Summary
이 프로토콜은 마우스에서 프라이밍 된 마이코 박테리아 포도막염 (PMU)을 유도하는 단계를 설명합니다. 이 방법은 마우스 모델 시스템에서 신뢰할 수 있고 강력한 안구 염증을 생성하는 데 도움이 되는 단계를 간략하게 설명합니다. 이 프로토콜을 사용하여 면역학, 전사 및 단백질체학 분석을 통한 추가 평가를 위해 단일 동물에서 포도막 눈과 염증이 없는 동료 눈을 생성했습니다.
Abstract
'포도막염'이라는 용어는 모두 안내 내 염증을 특징으로하는 이질적인 일련의 상태를 설명합니다. 대체로 포도막염은 병인학에 의해 정의됩니다 : 감염 또는자가 면역. 감염성 포도막염은 적절한 항균제로 치료해야 하는 반면, 자가면역 포도막염은 코르티코스테로이드 또는 기타 면역억제제로 치료해야 합니다. 감염 후 포도막염은 초기 감염 후 면역 후유증을 조절하기 위해 코르티코스테로이드가 필요한 만성 포도막염의 한 형태입니다. 결핵균 (Mtb) 감염과 관련된 포도막염은 잘 알려진 형태의 감염 후 포도막염이지만 질병의 메커니즘은 완전히 이해되지 않았습니다. mTB 감염 후 만성 안구 염증을 자극하는 데 마이코박테리아 항원과 선천성 리간드가 하는 역할을 이해하기 위해 마우스에 사용하기 위해 프라이밍된 마이코박테리아 포도막염(PMU) 모델이 개발되었습니다. 이 원고는 PMU를 생성하고 컬러 안저 및 광학 간섭 단층 촬영 (OCT) 영상을 사용하여 염증의 임상 경과를 모니터링하는 방법을 설명합니다. PMU는 열 사멸 마이코박테리아 추출물로 면역화한 후 7일 후 동일한 추출물을 한쪽 눈에 유리체내 주사하여 유도됩니다. 안구 염증은 생체 내 이미징을 사용하여 종단적으로 모니터링한 다음 조직학, 유세포분석, 사이토카인 분석, qPCR 또는 mRNA 시퀀싱을 포함한 광범위한 분석을 위한 샘플 수집을 수행합니다. PMU의 마우스 모델은 mTB에 대한 안구 반응, 만성 포도막염의 메커니즘을 연구하고 새로운 항염증 요법의 전임상 효과 테스트에 유용한 새로운 도구입니다.
Introduction
용어 '포도막염'은 모두 안구내 염증을 특징으로 하는 이질적인 일련의 상태를 설명합니다1. 포도막염의 동물 모델은 질병 메커니즘을 이해하고 새로운 치료법의 전임상 테스트에 중요합니다. 포도막염의 많은 동물 모델이 확립되었다2. 가장 광범위하게 연구 된 두 가지는 실험적 자가면역 포도막염(또는 포도막염; EAU) 및 내 독소 유발 포도막염 (EIU). EAU는 일반적으로 안구 항원을 이용한 면역화에 의해 생성되거나 AIRE 유전자 3,4가 없을 때 중심 내성이 중단될 때 자발적으로 발생할 수 있습니다. 모델의 다른 변이체는 이후상이한 포도막 생성 펩티드를 포함하도록 5,6,7로 개발되었다; 이것들은 광범위하게 검토되었습니다 8,9,10. EAU는 인간에서 Vogt-Koyanagi-Harada 병 및 조류 화상 맥락 망막염과 같은 T 세포 의존성자가 면역 포도막염의 형태에 대한 주요 모델입니다. EIU는 박테리아 지질 다당류 (LPS)의 전신 또는 국소 주사에 의해 생성됩니다 10,11. EIU는 선천성 면역 신호 전달 경로12의 활성화에 의해 생성되는 급성 포도막염의 모델로 사용되었습니다. 두 모델 모두 안구 면역학에 대한 현재의 이해에 중요한 역할을했지만 감염 후 만성 포도막염에 효과적인 모델은 아닙니다. 최근 마우스에서 확립 된 프라이밍 된 마이코 박테리아 포도막염 (PMU) 모델은 이제 이러한 형태의 포도막염13의 임상 적 및 세포 측면을 조사하고 평가하는 접근법을 제공합니다.
전 세계적으로 마이코박테리아 감염의 유병률이 높으며 2019년 세계보건기구(WHO)에서 보고한 1,000만 건 이상의 새로운 사례와 140만 명 이상의 사망자가 보고되었습니다14. 활동성 결핵 (TB) 감염의 폐외 증상은 포도막염을 포함하며 감염성 포도막염15,16의 잘 알려진 원인입니다. 결핵 관련 포도막염의 증상은 프로테아이며, 이는 직접적인 안구 감염뿐만 아니라 잘 이해되지 않은 면역 매개 염증17,18,19를 포함하는 질병의 여러 별개의 메커니즘을 반영할 가능성이 있습니다. 이러한 감염 후 후유증에 대해 제안된 메커니즘에는 망막 색소 상피(RPE)에서 파우시세균 감염의 지속성에 의해 자극되는 만성 염증 반응, 성공적으로 제거된 안구 감염으로부터 잔류 병원체 관련 분자 패턴(PAMP)의 존재에 의해 자극되는 만성 염증 반응, 분자 모방 또는 항원 과정을 통한 안구 항원에 대한 적응 면역 반응의 부적절한 활성화가 포함됩니다. 전신 결핵 감염으로 인한 확산20,21,22,23.
만성 감염 후 포도막염에 대한 더 나은 기계론적 이해를 얻고 질병 시작에서 마이코박테리아 항원의 역할을 연구하기 위해 PMU 모델이 마우스13,24에서 사용하도록 개발되었습니다. 따라서, 염증을 유도하기 위해, 마우스는 먼저 전신 감염을 모방하기 위해 열 사멸된 결핵균 H37Ra 균주로부터 항원의 피하 주사를 받고, 이어서 7일 후 국소 안구 감염을 모방하기 위해 왼쪽 또는 오른쪽 눈에 투여된 동일한 항원의 유리체내 주사를 받는다. 이어지는 포도막염의 강도 및 지속 기간은 종방향 생체 내 광학 간섭 단층 촬영 (OCT) 및 눈의 기저 영상화에 의해 모니터링된다(25). PMU는 유리체염, 혈관주위 망막 염증 및 망막외 손상의 초점 영역을 동반한 만성 T 세포 우성 후방 포도막염으로 발전하는 급성 골수성 우성 범포도막염을 특징으로 합니다26. 눈의 후방 부분에서 육아 종성 염증의 존재는 PMU 모델이 과거 Mtb 감염의 면역 학적 증거가있는 환자에서 볼 수있는 일부 형태의 전방 (육아 종성 및 비 육아 종성) 및 중간 포도막염을 연구하는 데 사용될 수 있음을 시사합니다27. 또한 PMU 모델에 사용 된 열 사멸 Mtb 성분은 항 결핵 요법 (ATT)28에 반응하는 안구 결핵 환자의 재발 성 포도막염 측면의 기저에있는 면역 반응을 유발하는 것으로 제안되었습니다. EAU 및 EIU와 비교할 때 질병 개시 및 염증 과정의 차이로 인해 PMU는 안구 항원 면역에 의존하지 않고 만성 포도막염 환자의 질병 메커니즘을 밝히는 데 도움이 될 수 있는 포도막염의 새로운 동물 모델을 나타냅니다. 이 프로토콜은 PMU를 생성하고, 염증의 임상 경과를 모니터링하고, 유세포 분석을 통한 사후 분석을 위한 안구 샘플을 수집하는 방법을 간략하게 설명합니다.
Protocol
수행 된 모든 절차는 워싱턴 대학의 동물 관리 및 사용위원회 (동물 연구 프로토콜 # 4481-02) 또는 영국 내무부 라이센스 (PPL 30/3281) 및 브리스톨 대학 윤리 검토 그룹에 따라 현지에서 승인되었습니다. 두 기관에서 수행 된 실험은 안과 및 시각 연구에서 동물 사용에 대한 시력 및 안과 연구 협회 (ARVO) 성명서와 일치했습니다. PMU는 6-10주령의 C57BL/6J 마우스에서 생성되었고; 모든 마우스는 포도막염 유도시에 적어도 18g의 무게를 측정하였고, Crb1 유전자29의 RD8 돌연변이에 대해 음성으로 확인되었다. 마우스는 특정 병원체가없는 조건에서 표준 차우 및 약용 물 (아세트 아미노펜 200-300 mg / kg / day)로 유지되었습니다. 동물 안락사는 표준 이산화탄소 흡입 방법30을 사용하여 수행하였다.
