Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Bestämning av mitokondriell andning och glykolys i ex vivo retinal vävnadsprover

Published: August 4, 2021 doi: 10.3791/62914
Automatic Translation
1, 1, 1
1Neurobiology, Neurodegeneration & Repair Laboratory, National Eye Institute, National Institutes of Health

Summary

Beskrivs här är ett detaljerat protokoll för att utföra mitokondriell stress analys och glykolytisk hastighet analys i ex vivo retinal vävnad prover med hjälp av en kommersiell bioanalyzer.

Abstract

Mitokondriell andning är en kritisk energigenererande väg i alla celler, särskilt retinala fotoreceptorer som har en mycket aktiv ämnesomsättning. Dessutom uppvisar fotoreceptorer också hög aerob glykolys som cancerceller. Exakta mätningar av dessa metaboliska aktiviteter kan ge värdefulla insikter om cellulär homeostas under fysiologiska förhållanden och i sjukdomstillstånd. Mikroplatebaserade analyser med hög genomströmning har utvecklats för att mäta mitokondriell andning och olika metaboliska aktiviteter i levande celler. En stor majoritet av dessa är dock utvecklade för odlade celler och har inte optimerats för intakta vävnadsprover och för applikation ex vivo. Beskrivs här är ett detaljerat steg-för-steg-protokoll, med hjälp av mikroplatebaserad fluorescensteknik, för att direkt mäta syreförbrukningshastigheten (OCR) som en indikator på mitokondriell andning, liksom extracellulär försurningsgrad (ECAR) som en indikator på glykolys, i intakt ex vivo retinal vävnad. Denna metod har använts för att framgångsrikt bedöma metaboliska aktiviteter i vuxna mus näthinnan och visa dess tillämpning i att undersöka cellulära mekanismer för åldrande och sjukdom.

Introduction

Mitokondrier är viktiga organeller som reglerar cellulär metabolism, signalering, homeostas och apoptos genom att samordna flera avgörande fysiologiska processer1. Mitokondrier fungerar som kraftverk i cellen för att generera adenosintrifosfat (ATP) genom oxidativ fosforylering (OXPHOS) och ge energi som stöder nästan alla cellulära händelser. Majoriteten av cellulärt syre metaboliseras i mitokondrier, där det fungerar som den slutliga elektron acceptor i elektrontransportkedjan (ETC) under aerob andning. Låga mängder ATP kan också produceras från glykolys i cytosolen, där glukos omvandlas till pyruvat, som kan omvandlas ytterligare till laktat eller transporteras till mitokondrier och oxideras till acetyl-CoA, ett substrat i trikarboxylsyracykeln (TCA-cykeln).

Näthinnan är en av de mest metaboliskt aktiva vävnaderna hos däggdjur2, som uppvisar höga nivåer av mitokondriell andning och extremt hög syreförbrukning3. Stången och kon fotoreceptorerna innehåller en hög densitet av mitokondrier4, och OXPHOS genererar de flesta ATP i näthinnan5. Dessutom förlitar sig näthinnan också starkt på aerob glykolys6,7 genom att omvandla glukos till laktat5. Mitokondriella defekter är associerade med olika neurodegenerativa sjukdomar8,9; och med sina unika höga energikrav är näthinnan särskilt sårbar för metaboliska defekter, inklusive de som påverkar mitokondriella OXPHOS4 och glykolys10. Mitokondriell dysfunktion och defekter i glykolys är inblandade i retinal11,12 och macular13 degenerativa sjukdomar, åldersrelaterade makuladegeneration10,14,15,16 och diabetiker retinopati17,18. Därför kan noggranna mätningar av mitokondriell andning och glykolys ge viktiga parametrar för att bedöma näthinnans integritet och hälsa.

Mitokondriell andning kan mätas genom bestämning av syreförbrukningshastighet (OCR). Med tanke på att omvandlingen av glukos till pyruvat och därefter till laktat resulterar i extrudering av protoner till och försurning av den extracellulära miljön, ger mätningar av den extracellulära försurningshastigheten (ECAR) en indikation på glykolysflöde. Eftersom näthinnan består av flera celltyper med intima relationer och aktiv synergi, inklusive utbyte av substrat6, är det absolut nödvändigt att analysera mitokondriell funktion och metabolism i samband med hela retinal vävnad med intakt laminering och kretsar. Under de senaste decennierna har Clark typ O2 elektroder och andra syremikroelektroder använts för att mäta syreförbrukning i näthinnan19,20,21. Dessa syreelektroder har stora begränsningar i känslighet, krav på en stor provvolym och behovet av kontinuerlig omrörning av suspenderingsprov, vilket vanligtvis leder till störningar i cellulära och vävnadssammanhang. Protokollet som beskrivs här utvecklades med hjälp av en microplate-baserade, fluorescence teknik för att mäta mitokondriell energi metabolism i nyligen dissekerade ex vivo mus näthinnan vävnad. Det möjliggör mätningar i realtid av både OCR och ECAR samtidigt med hjälp av ett litet prov (1 mm stans) av ex vivo retinal vävnad samtidigt som behovet av suspension och kontinuerlig omrörning undviks.

