno tienen limitaciones importantes en la sensibilidad, el requisito de un gran volumen de muestra y la necesidad de agitación continua de la muestra en suspensión, lo que generalmente conduce a la interrupción del contexto celular y tisular. El protocolo descrito aquí se desarrolló utilizando una técnica de fluorescencia basada en microplacas para medir el metabolismo energético mitocondrial en tejido de retina de ratón ex vivo recién diseccionado. Permite mediciones en tiempo real de rendimiento medio de OCR y ECAR simultáneamente utilizando una pequeña muestra (punzón de 1 mm) de tejido retiniano ex vivo, evitando la necesidad de suspensión y agitación continua.

Aquí se demuestra el procedimiento experimental para el ensayo de estrés mitocondrial y el ensayo de tasa glucolítica en discos de punción retiniana recién diseccionados. Este protocolo permite la medición de las actividades metabólicas relacionadas con las mitocondrias en un contexto tisular ex vivo. A diferencia de los ensayos realizados con células cultivadas, las lecturas obtenidas aquí reflejan el metabolismo energético combinado a nivel tisular y están influenciadas por las interacciones entre los diferentes tipos de células dentro del tejido. El protocolo se modifica a partir de una versión publicada anteriormente22,23 para adaptarse a la nueva generación del analizador de flujo extracelular Agilent Seahorse de 24 pocillos (XFe24) con placa de captura de islotes. El medio de ensayo, las concentraciones de compuestos de inyección y el número/duración de los ciclos de ensayo también se han optimizado para el tejido retiniano. Se proporciona un protocolo detallado paso a paso para la preparación de discos perforados de retina. Se puede obtener más información sobre la configuración del programa y el análisis de datos en la guía del usuario del fabricante24,25,26.

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Protocol

Todos los protocolos de ratón fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del Instituto Nacional del Ojo (NEI ASP # 650). Los ratones fueron alojados en condiciones de luz-oscuridad de 12 h y cuidados siguiendo las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, el Instituto de Recursos Animales de Laboratorio y la Política del Servicio de Salud Pública sobre Cuidado Humanitario y Uso de Animales de Laboratorio.

1. Cartucho del sensor hidratante y preparación del medio de ensayo

  1. El día antes del experimento, agregue 1 ml del medio de calibración a cada pozo de la placa de utilidad. Coloque la cubierta Hydro-Booster en la parte superior y baje el cartucho del sensor a través de la abertura de la cubierta. Compruebe que el sensor está sumergido en el medio de calibración. Incubar el cartucho del sensor durante la noche en una incubadora libre de CO2 a 37 °C para activar los fluoróforos.
    NOTA: Para evitar la evaporación, la incubadora se humidifica manteniendo una bandeja de agua en el interior, y el cassette del cartucho del sensor se envuelve con una envoltura de plástico transparente.
  2. Prepare el medio de ensayo reconstituyendo el medio Seahorse DMEM con la adición de glucosa, piruvato y glutamina a las concentraciones deseadas. En los ensayos reportados en este artículo, la concentración final de sustratos en el medio de ensayo son: 6 mM de glucosa, 0.12 mM de piruvato y 0.5 mM de glutamina. Para cada placa de ensayo, 40 ml del medio de ensayo se preparan frescos el día del experimento.
  3. Configure el programa de ensayo en el analizador siguiendo las instrucciones del fabricante26. En el ensayo demostrado aquí, el protocolo se establece de la siguiente manera: 5 ciclos de mediciones para la línea de base, luego inyectar el puerto A, seguido de 4 ciclos de mediciones, luego inyectar el puerto B y seguido de 4 ciclos de mediciones. Cada ciclo se compone de mezcla (3 min), espera (2 min) y medida (3 min).