1. 피하 주사를위한 항원 제제
- Mtb H37Ra 분말과의 흡입 또는 피부 접촉을 방지하기 위해 화학 흄 후드 내부에서이 섹션의 모든 절차를 수행하십시오. 완전한 프로인트의 보조제(일반적으로 BSL-1)에 대한 기관 정책에 따라 처리하십시오. 여기에는 내화학성 장갑, 보안경 및 보호복(실험실 코트) 사용이 포함됩니다.
- 실험 동물에 도입 될 시약의 오염을 방지하기 위해 우수한 멸균 기술을 사용하십시오.
- 5mL 미세 원심분리 튜브에서 동결건조되고 열이 사멸된 M. 결핵 H37Ra 분말 5mg과 차가운 PBS 2.5mL를 혼합하여 PBS에서 Mtb 현탁액을 만듭니다. 30초 동안 한 번 소용돌이친 다음 얼음 위에 놓습니다.
- PBS에서 H37Ra의 미세한 현탁액을 생성하려면 5분 동안 얼음 위에서 현탁액을 초음파 처리합니다.
- 변환기 장치의 본체를 풀고 70%(v/v) 알코올 면봉으로 프로브를 청소합니다.
- 초음파 처리기를 켜고 전원 제어 손잡이를 돌려 전원 설정을 4로 조정하고 프로브의 팁을 PBS 함유 마이코박테리아 분말에 담그십시오. 프로브 팁이 샘플 깊이의 절반 이상에 잠겨 있고 프로브 팁이 미세 원심분리 튜브의 벽에 닿지 않는지 확인하십시오.
- 혼합물을 얼음에 30 초 동안 초음파 처리하고 30 초 동안 일시 중지하고 총 5 분 동안 반복하여 액체를 가열하지 않고 분말을 균일 한 현탁액으로 완전히 분산시킵니다.
- 혼합물에 2.5mL의 프로인트 불완전 보조제를 첨가하고 에멀젼이 치약과 같은 일관성을 형성 할 때까지 얼음에서 초음파 처리 과정을 반복하십시오.
- 컨트롤 노브를 사용하여 전원을 0으로 설정하고 장치를 꺼서 초음파 처리를 종료합니다. 서스펜션에서 팁을 제거하고 알코올 면봉으로 프로브를 닦습니다.
- 항원 에멀젼을 4°C에서 보관한다. 에멀젼의 배치를 만들면 실험 전반에 걸쳐 일관성을 보장하는 데 도움이 됩니다. 에멀젼은 4°C에서 최대 3개월 동안 보관할 수 있습니다.
2. 피하 주사
- 유리체 내 주사 (-7 일로 지정) 일주일 전에 피하 주사를 수행하십시오.
- 1mL 주사기(바늘이 부착되지 않음)에 마이코박테리아 에멀젼을 넣습니다. 에멀젼의 점도와 불투명도로 인해보기 어려운 기포가 주사기를 채울 수 있습니다.
- 주사기의 기포를 방지하려면 0.2-0.3mL의 에멀젼을 넣은 후 주사기를 뒤집고(팁이 위를 향함) 카운터 가장자리에서 주사기를 반복해서 가볍게 두드려 기포를 표면으로 가져옵니다.
- 주사기에서 공기를 배출하고 주사기를 계속 채우십시오. 반전하고 채워질 때까지 간헐적으로 탭합니다.
- 주사기에 25G 바늘을 놓고 바늘을 채우기 위해 에멀젼을 전진시킵니다. 사용할 때까지 주사기를 얼음 위에 보관하십시오.
- 피하 주사를 안전하게 수행하기 위해, 마우스를 마취하거나 동물 뒷부분(31)에 쉽게 접근할 수 있는 인도적 구속 방법을 이용한다.
- 피하 주사를 위해 마취하려면 동물을 이소플루란 유도 챔버(유도의 경우 3%-4%, 유지의 경우 1%-3%)에 두십시오. 마취되면 마우스의 호흡 속도가 느리고 호흡 곤란의 징후가 없는지 확인하십시오.
- 엉덩이의 등쪽 표면 또는 사타구니 림프절 부위에 인접한 다리의 복부 표면에 피하 주사를하십시오.
- 근육에 주입되지 않도록 바늘을 조심스럽게 삽입하십시오. 0.05mL의 Mtb 에멀젼을 피하 공간에 주입합니다. 두꺼운 에멀젼이 완전히 주입 될 수 있도록 바늘을 즉시 제거하지 마십시오.
- 동물 당 총 0.1 mL에 대해 왼쪽과 오른쪽 양쪽에 주사를 반복하십시오.
- 마취 된 경우 완전히 회복 될 때까지 마우스를 따뜻한 가열 패드에 놓습니다. 흉골 누운 자세를 유지하기에 충분한 의식을 회복 할 때까지 마우스를 방치하지 마십시오.
- 완전히 회복되면 마우스를 케이지로 되돌리고 케이지 카드에 피하 주사 날짜를 표시하십시오.
- 항염증제가 포도막염 유도에 영향을 줄 수 있으므로 경구 용 아세트 아미노펜 (200mg / kg / 일)으로 진통제를 제공하지만 NSAID는 제공하지 마십시오.
3. 유리체내 주사를 위한 항원 스톡 제제
- 유리체내 Mtb 현탁액의 오염을 방지하기 위해 적절한 멸균 조건에서 이 섹션의 모든 절차를 수행하십시오.
- 유리체 내 현탁액을 만드십시오.
- 경증에서 중등도의 판포도막염을 유도하려면 1x PBS 1mL에 마이코박테리아 추출물 5mg을 추가하여 5mg/mL 농도로 유리체내 현탁액을 만듭니다.
- 중등도에서 중증의 판포도막염을 유도하려면 10mg의 마이코박테리아 추출물을 1mL의 1x PBS에 추가하여 10mg/mL 농도로 유리체내 현탁액을 만듭니다.
- 30초 동안 한 번 소용돌이친 다음 얼음 위에 놓습니다.
- PBS에서 H37Ra의 미세 현탁액을 생성하려면 단계 1.4에 설명된 대로 10분 동안 얼음 위에서 현탁액을 초음파 처리합니다. 이 스톡 용액을 100 μL 부피로 분취하여 -20°C에서 보관한다.
- 사용하기 전에 실온에서 해동하고 고온에서 1분 동안 와류를 일으키십시오. 동물 시설로 운송하는 동안 분취량을 얼음 위에 보관하십시오.
4. 0일째 유리체내 주사 시술
- 동물 준비
- 장착 된 검사 장갑을 착용하고 마우스를 저울에 올려 무게를 그램 단위로 얻습니다.
- 동물을 마취하기 위해 멸균수와 혼합 된 100mg / mL 케타민과 20mg / mL 자일 라진을 함유 한 용액 0.02mL / g의 복강 주사를하십시오. 대안적인 접근법은 ~1.5% 이소플루란(흡입)을 사용한 유도를 포함한다.
- 마우스가 잠들 때까지 약 2분 정도 기다린 다음 마우스를 보온 상자에 넣고 덮개를 덮습니다. 귀, 발가락 및 꼬리 꼬집음과 같은 통증 반사 테스트를 수행하여 절차32에 대한 마취 깊이를 평가합니다.
- 잠이 들면 0.5 % (v / v) 테트라 카인 1 방울로 각막을 마취하십시오. 마우스의 코 나 입 근처에 테트라 카인이 들어 가지 않도록하십시오. 10 초 후 여분의 액체를 두드리십시오.
참고: 홍채 확장 및 전방(AC) 시각화는 국소 마취를 시행할 때 개선되는 것으로 관찰되었으며, 이는 전신 및 국소 마취를 병용한 각막 반사 억제로 인해 개선되었기 때문일 수 있습니다. 그러나 원하는 경우 이 단계를 생략할 수 있습니다. - 2.5 % (v / v) 페닐에 프린 1 방울로 동공을 확장하십시오. 코나 입에 들어갈 수 있는 과도한 비말을 피하도록 주의하십시오. 2-3분 후 여분의 액체를 두드려 제거합니다.