Visat här är det experimentella förfarandet för mitokondriell stress analys och glykolytisk hastighet analys på nyligen dissekerade retinal stans diskar. Detta protokoll tillåter mätning av mitokondrier-relaterade metaboliska aktiviteter i en ex vivo vävnad sammanhang. Till skillnad från de analyser som utförs med hjälp av odlade celler återspeglar avläsningarna här kombinerad energimetabolism på vävnadsnivå och påverkas av interaktioner mellan de olika celltyperna i vävnaden. Protokollet är modifierat från en tidigare publicerad version22,23 för att anpassa sig till den nya generationen av Agilent Seahorse extracellulära flöde 24-brunnar (XFe24) analysator med Islet Capture plate. Analysmediet, koncentrationerna av injektionsföreningar och antalet/varaktigheten av analyscyklerna har också optimerats för näthinnevävnad. Ett detaljerat steg-för-steg-protokoll ges för beredning av näthinnestansskivor. Mer information om programinställningar och dataanalys kan erhållas från tillverkarens användarhandbok24,25,26.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla musprotokoll godkändes av Animal Care and Use Committee vid National Eye Institute (NEI ASP# 650). Möss inrymdes i 12 timmar ljusmörka förhållanden och vårdades genom att följa rekommendationerna från Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, Institute of Laboratory Animal Resources och Folkhälsopolicyn för human vård och användning av laboratoriedjur.

1. Hydrerande sensorpatron och beredning av analysmediet

  1. Dagen före experimentet, tillsätt 1 ml kalibreringsmediet till varje brunn på verktygsplattan. Placera Hydro-Booster-locket på toppen och sänk sensorpatronen genom öppningen på locket. Kontrollera att sensorn är nedsänkt i kalibreringsmediet. Inkubera sensorpatronen över natten i en CO2-fri inkubator vid 37 °C för att aktivera fluoroforerna.
    OBS: För att förhindra avdunstning fuktas inkubatorn genom att hålla en bricka med vatten inuti och sensorkassetten är insvept med klar plastfolie.
  2. Förbered analysmediet genom att rekonstruera seahorse DMEM-mediet med tillsats av glukos, pyruvat och glutamin till önskade koncentrationer. I de analyser som rapporteras i denna artikel är den slutliga koncentrationen av substrat i analysmediet: 6 mM glukos, 0,12 mM pyruvat och 0,5 mM glutamin. För varje analysplatta bereds 40 ml av analysmediet färskt på experimentdagen.
  3. Ställ in analysprogrammet i analysatorn enligt tillverkarens instruktion26. I den analys som visas här fastställs protokollet enligt följande: 5 cykler av mätningar för baslinjen, injicera sedan port A, följt av 4 cykler av mätningar, injicera sedan port B och följt av 4 cykler av mätningar. Varje cykel består av mix (3 min), vänta (2 min) och mått (3 min).

2. Beläggningsnätinsatser av mikroplatta för holmefångst

  1. Förbered beläggningsblandningen genom att kombinera 20 μL av cellfästets medium (t.ex. Cell-Tak) med 171 μL 0,1 M natriumbikarbonat och 9 μL 1 M NaOH.
  2. Öppna locket på kassetten som innehåller nätinsatser. Pipett 8 μL av beläggningsblandningen till varje nätinsatser. Använd en pipettspets för att försiktigt smeta/sprida droppen runt för att fördela beläggningsblandningen lika genom hela nätinsatsen.
  3. Stäng kassetten och låt nätinsatserna inkuberas vid rumstemperatur i minst 25 minuter för adsorption.
  4. Tvätta nätinsatsen genom att pipettera 4 ml av analysmediet direkt på nätinsatserna. Skaka försiktigt kassetten för att säkerställa att alla nätinsatser tvättas med analysmediet.
  5. Håll nätinsatsen åt sidan. Den är klar att användas.

3. Förbereda injektionsföreningar

  1. Ta ut lager alikvoter av Bam15 (10 mM), Rotenone (10 mM), Antimycin A (10 mM) och 2-DG (500 mM) från -80 °C frys och tina vid rumstemperatur.
    OBS: 2-DG-beståndet är klart att användas. De andra drogerna måste spädas ut till arbetsbeståndet.
  2. Värm upp 10 ml av analysmediet i ett vattenbad på 37 °C.
  3. Späd 10 mM Bam15-beståndet till 50 μM arbetslager med hjälp av ett tvåstegs utspädningsförfarande: blanda 20 μL 10 mM-lager med 20 μL DMSO för att få 5 mM mellanlager. Blanda sedan 10 μL av ovanstående mellanlager på 5 mM med 990 μL förvärmt analysmedium för att få det slutliga arbetslagret på 50 μM.
  4. Späd och kombinera 10 mM Rotenone och 10 mM Antimycin A-beståndet till 10 μM Rotenone/Antimycin A (Rot/AA) arbetslager med två steg utspädningar: blanda 10 μL vardera av 10 mM Rotenone och 10 mM Antimycin A-beståndet med 80 μL DMSO för att få 1 mM Rot/AA mellanlager. Blanda sedan 10 μL av ovanstående mellanlager på 1 mM med 990 μL förvärmt analysmedium för att få det slutliga arbetslagret 10 μM Rot/AA.
  5. Förbered nyligen ovan nämnda arbetslager av injektionsföreningar på dagen för försöket och ställ dem åt sidan vid rumstemperatur tills de laddas i sensorpatronens insprutningsportar.