2. Revestimiento de inserciones de malla de microplaca de captura de islotes

  1. Prepare la mezcla de recubrimiento combinando 20 μL del medio de fijación celular (por ejemplo, Cell-Tak) con 171 μL de bicarbonato de sodio de 0,1 M y 9 μL de 1 M de NaOH.
  2. Abra la tapa del cassette que contiene las inserciones de malla. Pipete 8 μL de la mezcla de recubrimiento a cada inserción de malla. Use una punta de pipeta para untar / extender suavemente la gota para distribuir la mezcla de recubrimiento por igual en todo el inserto de malla.
  3. Cierre el cassette y permita que los insertos de malla se incuben a temperatura ambiente durante al menos 25 minutos para la adsorción.
  4. Lave el inserto de malla pipeteando 4 ml del medio de ensayo directamente sobre los insertos de malla. Agite suavemente el cassette para asegurarse de que todos los insertos de malla se laven con el medio de ensayo.
  5. Mantenga el inserto de malla a un lado. Está listo para usar.

3. Preparación de compuestos de inyección

  1. Sacar las alícuotas de Bam15 (10 mM), Rotenona (10 mM), Antimicina A (10 mM) y 2-DG (500 mM) desde -80 °C congelador y descongelar a temperatura ambiente.
    NOTA: El stock 2-DG está listo para usar. Los otros medicamentos deben diluirse en stock de trabajo.
  2. Calentar 10 ml del medio de ensayo en un baño de agua a 37 °C.
  3. Diluir 10 mM bam15 stock a 50 μM de material de trabajo utilizando un procedimiento de dilución de dos pasos: mezclar 20 μL de stock de 10 mM con 20 μL de DMSO para obtener 5 mM de stock intermedio. A continuación, mezcle 10 μL del material intermedio anterior a 5 mM con 990 μL de medio de ensayo precalentado para obtener el material de trabajo final de 50 μM.
  4. Diluir y combinar 10 mM de rotenona y 10 mM de antimicina A en 10 μM de rotenona/antimicina A (Podredumbre/AA) en dos pasos de diluciones: mezclar 10 μL cada uno de 10 mM de rotenona y 10 mM de antimicina A con 80 μL de DMSO para obtener 1 mM de podredumbre/AA de material intermedio. A continuación, mezcle 10 μL del material intermedio anterior de 1 mM con 990 μL de medio de ensayo precalentado para obtener el material de trabajo final de 10 μM Rot/AA.
  5. Prepare recién preparados los materiales de trabajo de compuestos de inyección mencionados anteriormente el día del experimento y déjelos a un lado a temperatura ambiente hasta que se carguen en los puertos de inyección del cartucho del sensor.

4. Disección retiniana y preparación del punzón retiniano

  1. Eutanasia de un ratón por asfixia por CO2 siguiendo las Directrices AVMA sobre Eutanasia27.
    NOTA: No deje al animal en una cámara de CO2 más tiempo del necesario para la eutanasia.
  2. Enucle los ojos y colóquelos en un tampón de PBS 1x viejo de hielo en una placa de Petri y luego colóquelo bajo un microscopio de disección.
  3. Retire con cuidado, cortando con microscisores, los músculos rectos adicionales unidos fuera del globo ocular y corte el nervio óptico.
  4. Use una aguja de 30 G para perforar un orificio en el borde de la córnea (limbo); esto sirve como el sitio de inserción para los microscisores. Luego, use una microescisora de disección fina para hacer un corte circular a lo largo del borde de la córnea, separándola de la copa del ojo posterior.
  5. Use fórceps de disección afilados para eliminar la córnea, el cristalino y el humor vítreo de la copa del ojo.
  6. Use microescisores de disección fina para hacer varios cortes pequeños en la capa escleral en el borde de la copa del ojo. Evite cortar la capa de retina. Use dos pinzas de disección afiladas para sujetar el tejido escleral a cada lado del corte y tire con mucho cuidado de la capa escleral para extraerla de la retina neural. Repita esto alrededor de la copa del ojo hasta que se extirpe toda la esclerótica y se obtenga una copa de retina intacta.
  7. Use microescisores de disección y haga cortes radiales en la copa de la retina para aplanarla y generar varias secciones distintas.
    NOTA: Dependiendo de las habilidades de disección de la persona y la experiencia en el manejo de tejido retiniano fresco, la copa de la retina se puede cortar para generar de 3 a 5 secciones distintas.
  8. Use un punzón de biopsia de 1 mm de diámetro para cortar un disco de retina de cada sección de la copa retiniana aplanada.
    NOTA: Se debe tener cuidado de perforar los discos de retina a la misma distancia de la cabeza del nervio óptico.
  9. Use fórceps para transferir los insertos de malla pre-recubiertos en la placa de Petri de disección. Con la ayuda de dos cepillos de pestañas superfinos, coloque el disco de punzonado de retina en el inserto de malla. El disco perforador de retina se coloca en el centro del inserto de malla con la capa de células ganglionares hacia abajo tocando la malla y la capa fotorreceptora hacia arriba.
    NOTA: Con frecuencia, algunas células RPE permanecen unidas a los fotorreceptores, y la pigmentación de estas células se puede utilizar como un indicador de la orientación del disco punzante retiniano.