- 안구 내염의 위험을 줄이려면 눈 표면과 주변 모발에 5 % 베타 딘 1 방울을 첨가하십시오. 눈에 2-3 분 동안 그대로 두십시오.
알림: 안구내염을 예방하기 위해 적절한 멸균 조건에서 이 섹션의 모든 절차를 수행하십시오. - 베타딘을 제거하고 하이프로멜로오스(0.3%) 또는 카보머 아이 젤 0.2% w/w)로 눈을 덮어 마취 시 건조함을 방지합니다. 이것은 또한 백내장 형성을 예방하는 데 도움이됩니다.
- 미세 주입 시스템 설정
- 마이크로실린지 펌프 컨트롤러와 주사기에 연결된 마이크로펌프를 사용하여 유리체내 주입을 수행한다(그림 1A-C). 또는 하위 섹션 33에 설명된 대로 Hamilton 주사기에 부착된 4.4G 바늘로 주사합니다.
- 34G 바늘을 주입 홀더에 연결하여 인젝터를 조립합니다. 주입 홀더의 앞쪽 끝에 있는 은색 나사 캡을 풀고 바늘을 홀더 본체에 반쯤 밀어 넣습니다. 은색 나사 캡 손가락을 단단히 조입니다.
- 4.2.4-4.2.5단계에서 설명한 대로 튜브를 사출 홀더에 연결합니다.
- 사출 홀더에 튜브를 삽입하려면 홀더 뒤쪽 끝에 있는 플라스틱 나사를 풀고 내부의 개스킷을 통해 튜브를 밀어 나사를 조입니다.
- 주입 중 튜브 손상을 방지하기 위해 튜브 끝과 약간의 간격을 유지하십시오. 그림 1C를 참조하십시오.
- 마이코박테리움 스톡 현탁액의 100 μL 분취량을 해동시킨다.
- 3 μL의 1 % 플루오 레신 나트륨 (AK-Fluor) 용액을 넣고 잘 와동시킵니다.
- 10 μL 주사기에 기포를 포함하지 않고 항원과 플루오레세인 혼합물을 넣습니다.
- 주사기에서 로딩 바늘을 제거하고 팁이 주사기 본체의 제로 마크에 도달할 때까지 은색 나사 캡 개스킷을 통해 튜브를 밀어 넣습니다.
- 튜브 끝이 원하는 위치에 올바르게 정렬되면 나사 캡 손가락을 단단히 조입니다.
- 주입 튜브를 통해 주사기의 용액을 플러시하여 시스템을 완전히 로드합니다. 그런 다음 4.2.8-4.2.11 단계를 반복하여 주사기를 다시로드하여 주입합니다.
- 로드된 주사기를 마이크로 펌프에 설치하려면 cl을 누르십시오.amp 마이크로 펌프 끝에 있는 해제 버튼을 눌러 주사기 클램프를 엽니다.
- 플런저의 캡을 마이크로 펌프의 뒤쪽 끝에 있는 플런저 캡 홀더에 놓습니다.
- 그런 다음 주사기 칼라를 칼라 스톱에 밀어 넣고 주사기 본체를 주사기 클램프에 밀어 넣습니다.
- cl을 풉니다.amp 버튼을 누르고 플런저 고정 나사를 조입니다. 그림 1D를 참조하십시오.
- 주입 홀더와 바늘을 정위 주입 장치의 o-cl을 통해 밀어 넣습니다. 이것은 사용자 지정 플랫폼입니다. 또는 주사기를 수동으로 잡고 배치 할 수 있습니다.
- 마이크로 시린지 펌프 컨트롤러의 주입량과 주입량 속도를 각각 40nL/s의 속도로 사이클당 500nL씩 주입하도록 설정합니다.
알림: 더 빠른 주입 속도를 사용할 수 있지만 바늘 위치 변경을 달성하기 전에 더 많은 역류가 발생할 수 있습니다. - 유리체 주사를 수행하기 전에 시스템이 올바르게 작동하는지 테스트하십시오.
알림: 주입 시스템이 올바르게 작동할 때 풋 페달 또는 컨트롤 패드를 사용하여 주입 주기를 활성화하면 플런저 캡 홀더가 눈에 띄게 움직이고 바늘 끝에 작은 녹색 액체 방울이 보입니다. 액체가 생성되지 않는 경우 추가 사이클을 활성화하거나 주사기를 세척하고 다시로드하십시오. - 눈을 주사하기 전에 95 % 에탄올 패드로 바늘을 부드럽게 닦으십시오.
- 유리체 내 주사 절차
- 마우스는 주입 절차를 수행하기 위해 정위 장치에 놓입니다.
- 마우스가 놓이는 스테이지/플랫폼은 표면에 2-3개의 종이 타월을 부착하여 따뜻하게 유지하십시오.
- 마우스를 플랫폼의 엎드린 위치에 놓습니다. 오른쪽 및 왼쪽 이어 바를 사용하여 동물의 머리를 부드럽게 고정하십시오. 그림 1E를 참조하십시오.
- 마우스를 배치하고 오른쪽 눈의 위쪽 비강이 보이도록 스코프 아래에 방향을 지정합니다.
- 30G 바늘을 사용하여 속눈썹을 옮기고 공막을 노출시킵니다. 윤부와 요골 혈관을 시각화하십시오.
- 멸균 된 30G 바늘을 사용하여 윤부 뒤쪽 1-2mm 공막에 가이드 구멍을 만드십시오.
- 주입 홀더에 부착 된 34G 바늘을 렌즈를 피할 수있는 각도로 가이드 구멍을 통해 눈에 삽입하되 바늘 끝을 유리체에 넣습니다.
- 마이크로 시린지 펌프 컨트롤러를 사용하여 1μL의 Mtb 추출물을 유리체에 조심스럽게 주입합니다. 지속적인 역류의 경우 적절한 용량 전달을 보장하기 위해 주입량을 1.5μL로 늘립니다.
알림: 가짜 대조군의 경우 1μL의 PBS를 동물의 눈에 주입하십시오. - 눈의 녹색 반사를 시각화하여 유리체 내 배치를 확인합니다. 그림 1F를 참조하십시오.
- 10 초 후 눈에서 바늘을 빼십시오. 역류에 유의하십시오.
- 플랫폼에서 마우스를 제거하고 각막 보호를 위해 양쪽 눈에 0.3% 하이프로멜로오스 또는 0.2% w/w 카보머 눈 연고를 바르고 회복 온난화 상자로 이동합니다.
- 흉골 누운 자세를 유지하기에 충분한 의식을 회복 할 때까지 마우스를 방치하지 마십시오. 완전히 회복 될 때까지 다른 동물의 회사로 돌아 가지 마십시오.
- 마우스가 완전히 깨어 나면 케이지로 돌아가서 아세트 아미노펜 (200-300 mg / kg / day) 약용 물병을 넣으십시오. 케이지 카드에 IVT 주사 날짜를 표시하십시오.
- 유리체 내 주사는 일반적으로 잘 견딥니다. 통증과 연구에서 제거해야 할 필요성을 나타낼 수 있는 임상 징후에는 안구 주위 탈모증(자가 외상을 나타냄), 각막 궤양, 체중 감소 및 구부린 자세가 포함됩니다.
- 유리체 내 주사를위한 대체 방법
알림: 이 절차는 작동 현미경과 미세 주사기의 33G 바늘을 사용하여 수행됩니다.- 눈을 쫓아 내고 한 쌍의 집게로 제자리에 고정하십시오.
- 그런 다음 카보머 아이 젤 0.2% w/w 또는 0.3% 하이프로멜로스 아이 젤을 바르고 원형 커버슬립(직경 7mm)을 눈 위에 놓습니다.
- 33μL Hamilton 주사기에 5G 피하 주사 바늘을 장착하고 ~2° 주입 각도로 각막 윤부에 약 45mm 원주를 삽입합니다.
- 바늘 경사를 유리체로 안내하여 렌즈와 시신경 디스크 사이에서 멈추고(외과의사의 상대적 관점에서 이것은 시신경 디스크 위/덮음 - 삽입 부위에서 약 1.5mm) 2μL의 Mtb(PBS에서 2.5ug/μL)를 천천히 주입합니다.
- 바늘을 제자리에 잠시 잡고 (주사제의 역류량을 줄이기 위해) 제거한 다음 제거하십시오.