4. Retinal dissekering och retinal punch förberedelse

  1. Avliva en mus genom CO2 kvävning enligt AVMA:s riktlinjer om dödshjälp27.
    OBS: Lämna inte djuret i en CO2-kammare längre än den tid som behövs för dödshjälp.
  2. Skriv upp ögonen och placera i isgamla 1x PBS-buffert i en Petri-maträtt och placera den sedan under ett dissekeringsmikroskop.
  3. Ta försiktigt bort, genom att skära med mikroscissorer, de extra rectusmusklerna som är fästa utanför ögongloben och skär av synnerven.
  4. Använd en 30 G nål för att slå ett hål vid hornhinnans kant (limbus); Detta fungerar som insättningsstället för mikroscissorerna. Använd sedan en fin dissekeringsmikrescissor för att göra ett cirkulärt snitt längs hornhinnans kant och separera det från den bakre ögonkoppen.
  5. Använd vassa dissekeringstänger för att ta bort hornhinnan, linsen och glasaktig humorn bort från ögonkoppen.
  6. Använd fina dissekeringsmikrescissorer för att göra flera små snitt på skleralskiktet vid ögonkoppens kant. Undvik att skära näthinnans lager. Använd två vassa dissekeringstångar för att hålla fast vid skleralvävnaden på varje sida av snittet och dra mycket försiktigt på skleralskiktet för att ta bort det från neural näthinnan. Upprepa detta runt ögonkoppen tills all sclera har tagits bort och en intakt näthinnekopp erhålls.
  7. Använd dissekeringsmikroscissorer och gör radiella snitt på näthinnekoppen för att platta ut den och generera flera distinkta sektioner.
    OBS: Beroende på personens dissekeringsförmåga och erfarenhet av att hantera färsk näthinnevävnad kan näthinnekoppen skäras för att generera 3 till 5 distinkta sektioner.
  8. Använd biopsistans med diametern 1 mm för att skära en näthinneskiva från varje del av den tillplattade näthinnekoppen.
    OBS: Var försiktig så att näthinneskivorna stansas på lika avstånd från det optiska nervhuvudet.
  9. Använd tång för att överföra de förbelagda nätinsatserna till den dissekerande petriskålen. Med hjälp av två superfina ögonfransborstar placerar du näthinnans stansskiva på nätinsatsen. Näthinnans stansskiva placeras i mitten av nätinsatsen med ganglion cell lager sida ner och vidrör nätet och fotoreceptorskiktet uppåt.
    OBS: Ofta förblir vissa RPE-celler fästa vid fotoreceptorerna, och pigmenteringen av dessa celler kan användas som en indikator på näthinnans stansdiskorientering.

5. Ladda sensorpatroninsprutningsportarna och kalibreringen

  1. Ta ut den hydratiserade sensorkassettplattan från inkubatorn på 37 °C. Ta bort Hydro-Booster-locket och sätt tillbaka sensorpatronen på verktygsplattan.
  2. Ladda önskad volym av lösningar för injektionsblandningar i lämpliga portar. Håll pipettens spets i 45 ° vinkel. För in pipettspetsen halvvägs in i en injektionsport med spetsens avfasning mot injektionsportens motsatta vägg och lasta försiktigt in föreningen i varje port. Undvik att införa luftbubblor.
  3. Se instrumentets användarhandbok för volymen av den sammansatta föreningen som lastats i varje injektionsport för en specifik analys. I de experiment som presenteras i detta dokument lastas 68 μL av arbetslagret 50 μM Bam15 (för mitokondriell stressanalys) eller 68 μL av arbetslagret 10 μM Rot/AA (för glykolytisk hastighetsanalys) i port A. 75 μL av 10 μM Rot/AA arbetslager (för mitokondriell stressanalys) eller 75 μL av 500 mM 2-DG arbetslager (för glykolytisk hastighetsanalys) lastas i port B.
  4. Ladda insprutningsportar för alla brunnar på plattan inklusive bakgrundskorrigeringsbrunnar och tomma brunnar för att säkerställa korrekt injektion. Ladda respektive sammansatt lösning i varje port för bakgrundskorrigeringsbrunnarna. Analysmedium kan ersättas, istället för den sammansatta lösningen, i var och en av bankbrunnarnas portar.
  5. Placera den laddade sensorpatronplattan, med locket av, i analysatorn för att starta kalibreringen innan analysen körs. När kalibreringen är över pausas programmet automatiskt i väntan på att verktygsplattan byts ut mot holmefångstplattan som innehåller näthinneslag.

6. Ladda fångstplattan för holme och starta analyskörning

  1. Tillsätt 607 μL av analysmediet till varje brunn på holmefångstplattan
  2. Använd tång för att ta tag i kanten på nätinsatsen som innehåller näthinnestansskivor ovanpå och ta ut den från Petri-skålen. Knacka lätt på botten av nätinsatsen på en absorberande torka vävnad för att ta bort extra vätska och lägg den i brunnen på holmeavfångningsplattan. Upprepa detta steg tills alla nätinsatser med näthinneslag placeras i holmefångstplattan. Fyll bakgrundskorrigeringsbrunnar och tomma brunnar med tomma nätinsatser.
  3. Använd två Graefe-tångar för att försiktigt och försiktigt trycka på kanten på varje nätinsats och se till att dessa är ordentligt insatta längst ner på holmefångstplattan.
  4. Placera den laddade holmefångstplattan i en 37 °C inkubator i 5 minuter för uppvärmning.
  5. Mata ut bruksplattan när kalibreringen är klar och byt ut den mot en och ersätt den mot holmefångstplattan, med locket av, innehållande näthinneslag.
  6. Återuppta analyskörningen.