5. Carga de los puertos de inyección del cartucho del sensor y calibración

  1. Saque el cassette de la placa del cartucho del sensor hidratado de la incubadora de 37 °C. Retire la cubierta hydro-Booster y vuelva a colocar el cartucho del sensor en la placa de servicio.
  2. Cargue el volumen deseado de soluciones de material de trabajo compuesto de inyección en los puertos apropiados. Sostenga la punta de la pipeta en un ángulo de 45 °. Inserte la punta de la pipeta hasta la mitad en un puerto de inyección con el bisel de la punta contra la pared opuesta del puerto de inyección y cargue suavemente el compuesto en cada puerto. Evite introducir burbujas de aire.
  3. Consulte la guía del usuario del instrumento para conocer el volumen del compuesto cargado en cada puerto de inyección para un ensayo específico. En los experimentos presentados en este artículo, 68 μL de material de trabajo bam15 de 50 μM (para el ensayo de estrés mitocondrial) o 68 μL de material de trabajo rot/AA de 10 μM (para el ensayo de velocidad glucolítica) se cargan en el puerto A; 75 μL de material de trabajo 10 μM Rot/AA (para ensayo de estrés mitocondrial) o 75 μL de material de trabajo 2-DG de 500 mM (para ensayo de velocidad glucolítica) se cargan en el puerto B.
  4. Puertos de inyección de carga de todos los pozos de la placa, incluidos los pozos de corrección de fondo y los pozos en blanco para garantizar una inyección adecuada. Cargue la solución compuesta respectiva en cada puerto para los pozos de corrección de fondo. El medio de ensayo puede ser sustituido, en lugar de la solución compuesta, en cada uno de los puertos de los pozos del banco.
  5. Coloque la placa del cartucho del sensor cargada, con la tapa apagada, en la máquina analizadora para iniciar la calibración antes de la ejecución del ensayo. Una vez finalizada la calibración, el programa se detendrá automáticamente, esperando el reemplazo de la placa de utilidad con la placa de captura del islote que contiene punzones de retina.

6. Carga de la placa de captura del islote e inicio de la ejecución del ensayo

  1. Añadir 607 μL del medio de ensayo a cada pocillo de la placa de captura del islote
  2. Use fórceps para agarrar el borde del inserto de malla que contiene discos perforadores de retina en la parte superior y sáquelo de la placa de Petri. Golpee ligeramente la parte inferior del inserto de malla en un pañuelo absorbente para eliminar el líquido adicional y colóquelo en el pozo de la placa de captura del islote. Repita este paso hasta que todos los insertos de malla con punzones de retina se coloquen en la placa de captura del islote. Llene los pozos de corrección de fondo y los pozos en blanco con inserciones de malla vacías.
  3. Use dos pinzas Graefe para presionar con cuidado y suavidad el borde de cada inserto de malla y asegúrese de que estén insertadas de manera segura en la parte inferior de la placa de captura del islote.
  4. Coloque la placa de captura del islote cargada en una incubadora de 37 °C durante 5 minutos para calentarse.
  5. Expulse la placa de utilidad después de que se complete la calibración y reemplácela por una y reemplácela con la placa de captura de islotes, con la tapa apagada, que contenga punzones de retina.
  6. Reanude la ejecución del ensayo.