- 주입 후 집게를 풀어 지구본을 배치하십시오. 이때 1% w/w 클로람페니콜 연고 한 방울을 눈에 투여하여 주사 후 안구내염으로부터 추가적인 보호를 제공할 수 있습니다.
- 주입 후 4.3.11-4.3.13단계에서 설명한 대로 복구 예열 상자로 이동합니다.
5. 포도막염을 검출하고 정량화하는 OCT 영상
- 동물 준비
- 4.1.2-4.1.4단계에 설명된 대로 마우스를 마취합니다.
- 2.5 % 페닐에 프린 1 방울로 동공을 확장하십시오. 코나 입에 들어갈 수 있는 과도한 비말을 피하도록 주의하십시오. 2-3분 후 여분의 액체를 두드려 제거합니다.
- 0.3% 하이프로멜로오스 또는 0.2% w/w 카보머 젤을 눈에 바르면 마취 중 건조함을 방지할 수 있습니다. 이것은 또한 백내장 형성을 예방하는 데 도움이됩니다.
- 몸의 따뜻함을 유지하기 위해 마우스를 수술 거즈 층으로 감싸고 동물 카세트에 놓습니다. 바이트 바가있는 머리를 배치하십시오.
- 전방 및 후방 챔버의 OCT 이미지를 획득합니다.
참고: 전방 및 후실 이미지를 얻는 경우 백내장 형성 후 이미지 저하를 방지하기 위해 먼저 후방(PC) 이미지를 얻으십시오. 백내장 형성은 자주 윤활하고 0.3% 하이프로멜로스 또는 0.2% w/w 카보머 아이 젤을 바르면 예방할 수 있습니다. 장시간 이미징(>10분)의 경우 마우스를 따뜻하게 유지(열 패드 사용)하는 것도 도움이 됩니다.- OCT 이미징 시스템을 켠 후 올바른 이미징 렌즈를 고정하고 필요에 따라 기준 암 위치를 조정합니다.
- 이미징 소프트웨어를 열고 고유한 마우스 ID를 만든 다음 OCT 제조업체의 프로토콜에 따라 이미징을 시작합니다.
- 빠른 스캔 프로토콜과 함께 Free Run 옵션을 사용하여 시신경이 후실 이미지를 중심으로 하거나 각막 정점이 전방 이미지에 위치하도록 눈을 배치합니다.
참고: 표 1 에는 상업적으로 이용 가능한 두 개의 소형 동물 이미징 시스템에 대한 이미징 프로토콜 매개변수가 포함되어 있습니다. 제품 사양에 대해서는 재료 표를 참조하십시오. - 후실 영상의 경우 OCT를 눈 표면에 가깝게 가져옵니다. 렌즈 표면이 눈에 닿지 않도록 주의하십시오.
- 눈의 위치가 올바르게 지정되면 빠른 스캔을 중지하고 볼륨 스캔 프로토콜을 선택한 다음 조준 옵션으로 스캔을 활성화합니다.
- 후방 세그먼트 이미지의 경우 시신경이 수평 B-스캔 정렬 이미지의 중앙에 있고 망막이 수직 정렬 축과 정렬될 때까지 조정합니다.
- 전방 세그먼트 이미지의 경우 수평 B-스캔 정렬 이미지와 수직 정렬 B-스캔 정렬 이미지 모두에서 각막의 정점을 중앙에 배치하도록 위치를 조정합니다. 두 이미지에 반사 아티팩트가 있으면 적절한 정렬이 확인됩니다. 그런 다음 반사 아티팩트를 제거할 수 있을 만큼 수평 이미지를 이동합니다. 그림 2를 참조하십시오.
- Snapshot을 클릭하여 볼륨 스캔 이미지를 캡처한 다음 저장을 클릭합니다.
- 다음으로, 평균화된 중앙선 스캔을 구한다. 스캔 프로토콜을 열고 조준 을 클릭한 다음 스냅샷을 클릭합니다. 동일한 패널을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭한 다음 평균을 클릭합니다.
- 두 렌즈로 각 눈에 대해 5.2.1-5.2.9단계를 반복합니다.
- 모든 이미지를 수집한 후 카세트에서 마우스를 제거하고 4.3.11-4.3.13단계에 나열된 대로 회복 중에 각막 보호 기능을 제공합니다.
6. OCT에 의한 염증 점수 매기기
- 치료 조건에 가려진 채점자의 도움을 받아 OCT 이미지에 점수를 매깁니다.
참고: 마우스 모델의 PMU의 경우 표 2 에 제공된 점수 시스템을 사용하는 것이 좋습니다. - 전방(AC) 및 후방(PC) 이미지를 모두 얻은 경우 이러한 점수를 결합하여 각 눈에 대한 최종 점수를 얻습니다.
알림: 전방 염증은 후실 염증 전에 해결됩니다.
7. 사후 조직학에 의한 염증 점수 매기기
- 실험이 끝나면 핵 제거에 의해 개별 눈을 수집하고 밤새 4 % 포름 알데히드로 고정하고 파라핀 임베딩, 절편 및 H & E 염색33을 진행합니다.
알림: 동공-시신경 축을 따라 여러 개의 4-8 μm 섹션을 권장합니다.
참고: 눈당 3개의 섹션은 표 3에 제공된 채점 시스템을 사용하여 마스크를 쓴 채점자에 의해 채점되며, 3개의 섹션의 평균 점수는 최종 조직학 염증 점수로 보고됩니다.
Representative Results
이 프로토콜은 프라이밍 된 마이코 박테리아 포도막염 모델 (PMU)을 사용하여 마우스에서 포도막염의 유도를 보여줍니다. 피하 주사의 일관성과 유리체 내 주사의 정확성을 보장하는 것은 프라이밍 된 마이코 박테리아 포도막염 모델 (PMU)을 개발하는 핵심 단계입니다. 도 1 은 입체택시 장치를 이용한 마우스 유리체내 주사 절차를 나타낸다. 이어바는 현미경으로 동일한 위치에 머리를 부드럽게 배치하는 데 도움이 됩니다(그림 1E). 그들은 또한 유리체 내 주사 절차 중에 머리를 안정적으로 유지하여 주사 외상의 위험을 줄입니다. 성공적인 주입 후, 주사 용액의 플루오레세인은 현미경으로 또는 그림 1F의 그림과 같이 측면도에서 볼 수 있는 눈 내부에서 녹색 반사를 생성합니다.
설명된 대로 수행되면 프로토콜은 유리체내 주사 후 빠르면 10시간 이내에 OCT 및 안저 영상을 사용하여 감지할 수 있는 강력한 급성 포도막염을 생성합니다. 그림 2 는 OCT 이미징을 위한 눈의 올바른 정렬을 보여줍니다. 표 1A 에는 OCT 프로토콜에 사용되는 매개 변수가 나열되어 있습니다. 이미지를 얻는 체계적인 접근 방식은 시간이 지남에 따라 비교할 수있는 고품질 이미지를 제공합니다. 전방 이미지는 홍채가 수평 및 수직면 모두에 평행하게 정렬 된 en face SLO 이미지 (그림 2A)를 사용하여 각막의 정점을 중심으로합니다 (그림 2B, C). 볼륨 및 라인 스캔은 수직 정렬로 캡처되어 열등한 영역과 상위 영역을 동시에 볼 수 있습니다. 후방 세그먼트 이미지는 en face SLO 이미지 (그림 2D)를 사용하여 시신경의 중심을 차지하고 RPE의 밝은 밴드는 망막을 수평 및 수직면에 평행하게 정렬하는 데 사용됩니다 (그림 2E, F).
도 3은 OCT 영상을 이용한 PMU 안구 염증의 전형적인 소견을 보여준다. 유리체내 주사 후 24시간, 염증 세포는 수성 및 유리체에서 볼 수 있다(도 3B). 중등도 또는 중증의 염증이있는 경우, AC의 열등한 각도에서 하이포 피온이 보입니다. 안구 염증의 정도는 표 2에 나열된 기준을 사용하여 이러한 OCT 이미지에서 점수를 매길 수 있습니다. 각 점수에 대해 전형적인 염증 특징을 나타내는 이미지의 대표적인 예가 도 4에 도시되어 있다. AC 및 PC 챔버 점수를 함께 추가하여 결합된 OCT 점수를 생성할 수 있습니다. 합산 점수는 >0이지만 ≤2.5는 경미한 염증을 나타냅니다. 중등도 염증은 >2.5 점이지만 ≤4.5 점으로 결정됩니다. 점수 >4.5는 심한 염증을 식별합니다. 염증은 일반적으로 유리체 내 주사 후 48 시간 후에 최고조에 달하며 AC와 PC에서 OCT 점수는 1과 3 사이입니다 (2와 6 사이의 결합 점수). AC 및 PC 점수 0.5 또는 4는 덜 일반적입니다. 일반적인 범위를 벗어난 점수가 자주 발생하는 경우 이상값 점수에 기여하는 요인을 식별하기 위해 문제 해결이 필요할 수 있습니다(토론 섹션 참조). 전방의 염증 점수는 유리체 내 주사 후 1 주일 이내에 0으로 돌아가는 경향이 있습니다. 대조적으로, 사후 점수는 0으로 돌아 가지 않습니다. 대신, 낮은 수준의 만성 염증은 유리체염의 형태로 지속되며, 혈관 주위 림프구는 유리체 내 주사 후 1-2 개월 동안 망막에 침윤합니다.