7. Kör avslutning och datalagring

  1. När körningen är klar, mata ut sensorpatronen och holmefångstplattan som innehåller näthinneslag. Data sparas automatiskt som ASYR-fil.
  2. Använd den associerade dataanalysprogramvaran för att visa och analysera data enligt tillverkarens användarhandbok26.
  3. Använd funktionen Exportera för att exportera XSLX-filen av data, som kan visas och analyseras med hjälp av kalkylbladsprogram.

8. Spara retinal punch provet

  1. Efter analysen, ta ut plattan från maskinen, ta bort sensorpatronen och ta försiktigt bort analysmediet från varje brunn med hjälp av en pipett.
  2. Applicera tillbaka locket och försegla sidorna av plattan med parafilmremsan.
  3. Förvara vid -80 °C.
  4. För normalisering, kvantifiera det totala DNA- eller proteininnehållet i stansen i varje brunn.

9. Dataanalys

  1. Mitokondriell stressanalys
    OBS: Det uppmätta OCR-värdet (totalOCR) representerar den totala syreförbrukningen i vävnaden. Efter Bam15 (uncoupler) injektion ökar OCR från basal nivå (totalOCRbasal) till den maximala nivån (totalOCRmax) och går ner efter Rot/AA injektion. Det återstående OCR-värdet efter Rot/AA-injektion (totalOCRRot/AA) representerar icke-mitokondriell syreförbrukning.
    1. Beräkna mitokondrirelaterad syreförbrukning som:
      Equation 1 (Eq. 1) 28 År
    2. Beräkna mitokondriell reservkapacitet (MRC) som:
      Equation 2 (Eq. 2) 29 År
      OBS: Den sista avläsningen bland de 5 mätningarna före Bam15 injektionen tas som "basalt" värde (för totalOCRbasal och mitoOCRbasal). Den högsta avläsningen bland de 4 mätningarna efter Bam15 injektion används som "max" värde (för totalOCRmax och mitoOCRmax). Den lägsta avläsningen bland de 4 mätningarna efter Rot/AA-injektionen används som totalOCRRot/AA.
  2. Glykolytisk kursanalys
    OBS: Det uppmätta ECAR-värdet (totalECAR) representerar den totala försurningen av mediet genom vävnadens metaboliska aktivitet. I allmänhet resulterar försurning av den extracellulära mikromiljön främst genom extrudering av den glykolytiska produkten, laktat. Katabolism av substrat i mitokondriell TCA cykel resulterar i produktion av CO2, vilket också försurar det extracellulära mediet genom hydrering till bikarbonat.
    1. Substract mitokondriell bidrog medium försurning (mitoECAR) från totalECAR för att erhålla glycoECAR.
      Equation 3 (Eq. 3) 28 År
      OBS: Mitokondriell andning och TCA cykel är starkt kopplade processer. Produktion av CO2 från mitokondrier är en funktion av oxphoshastigheten, som är mätbar med mitoOCR.
    2. Beräkna mitoECAR som:
      Equation 4 (Eq. 4) 28 År
      där CCF (CO2 Contribution Factor) är ett empiriskt beräknat kvotvärde som representerar mängden H+-bidrag från CO2-medierad försurning jämfört med varje O2-förbrukning från OXPHOS. CCF för detta system är förutbestämt till 0,6028. Noggrann mätning av medelförsurning bestäms av mediets buffertkapacitet, instrumentets pH-sensors känslighet och den effektiva mätkammarens kapacitet. Här är BF (Buffer Factor) en parameter för den experimentella in situ-buffertkapaciteten, som representerar mängden H+ eller OH- som läggs till i den effektiva mätkammaren för att ändra pH-nivån med 1 enhet. När anpassat analysmedium används kan BF bestämmas genom titrering av kända mängder syra i analysmediet enligt buffertfaktorprotokollet30. Seahorse DMEM medium pH 7.4 som används i detta protokoll har en förutbestämd BF på 2,60 mmol H+/L/pH. Den fångstplatta för holme som används i detta protokoll har en Volmicrochamber = 16,6 μL31. Volymskalningsfaktorn, Kvol, är en empiriskt bestämd konstant. Kvol-värdet är inte tillgängligt för fångstplattan för holme men kan beräknas utifrån värdet på mikroplattan28, med hänsyn till volymskillnaden i deras mikrochamber, till 0,41.
      OBS: Injektion av Rot/AA stänger av mitokondriell andning och tvingar vävnaden att byta till glykolys för ATP-produktion, vilket leder till högre laktatprofilering och en ökning av ECAR-mätningen. Glykolys upphör med 2- GD injektion, och den återstående ECAR mätningen avslöjar icke-glykolytisk och icke-mitokondriell försurning av medium.
    3. Beräkna den glykolytiska reservkapaciteten (GRC) som:
      Equation 5 (Eq. 5) 32
      där den sista avläsningen bland de 5 mätningarna före Rot/AA-injektionen tas som "basalt" värde (glycoECARbasal). Den högsta avläsningen bland de 4 mätningarna efter Rot/AA-injektion används som "max" värde (glycoECARmax). Den lägsta avläsningen bland de 4 mätningarna efter 2-GD injektion används som glycoECAR2-DG.
  3. Normalisering
    OBS: Normalisering är viktigt vid jämförelse av avläsningar från näthinnevävnader i olika åldersgrupper eller mellan vilda och patologiska/degenerativa prover, som kan skilja sig åt i celltal.
    1. Använd kommersiellt tillgängliga kit för att bedöma DNA-innehållet i varje näthinnestansskiva33,34.
    2. Alternativt kan du använda radioimmunoprecipitation assay buffer (RIPA buffert) för att extrahera totalt protein från näthinnestansen och använda proteininnehållet för normalisering.
      OBS: Ytan på en vuxen mus näthinna har tidigare fastställts vara cirka 20 mm2, och varje näthinna innehåller ~ 6,5 miljoner celler35. Därför är varje näthinneslag med diametern 1 mm ~1/25 av en enda näthinna och innehåller ~260K celler. Man kan hänvisa till dessa siffror när man jämför data från en näthinnestans med dem från andra vävnadsprover eller odlade celler,