7. Ejecute la terminación y el almacenamiento de datos

  1. Una vez completada la ejecución, expulse el cartucho del sensor y la placa de captura del islote que contiene punzones retinianos. Los datos se guardan automáticamente como archivo .asyr.
  2. Utilice el software de análisis de datos asociado para ver y analizar los datos siguiendo la guía del usuario del fabricante26.
  3. Utilice la función Exportar para exportar el archivo .xslx de los datos, que se puede ver y analizar utilizando un software de hoja de cálculo.

8. Guardar la muestra de punzón retiniano

  1. Después del ensayo, saque la placa de la máquina, retire el cartucho del sensor y retire suavemente el medio de ensayo de cada pozo con una pipeta.
  2. Vuelva a aplicar la cubierta y selle los lados de la placa con la tira de parafilm.
  3. Conservar a -80 °C.
  4. Para la normalización, cuantifique el contenido total de ADN o proteína del punzón en cada pozo.

9. Análisis de datos

  1. Ensayo de estrés mitocondrial
    NOTA: El valor de OCR medido (totalOCR) representa el consumo total de oxígeno por parte del tejido. Después de la inyección de Bam15 (desacoplador), el OCR aumenta desde el nivel basal (totalOCRbasal) hasta el nivel máximo (totalOCRmax) y disminuye después de la inyección de Rot/AA. El valor de OCR residual después de la inyección de Rot/AA (totalOCRRot/AA) representa el consumo de oxígeno no mitocondrial.
    1. Calcule el consumo de oxígeno relacionado con las mitocondrias como:
      Equation 1 (Eq. 1) 28
    2. Calcule la capacidad de reserva mitocondrial (MRC) como:
      Equation 2 (Eq. 2) 29
      NOTA: La última lectura entre las 5 mediciones antes de la inyección de Bam15 se toma como el valor "basal" (para totalOCRbasal y mitoOCRbasal). La lectura más alta entre las 4 mediciones después de la inyección de Bam15 se utiliza como valor "máximo" (para totalOCRmax y mitoOCRmax). La lectura más baja entre las 4 mediciones después de la inyección de Rot/AA se utiliza como totalOCRRot/AA.
  2. Ensayo de velocidad glucolítica
    NOTA: El valor ECAR medido (totalECAR) representa la acidificación total del medio por la actividad metabólica del tejido. En general, la acidificación del microambiente extracelular resulta principalmente por extrusión del producto glicolítico, el lactato. El catabolismo de sustratos en el ciclo mitocondrial del TCA da como resultado la producción de CO2, que también acidifica el medio extracelular a través de la hidratación al bicarbonato.
    1. Substract mitocondrial contribuyó a la acidificación media (mitoECAR) de totalECAR para obtener el glycoECAR.
      Equation 3 (Eq. 3) 28
      NOTA: La respiración mitocondrial y el ciclo de TCA son procesos fuertemente acoplados. La producción de CO2 a partir de las mitocondrias es una función de la tasa de OXPHOS, que es medible por mitoOCR.
    2. Calcule el mitoECAR como:
      Equation 4 (Eq. 4) 28
      donde, el CCF (Factor de Contribución de CO2) es un valor de relación calculado empíricamente, que representa la cantidad de contribución de H + de la acidificación mediada por CO2 frente a cada consumo de O2 de OXPHOS. El CCF para este sistema está predeterminado a ser 0.6028. La medición precisa de la acidificación del medio está determinada por la capacidad tampón del medio, la sensibilidad del sensor de pH del instrumento y la capacidad efectiva de la cámara de medición. Aquí, el BF (Buffer Factor) es un parámetro de la capacidad de buffer experimental in situ, que representa la cantidad de H+ u OH- añadida a la cámara de medición efectiva para cambiar el nivel de pH en 1 unidad. Cuando se utiliza un medio de ensayo personalizado, el BF se puede determinar titulando cantidades conocidas de ácido en el medio de ensayo siguiendo el protocolo del factor tampón30. El Seahorse DMEM medium pH 7.4 utilizado en este protocolo tiene un BF predeterminado de 2.60 mmol H +/ L / pH. La placa de captura de islotes utilizada en este protocolo tiene una Volmicrocámara = 16,6 μL31. El factor de escalado de volumen, Kvol, es una constante determinada empíricamente. El valor de Kvol no está disponible para la placa de captura de islotes, pero se puede calcular a partir del valor de la microplaca28, teniendo en cuenta la diferencia de volumen en sus microcámaras, que es de 0,41.