PMU의 염증 점수는 조직학을 사용하여 결정할 수도 있습니다. 그림 5 는 조직학에 의한 PMU의 심각도를 채점하는 데 사용되는 대표적인 H & E 섹션을 보여줍니다. 수성 및 유리체에서 염증 세포의 수를 계수하고 표 3에 나열된 점수 기준을 사용하여 중증도를 결정하는 데 사용합니다. 섬 모체의 염증 세포 침윤은 일반적으로 경증 또는 중등도의 염증에서 조직학 섹션 (일방적 침범)의 한쪽에서 볼 수 있습니다. 염증이 심할 때, 이것은 수정체의 양쪽에있는 섬 모체에 염증 세포 침윤의 존재에 의해 반영됩니다 (양측 침범이라고 함). 유리체내 주사 후 후기 시점 동안, 혈관주위 및 망막내 백혈구 및 망막외 주름의 존재를 포함한 만성 염증 발현도 확인될 수 있다. 조직학은 또한 열악한 주사 기술의 영향을 받는 눈을 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다. 유리체 내 주사 중 수정체에 대한 외상은 외상 부위에 인접한 렌즈 캡슐 외부에 무정형 에오신 염색 (분홍색) 렌즈 단백질의 존재로 확인할 수 있습니다. 유리체 내 mTB가 결막 하 공간으로 역류하면 눈 외부에 염증이 발생하며, 이는 절편에 존재하는 안구 주위 구조를주의 깊게 검토하여 확인할 수 있습니다. 눈 안에 mTB 추출물을 유지하지 못하기 때문에 이러한 눈은 일반적으로 염증의 OCT 점수가 낮습니다.
명시야 안저 영상은 또한 하이포피온, 유리막염, 망막 또는 혈관주위 염증 세포 침윤의 발달을 포함하여 PMU의 임상적으로 관련된 측면을 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 그림 6 은 안저 이미지에서 망막 및 혈관 주위 염증을 볼 수 있는 두 가지 예를 보여줍니다. 이 두 눈은 또한 PMU 모델에서 흔히 볼 수있는 염증 범위를 보여줍니다. 표 1B 는 안저/망막 OCT 영상 시스템에 사용되는 파라미터를 나열합니다. 심한 염증이 이미지 품질에 미치는 영향(그림 6, 2일차, 상단 행의 OCT 및 안저 이미지)과 21일째에 나타나는 질병의 정도에 주목하십시오. 각막 부종은 또한 급성 염증 동안 이미지 품질을 저하시킬 수 있습니다. 그러나 각막 부종이 염증만으로 심한 경우는 드뭅니다. 보다 일반적으로, 이미지 품질은 이미징 및 마취 이벤트 동안 불완전한 표면 보호로 인한 상피 손상에 의해 저하됩니다.
PMU 모델은 모든 마우스 품종 또는 유전자형에서 포도막염을 유도하는 데 사용할 수 있습니다. 흰둥이 눈에서 OCT는 여전히 염증을 측정하는 데 사용할 수 있지만 안저 색소가 없기 때문에 명시야 이미징13,34로 염증을 시각화하는 것이 어렵습니다. 사후 연구는 안구 조직, 국소 림프절 또는 비장에 대해 수행 할 수 있습니다. 일부 예는 유동 세포분석 및 면역조직화학과 같은 면역 세포의 존재에 대한 분석 및 염증성 사이토카인의 측정을 포함한다. PMU로 염증을 시작한 후 테스트한 모든 시점(1일에서 56일까지)에는 다중 매개변수 흐름 분석12,35에 의해 눈의 많은 주요 백혈구 집단을 검출하기에 충분한 CD45+ 염증 세포가 개별 눈에 존재합니다. 단백질 농도 측정, 단백질체학 연구 또는 사이토카인 농도 측정을 위해 염증이 있는 눈에서 수성(2-5μL) 및 유리체(5-10μL) 체액을 수집할 수 있습니다36.
그림 1: 마우스 유리체내 주사 설정. 유리체내 주사는 (A) (B) 마이크로펌프 및 (C) 주사기에 연결된 마이크로시린지 펌프 컨트롤러를 사용하여 마우스 눈 상에서 수행된다. 주사기가 로드되어 (D) 마이크로펌프에 장착됩니다. 마우스 헤드는 유리체 내 주사 절차 동안 안정성과 일관성을 보장하기 위해 (E) 이어 바를 사용하여 배치됩니다. (F) 주사액의 플루오레세인은 성공적인 시술 후 눈 안에서 녹색 반사를 생성합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: OCT 이미징을 위한 눈의 적절한 정렬 . (A) 엔페이스 스캐닝 레이저 검안경(SLO) 이미지를 사용하여 눈은 전방 이미징을 위해 중앙에 있습니다. 녹색 선은 패널 (B)에 표시된 수평선 스캔의 위치를 나타냅니다. 중앙 각막은 반사 인공물을 줄이기 위해 피합니다. (C) 중심부 전방을 통한 수직 B- 스캔. 이 스캔은 수평 스캔에서 90°에서 얻습니다. 렌즈의 각 측면에 있는 조리개 섹션의 정렬은 수평 스캔(패널 B)에서 수평을 이루고 수직 스캔(패널 C)에서 서로 위에 배열됩니다. (D) SLO 영상을 이용하여 후부 영상은 시신경의 중심에 위치한다. (e) 수평 B-스캔 정렬, (f) 수직 B-스캔 정렬. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: PMU의 유도는 종방향 OCT 영상으로 모니터링할 수 있는 범포도막염을 생성합니다. 맨 윗줄은 전방 (AC)을 보여줍니다. 맨 아래 줄은 질병 경과의 병리학 적 변화를 강조하기 위해 후방 챔버 (PC) OCT 이미지를 보여줍니다. (a) 포도막염의 유도 전의 AC (위) 및 PC (아래)의 기준선 OCT 이미지, 둘 다 점수 0. (b) 유리체내 주사 후 1일째 PC에서 각막 부종(검은색 화살표), 하이포피온(*) AC에서 다중 자유 부유 염증 세포(흰색 화살표), 및 유리체염(흰색 화살표)의 존재를 나타낸다. (C) 전방 수정체 캡슐에 AC 세포가 거의 없는 유리체내 주사 후 7일째(흰색 화살표) 및 감소된 유리체염(흰색 화살표촉). (d) 유리체내 주사 후 28일째 전방 전방에서 AC 염증이 해결되고 경미한 유리체염이 발생한다. 약어 : C- 각막, L- 렌즈, I- 홍채, Aq - 수성, V 유리체, RGC - 망막 신경절 세포, PR - 광 수용체, Ch- 맥락막. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: OCT 점수의 예. 0과 4 사이의 OCT 점수는 표 2에 표시된 범주형 시스템을 사용하여 각 AC 이미지 및 PC 이미지에 할당됩니다. AC 및 PC 점수는 눈의 최종 OCT 점수에 합산됩니다. (ᄀ,ᄀ) 점수가 0인 예입니다. (나, 이) 점수 0.5의 예. (씨, 여) 점수 1의 예. (G, J) 점수 2의 예. (H,K) 점수 3의 예. (I, L) 스코어 4의 예는 패널 I 및 L에 제시되어 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 조직학 점수의 예. 조직학 점수는 H & E 섹션에서 볼 수있는 5 가지 특성, 즉 전방 단백질 밀도, 전방 세포 수, 섬 모체의 면역 세포 침윤, 유리체 세포 밀도, 망막 혈관 염증 및 구조적 망막 변화를 기반으로 결정됩니다. 각 특성에 대해 0-2의 점수가 할당됩니다. 각 점수에 대한 설명은 표 3에 나와 있습니다. 