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De data som rapporteras här är representativ mitokondriell stressanalys som visar OCR-spår (figur 1) och glykolytisk hastighetsanalys som visar OCR-spår och ECAR-spår (figur 2), som utfördes med ny dissekerade 1 mm retinal punch-skivor från 4 månader gamla transgena Nrl-L-EGFP-möss36 (C57B/L6 bakgrund). Dessa möss uttrycker GFP specifikt i stångfotoreceptorer utan att ändra normal retinal utveckling, histologi och fysiologi och har använts i stor utsträckning som vilda kontroller i retinal forskning. Två Nrl-L-GFP kullkamratmöss användes i de analyser som presenteras här. GFP som uttrycks i mössen Nrl-L-GFP stör inte mätningarna av OCR och ECAR i detta protokoll. Fem näthinne stansar togs från varje näthinnan. Tio av retinal stansar användes för mitokondriell stress analys och de andra 10 användes för glykolytisk hastighet analys. Seahorse XF DMEM medium, pH 7,4 (består med 6 mM glukos, 0,12 mM pyruvat och 0,5 mM glutamin) och Seahorse XFe24 Islet Capture plattor användes i experimenten. De representativa data som presenteras här erhölls med samma 1 mm diameter puncher men normaliserades inte med avseende på DNA/ proteinhalten.

I mitokondriell stressanalys injicerades uncoupler Bam1537 efter att ha fastställt OCR-baslinjen, vilket ledde till förbättrad OCR till den maximala nivån. Rotenon och Antimycin A injicerades för att hämma mitokondriernas andning vid komplex I respektive komplex III, vilket resulterade i att OCR sjönk till den minimala nivån (figur 1). Skillnaden mellan den maximala nivån av OCR och den sista mätningen av den basala OCR-nivån återspeglar mitokondriell reservkapacitet (MRC). MRC beräknas vara 19,2% ±3,4% med hjälp av Eq. 2, i överensstämmelse med tidigare uppmätta MRC-värden i näthinnor på ~ 3 månader gamla Nrl-L-EGFP-möss med den tidigare generationen Seahorse XF24 analyzer22,38.

I den glykolytiska frekvensanalysen injicerades Rotenone och Antimycin A efter att baslinjen fastställts för den totala ECAR. Med produktionen av ATP från OXPHOS stoppad, vävnaden tvingas förlita sig på glykolys för energi, och en ökning av den extracellulära frisättningen av laktat driver ECAR till den maximala nivån. Glykolys upphör genom injektion av 2-DG, som konkurrerar med glukos för hexokinasbindning, vilket gör att ECAR sjunker till miniminivån (figur 2). Mitokondrier bidrog ECAR (mitoECAR) kan beräknas utifrån mitoOCR-värdet (Eq. 4). Glykolys bidrog ECAR glycoECAR beräknas och plottas genom att subtrahera mitoECAR från totalECAR. Skillnaden mellan maximal nivå av glycoECAR och den senaste mätningen av glycoECAR basal nivå återspeglar glykolys reservkapaciteten (GRC). Här beräknas GRC vara 35,7% ± 3,4% med eq. 5.

Som en mycket glykolytisk vävnad står laktatproduktionen från näthinnan för en viktig källa till extracellulär försurning, vilket framgår av den lilla skillnaden av glycoECAR från totalECAR. Intressant nog platå ecar-mätningen inte platå omedelbart efter Rot/AA-injektionen utan sjunker efter den andra mätningen. Näthinnestansskivan är ett intakt ex vivo-system som består av olika celltyper, inklusive Müller glia-cellerna, som är kända för att ta emot laktat (glykolysslutprodukt) som frigörs från fotoreceptorerna6. En minskning av ECAR-mätningen efter Rot/AA-injektionen förklaras därför sannolikt av ökat avlägsnande av laktat från det intercellulära utrymmet, vilket saktar ner/förhindrar dess frisättning i mediet.