      NOTA: La inyección de rot /AA apaga la respiración mitocondrial y obliga al tejido a cambiar a la glucólisis para la producción de ATP, lo que lleva a una mayor extrusión de lactato y un aumento en la medición de ECAR. La glucólisis se interrumpe con la inyección de 2-DG, y la medición residual de ECAR revela acidificación no glicolítica y no mitocondrial del medio.
    3. Calcule la capacidad de reserva glucolítica (GRC) como:
      Equation 5 (Eq. 5) 32
      donde, la última lectura entre las 5 mediciones antes de la inyección de Rot/AA se toma como el valor "basal" (glicoECARbasal). La lectura más alta entre las 4 mediciones después de la inyección de Rot/AA se utiliza como valor "máximo" (glycoECARmax). La lectura más baja entre las 4 mediciones después de la inyección de 2-DG se utiliza como glycoECAR2-DG.
  3. Normalización
    NOTA: La normalización es esencial cuando se comparan las lecturas de tejidos retinianos de diferentes grupos de edad o entre muestras de tipo salvaje y patológicas/degenerativas, que pueden diferir en el número de células.
    1. Utilice kits disponibles comercialmente para evaluar el contenido de ADN en cada disco punzante retiniano33,34.
    2. Alternativamente, use un tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación (tampón RIPA) para extraer la proteína total del punzón retiniano y use el contenido de proteína para la normalización.
      NOTA: El área de superficie de la retina de un ratón adulto se ha determinado previamente que es de alrededor de 20 mm2, y cada retina contiene ~ 6.5 millones de células35. Por lo tanto, cada punzón retiniano de 1 mm de diámetro es ~ 1/25 de una sola retina y contiene ~ 260K células. Uno puede referirse a estos números al comparar los datos de un punzón retiniano con los de otras muestras de tejido o células cultivadas,

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Representative Results

Los datos reportados aquí son ensayos representativos de estrés mitocondrial que muestran trazas de OCR (Figura 1) y ensayos de tasa glucolítica que muestran trazas de OCR y trazas de ECAR (Figura 2), que se realizaron utilizando discos perforados de retina de 1 mm recién diseccionados de ratones transgénicos Nrl-L-EGFP de 4 meses de edad36 (fondo C57B / L6). Estos ratones expresan GFP específicamente en fotorreceptores de bastón sin alterar el desarrollo normal de la retina, la histología y la fisiología y se han utilizado ampliamente como controles de tipo salvaje en la investigación de la retina. Se utilizaron dos ratones compañeros de camada Nrl-L-GFP en los ensayos presentados aquí. GFP expresado en los ratones Nrl-L-GFP no interfiere con las mediciones de OCR y ECAR en este protocolo. Se tomaron cinco punzones retinianos de cada retina. Diez de los punzones retinianos se utilizaron para el ensayo de estrés mitocondrial y los otros 10 se utilizaron para el ensayo de tasa glucolítica. En los experimentos se utilizaron el medio Seahorse XF DMEM, pH 7.4 (constituido con 6 mM de glucosa, 0.12 mM de piruvato y 0.5 mM de glutamina) y las placas de captura de islotes Seahorse XFe24. Los datos representativos aquí presentados se obtuvieron utilizando el mismo perforador de 1 mm de diámetro, pero no se normalizaron con respecto al contenido de ADN/proteína.