각 특성에 대한 0-2의 대표적인 예제 점수가 이 그림에 나와 있습니다. 왼쪽 열은 0의 점수를 보여줍니다. 가운데 열에는 점수 1의 예가 표시됩니다. 오른쪽 열에는 점수 2의 예가 표시됩니다. 같은 섹션의 렌즈 양쪽에 있는 모양체가 세포 염증을 나타내는 경우 섬모체 점수에 대한 점수 2가 할당됩니다. 최종 조직학 점수는 5가지 기준 각각에 대한 점수의 합입니다(최대 점수 10). 오른쪽 하단 패널의 화살표는 표면 망막 혈관과 관련된 혈관 주위 백혈구를 나타냅니다. 검은색 스케일 바는 500μm를 나타냅니다. 섬모 스케일 바는 100μm를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: PMU의 세로 안저 영상은 다양한 질병 중증도를 확인했습니다 . (A) 심하게 염증이 있는 눈은 2일째 OCT(맨 아래 줄)에서 조밀한 유리체염 및 망막 부종뿐만 아니라 컬러 안저 영상(맨 윗줄)에서 망막에 여러 개의 흰색 침윤과 혈관 비틀림을 보여줍니다. 망막 병변 수의 진행은 유리체염이 개선되는 동안 시간이 지남에 따라 볼 수 있습니다. 녹색 선은 OCT 이미지의 위치를 나타냅니다. (B) 경미하게 염증이있는 눈은 안저에서 점점 더 많은 별개의 선형 병변과 유리체 공간에 많은 침윤 세포를 보여줍니다. 스케일 바 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| A | |||
| 마우스 전방 챔버 | 빠른 스캔 | 볼륨 스캔 | 선형 스캔 |
| 길이 x 너비 | 세로 4.0 밀리미터 x 4.0 밀리미터 | 세로 3.6 밀리미터 x 세로 3.6 밀리미터 | 3.6 밀리미터 |
| 각 | 0 | 90 | 90 |
| A-스캔/B-스캔 | 800 | 1000 | 1000 |
| # B-스캔 | 50 | 400 | 1 |
| 프레임/ B-스캔 | 1 | 3 | 20 |
| 마우스 후방 챔버 | 빠른 스캔 | 볼륨 스캔 | 선형 스캔 |
| 길이 x 너비 | 세로 1.6 밀리미터 x 세로 1.6 밀리미터 | 세로 1.6 밀리미터 x 세로 1.6 밀리미터 | 1.6 밀리미터 |
| 각 | 0 | 0 | 0 |
| A-스캔/B-스캔 | 800 | 1000 | 1000 |
| # B-스캔 | 50 | 200 | 1 |
| 프레임/ B-스캔 | 1 | 3 | 20 |
| B | |||
| 마우스 후방 챔버 | 볼륨 스캔 | 선형 스캔 | |
| 길이 x 너비 | 세로 0.9 밀리미터 x 0.9 밀리미터 | 1.8 밀리미터 | |
| 각 | 0 | 임의(일반적으로 0 또는 90) | |
| A-스캔/B-스캔 | 1024 | 1024 | |
| # B-스캔 | 512 | 1 | |
| 프레임/ B-스캔 | 1 | 30 |
표 1: 스캔 매개변수. (A) OCT 스캔 매개 변수. (B) 안저/망막 OCT 스캔 매개변수
| 10월 점수 설명 | ||||||
| 점수 | 전방 챔버 | 후방 챔버 | ||||
| 해당 없음 | 전방 각막 너머의 시야 없음 | 후방 세그먼트가 보이지 않음 | ||||
| 0 | 염증 없음 | 염증 없음 | ||||
| 0.5 | 수성 1-5 세포 | 유리체 면적의 10 % 미만을 차지하는 세포는 거의 없습니다. | ||||
| 또는 각막 부종 | 망막 하 또는 망막 내 침윤 또는 망막 구조 파괴 없음 | |||||
| 1 | 수성 6-20 세포 | 확산 세포 (조밀 한 덩어리 없음)는 유리체 영역의 10-50 %를 차지합니다. | ||||
| 또는 전방 수정체 캡슐의 단일 세포 층 | 망막 하 또는 망막 내 침윤 또는 망막 구조 파괴 없음 | |||||
| 2 | 수성 20-100 세포 | 유리체 영역의 > 50 %를 차지하는 확산 세포 (조밀 한 덩어리 없음) | ||||
| 또는 20개 미만의 세포와 하이포피온이 존재함 | 망막 하 또는 망막 내 침윤 또는 망막 구조 파괴 없음 | |||||
| 3 | 수성 20-100 세포 | 2 등급 및 1 등급과 동일한 확산 세포 | ||||
| 그리고 하이포피온 또는 동공막 | 그리고 유리체 영역의 10 % -20 %를 차지하는 적어도 하나의 조밀 한 유리체 혼탁 또는 2 등급 및 희귀 (≤ 2) 망막 하 또는 ntraretinal 혼탁과 동일한 유리체 세포의 존재 | |||||
| 4 | 임의의 수의 수성 셀 | 유리체 영역의 > 20 %를 차지하는 조밀 한 유리체 혼탁. | ||||
| 그리고 큰 하이포피온 및 동공막 또는 심한 염증으로 인한 전방 구조 손실 | 또는 망막하 또는 망막내 혼탁이 큰 미만성 유리체 세포 | |||||
표 2: PMU OCT 점수 기준: OCT 이미지는 표에 나열된 기준에 따라 점수가 매겨집니다. 눈의 최종 점수를 얻기 위해 AC 및 PC 점수가 추가됩니다. 눈의 명확한 시야를 얻지 못한 경우, 이미지에 NA 점수가 할당되었으며,이를 연구에서 제외했습니다.
| 조직학 점수 설명 | |||
| 특성 | 0 | 1 | 2 |
| 전방 (AC) 단백질 | AC에서 에오신으로 염색되는 부족한 무세포 입자 | AC의 어느 곳에서나 중간이지만 합류하지 않는 세포 외 에오신 염색 | AC 전체의 합류 또는 거의 합류 세포외 에오신 염색 |
| 전방 (AC) 세포 | 세포 없음 | 1–100개의 세포가 있지만 조밀한 세포 응집체는 없음 | >100개의 셀 또는 조밀한 세포 집합체 |
| 섬 모체 염증 | 섬 모체 또는 주변 유리체의 백혈구 침윤 없음 | 섬 모체 및 / 또는 주변 유리체에 침투하는 백혈구의 일방적 인 존재. | 섬 모체 및 / 또는 주변 유리체에 침투하는 백혈구의 양측 존재. |
| 망막 혈관 염증 | 혈관 주위 백혈구가있는 망막 혈관 없음 | 혈관 주위 백혈구가있는 섹션 당 하나의 혈관 | 혈관 주위 백혈구가있는 섹션 당 >1 개의 용기 |
| 망막 접힘 또는 손상 | 망막 손상 없음 | 섹션 당 1-3 망막 주름 | 섹션당 >3개의 망막 주름 또는 기타 망막층 파괴 또는 망막내 출혈 |
표 3 : PMU 조직학 점수 기준 : 눈의 H & E 섹션은 표에 나열된 기준에 따라 채점되었습니다. 동일한 눈으로부터의 3개의 절편을 스코어링하고 평균화하여 눈의 최종 조직학 점수를 얻었다.
Discussion
포도막염의 동물 모델은 안구 염증 및 항상성의 메커니즘을 이해하고 포도막염 환자에 대한 의료 및 수술 요법의 전임상 평가를 가능하게 하는 데 중요한 역할을 했습니다37. PMU 모델의 토끼 및 래트 변이체 모두 개념 증명 연구 38,39,40을 통해 전임상 치료에서 그 가치를 입증했습니다. 마우스에서 다양한 범위의 형질전환 균주를 사용할 수 있기 때문에 마우스 PMU 모델 시스템을 구축하면 이제 이 질병의 병리에 기여하는 특정 세포 유형, 경로 및 유전자를 식별하기 위한 보다 상세한 기계론적 연구가 가능합니다.