Figure 1
Figur 1: Mitokondriell stressanalys. Den ritade grafen visar OCR spår från 1 mm retinal stansskivor i Seahorse XF DMEM buffert, kompletterad med 6 mM glukos, 0,12 mM pyruvat och 0,5 mM glutamin. Varje datapunkt representerar medelvärdet av mätningar från 10 brunnar. Felfält = standardfel. MRC beräknas vara 19,2% ±3,4%. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 2
Figur 2: Glykolytisk hastighetsanalys. Den ritade grafen visar den uppmätta OCR-spårningen, ECAR-spår (totalECAR) och den beräknade glykolysen bidrog ECAR (glycoECAR) från 1 mm retinal stansskivor i Seahorse XF DMEM buffert kompletterad med 6 mM glukos, 0,12 mM pyruvat och 0,5 mM glutamin. Varje datapunkt representerar medelvärdet av mätningar från 10 brunnar. Felfält = standardfel. GRC beräknas till 35,7% ±3,4% Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Här finns detaljerade instruktioner för att utföra mikroplate-baserade analyser av mitokondriell andning och glykolysaktivitet med hjälp av ex vivo, ny dissekerade näthinnestansskivor. Protokollet har optimerats för att: 1) säkerställa användningen av ett lämpligt analysmedium för ex vivo retinal vävnad; 2) använda rätt storlek på näthinnestansskivor för att erhålla OCR- och ECAR-avläsningar som faller inom maskinens optimala detekteringsområde; 3) beläggning av nätinsatser för att förbättra fastheten hos näthinnestans för stabil avläsning under mätcykeln; 4) användning av optimal koncentration av varje injicerad läkemedelsförening; och 5) säkerställa förändrad cykellängd för att nå en platå av mitokondriella tillstånd vid varje steg. Reagenserna och protokollet har ändrats från en tidigare publicerad version23 för att anpassa sig till den nya generationen Seahorse XFe24-maskinen. I stället för Ames buffert som användes i det tidigare protokollet23 används här ett grundläggande Seahorse DMEM-medium för att tillåta den anpassade konstitutionen för bränslekälla genom att tillsätta glukos, glutamin och pyruvat separat. Detta gör det också möjligt att utföra olika analyser där ett specifikt bränslesubstrat levereras eller berövas från mediet. I de analyser som presenteras här utgjordes mediet till samma koncentration av glukos (6 mM), glutamin (0,5 mM) och pyruvat (0,12 mM) som i Ames buffert, som har visat sig vara lämpliga för näthinnevävnad. En annan fördel med detta medium (med 5 mM HEPES) jämfört med Ames buffert (med 22,6 mM NaHCO3) är dess låga buffertkapacitet, vilket säkerställer känslig och noggrann mätning av ECAR28.

Både mitokondriell stress och glykolytiska hastighetsanalyser kan utföras enligt protokollet som beskrivs här med hög precision, vilket framgår av de snäva standardfelvärdena mellan replikerande brunnar. Det är dock värt att notera de faktorer som kan bidra till datavariation. Undvik celldöd i näthinnevävnad. Hela dissekeringsprocessen bör utföras i iskall 1x PBS, och processen från enucleation av ögon till att sätta holmefångstplatta som innehåller näthinnestansen i maskinen bör inte överstiga 2 timmar. Försiktighet bör iakttas under dissekeringen av näthinnan kopp för att undvika skador på näthinnan vävnad, och slag bör inte tas från områden som skadats av dissekering. Ny, vass biopsistans bör användas i varje experiment och byta stansare när kanten är tråkig eller böjd för att säkerställa konsistens och noggrannhet vid skärning av näthinneslag med 1 mm diameter. Försök att få näthinneskivorna stansade på samma sätt från synnervens huvud för att undvika regionala variationer (centrum kontra perifert). Efter analysen, kontrollera varje brunn för eventuella tecken på näthinnan stans avskild från mesh insatsen. När en näthinnestans har dålig vidhäftning på meshinsats eller lossnar under mätningen, kommer avståndet från sensersond till vävnaden att förändras, vilket påverkar avläsningarna. Utelämna data från sådana brunnar med lossnad näthinneslag.

Mätning av realtids mitokondriell metabolism i intakt retinal vävnad har breda tillämpningar och kan ge användbar information för olika studier. Dessa analyser har använts för att mäta mitokondriell andning i näthinnevävnader från möss med olika genetisk bakgrund för att avslöja deras inneboende skillnad i mitokondriell aktivitet39,40. Det användes också för att studera förändringar i mitokondriell energimetabolism under åldrandet av näthinnan38. Genom att tillhandahålla olika bränslesubstrat och använda olika hämmare som riktar sig mot olika metaboliska vägar, ger det insikter om cellens/ vävnadens preferens på vissa bränslekällor22,38. Dessutom kan jämförelse på OCR och MRC mellan vilda mus- och musmodeller av ärvd retinal degeneration ge bevis på mitokondriella defekter i degenererande näthinnan22.