En el ensayo de estrés mitocondrial, el desacoplador Bam1537 se inyectó después de establecer la línea de base de OCR, lo que llevó a un OCR mejorado al nivel máximo. Se inyectaron rotenona y antimicina A para inhibir la respiración mitocondrial en el complejo I y el complejo III, respectivamente, lo que resultó en que el OCR cayera al nivel mínimo (Figura 1). La diferencia entre el nivel máximo de OCR y la última medición del nivel basal de OCR refleja la capacidad de reserva mitocondrial (MRC). Se calcula que el MRC es del 19,2% ±3,4% utilizando Eq. 2, consistente con los valores de MRC medidos previamente en retinas de ~ 3 meses de edad Nrl-L-EGFP utilizando el analizador Seahorse XF24 de la generación anterior22,38.

En el ensayo de tasa glucolítica, se inyectaron rotenona y antimicina A después de establecer la línea de base para el ECAR total. Con la producción de ATP de OXPHOS detenida, el tejido se ve obligado a depender de la glucólisis para obtener energía, y un aumento en la liberación extracelular de lactato impulsa ECAR al nivel máximo. La glucólisis cesa mediante la inyección de 2-DG, que compite con la glucosa para la unión a la hexoquinasa, lo que hace que ECAR caiga al nivel mínimo (Figura 2). Las mitocondrias aportadas por ECAR (mitoECAR) se pueden calcular a partir del valor de mitoOCR (Eq. 4). La glucólisis aportada por ECAR glycoECAR se calcula y traza restando mitoECAR del totalECAR. La diferencia entre el nivel máximo de glycoECAR y la última medición del nivel basal de glycoECAR refleja la capacidad de reserva de glucólisis (GRC). Aquí, el GRC se calcula en un 35,7% ± 3,4% utilizando Eq. 5.

Como tejido altamente glicolítico, la producción de lactato de la retina representa una fuente importante de acidificación extracelular, como lo revela la pequeña diferencia de glycoECAR del totalECAR. Curiosamente, la medición de ECAR no se estabiliza inmediatamente después de la inyección de Rot / AA, sino que disminuye después de la segunda medición. El disco punzante retiniano es un sistema ex vivo intacto compuesto por diferentes tipos de células, incluidas las células de la glía de Müller, que se sabe que reciben lactato (producto final de la glucólisis) liberado de los fotorreceptores6. Por lo tanto, una caída en la medición de ECAR después de la inyección de Podredumbre / AA probablemente se explica por una mayor eliminación de lactato del espacio intercelular, lo que ralentiza / previene su liberación en el medio.