포도막염의 동물 모델은 염증의 발생률 및 강도에서 동물 대 동물 가변성을 입증할 수 있다(41). C57BL/6 마우스 균주에서 PMU는 여기에 설명된 프로토콜을 사용하여 안정적으로 생성됩니다. 포도막염 경과 및 강도의 균주 별 변화는 EAU 및 EIU42,43 모두에 대해보고되었습니다. PMU의 중증도 및 경과에 대한 균주 특이적 영향은 실험적으로 측정되지 않았지만 이 모델은 야생형 C57BL/6J와 알비노 마우스(B6(Cg)-Tyrc-2J/J)에서 사용되어 유사한 염증 반응을 일으켰습니다. PMU 모델을 생성할 때 아래 나열된 고려 사항을 제어하면 새로운 연구원이 변동성을 제한하고 가장 일관되고 재현 가능한 포도막염을 생성하는 데 도움이 될 수 있습니다.
피하 주사의 일관성 보장 :
일관된 피하 주사를 제공하려면 에멀젼에서 모든 기포가 제거되었는지 확인하십시오. 고려 사항에는 주사기를 로드하기 전에 미리 만들어진 에멀젼의 짧은 원심분리기(400 x g에서 30초)가 포함됩니다. 이렇게하면 에멀젼에 갇힌 공기가 제거됩니다. 또한 주사기를 넣을 때 주기적으로 뒤집어 (tip-up) 주사기를 두드려 기포를 제거하십시오. 주사하는 동안 근육 주사를 피하기 위해 주사기를 너무 깊게 두지 마십시오. 반대로, 얕은(피내) 주사는 피부를 통한 에멀젼의 침식을 초래할 수 있다. 두꺼운 점성 에멀젼을 완전히 주입하고 피부에서 역류를 방지하기 위해 주사 부위에서 주사기를 제거하기 전에 잠시 멈추는 것을 잊지 마십시오.
피하 주사를 놓은 지 7 일 후, 뒷다리의 양쪽에 만져지는 결절이 있는지 확인하십시오. 결절을 확인할 수 없으면 에멀젼이 아닌 공기가 주입되었을 가능성이 있습니다. 이 경우 급성 염증이 강력하지 않을 수 있으며 만성 염증이 발생하지 않을 수 있습니다.
감염성 안구 내염의 발병을 예방하십시오 :
박테리아 또는 진균성 안구내염은 예방되지 않으면 교란 변수를 생성합니다44. 세균성 안구내염을 예방하려면 유리체내 현탁액을 만들 때 항상 좋은 무균 기술을 연습하고, 눈에 닿을 모든 재사용 가능한 도구를 취급하고 청소하십시오. 멸균 일회용 품목을 사용하거나 오토클레이브를 하거나 95% 알코올 세척 또는 물티슈로 청소하는 것이 중요합니다. 안구 표면, 눈꺼풀 및 안구 주위 모피에 적용된 베타딘의 적절한 사용은 또한 안구내염45를 예방하는 데 도움이 됩니다. 주사 후 과정에서 극심한 염증으로 안구 구조가 지워지기 때문에 감염된 눈을 인식하는 것은 간단합니다. PMU에서는 일반적이지 않습니다. 안내 출혈의 존재는 또한 주사로 인한 안구 내염 또는 외상을 암시 할 수 있습니다. 그러한 경우이 동물들을 연구에서 제외하십시오.
유리체 내 주사의 일관성 보장 :
유리체내 주사는 PMU에서 신뢰할 수 있고 재현 가능한 염증을 유도하는 데 중요한 단계입니다. 각 주사로 일정한 양의 Mtb 현탁액을 제공하고, 외상을 피하고, 현탁액의 역류를 방지하는 것은 주사를 수행할 때 고려해야 하는 모든 요소입니다. 일관된 현탁액을 보장하려면 해동 시 그리고 주사기에 넣기 전에 스톡 현탁액을 완전히 와동하십시오. 사용된 이 Mtb 추출물은 용액을 형성하지 않기 때문에, 현탁액은 시간이 지남에 따라 침강될 수 있다. 각 주사에서 Mtb 추출물의 균일한 농도를 보장하려면 로딩 후 15분 이내에 주사기를 사용하거나 배출하고 다시 로드하십시오. Phenylephrine은 뒤쪽 눈에 더 큰 시야를 제공하고 주사 중 눈에 대한 외상의 위험을 줄이기 위해 확장에 사용됩니다. 이 방울은 자연스러운 눈꺼풀 수축과 지구의 약간의 돌출을 생성하여 집게로 눈을 잡을 필요없이 윤부 뒤쪽 1-2mm 영역을 잘 시각화 할 수 있습니다. 눈을 억제하기 위해 집게를 사용하면 잠재적인 외상을 유발할 수 있으며 일시적으로 안압을 높이고 Mtb 현탁액의 역류 위험을 높일 수 있습니다. 외상은 또한 눈에 너무 많은 양을 주입하려고 시도함으로써 발생할 수 있습니다. 주사량은 2μL로 제한되어 안압의 현저하고 장기간의 상승과 눈의 외상을 방지합니다. 또한 어린 동물은 성인 생쥐보다 작은 눈을 갖습니다. 일반적으로 6-8 주 마우스 (20-25g)는 균일 한 눈 크기를 제공하고 Mtb 주사 후 염증에서 더 큰 일관성을 보장합니다. 마이코박테리아 현탁액의 주사 후 역류의 더 높은 빈도가 더 작은 마우스에서 관찰되었습니다. 이것은 차례로 예상보다 적은 급성 염증을 유발합니다. 희석된 fluorescein 용액은 초보자 주입기에게 주입 기술의 성공에 대한 시각적 피드백을 제공하는 데 사용됩니다. 주사시 팽창은 유리체강에 주입 된 물질을 직접 시각화하고 렌즈 외상의 증거를 기록 할 수있는 기회를 제공합니다. 수정체 외상의 경우 수정체 선명도가 변화하여 백내장이 발생하여 OCT에서 시각화할 수 있습니다. 안구 외상의 경우, 렌즈로 유발 된 포도막염46의 가능성 때문에 눈을 연구에서 제외해야합니다. 눈에서 주사기를 제거하기 전에 10초 동안 일시 중지하여 눈 안에 Mtb 현탁액이 분산되고 역류를 줄이는 것이 좋습니다.
PMU 모델은 유리체내 주사에서 Mtb의 농도를 변화시킴으로써 급성 염증의 강도를 변화시키도록 수정될 수 있다. 2.5 μg/μL에서 15 μg/μL에 이르는 다양한 용량이 이전에 당사 실험실에서 테스트되었습니다. 그러나 10μg/μL보다 높은 용량은 자발적인 수정체 파열, 심한 각막 부종 및 흉터, hyphema를 포함한 심각한 눈 손상을 유발하는 것으로 밝혀졌습니다. 이 정도의 중증도는 감염 후 포도막염이있는 인간 환자에게는 전형적이지 않으므로 이러한 농도는 권장되지 않습니다. 5 μg / μL 용량은 경증에서 중등도의 급성 염증 및 경증 만성 포도막염을 안정적으로 생성하는 것으로 밝혀졌습니다. 10 μg/μL 용량은 신뢰할 수 있는 중등도에서 중증의 급성 질환 및 더 주목할만한 만성 질환을 생성합니다. 따라서, 유리체내 농도를 변화시키는 것은 실험적 질문에 기초하여 필요에 따라 사용하기 위한 대안적인 질환 중증도를 제공할 수 있다. 결과가 피하 또는 유리체 내 주사와 관련된 외상이 아닌 mTB에 대한 반응으로 인한 것인지 확인하기 위해 대조군을 선택해야 합니다. 가짜 주사 대조군에서는 mTB 추출물 대신 PBS를 사용할 수 있습니다. 노출되지 않은 동물과의 비교를 위해, 동료 눈이 항상 동등하지는 않기 때문에 진정한 순진한 샘플을 고려해야합니다.
마우스 눈의 크기가 작기 때문에 OCT는 직접 시각화 또는 현미경 명시야 사진보다 전방의 염증을 감지하는 데 더 민감한 분석이 될 수 있습니다. 쥐25에서 PMU에 대한 이전 연구는 OCT보다 조직학에 의해 더 많은 세포가 검출 될 수 있지만 두 양식 사이에 좋은 상관 관계가 있음을 결정했다. OCT는 동일한 동물에서 종방향으로 염증을 모니터링하는 데 사용할 수 있다는 추가적인 이점이 있습니다. EAU 및 EIU와 같은 포도막염의 다른 주요 마우스 모델도 정량 분석을 위해 OCT를 사용했습니다 12,47,48. 마우스의 PMU 모델에서 전방 세포는 OCT에서만 볼 수 있으며 큰 하이포피온이 존재하지 않는 한 임상 검사에서 볼 수 없습니다. 유리체 염증 (유리체염)은 컬러 안저 영상으로 관찰 할 수 있지만 정량적 변화를 감지하는 것은 OCT 영상에서만 가능합니다. 망막 혈관 염증 및 망막 손상과 같은 모델의 다른 측면은 OCT 및 현미경 명시야 안저 사진으로 쉽게 식별할 수 있습니다.
OCT를 사용할 때 국소 영상이 염증 정도의 지역적 차이에 의해 어떻게 영향을 받을 수 있는지 고려하는 것이 중요합니다. 이전 보고서에 따르면 인간의 전방에서 세포의 고르지 않은 분포가 확인되었으며 더 많은 세포가 열등하게 위치합니다49. 마우스에서는 비슷한 소인이 흔합니다. 따라서 AC를 통한 수직 또는 방사형 스캔은 염증 범위를 캡처하는 이미지를 보장하는 데 도움이 됩니다. 또한 동일한 위치에서 이미징을 수행하면 동일한 눈에서 세로로 수집된 이미지에 일관성이 제공됩니다. 눈의 같은 부분에서 이미지를 얻으려면 안정적인 랜드 마크와 체계적인 접근 방식을 사용하십시오. 전방 챔버 이미지의 경우, 이미지는 각막의 정점에 바로 인접한 중앙에 배치되고 수직으로 배향되어 열등한 각도에서 하이포 피온의 존재를 감지 할 수 있습니다. 후방 세그먼트 이미지의 경우 이미지는 시신경의 중심에 있습니다. 지역 변동성을 캡처하기 위해 점수 매기기에 최소 3개의 라인 스캔을 사용하는 것이 좋습니다. 염증이 주변 위치로 제한되는 경우 볼륨 스캔을 획득하는 것이 도움이 될 수 있습니다. 볼륨 스캔 수집은 지역적 차이를 캡처하는 데 도움이 될 수 있지만 데이터 스토리지 요구 사항을 증가시킵니다.
PMU 마우스 모델에서 염증을 특성화하는데 사용될 수 있는 다른 생체내 분석은 생물발광 영상화13,35를 포함한다. 다중 파라미터 유세포 분석과 같은 사후 분석은 눈의 수성 및 후방에서 침윤하는 면역 세포 유형 집단을 식별하고 정량화하기 위해 수행 될 수 있습니다12,26. PMU 모델에서, 급성 염증은 우세한 호중구 침윤물을 갖는 선천적 반응을 특징으로 하며, 이어서 한 달 이상 지속되는 만성 및 지속적인 적응 T 세포 우성 반응이 뒤따른다35. 사후 조직에서 수행할 수 있는 면역 기능의 다른 분석에는 안구 유체 사이토카인 분석이 포함됩니다. 또한 mRNA 시퀀싱 및 면역 형광 이미징과 같은 다른 다운 스트림 분석을 사용하여 포도막염50,51에서 망막 면역 세포 집단의 유전자 및 단백질 발현 패턴을 평가할 수 있습니다.
PMU 모델은 다른 종에 적합한 적응을 사용하여 다른 설치류 시스템에서 복제 될 수 있습니다. PMU 모델은 이전에 래트 및 토끼38,39,40에서 사용되었다. 쥐에서 급성 panuveitis는 조직학에 의한 만성 염증의 징후를 일으키지 않고 14 일 동안 자발적으로 해결되는 유리체 내 주사 후 발생합니다24. 토끼에서 포도막염 유도는 유리체 내 주사 전에 두 차례의 피하 주사를 사용하지만 강력한 범포도막염을 생성합니다. 마우스 모델 사용의 장점 중 하나는 포도막염52의 기본 메커니즘을 이해하는 데 도움이 될 수있는 수많은 형질 전환 및 녹아웃 균주를 즉시 사용할 수 있다는 것입니다. 모든 설치류 모델은 제제가 전신적으로 또는 국소 적하로서 투여되는 경우 전임상 요법 시험에 사용될 수 있다. 그러나 크기가 크기 때문에 쥐와 토끼 눈은 포도막염에 대한 이식형 또는 국소 주사 치료 옵션에 대한 전임상 연구에 사용하기에 더 나은 모델입니다.
요약하면,이 프로토콜은 만성 안구 염증의 메커니즘을 연구하는 데 관심이있는 연구자에게 안구 항원에 대한 사전 면역에 의존하지 않는 새로운 도구를 제공합니다.
Disclosures
저자는 공개 할 재정적 갈등이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 미국 메릴랜드주 베데스다에 있는 국립 보건원(KP) K08EY0123998, (KP) R01EY030431, (KP) R21 EY02939, UW 비전 연구 핵심 보조금(NEI P30EY01730), Mark Daily, MD 연구 기금 및 Christopher and Alida Latham 연구 기금의 선물, 실명 예방 연구의 무제한 부서 보조금, 실명 예방 연구(KP)의 경력 개발 상. 브리스톨에서 수행 된 작업은 Sight Research UK와 The Underwood Trust의 추가 자금으로 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AK-FLUOR | Akorn Pharmaceuticals, IL, USA | 10% Fluorescein sodium 100 mg/mL in 5 mL vial | |
| AnaSed | Akorn Animal Health, IL, USA | NDC 59399-110-20 | Xylazine 20 mg/mL |
| Betadine 5% Sterile Ophthalmic Prep Solution | Alcon, TX, USA | 8007-1 | |
| B-D Precision Glide Needles -25 G | Becton, Dickinson and Company, NJ, USA | 305122 | |
| B-D Precision Glide needle -30-G | Becton, Dickinson and Company, NJ, USA | 305106 | |
| Bond MAX, Bond Rx | Leica Biosystems, IL,USA | Automated IHC staining system | |
| Chloramphenicol ointment | Martindale Pharma, Romford, UK | 1% w/w Chloramphenicol | |
| EG1150H | Leica Biosystems, IL,USA | Tissue Embedding | |
| Envisu R2300 | Bioptigen/Leica | OCT Machine | |
| Freund's Incomplete Adjuvant | BD Difco, NJ, USA | 263910 | |
| GenTeal lubricant eye ointment | Alcon, TX, USA | --- | |
| GenTeal lubricant eye gel | Alcon, TX, USA | --- | |
| H37Ra lyophilized Mycobacteria extract | BD Difco, NJ, USA | 231141 | |
| Hamilton RN Needle (33/12/2)S | Hamilton, Reno, NV | 7803-05(33/12/2) | 33 G |
| Hamilton syringe | Hamilton, Reno, NV | CAL7633-01 | 5 µL |
| Insulin needle | Exel International, USA | 26029 | 1 mL |
| Isoflurane | |||
| Ketaset | Zoetis, USA | 377341 | Ketamine HCL 100 mg/mL |
| Microinjection Syringe Pump and Micro4Controller | World Precision Instruments, FL, USA | UMP3 | |
| Micron IV | Phoenix Research Laboratories, Pleasanton, CA | Alternative Imaging/OCT Machine | |
| Nanofil 10 µL syringe | World Precision Instruments, FL, USA | NANOFIL | |
| Nanofil Intraocular Injection Kit | World Precision Instruments, FL, USA | IO-KIT | |
| Olympus SZX10 | Olympus | Dissection scope | |
| PBS | Gibco | 14190 | |
| Phenylephrine Hydrochloride Ophthalmic Solution USP 2.5% Sterile 15 mL | Akorn Pharmaceuticals, IL, USA | 17478020115 | |
| RM2255 | Leica Biosystems, IL,USA | Tissue Sectioning | |
| TB Syringe | Becton, Dickinson and Company, NJ, USA | 309602 | 1 mL |
| Tetracaine 0.5% | Alcon, TX, USA | 1041544 | |
| Tissue Tek VIP series | Sakura Finetek USA, Inc.,CA. | Histology Tissue Processing | |
| Tropicamide 1% | Chauvin Pharmaceuticals, Romford, UK | Minims | |
| Tylenol | Johnson & Johnson Consumer Inc, PA, USA | NDC 50580-614-01 | Acetaminophen |
| Viscotears | Novartis Pharmaceuticals, Camberley, UK | Carbomer eye gel 0.2% w/w |
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