Det finns begränsningar för denna teknik. Den fångstplatta för holme som används i dessa analyser innehåller endast 24 brunnar; Därför kan den bara tillhandahålla analys av mellanflödet. Datakvaliteten från denna metod är beroende av kvaliteten på näthinnestansskivor och cellernas livskraft. Retinal dissekering och retinal punch disks förberedelse är också en tidskrävande process, vilket gör det mindre genomförbart att hög genomströmning analys på levande ex vivo retinal vävnader även när 96-brunnsplattor finns tillgängliga. Jämfört med ett monolager av odlade celler påverkar penetration av läkemedelsförening i näthinnevävnaden också dataavläsning. Dessutom representerar de uppmätta OCR- och ECAR-värdena den totala prestandan hos hela vävnaden, som består av många olika celltyper. därför måste man överväga förhållandet och interaktioner mellan olika neuronala och gliaceller i näthinnan medan man tolkar data. Särskilda experimentella konstruktioner bör genomföras genom anpassning till varje projekt. Det rekommenderas att man innehåller 3 till 5 näthinneslag (från samma öga eller samma mus) som tekniska replikat och använder prover från 3 eller fler möss som biologiska replikat.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöds av Intramural Research Program vid National Eye Institute (ZIAEY000450 och ZIAEY000546).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1X PBS Thermo Fisher 14190-144
2-Deoxy glucose (2-DG), 500 mM stock solution Sigma D6134 Dissolve in Seahorse XF DMEM medium, prepare ahead of time
30-gauge needle BD Precision Glide 305106
Antimycin A, 10 mM stock solution Sigma A8674 Dissolve in DMSO, prepare ahead of time
Bam15, 10 mM stock solution TimTec ST056388 Dissolve in DMSO, prepare ahead of time
Biopsy puncher, 1 mm Integra Miltex 33-31AA
Cell-Tak Corning Life Sciences CB40240
CO2 asphyxiation chamber
Dissection forceps-Dumont #5 Fine Science Tools 11251-10 Stright tip
Dissection forceps-Dumont #7 Fine Science Tools 11274-20 Curved tip
Dissection microscope
DMSO Sigma D2438
Graefe forceps Fine Science Tools 11051-10 Curved, Serrated tip
Microscissors Fine Science Tools 15004-08 Curved tip
NaOH solution, 1 M Sigma-Aldrich S8263 Aqueous solution, prepare ahead of time
Rotenone, 10 mM stock solution Sigma R8875 Dissolve in DMSO, prepare ahead of time
Seahorse calibration medium Agilent 100840-000
Seahorse XF 1.0 M glucose Agilent 103577-100
Seahorse XF 100 mM pyruvate Agilent 103578-100
Seahorse XF 200 mM glutamine Agilent 103579-100
Seahorse XF DMEM medium Agilent 103575-100 pH 7.4, with 5 mM HEPES
Seahorse XFe24 Islet Capture FluxPak Agilent 103518-100 Containing Sensor Cartridge and Islet Capture microplate
Seahorse XFe24, Extra Cellular Flux Analyzer Agilent
Sodium bicarbonate solution, 0.1 M Sigma-Aldrich S5761 Aqueous solution, prepare ahead of time
Superfine eyelash brush Ted Pella 113