Figure 1
Figura 1: Ensayo de estrés mitocondrial. El gráfico trazado muestra el rastro de OCR de discos perforados de retina de 1 mm en tampón Seahorse XF DMEM, complementado con 6 mM de glucosa, 0,12 mM de piruvato y 0,5 mM de glutamina. Cada punto de datos representa el promedio de mediciones de 10 pozos. Barra de error = error estándar. El MRC se calcula en 19.2%±3.4%. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Ensayo de tasa glucolítica. El gráfico trazado muestra el rastro OCR medido, el rastro ECAR (totalECAR) y la glucólisis calculada aportada ECAR (glycoECAR) a partir de discos perforadores retinianos de 1 mm en el tampón Seahorse XF DMEM suplementado con 6 mM de glucosa, 0,12 mM de piruvato y 0,5 mM de glutamina. Cada punto de datos representa el promedio de mediciones de 10 pozos. Barra de error = error estándar. GRC se calcula que es 35.7%±3.4% Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Aquí se proporcionan instrucciones detalladas para realizar ensayos basados en microplacas de la respiración mitocondrial y la actividad de la glucólisis utilizando discos perforadores de retina recién diseccionados ex vivo. El protocolo se ha optimizado para: 1) garantizar el uso de un medio de ensayo adecuado para el tejido retiniano ex vivo; 2) emplear el tamaño adecuado de los discos perforadores de retina para obtener lecturas de OCR y ECAR que se encuentren dentro del rango de detección óptimo de la máquina; 3) inserciones de malla de recubrimiento para mejorar la adhesividad del punzón retiniano para una lectura estable durante el ciclo de medición; 4) uso de la concentración óptima de cada compuesto de drogas inyectadas; y 5) asegurar la duración alterada del ciclo para alcanzar una meseta de estados mitocondriales en cada paso. Los reactivos y el protocolo han sido modificados a partir de una versión publicada anteriormente23 para adaptarse a la máquina Seahorse XFe24 de nueva generación. En lugar del tampón de Ames utilizado en el protocolo anterior23, aquí se utiliza un medio DMEM básico de Caballito de Mar para permitir la constitución personalizada de la fuente de combustible mediante la adición de glucosa, glutamina y piruvato por separado. Esto también permite realizar varios ensayos donde se suministra o priva del medio un sustrato combustible específico. En los ensayos presentados aquí, el medio se constituyó con la misma concentración de glucosa (6 mM), glutamina (0,5 mM) y piruvato (0,12 mM) que en el tampón de Ames, que han demostrado ser adecuados para el tejido retiniano. Otra ventaja de este medio (con 5 mM HEPES) sobre el buffer de Ames (con 22,6 mM NaHCO3) es su baja capacidad de buffer, que garantiza una medición sensible y precisa de ECAR28.

Tanto el estrés mitocondrial como los ensayos de velocidad glucolítica se pueden realizar siguiendo el protocolo descrito aquí con alta precisión, como lo demuestran los ajustados valores de error estándar entre los pozos replicantes. Sin embargo, vale la pena señalar los factores que pueden contribuir a la variabilidad de los datos. Evite la muerte celular en el tejido de la retina. Todo el proceso de disección debe realizarse en 1x PBS helado, y el proceso desde la enucleación de los ojos hasta la colocación de la placa de captura de islotes que contiene el punzón de retina en la máquina no debe exceder las 2 horas. Se debe tener precaución durante la disección de la copa de retina para evitar cualquier daño al tejido de la retina, y no se deben tomar punzones de áreas dañadas por la disección. Se debe usar un nuevo perforador de biopsia afilado en cada experimento, y cambiar el punzón cuando el borde esté opaco o doblado para garantizar la consistencia y precisión en el corte de punzones de retina a 1 mm de diámetro. Trate de perforar los discos de retina equidistantes de la cabeza del nervio óptico para evitar variaciones regionales (centro versus periférico). Después del ensayo, revise cada pocillo para detectar cualquier signo de que el punzón de la retina se separe del inserto de malla. Cuando un punzón retiniano tiene una adherencia deficiente en el inserto de malla o se desprende durante la medición, la distancia de la sonda del senser al tejido cambiará, lo que afectará las lecturas. Omita los datos de tales pozos con punzón retiniano desprendido.

La medición del metabolismo mitocondrial en tiempo real en el tejido retiniano intacto tiene amplias aplicaciones y puede proporcionar información útil para diversos estudios. Estos ensayos se han utilizado para medir la respiración mitocondrial en tejidos retinianos de ratones de diferentes orígenes genéticos para revelar su diferencia intrínseca en la actividad mitocondrial39,40. También se utilizó para estudiar los cambios en el metabolismo energético mitocondrial durante el envejecimiento de la retina38. Al proporcionar diferentes sustratos de combustible y utilizar varios inhibidores dirigidos a diferentes vías metabólicas, proporciona información sobre la preferencia de la célula / tejido en ciertas fuentes de combustible22,38. Además, la comparación en OCR y MRC entre modelos de ratón y ratón de tipo salvaje de degeneración retiniana hereditaria puede proporcionar evidencia de defectos mitocondriales en la degeneración de la retina22.

Existen limitaciones de esta técnica. La placa de captura de islotes utilizada en estos ensayos solo contiene 24 pocillos; por lo tanto, solo puede proporcionar análisis de rendimiento medio. La calidad de los datos de este método depende de la calidad de los discos perforadores de retina y la viabilidad de las células. Además, la disección retiniana y la preparación de discos perforados retinianos es un proceso que consume mucho tiempo, lo que lo hace menos factible para el análisis de alto rendimiento en tejidos retinianos ex vivo ex vivo , incluso cuando hay placas de 96 pocillos disponibles. En comparación con una monocapa de células cultivadas, la penetración del compuesto farmacológico en el tejido de la retina también afecta la lectura de datos. Además, los valores medidos de OCR y ECAR representan el rendimiento total de todo el tejido, que está compuesto por muchos tipos de células diferentes; por lo tanto, es necesario considerar la relación y las interacciones entre las diferentes células neuronales y gliales en la retina al interpretar los datos. Los diseños experimentales específicos deben implementarse adaptándose a cada proyecto. Se recomienda que se incluyan de 3 a 5 punzones de retina (del mismo ojo o del mismo ratón) como réplicas técnicas y se utilicen muestras de 3 o más ratones como réplicas biológicas.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo es apoyado por el Programa de Investigación Intramuros del Instituto Nacional del Ojo (ZIAEY000450 y ZIAEY000546).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1X PBS Thermo Fisher 14190-144
2-Deoxy glucose (2-DG), 500 mM stock solution Sigma D6134 Dissolve in Seahorse XF DMEM medium, prepare ahead of time
30-gauge needle BD Precision Glide 305106
Antimycin A, 10 mM stock solution Sigma A8674 Dissolve in DMSO, prepare ahead of time
Bam15, 10 mM stock solution TimTec ST056388 Dissolve in DMSO, prepare ahead of time
Biopsy puncher, 1 mm Integra Miltex 33-31AA
Cell-Tak Corning Life Sciences CB40240
CO2 asphyxiation chamber
Dissection forceps-Dumont #5 Fine Science Tools 11251-10 Stright tip
Dissection forceps-Dumont #7 Fine Science Tools 11274-20 Curved tip
Dissection microscope
DMSO Sigma D2438
Graefe forceps Fine Science Tools 11051-10 Curved, Serrated tip
Microscissors Fine Science Tools 15004-08 Curved tip
NaOH solution, 1 M Sigma-Aldrich S8263 Aqueous solution, prepare ahead of time
Rotenone, 10 mM stock solution Sigma R8875 Dissolve in DMSO, prepare ahead of time
Seahorse calibration medium Agilent 100840-000
Seahorse XF 1.0 M glucose Agilent 103577-100
Seahorse XF 100 mM pyruvate Agilent 103578-100
Seahorse XF 200 mM glutamine Agilent 103579-100
Seahorse XF DMEM medium Agilent 103575-100 pH 7.4, with 5 mM HEPES
Seahorse XFe24 Islet Capture FluxPak Agilent 103518-100 Containing Sensor Cartridge and Islet Capture microplate
Seahorse XFe24, Extra Cellular Flux Analyzer Agilent
Sodium bicarbonate solution, 0.1 M Sigma-Aldrich S5761 Aqueous solution, prepare ahead of time
Superfine eyelash brush Ted Pella 113

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Neurociencia Número 174
Determinación de la respiración mitocondrial y la glucólisis en <em>muestras de</em> tejido retiniano ex vivo
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Jiang, K., Nellissery, J., Swaroop,… More

Jiang, K., Nellissery, J., Swaroop, A. Determination of Mitochondrial Respiration and Glycolysis in Ex Vivo Retinal Tissue Samples. J. Vis. Exp. (174), e62914, doi:10.3791/62914 (2021).

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