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: In sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
  2. Wong-Riley, M. T. Energy metabolism of the visual system. Eye Brain. 2, 99-116 (2010).
  3. Yu, D. Y., Cringle, S. J. Oxygen distribution and consumption within the retina in vascularised and avascular retinas and in animal models of retinal disease. Progress in Retina and Eye Research. 20, 175-208 (2001).
  4. Barot, M., Gokulgandhi, M. R., Mitra, A. K. Mitochondrial dysfunction in retinal diseases. Current Eye Research. 36 (12), 1069-1077 (2011).
  5. Joyal, J. S., Gantner, M. L., Smith, L. E. H. Retinal energy demands control vascular supply of the retina in development and disease: The role of neuronal lipid and glucose metabolism. Progress in Retina and Eye Research. 64, 131-156 (2018).
  6. Hurley, J. B., Lindsay, K. J., Du, J. Glucose, lactate, and shuttling of metabolites in vertebrate retinas. Journal of Neuroscience Research. 93 (7), 1079-1092 (2015).
  7. Haydinger, C. D., Kittipassorn, T., Peet, D. J. Power to see-Drivers of aerobic glycolysis in the mammalian retina: A review. Clinical and Experimental Ophthalmology. 48 (8), 1057-1071 (2020).
  8. Wright, A. F., et al. Lifespan and mitochondrial control of neurodegeneration. Nature Genetics. 36, 1153-1158 (2004).
  9. Bossy-Wetzel, E., Schwarzenbacher, R., Lipton, S. A. Molecular pathways to neurodegeneration. Nature Medicine. 10, Suppl 2-9 (2004).
  10. Leveillard, T., Philp, N. J., Sennlaub, F. Is retinal metabolic dysfunction at the center of the pathogenesis of age-related macular degeneration. International Journal of Molecular Sciences. 20 (3), (2019).
  11. Vlachantoni, D., et al. Evidence of severe mitochondrial oxidative stress and a protective effect of low oxygen in mouse models of inherited photoreceptor degeneration. Human Molecular Genetics. 20 (2), 322-335 (2011).
  12. Grenell, A., et al. Loss of MPC1 reprograms retinal metabolism to impair visual function. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 116 (9), 3530-3535 (2019).
  13. Wright, A. F., Chakarova, C. F., Abd El-Aziz, M. M., Bhattacharya, S. S. Photoreceptor degeneration: genetic and mechanistic dissection of a complex trait. Nature Reviews in Genetics. 11 (4), 273-284 (2010).
  14. Jarrett, S. G., Boulton, M. E. Consequences of oxidative stress in age-related macular degeneration. Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 399-417 (2012).
  15. Rozing, M., et al. Age-related macular degeneration: A two-level model hypothesis. Progress in Retina Eye Research. 76, 100825 (2020).
  16. Yokosako, K., et al. Glycolysis in patients with age-related macular degeneration. Open Ophthalmology Journal. 8, 39-47 (2014).
  17. Bek, T. Mitochondrial dysfunction and diabetic retinopathy. Mitochondrion. 36, 4-6 (2017).
  18. Yumnamcha, T., Guerra, M., Singh, L. P., Ibrahim, A. S. Metabolic dysregulation and neurovascular dysfunction in diabetic retinopathy. Antioxidants. 9 (12), Basel. (2020).
  19. Futterman, S., Kinoshita, J. H. Metabolism of the retina. I. Respiration of cattle retina. Journal of Biological Chemistry. 234 (4), 723-726 (1959).
  20. Linsenmeier, R. A. Effects of light and darkness on oxygen distribution and consumption in the cat retina. Journal of General Physiology. 88 (4), 521-542 (1986).
  21. Medrano, C. J., Fox, D. A. Oxygen consumption in the rat outer and inner retina: light- and pharmacologically-induced inhibition. Experiments in Eye Research. 61 (3), 273-284 (1995).
  22. Kooragayala, K. Quantification of oxygen consumption in retina ex vivo demonstrates limited reserve capacity of photoreceptor mitochondria. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 56 (13), 8428-8436 (2015).
  23. Adlakha, Y. K., Swaroop, A. Determination of mitochondrial oxygen consumption in the retina ex vivo: applications for retinal disease. Methods in Molecular Biology. 1753, 167-177 (2018).
  24. Agilent Mitocondrial stress test user guide. , Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/XF_Cell_Mito_Stress_Test_Kit_User_Guide.pdf (2021).
  25. Agilent Glycolytic rate assay user guide. , Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/103344-400.pdf (2021).
  26. Agilent wave 2.6 user guide. , Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/S7894-10000_Rev_C_Wave_2_6_User_Guide.pdf (2021).
  27. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals. , Available from: https://www.avma.org/sites/default/files/2020-01/2020-Euthanasia-Final-1-17-20.pdf (2021).
  28. Improving Quantification of Cellular Glycolytic Rate Using Agilent Seahorse XF Technology. , Available from: https://www.agilent.com/cs/library/whitepaper/public/whitepaper-improve-quantification-of-cellular-glycolytic-rate-cell-analysis-5991-7894en-agilent.pdf (2021).
  29. Report Generator User Guide Agilent Seahorse XF Cell Mito Stress Test. , Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/Report_Generator_User_Guide_Seahorse_XF_Cell_Mito_Stress_Test_Single_File.pdf (2021).
  30. Agilent Seahorse XF Buffer Factor Protocol. , Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/usermanual-xf-buffer-factor-protocol-cell-analysis-S7888-10010en-agilent.pdf (2021).
  31. Agilent sensor cartridges and cell culture microplates. , Available from: https://www.agilent.com/cs/library/brochures/5991-8657EN_seahorse_plastics_brochure.pdf (2021).
  32. Agilent Seahorse XF Glycolysis Stress Test Kit User Guide. , Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/XF_Glycolysis_Stress_Test_Kit_User_Guide.pdf (2021).
  33. Fan, Y. Y. A bioassay to measure energy metabolism in mouse colonic crypts, organoids, and sorted stem cells. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 309, 1-9 (2015).
  34. Huang, L., et al. Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell- and patient-derived tumor organoids. Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).
  35. Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. The major cell populations of the mouse retina. Journal of Neuroscience. 18 (21), 8936-8946 (1998).
  36. Akimoto, M., et al. Targeting of GFP to newborn rods by Nrl promoter and temporal expression profiling of flow-sorted photoreceptors. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 103 (10), 3890-3895 (2006).
  37. Kenwood, B. M., et al. Identification of a novel mitochondrial uncoupler that does not depolarize the plasma membrane. Molecular Metabolism. 3 (2), 114-123 (2014).
  38. Corso-Diaz, X., et al. Genome-wide profiling identifies DNA methylation signatures of aging in rod photoreceptors associated with alterations in energy metabolism. Cell Reports. 31 (3), 107525 (2020).
  39. Berkowitz, B. A., et al. Mitochondrial respiration in outer retina contributes to light-evoked increase in hydration in vivo. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 59 (15), 5957-5964 (2018).
  40. Joyal, J. S., et al. Retinal lipid and glucose metabolism dictates angiogenesis through the lipid sensor Ffar1. Nature Medicine. 22 (4), 439-445 (2016).

Tags

Neurovetenskap nummer 174
Bestämning av mitokondriell andning och glykolys i <em>ex vivo</em> retinal vävnadsprover
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jiang, K., Nellissery, J., Swaroop,… More

Jiang, K., Nellissery, J., Swaroop, A. Determination of Mitochondrial Respiration and Glycolysis in Ex Vivo Retinal Tissue Samples. J. Vis. Exp. (174), e62914, doi:10.3791/62914 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter