Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Primed Mycobacterial Uveitis (PMU) som en modell för postinfektiös uveit

Published: December 17, 2021 doi: 10.3791/62925
Automatic Translation
1, 2, 1, 2, 1
1Department of Ophthalmology, University of Washington, 2Academic Unit of Ophthalmology, Translational Health Sciences, University of Bristol

Summary

Detta protokoll beskriver stegen för att inducera Primed Mycobacterial Uveitis (PMU) hos möss. Denna metod beskriver stegen för att producera tillförlitlig och robust okulär inflammation i musmodellsystemet. Med hjälp av detta protokoll genererade vi uveitiska ögon och oinflammerade medögon från enstaka djur för vidare utvärdering med immunologiska, transkriptomiska och proteomiska analyser.

Abstract

Termen "uveit" beskriver en heterogen uppsättning tillstånd som alla har intraokulär inflammation. I stort sett definieras uveit av etiologi: infektion eller autoimmunitet. Infektiös uveit kräver behandling med lämpliga antimikrobiella medel, medan autoimmun uveit kräver behandling med kortikosteroider eller andra immunsuppressiva medel. Postinfektiös uveit är en form av kronisk uveit som kräver kortikosteroider för att kontrollera immunföljder efter den första infektionen. Uveit associerad med Mycobacterium tuberculosis (Mtb) -infektion är en välkänd form av postinfektiös uveit, men sjukdomsmekanismerna är inte helt förstådda. För att förstå vilken roll mykobakteriella antigener och medfödda ligander spelar för att stimulera kronisk okulär inflammation efter mTB-infektion, utvecklades modellen Primed Mycobacterial Uveitis (PMU) för användning hos möss. Detta manuskript beskriver metoderna för att generera PMU och övervaka det kliniska förloppet av inflammation med hjälp av färgfundus och optisk koherenstomografi (OCT) avbildning. PMU induceras av immunisering med värmedödat mykobakteriellt extrakt följt av intravitreal injektion av samma extrakt i ett öga sju dagar senare. Okulär inflammation övervakas longitudinellt med hjälp av in vivo-avbildning och följs av provsamling för ett brett spektrum av analyser, inklusive histologi, flödescytometri, cytokinanalys, qPCR eller mRNA-sekvensering. Musmodellen av PMU är ett användbart nytt verktyg för att studera de okulära svaren på mTB, mekanismen för kronisk uveit, och för prekliniska effektivitetstester av nya antiinflammatoriska terapier.

Introduction

Termen "uveit" beskriver en heterogen uppsättning tillstånd som alla har intraokulär inflammation1. Djurmodeller av uveit är viktiga för att förstå sjukdomsmekanismer och för preklinisk testning av nya terapier. Ett antal djurmodeller av uveit har etablerats2. De två som har studerats mest omfattande är experimentell autoimmun uveit (eller uveoretinit; EAU) och endotoxininducerad uveit (EIU). EAU genereras vanligtvis genom immunisering med okulära antigener eller kan uppstå spontant när central tolerans störs i frånvaro av AIRE-genen 3,4. Andra varianter av modellen har sedan dess utvecklats 5,6,7 för att inkludera olika uveitogena peptider; dessa har granskats omfattande 8,9,10. EAU är den primära modellen för former av T-cellberoende autoimmun uveit såsom Vogt-Koyanagi-Haradas sjukdom och fågelhot korioretinit hos människor. EIU genereras genom systemisk eller lokal injektion av bakteriell lipopolysackarid (LPS)10,11. EIU har använts som en modell av akut uveit som genereras genom aktivering av medfödda immunsignalvägar12. Båda modellerna har varit avgörande för den nuvarande förståelsen av okulär immunologi, men inte heller effektiva modeller för postinfektiös kronisk uveit. Nyligen etablerad hos möss ger Primed Mycobacterial Uveitis (PMU) -modellen nu ett tillvägagångssätt för att förhöra och utvärdera kliniska och cellulära aspekter av denna form av uveit13.

Det finns en hög förekomst av mykobakteriell infektion över hela världen, med över 10 miljoner nya fall och mer än 1.4 miljoner dödsfall rapporterade av Världshälsoorganisationen 201914. Extrapulmonell manifestation av aktiv tuberkulosinfektion (TB) inkluderar uveit och är en välkänd orsak till infektiös uveit15,16. Manifestationerna av TB-associerad uveit är protean, vilket sannolikt återspeglar flera distinkta sjukdomsmekanismer för att inkludera direkt okulär infektion samt mindre väl förstådd immunmedierad inflammation17,18,19. De föreslagna mekanismerna för dessa postinfektiösa följdsjukdomar inkluderar ett kroniskt inflammatoriskt svar stimulerat av persistensen av en pauci-bacillärinfektion i retinalpigmentepitelet (RPE), ett kroniskt inflammatoriskt svar stimulerat av närvaron av kvarvarande patogenassocierade molekylära mönster (PAMP) från en framgångsrikt rensad okulär infektion och olämplig aktivering av det adaptiva immunsvaret mot okulära antigener genom en process av molekylär mimik eller antigen spridning orsakad av systemisk TB-infektion20,21,22,23.

För att få en bättre mekanistisk förståelse av kronisk postinfektiös uveit och studera rollen av mykobakteriella antigener vid initiering av sjukdom utvecklades PMU-modellen för användning hos möss13,24. För att framkalla inflammation får musen därför först en subkutan injektion av antigen från den värmedödade Mycobacterium tuberculosis H37Ra-stammen för att efterlikna systemisk infektion, följt sju dagar senare av intravitreal injektion av samma antigen administrerat till vänster eller höger öga för att efterlikna lokal okulär infektion. Intensiteten och varaktigheten av den efterföljande uveiten övervakas genom longitudinell in vivo optisk koherenstomografi (OCT) och fundal avbildning av ögat25. PMU kännetecknas av en akut, myeloid-dominerande panuveit som utvecklas till en kronisk T-celldominerande bakre uveit med vitrit, perivaskulär retinal inflammation och fokalområden med yttre retinal skada26. Förekomsten av granulomatös inflammation i det bakre segmentet av ögat tyder på att PMU-modellen kan användas för att studera vissa former av främre (granulomatös och icke-granulomatös) och mellanliggande uveit, sett hos patienter med immunologiska bevis på tidigare Mtb-infektion27. Dessutom har komponenterna i värmedödad Mtb som används i PMU-modellen föreslagits för att utlösa immunsvar som ligger till grund för aspekterna av återkommande uveit hos patienter med okulär tuberkulos som svarar på anti-tuberkulär terapi (ATT)28. På grund av skillnaderna i sjukdomsinitiering och inflammatoriskt förlopp jämfört med EAU och EIU representerar PMU en ny djurmodell av uveit som inte är beroende av immunisering med okulära antigener och kan hjälpa till att belysa sjukdomsmekanismer hos patienter med kronisk uveit. Detta protokoll beskriver metoderna för att generera PMU, övervaka det kliniska förloppet av inflammation och samla in okulära prover för post-mortemanalys med flödescytometri.

Protocol

Alla utförda procedurer godkändes lokalt av djurvårds- och användningskommittén vid University of Washington (djurstudieprotokoll # 4481-02) eller i överensstämmelse med Storbritanniens inrikeskontorslicens (PPL 30/3281) och University of Bristol Ethical Review Group. Experiment som utfördes vid båda institutionerna överensstämde med Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Visual Research. PMU genererades i 6-10 veckor gamla C57BL / 6J-möss; alla möss vägde minst 18 g vid tidpunkten för uveitinduktion och bekräftades negativa för rd8-mutationen av Crb1-genen29. Möss bibehölls med standard chow och medicinskt vatten (paracetamol 200-300 mg/kg/dag) ad libitum under specifika patogenfria förhållanden. Djurdödshjälp utfördes med hjälp av en standard koldioxidinhalationsmetod30.

1. Antigenpreparat för subkutan injektion

  1. Utför alla procedurer i detta avsnitt inuti en kemisk dragskåp för att förhindra inandning eller hudkontakt med Mtb H37Ra-pulvret. Hantera enligt dina institutionella policyer för Complete Freunds adjuvans (vanligtvis BSL-1). Detta inkluderar användning av kemikalieresistenta handskar, skyddsglasögon och skyddande arbetskläder (labbrock).
  2. Använd en bra steril teknik för att förhindra kontaminering av reagens som kommer att införas i försöksdjur.
  3. Gör Mtb-suspensionen i PBS genom att blanda 5 mg frystorkat, värmedödat M. tuberculosis H37Ra-pulver med 2,5 ml kallt PBS i ett 5 ml mikrocentrifugrör. Vortex en gång i 30 s och lägg sedan på is.
  4. För att generera en fin suspension av H37Ra i PBS, sonikera suspensionen på is i 5 minuter.
    1. Lossa omvandlarenhetens kropp och rengör sonden med en 70% (v / v) alkoholpinne.
    2. Slå på sonicator, justera ströminställningen till 4 genom att vrida på strömreglaget och fördjupa sondens spets i PBS-innehållande mykobakteriellt pulver. Se till att sondspetsen är nedsänkt till minst hälften av provets djup och att sondspetsen inte vidrör mikrocentrifugrörets vägg.
  5. Sonicate blandningen på is i 30 s, pausa 30 s och upprepa i totalt 5 min för att helt sprida pulvret i en jämn suspension utan att värma vätskan.
  6. Tillsätt 2,5 ml Freunds ofullständiga adjuvans till blandningen och upprepa ultraljudsbehandlingsprocessen på is tills emulsionen bildar en tandkrämliknande konsistens.
  7. Ställ in strömmen till 0 med kontrollvredet och stäng av enheten för att avsluta ultraljudsbehandlingen. Ta bort spetsen från suspensionen och torka av sonden med en alkoholpinne.
  8. Förvara antigenemulsionen vid 4 °C. Att göra satser av emulsionen hjälper till att säkerställa konsistens mellan experiment. Emulsionen kan förvaras vid 4 °C i upp till 3 månader.

2. Subkutan injektion

  1. Utför subkutan injektion en vecka före den intravitreala injektionen (betecknad som dag -7).
  2. Ladda en 1 ml spruta (ingen nål fäst) med mykobakteriell emulsion. På grund av emulsionens viskositet och opacitet kan svåra att se luftbubblor fylla sprutan.
    1. För att förhindra luftbubblor i sprutan, efter att ha laddat 0,2-0,3 ml emulsion, vänd sprutan (spetsen uppåt) och knacka försiktigt på sprutan upprepade gånger på kanten av en räknare för att föra bubblorna till ytan.
  3. Släpp ut luften från sprutan och fortsätt fylla sprutan. Invertera och tryck ibland tills den är fylld.
  4. Placera en 25 G nål på sprutan och för vidare emulsionen för att fylla nålen. Förvara sprutan på is tills den används.
  5. För att utföra den subkutana injektionen på ett säkert sätt, antingen bedöva musen eller använd humana fasthållningsmetoder som möjliggör enkel åtkomst till djurets bakkvartsparter31.
  6. För att bedöva för subkutan injektion, placera djuret i en isofluraninduktionskammare (3% -4% för induktion och 1% -3% för underhåll). När du är bedövad, se till att musen har en långsam andningsfrekvens och inte uppvisar några tecken på andningsbesvär.
  7. Placera de subkutana injektionerna på antingen höftens dorsala yta eller på benens ventrala yta proximala till området för de inguinala lymfkörtlarna.
    1. Sätt försiktigt in nålen för att förhindra injektion i muskeln. Injicera 0,05 ml av Mtb-emulsionen i det subkutana utrymmet. Ta inte bort nålen omedelbart så att den tjocka emulsionen kan injiceras helt.
    2. Upprepa injektionen på både vänster och höger sida i totalt 0,1 ml per djur.
  8. Om du bedövas, placera musen på en varm värmedyna tills fullständig återhämtning. Lämna inte musen utan uppsikt förrän den har återfått tillräckligt med medvetande för att upprätthålla sternal recumbency.
  9. Sätt tillbaka musen i buren när den är helt återställd och märk burkortet med datumet för subkutan injektion.
  10. Ge analgesi med oralt paracetamol (200 mg/kg/dag), men inte NSAID eftersom antiinflammatoriska medel kan påverka induktionen av uveit.

3. Antigenberedning för intravitreal injektion

  1. Utför alla procedurer i detta avsnitt under lämpliga sterila förhållanden för att förhindra kontaminering av den intravitreala Mtb-suspensionen.
  2. Gör de intravitreala suspensionerna.
    1. För induktion av mild till måttlig panuveit, gör den intravitreala suspensionen vid en koncentration på 5 mg / ml genom att tillsätta 5 mg av mykobakterieextraktet till 1 ml 1x PBS.
    2. För induktion av måttlig till svår panuveit, gör den intravitreala suspensionen vid en koncentration på 10 mg / ml genom att tillsätta 10 mg av mykobakterieextraktet till 1 ml 1x PBS.
  3. Vortex en gång i 30 s och lägg sedan på is.
  4. För att generera en fin suspension av H37Ra i PBS, sonikera suspensionen på is i 10 minuter enligt beskrivningen i steg 1.4. Alikvotera denna stamlösning i 100 μl volymer och förvara vid -20 °C.
  5. Före användning, tina vid rumstemperatur och virvla på hög i 1 min. Håll alikvoterna på is under transport till djuranläggningen.

4. Intravitreal injektionsprocedur på dag 0

  1. Förberedelse av djur
    1. Använd monterade undersökningshandskar, placera musen på en vägningsbalans för att få sin vikt i gram.
    2. Ge en intraperitoneal injektion på 0,02 ml/g kroppsvikt av en lösning innehållande 100 mg/ml Ketamin och 20 mg/ml Xylazin blandat med sterilt vatten för att bedöva djuret. Ett alternativt tillvägagångssätt inkluderar induktion med ~ 1,5% isofluran (inhalerad).
    3. Vänta cirka 2 minuter tills musen somnar och lägg sedan musen i en värmelåda och täck locket. Utför smärtreflextester som öron-, tå- och svansnypa för att bedöma anestesidjupet för proceduren32.
    4. När du sover, bedöva hornhinnan med 1 droppe 0,5% (v / v) tetrakain. Undvik att få tetrakain nära musens näsa eller mun. Efter 10 s, badda bort överskottsvätskan.
      OBS: Det har observerats att irisutvidgning och visualisering av främre kammare (AC) förbättras när topisk anestesi administreras, eventuellt på grund av förbättrad hornhinnereflexundertryckning med den kombinerade systemiska och aktuella anestesi. Detta steg kan dock utelämnas om så önskas.
    5. Vidga pupillen med 1 droppe av 2,5% (v/v) fenylefrin. Var försiktig för att undvika överflödiga droppar som kan komma in i näsan eller munnen. Efter 2-3 min, badda bort överskottsvätskan.
    6. För att minska risken för endoftalmit, tillsätt 1 droppe 5% betadin till ögonytan och omgivande hår. Låt stå på ögat i 2-3 min.
      OBS: Utför alla procedurer i detta avsnitt under lämpliga sterila förhållanden för att förhindra endoftalmit.
    7. Ta bort betadin och täck ögat med hypromellos (0,3%) eller karbomer ögongel 0,2% w/w) för att förhindra torrhet under anestesi. Detta kommer också att bidra till att förhindra kataraktbildning.
  2. Ställa in mikroinjektionssystemet
    1. Utför den intravitreala injektionen med en mikropump ansluten till en mikrosprutpumpsregulator och en injektionsspruta (figur 1A-C). Alternativt kan du injicera med en 33 G-nål fäst vid en Hamiltonspruta enligt beskrivningen i avsnitt 4.4.
    2. Anslut en 34 G nål till injektionshållaren för att montera injektorn. Lossa silverskruvlocket i den främre änden av injektionshållaren och skjut nålen in i hållarens kropp ungefär halvvägs. Dra åt silverskruvlockets finger ordentligt.
    3. Anslut slangen till injektionshållaren enligt steg 4.2.4–4.2.5.
    4. För att sätta in slangen på injektionshållaren, lossa plastskruven på hållarens bakre ände, skjut slangen genom packningen inuti och dra åt skruven.
    5. Håll ett litet mellanrum med slangens ände för att förhindra slangskador under injektionen. Se figur 1C.
    6. Tina en alikvot på 100 μl av mycobacterium-stamsuspensionen.
    7. Tillsätt 3 μL av en 1% fluoresceinnatriumlösning (AK-Fluor) och virvelbrunn.
    8. Ladda en 10 μl spruta med antigen- och fluoresceinblandningen utan att inkludera några luftbubblor.
    9. Ta bort lastnålen från sprutan och skjut slangen genom silverskruvlockets packning tills spetsen når nollmärket i sprutkroppen.
    10. När slangens spets är korrekt inriktad på önskat läge, dra åt skruvlockets finger ordentligt.
    11. Spola lösningen i sprutan genom injektionsslangen för att ladda systemet helt. Upprepa sedan steg 4.2.8-4.2.11 för att ladda om sprutan för injektion.
    12. För att installera den laddade sprutan på mikropumpen, tryck på klämutlösningsknappen i slutet av mikropumpen för att öppna sprutklämmorna.
    13. Placera kolvens lock i kolvhållaren i mikropumpens bakre ände.
    14. Skjut sedan sprutkragen på kragestoppet och sprutkroppen in i sprutklämman.
    15. Lossa klämknappen och dra åt kolvens fästskruv. Se figur 1D.
    16. Skjut injektionshållaren och nålen genom o-klämman på den stereotaktiska injektionsapparaten. Detta är en anpassad plattform; Alternativt kan sprutan hållas och placeras manuellt.
    17. Ställ in infusionsvolymen och infusionsvolymens hastighet på mikrosprutpumpens regulator för att injicera 500 nL per cykel med en hastighet av 40 nL/s.
      OBS: Snabbare injektionshastigheter kan användas, men mer återflöde kan upplevas innan nålomplacering kan uppnås.
    18. Testa systemet för att säkerställa att det fungerar korrekt innan du utför en intravitreal injektion.
      OBS: När injektionssystemet fungerar korrekt kommer aktivering av en injektionscykel med fotpedalen eller kontrollplattan att ge synlig rörelse av kolvlockhållaren och en liten droppe grönaktig vätska kommer att ses vid nålspetsen. Om ingen vätska produceras, aktivera ytterligare cykler eller spola och ladda om sprutan.
    19. Innan du injicerar ögat, torka försiktigt av nålen med en 95% etanolkudde.
  3. Intravitreal injektionsförfarande
    1. Musen placeras på en stereotaxisk apparat för att utföra injektionsproceduren.
    2. Håll scenen/plattformen som musen vilar på varm genom att fästa 2-3 pappershanddukar på ytan.
    3. Placera musen i ett benäget läge på plattformen. Använd höger och vänster öronstänger för att försiktigt fixa djurets huvud. Se figur 1E.
    4. Placera musen och orientera under omfånget så att den överlägsna nasala aspekten av höger öga är synlig.
    5. Använd en 30 G nål för att förskjuta ögonfransarna och exponera sclera. Visualisera limbus och det radiella blodkärlet.
    6. Använd en steril 30 G nål för att göra ett styrhål i sclera 1-2 mm bakom limbus.
    7. För in 34 G-nålen som är fäst vid injektionshållaren i ögat genom styrhålet i en vinkel som undviker linsen, men placera nålspetsen i glaskroppen.
    8. Använd mikrosprutpumpens styrenhet och injicera försiktigt 1 μl av Mtb-extraktet i glaskroppen. Vid konsekvent återflöde, öka injektionsvolymen till 1,5 μL för att säkerställa adekvat dosleverans.
      OBS: För skenkontroller, injicera 1 μL PBS i djurets öga.
    9. Verifiera intravitreal placering genom visualisering av en grönaktig reflex i ögat. Se figur 1F.
    10. Efter 10 s, dra ut nålen från ögat. Notera eventuell återflöde.
    11. Ta bort musen från plattformen, placera 0,3% hypromellos eller 0,2% w karbomer ögonsalva på båda ögonen för hornhinneskydd och flytta till återhämtningsvärmningsboxen.
    12. Lämna inte musen utan uppsikt förrän den har återfått tillräckligt med medvetande för att upprätthålla sternal recumbency. Återvänd inte till sällskap med andra djur tills de är helt återställda.
    13. När musen är helt vaken, återgå till buren och tillsätt paracetamol (200-300 mg/kg/dag) medicinsk vattenflaska. Märk burkortet med datum för IVT-injektion.
    14. Intravitreala injektioner tolereras i allmänhet väl. Kliniska tecken som kan indikera smärta och behovet av borttagning från studien inkluderar periokulär alopeci (indikerar självtrauma), hornhinnesår, viktminskning och böjd hållning.
  4. Alternativ metod för intravitreal injektion
    OBS: Denna procedur utförs med hjälp av ett operationsmikroskop och en 33 G nål på en mikrospruta.
    1. Proptose ögat och håll det på plats med ett par pincett.
    2. Applicera sedan karbomer ögongel 0,2 % w/w eller 0,3% hypromellos ögongel och placera en cirkulär täckglas (7 mm diameter) över ögat.
    3. Montera en 33 G hypodermisk nål på en 5 μL Hamilton spruta och sätt in den ca 2 mm omkrets i hornhinnans limbus med en ~45° injektionsvinkel.
    4. Led nålavfasningen in i glaskroppen, stanna mellan linsen och den optiska skivan (ur kirurgens relativa synvinkel är detta ovanför / täcker optisk skiva - cirka 1,5 mm från insättningsstället) och injicera 2 μL Mtb (vid 2,5 ug / μL i PBS) långsamt.
    5. Håll nålen på plats en kort stund (för att minska mängden återflöde av injektorat) och ta sedan bort den.
    6. Efter injektion, återta jordklotet genom att släppa pincett. En droppe av 1% w / w kloramfenikolsalva kan administreras till ögat vid denna tidpunkt för att ge ytterligare skydd mot endoftalmitis efter injektion.
    7. Efter injektionen, flytta till återvinningsuppvärmningsboxen enligt steg 4.3.11-4.3.13.

5. OCT-avbildning för att detektera och kvantifiera uveit

  1. Förberedelse av djur
    1. Bedöva musen enligt beskrivningen i steg 4.1.2-4.1.4
    2. Utvidga pupillen med 1 droppe 2,5% fenylefrin. Var försiktig för att undvika överflödiga droppar som kan komma in i näsan eller munnen. Efter 2-3 minuter, badda bort överskottsvätskan.
    3. Placera 0,3% hypromellos eller 0,2% w/w karbomergel på ögat för att förhindra torrhet under narkos. Detta kommer också att bidra till att förhindra kataraktbildning.
    4. Vik musen i ett lager av kirurgisk gasbindning för att bibehålla kroppsvärmen och placera den på djurkassetten. Placera huvudet med bettstången.
  2. Skaffa OCT-bilderna av de främre och bakre kamrarna.
    OBS: Om du får främre och bakre kammarbilder, skaffa de bakre kammarbilderna (PC) först för att förhindra bildnedbrytning efter kataraktbildning. Kataraktbildning kan förhindras med frekvent smörjning och applicering av 0,3% hypromellos eller 0,2% w karbomer ögongel. För utökad avbildning (>10 min) hjälper det också att hålla musen varm (genom att använda en värmepanna).
    1. När du har slagit på OCT-bildsystemet, säkra rätt bildlins och justera referensarmens position efter behov.
    2. Öppna bildprogramvaran, skapa det unika mus-ID och börja avbildning enligt OCT-tillverkarens protokoll.
    3. Använd Free Run-alternativet med snabbsökningsprotokollet och placera ögat med synnerven centrerad på bakre kammarbilder eller hornhinnans topp på främre kammarbilder.
      OBS: Tabell 1 innehåller avbildningsprotokollparametrar för två kommersiellt tillgängliga bildsystem för små djur. Se materialförteckningen för produktspecifikationer.
    4. För bakre kammaravbildning, för OCT nära ögats yta. Var försiktig för att undvika att linsens yta kommer i kontakt med ögat.
    5. När ögat är korrekt placerat stoppar du snabbskanningen och väljer volymskanningsprotokollet och aktiverar skanningen med alternativet Sikta .
    6. För bilder av bakre segment justerar du tills synnerven är centrerad i bilden Horisontell B-skanningsjustering och att näthinnan är i linje med den vertikala justeringsaxeln
    7. För bilder av främre segment justerar du positionen så att hornhinnans topp centreras i både bilden Vågrät B-skanningsjustering och Lodrät justering B-skanningsjustering. Närvaron av en reflektionsartefakt i båda bilderna kommer att bekräfta korrekt inriktning. Flytta sedan den horisontella bilden tillräckligt för att ta bort reflektionsartefakten. Se figur 2.
    8. Klicka på Snapshot för att fånga volymskanningsbilden och klicka sedan på Spara.
    9. Därefter hämtar du den genomsnittliga centrala linjesökningen. Öppna skanningsprotokollet och klicka på Aim följt av Snapshot. Högerklicka på samma panel och klicka sedan på Genomsnitt.
    10. Upprepa steg 5.2.1-5.2.9 för varje öga med båda linserna.
    11. När alla bilder har samlats in tar du bort musen från kassetten och ger hornhinneskydd under återställningen enligt stegen 4.3.11-4.3.13.

6. Poängsättning av inflammation av OCT

  1. Gör OCT-bilderna med hjälp av väghyvlar som är maskerade till behandlingstillståndet.
    För PMU i musmodellen rekommenderas poängsystemet i tabell 2 .
  2. Om både främre kammarbilder (AC) och bakre kammarbilder (PC) erhölls, kombinera dessa poäng för att få slutresultatet för varje öga.
    OBS: Främre kammarinflammation löser sig före bakre kammarinflammation.

7. Poängsättning av inflammation genom post-mortem histologi

  1. I slutet av experimentet, samla enskilda ögon genom enucleation, fixa i 4% formaldehyd över natten och fortsätt för paraffinbäddning, sektionering och H&E-färgning33.
    OBS: Flera 4-8 μm sektioner längs den pupillär-optiska nervaxeln rekommenderas.
    OBS: Tre sektioner per öga poängsätts av en maskerad väghyvel med hjälp av poängsystemet i tabell 3, och den genomsnittliga poängen för de tre sektionerna rapporteras som den slutliga histologiinflammationspoängen.

Representative Results

Detta protokoll visar induktion av uveit hos möss med hjälp av den grundade mykobakteriella uveitmodellen (PMU). Att säkerställa konsistens i den subkutana injektionen och noggrannheten hos den intravitreala injektionen är viktiga steg i utvecklingen av den grundade mykobakteriella uveitmodellen (PMU). Figur 1 visar musens intravitreala injektionsprocedur med hjälp av en stereotaxisk apparat. Öronstänger hjälper till att försiktigt placera huvudet på samma plats under mikroskopet (figur 1E). De håller också huvudet stabilt under det intravitreala injektionsförfarandet, vilket minskar risken för injektionstrauma. Efter en lyckad injektion producerar fluorescein i injektionslösningen en grönaktig reflektion inifrån ögat som kan ses under mikroskopet eller från en sidovy som visas i figur 1F.

När det utförs enligt beskrivningen genererar protokollet robust akut uveit som kan detekteras med hjälp av OCT- och fundus-avbildning så tidigt som 10 timmar efter intravitreal injektion. Figur 2 visar den korrekta inriktningen av ögat för OCT-avbildning. I tabell 1A förtecknas de parametrar som används i ULT-protokollet. Ett systematiskt tillvägagångssätt för att få bilder kommer att ge högkvalitativa bilder som kan jämföras över tiden. Främre kammarbilder centreras på hornhinnans topp med hjälp av SLO-bilden en face (figur 2A) med iris i linje parallellt med både horisontella och vertikala plan (figur 2B,C). Volym- och linjeskanningar fångas med en vertikal inriktning så att sämre och överlägsna regioner kan ses samtidigt. Bakre segmentbilder centreras på synnerven med hjälp av SLO-bilden i ett ansikte (figur 2D), och RPE: s ljusa band används för att rikta in näthinnan parallellt med både horisontella och vertikala plan (figur 2E, F).

Figur 3 visar typiska fynd av PMU-okulär inflammation med OCT-avbildning. Tjugofyra timmar efter intravitreal injektion ses inflammatoriska celler i vatten och glasaktiga (figur 3B). I närvaro av måttlig eller svår inflammation kommer en hypopyon att ses i den sämre vinkeln i AC. Graden av okulär inflammation kan poängsättas på dessa OCT-bilder med hjälp av de kriterier som anges i tabell 2. Representativa exempel på bilder som visar de inflammatoriska egenskaper som är typiska för varje poäng visas i figur 4. AC- och PC-kammarpoäng kan läggas ihop för att generera den kombinerade OCT-poängen. Kombinerade poäng >0 men ≤2,5 representerar mild inflammation. Måttlig inflammation bestäms av poängen >2,5 men ≤4,5. Poäng >4,5 identifierar allvarlig inflammation. Inflammation toppar vanligtvis 48 timmar efter intravitreal injektion med OCT-poäng i AC och PC mellan 1 och 3 (kombinerade poäng mellan 2 och 6). AC- och PC-poäng på 0,5 eller 4 är mindre vanliga. Om poäng utanför det typiska intervallet påträffas ofta kan felsökning krävas för att identifiera de faktorer som bidrar till avvikande poäng (se diskussionsavsnittet). Inflammationspoäng i den främre kammaren tenderar att återgå till noll inom en vecka efter intravitreal injektion. Däremot återgår inte bakre poäng till noll; Istället kvarstår kronisk inflammation på låg nivå i form av vitrit, och perivaskulära lymfocyter infiltrerar i näthinnan i 1-2 månader efter intravitreal injektion.

Inflammationspoäng i PMU kan också bestämmas med hjälp av histologi. Figur 5 visar representativa H&E-sektioner för användning vid poängsättning av svårighetsgraden av PMU efter histologi. Antalet inflammatoriska celler i vattenhaltiga och glasaktiga räknas och används för att bestämma svårighetsgraden med hjälp av poängkriterierna i tabell 3. Inflammatorisk cellinfiltration av ciliärkroppen ses vanligtvis på ena sidan av histologisektionen (ensidig inblandning) vid mild eller måttlig inflammation. När inflammation är svår återspeglas detta av närvaron av ett inflammatoriskt cellinfiltrat i ciliärkroppen på båda sidor av linsen (kallad bilateral involvering). Under senare tidpunkter efter intravitreal injektion kan kroniska inflammationsmanifestationer, inklusive närvaron av perivaskulära och intraretinala leukocyter och yttre retinala veck, också identifieras. Histologi kan också vara till hjälp för att identifiera ögon som påverkas av dålig injektionsteknik. Trauma mot linsen under den intravitreala injektionen kan identifieras genom närvaron av amorfa eosinfärgade (rosa) linsproteiner utanför linskapseln intill traumaområdet. Återflöde av intravitreal mTB i subkonjunktivalutrymmet kommer att generera inflammation utanför ögat som kan identifieras genom en noggrann granskning av periokulära strukturer som finns på sektionerna. På grund av misslyckandet med att behålla mTB-extrakt i ögonen, dessa ögon kommer vanligtvis att ha låga OCT poäng av inflammation.

Brightfield fundus-avbildning kan också användas för att identifiera kliniskt relevanta aspekter av PMU, inklusive utveckling av hypopyon, vitrit och retinal eller perivaskulär inflammatorisk cellinfiltration. Figur 6 visar två exempel där retinal och perivaskulär inflammation kan ses på fundusbilder. Dessa två ögon visar också det inflammationsintervall som är vanligt i PMU-modellen. I tabell 1B visas de parametrar som används i bildsystemet fundus/retinal OCT. Observera den inverkan som allvarlig inflammation har på bildkvaliteten (figur 6, dag 2, OCT- och fundusbilder i den övre raden) och omfattningen av sjukdomen som finns på dag 21. Hornhinneödem kan också minska bildkvaliteten under akut inflammation; Det är dock ovanligt att hornhinneödem är allvarligt från inflammation ensam. Mer vanligt kommer bildkvaliteten att försämras av epitelskador till följd av ofullständigt ytskydd under avbildning och anestesihändelser.

PMU-modellen kan användas för att inducera uveit i vilken musras eller genotyp som helst. I albinoögon kan OCT fortfarande användas för att poängsätta inflammation, men frånvaron av funduspigment gör visualisering av inflammation utmanande genom brightfield-avbildning13,34. Post mortem-studier kan utföras på okulära vävnader, regionala lymfkörtlar eller mjälten. Några exempel inkluderar analyser för förekomst av immunceller såsom flödescytometri och immunohistokemi och mätning av inflammatoriska cytokiner. Vid alla tidpunkter som testats efter initiering av inflammation med PMU (dag 1 till dag 56) finns det tillräckligt med CD45 + inflammatoriska celler närvarande i enskilda ögon för att upptäcka många stora leukocytpopulationer i ögat genom flödesanalys med flera parametrar12,35. Vattenhaltiga (2-5 μL) och glasaktiga (5-10 μL) humor kan samlas in från inflammerade ögon för bestämning av proteinkoncentration, proteomiska studier eller cytokinkoncentrationsbestämning36.

Figure 1
Bild 1: Inställning av intravitreal injektion med mus. Den intravitreala injektionen utförs på musögat med (A) en mikrosprutpumpsregulator ansluten till (B) mikropumpen och (C) en injektionsspruta. Sprutan laddas och monteras på (D) Micropump. Mushuvudet är placerat med (E) öronstänger för att säkerställa stabilitet och konsistens under den intravitreala injektionsproceduren. (F) Fluorescein i injektionslösningen ger en grönaktig reflektion inifrån ögat efter ett framgångsrikt förfarande. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Korrekt inriktning av ögat för OCT-avbildning . (A) Med hjälp av SLO-bilden (en-face scanning laser ophthalmoscope) är ögat centrerat för främre kammaravbildning. Den gröna linjen anger positionen för den vågräta linjegenomsökningen som visas i panelen (B). Observera att den centrala hornhinnan undviks för att minska reflektionsartefakten. (C) Vertikal B-skanning genom den paracentrala främre kammaren. Denna skanning erhålls vid 90 ° från den horisontella skanningen. Observera att inriktningen av irissektionerna på varje sida av linsen är jämn i den horisontella skanningen (panel B) och ordnad ovanför varandra i den vertikala skanningen (panel C). (D) Med hjälp av SLO-bilden är den bakre kammarbilden centrerad på synnerven. (e) horisontell B-skanningsinriktning, (f) vertikal B-skanningsinriktning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Induktion av PMU genererar panuveit som kan övervakas genom longitudinell OCT-avbildning. Den övre raden visar främre kammaren (AC); den nedre raden visar bilder från bakre kammaren (PC) OCT för att markera patologiska förändringar i sjukdomsförloppet. (A) Baslinjebild av OCT av AC (överst) och PC (botten) före induktion av uveit, båda får poäng 0. (B) Dag 1 efter intravitreal injektion som visar förekomst av hornhinneödem (svart pil), en hypopyon (*) flera fritt flytande inflammatoriska celler i AC (vita pilar) och vitrit (vita pilspetsar) i PC. (C) Dag 7 efter intravitreal injektion med få AC-celler på den främre linskapseln (vit pil) och minskad vitrit (vit pilspets). (D) Dag 28 efter intravitreal injektion främre kammare med upplöst AC-inflammation och mild vitrit. Förkortningar: C- hornhinna, L-lins, I- iris, Aq - vattenhaltig, V glasögon, RGC - retinala ganglionceller, PR - fotoreceptorer, Ch- choroid. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Exempel på OCT-poäng. En OCT-poäng mellan 0 och 4 tilldelas varje AC-bild och PC-bild med hjälp av det kategoriska systemet som visas i tabell 2. AC- och PC-poängen kombineras för den slutliga OCT-poängen för ögat. (A,D) Exempel på en poäng på noll. (B,E) Exempel på en poäng på 0,5. (C,F) Exempel på en poäng på 1. (G,J) Exempel på en poäng på 2. (H,K) Exempel på en poäng på 3. (I,L) Exempel på en poäng på 4 visas i panelerna I och L. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Exempel på histologipoäng. Histologipoäng bestäms utifrån fem egenskaper som är synliga i H&E-sektioner: Främre kammarproteindensitet, främre kammarcellnummer, immuncellinfiltration av ciliärkroppen, glaskroppstäthet, retinal vaskulär inflammation och strukturella retinala förändringar. En poäng på 0-2 tilldelas för varje egenskap. Beskrivningen av varje poäng finns i tabell 3. En representativ exempelpoäng på 0-2 för varje egenskap visas i denna figur. Den vänstra kolumnen visar poängen noll. I mittkolumnen visas exempel på poäng 1. Den högra kolumnen visar exempel på poäng 2. En poäng på 2 för ciliär kroppspoäng tilldelas om den ciliära kroppen på vardera sidan av linsen i samma sektion visar cellulär inflammation. Den slutliga histologipoängen är summan av poängen för vart och ett av de fem kriterierna (maxpoäng 10). Pilen i den nedre högra panelen indikerar perivaskulära leukocyter associerade med ett ytligt retinalt kärl. Svart skalstreck indikerar 500 μm. Ciliary skalfält indikerar 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 6
Figur 6: Longitudinell fundusavbildning i PMU identifierade en rad sjukdoms svårighetsgrad . (A) Allvarligt inflammerade ögon visar flera vita infiltrat i näthinnan och vaskulär tortuositet på färgfundusavbildning (övre raden) samt tät vitrit och retinalt ödem på OCT (nedre raden) på dag 2. Progression i antalet retinala lesioner kan ses över tid medan vitriten förbättras. Grön linje anger positionen för OCT-bilden. (B) Lindrigt inflammerade ögon uppvisar färre och mer diskreta linjära lesioner i fundus och ett antal infiltrerande celler i glaskroppen. Skalstreck = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

A
Mus främre kammare Snabb genomsökning Genomsökning av volym Linjär skanning
Längd X bredd 4,0 mm x 4,0 mm 3,6 mm x 3,6 mm 3,6 mm
Vinkel 0 90 90
A-scan/B-Scan 800 1000 1000
# B-skanningar 50 400 1
Ramar/ B-skanning 1 3 20
Mus bakre kammare Snabb genomsökning Genomsökning av volym Linjär skanning
Längd X bredd 1,6 mm x 1,6 mm 1,6 mm x 1,6 mm 1,6 mm
Vinkel 0 0 0
A-scan/B-Scan 800 1000 1000
# B-skanningar 50 200 1
Ramar/ B-skanning 1 3 20
B
Mus bakre kammare Genomsökning av volym Linjär skanning
Längd X bredd 0,9 mm x 0,9 mm 1,8 mm
Vinkel 0 Alla (vanligtvis 0 eller 90)
A-scan/B-Scan 1024 1024
# B-skanningar 512 1
Ramar/ B-skanning 1 30

Tabell 1: Skanningsparametrar. A) Parametrar för genomsökning av utomeuropeiska länder och territorier. (B) Parametrar för genomsökning av Fundus/retinal ULT

Beskrivningar av OCT-poäng
Tjog Främre kammaren Bakre kammaren
NA Ingen utsikt bortom främre hornhinnan Ingen vy över det bakre segmentet
0 Ingen inflammation Ingen inflammation
0.5 1–5 celler i vattenhaltiga Få celler upptar mindre än 10% av glaskroppen
ELLER hornhinneödem Inga subretinala eller intraretinala infiltrat eller retinala arkitekturstörningar
1 6–20 celler i vattenhaltiga Diffusa celler (inga täta klumpar) som upptar mellan 10 och 50% av glaskroppen.
ELLER ett enda lager av celler på den främre linskapseln Inga subretinala eller intraretinala infiltrat eller retinala arkitekturstörningar
2 20–100 celler i vattenhaltiga Diffusa celler (inga täta klumpar) som upptar > 50% av glaskroppen
ELLER färre än 20 celler och en hypopyon närvarande Inga subretinala eller intraretinala infiltrat eller retinala arkitekturstörningar
3 20–100 celler i vattenhaltiga Diffusa celler lika med grad 2 och 1
OCH en hypopyon ELLER ett pupillmembran OCH minst en tät glasaktig opacitet som upptar 10%-20% av glaskroppen ELLER närvaron av glasögonceller lika med grad 2 och sällsynta (≤ 2) subretinala eller ntraretinala opaciteter
4 Valfritt antal vattenhaltiga celler Tät glasaktig opacitet som upptar > 20% av glaskroppen.
OCH en stor hypopyon och pupillmembran ELLER främre strukturförlust på grund av allvarlig inflammation ELLER diffusa glasceller med stora subretinala eller intraretinala opaciteter

Tabell 2: Poängkriterier för PMU ULT: OCT-bilder poängsätts enligt de kriterier som anges i tabellen. AC- och PC-poäng läggs till för att få ögats slutpoäng. I de fall där en tydlig syn på ögat inte förvärvades tilldelades en poäng av NA till bilderna, och dessa uteslöts från studien.

Histologi Poäng Beskrivning
Kännetecken 0 1 2
Främre kammare (AC) Protein Knappa acellulära partiklar som färgar med eosin i AC Måttlig, men inte sammanflytande, extracellulär eosinfärgning var som helst i AC Sammanflytande eller nära sammanflytande extracellulär eosinfärgning i hela AC
Främre kammare (AC) Cell Inga celler 1–100 celler, men inga täta aggregeringar av celler >100 celler eller täta aggregeringar av celler
Ciliary Kropp Inflammation Ingen leukocytinfiltration av den ciliära kroppen eller omgivande glaskroppar Ensidig närvaro av leukocyter som infiltrerar den ciliära kroppen och/eller den omgivande glaskroppen. Bilateral närvaro av leukocyter som infiltrerar ciliärkroppen och/eller det omgivande glaskroppen.
Retinal vaskulär inflammation Inga retinala kärl med perivaskulära leukocyter Ett kärl per sektion med perivaskulära leukocyter >1 kärl per sektion med perivaskulära leukocyter
Retinal veck eller skada Ingen näthinneskada 1–3 näthinneveck per sektion >3 näthinneveck per sektion, eller någon annan retinal skiktförstöring eller intraretinal blödning

Tabell 3: Poängkriterier för PMU-histologi: H&E-delar av ögat poängsattes utifrån de kriterier som anges i tabellen. Tre sektioner från samma öga poängsattes och medelvärdet för att få den slutliga histologipoängen för ögat.

Discussion

Djurmodeller av uveit har varit avgörande för att förstå mekanismerna för okulär inflammation och homeostas samt möjliggjort preklinisk utvärdering av medicinska och kirurgiska terapier för patienter med uveit37. Både kanin- och råttvarianter av PMU-modellen har visat sitt värde i preklinisk terapi via proof of concept-studier38,39,40. På grund av tillgången på ett varierat utbud av transgena stammar hos möss tillåter etablering av musens PMU-modellsystem nu mer detaljerade mekanistiska studier för att identifiera specifika celltyper, vägar och gener som bidrar till patologin för denna sjukdom.

Djurmodeller av uveit kan visa djur till djur variabilitet i förekomst och intensitet av inflammation41. I C57BL/6-musstammen genereras PMU tillförlitligt med hjälp av protokollet som beskrivs här. Stamspecifika variationer i uveitförlopp och intensitet har rapporterats för både EAU och EIU42,43. Medan stamspecifika effekter på svårighetsgrad och förlopp av PMU inte har mätts experimentellt, har denna modell använts i vildtyp C57BL / 6J såväl som hos albinomöss (B6 (Cg) -Tyrc-2J / J) och producerat liknande inflammatoriska svar. Genom att generera PMU-modellen kan kontroll av övervägandena nedan hjälpa nya forskare att begränsa variationen och producera den mest konsekventa och reproducerbara uveiten.

Se till att de subkutana injektionerna är konsekventa:
För att ge en konsekvent subkutan injektion, se till att alla luftbubblor avlägsnas från emulsionen. Överväganden inkluderar en kort centrifug (30 s vid 400 x g) av den färdiga emulsionen innan sprutan laddas. Detta kommer att ta bort luft som fångas i emulsionen. När du laddar sprutan, invertera (tip-up) regelbundet och knacka på sprutan för att ta bort eventuella luftbubblor. Placera inte sprutan för djupt under injektionen för att undvika intramuskulär injektion. Omvänt kan en grund (intradermal) injektion resultera i erosion av emulsionen genom huden. Kom ihåg att pausa en kort stund innan du tar bort sprutan från injektionsstället för att säkerställa fullständig injektion av den tjocka viskösa emulsionen och för att förhindra återflöde från huden.

Sju dagar efter att ha placerat den subkutana injektionen, bekräfta närvaron av palpabla knölar på vardera sidan av bakbenen. Om inga knölar kan identifieras är det möjligt att luft injicerades snarare än emulsion. I detta fall kan akut inflammation inte vara lika robust, och kronisk inflammation kanske inte utvecklas.

Förhindra utvecklingen av infektiös endoftalmit:
Bakteriell eller svamp endoftalmitis kommer att generera en förvirrande variabel om den inte förhindras44. För att förhindra bakteriell endoftalmit, öva alltid god aseptisk teknik när du gör den intravitreala suspensionen, hanterar och rengör alla återanvändbara verktyg som kommer i kontakt med ögat. Att använda sterila engångsartiklar, autoklavering eller rengöring med 95% alkoholtvättar eller våtservetter är viktigt. Lämplig användning av betadin applicerad på ögonytan, locken och periokulär päls hjälper också till att förhindra endoftalmit45. Det är enkelt att känna igen ett öga med infektion eftersom de okulära strukturerna kommer att utplånas av extrem inflammation under kursen efter injektionen. Detta är inte typiskt för PMU. Förekomsten av intraokulär blödning kan också föreslå endoftalmit eller trauma från injektionen. I sådana fall utesluter du dessa djur från studien.

Se till att den intravitreala injektionen är konsekvent:
Den intravitreala injektionen är ett kritiskt steg i induktionen av tillförlitlig och reproducerbar inflammation i PMU. Att tillhandahålla en konsekvent mängd Mtb-suspension vid varje injektion, undvika trauma och förhindra återflöde av suspensionen är alla faktorer som bör beaktas vid utförandet av injektionerna. För att säkerställa en konsekvent suspension, virvla stamsuspensionen noggrant vid upptining och innan du laddar den i sprutan. Eftersom detta Mtb-extrakt som används inte bildar en lösning kan suspensionen genomgå sedimentering över tiden. För att säkerställa en jämn koncentration av Mtb-extraktet i varje injektion, använd eller släpp ut och ladda om sprutan inom 15 minuter efter lastning. Fenylefrin används för utvidgning för att ge ett större synfält till det bakre ögat och minska risken för trauma i ögat under injektionen. Denna droppe genererar naturlig lockindragning och lätt proptos av världen, vilket möjliggör god visualisering av området 1-2 mm bakom limbus utan att behöva ta tag i ögat med pincett. Att använda tång för att hålla fast ögat kan orsaka potentiellt trauma och tillfälligt öka det intraokulära trycket och risken för återflöde av Mtb-suspensionen. Trauma kan också orsakas av att försöka injicera för mycket volym i ögat. Injektionsvolymen är begränsad till 2 μL för att förhindra signifikant och långvarig höjning av intraokulärt tryck och trauma i ögat. Dessutom kommer yngre djur att ha ögon som är mindre än vuxna möss. Vanligtvis ger 6-8 veckors möss (20-25 g) en enhetlig ögonstorlek och säkerställer större konsistens i inflammationen efter injektion av Mtb. En högre frekvens av återflöde efter injektion av den mykobakteriella suspensionen observerades hos mindre möss. Detta leder i sin tur till en mindre än förväntad akut inflammation. En utspädd fluoresceinlösning används för att ge nybörjarens injektor visuell återkoppling om framgången med deras injektionsteknik. Dilatation vid injektionstillfället möjliggör direkt visualisering av det injicerade materialet i glaskroppen och möjligheten att notera eventuella tecken på linstrauma. Vid linstrauma kan det orsaka en förändring i linsklarheten som orsakar grå starr som kan visualiseras på OCT. Vid okulärt trauma måste ögonen uteslutas från studien på grund av möjligheten till linsinducerad uveit46. Vi rekommenderar att du pausar i 10 s innan du tar bort sprutan från ögat för att möjliggöra spridning av Mtb-suspensionen i ögat och minska återflödet.

PMU-modellen kan modifieras för att ändra intensiteten av akut inflammation genom att variera koncentrationen av Mtb i den intravitreala injektionen. Olika doser från 2,5 μg/μL till 15 μg/μL har testats tidigare i vårt labb. Doser högre än 10 μg/μL visade sig dock orsaka allvarliga ögonskador, inklusive spontan linsbrott, svårt hornhinneödem och ärrbildning samt hyfem. Denna svårighetsgrad är inte typisk hos humana patienter med postinfektiös uveit, och därför rekommenderas inte dessa koncentrationer. En dos på 5 μg/μL visade sig på ett tillförlitligt sätt ge mild till måttlig akut inflammation och mild kronisk uveit; dosen 10 μg/μl ger en tillförlitligt måttlig till svår akut sjukdom och mer anmärkningsvärd kronisk sjukdom. Således kan varierande intravitreal koncentration ge alternativa sjukdoms svårighetsgrader för användning efter behov baserat på den experimentella frågan. Kontroller bör väljas för att säkerställa att resultaten beror på svaret på mTB och inte trauma i samband med subkutana eller intravitreala injektioner. I skeninjektionskontrollerna kan PBS användas i stället för mTB-extraktet. För jämförelser med oexponerade djur bör sanna naiva prover betraktas som andra ögon är inte alltid likvärdiga.

På grund av musögats lilla storlek kan OCT vara en känsligare analys för att upptäcka inflammation i den främre kammaren än direkt visualisering eller mikroskopisk ljusfältfotografering. Tidigare arbete med PMU hos råttor25 bestämde att fler celler kan detekteras med histologi än med OCT men att det finns en god korrelation mellan de två modaliteterna. OCT har den extra fördelen att det kan användas för att övervaka inflammationen i längdriktningen hos samma djur. Andra stora musmodeller av uveit, såsom EAU och EIU, har också använt OCT för kvantitativ analys 12,47,48. I PMU-modellen av möss är främre kammarceller endast synliga på OCT och kan inte ses på kliniska undersökningar om inte en stor hypopyon är närvarande. Glasartad inflammation (vitrit) kan observeras med färgfondusavbildning, men att upptäcka kvantitativ förändring är endast möjlig med OCT-avbildning. Andra aspekter av modellen, såsom retinal vaskulär inflammation och retinal skada, kan lätt identifieras med antingen OCT och mikroskopisk brightfield fundus-fotografering.

När du använder OCT är det viktigt att överväga hur lokaliserad avbildning kan påverkas av regionala skillnader i graden av inflammation. Tidigare rapporter har identifierat en ojämn fördelning av celler i människans främre kammare, med fler celler som ligger sämreän 49. Hos möss är en liknande predisposition vanlig. Således kommer vertikala eller radiella skanningar genom AC att bidra till att säkerställa bilder som fångar inflammationsområdet. Dessutom kommer avbildning på samma plats också att ge konsekvens till bilder som samlas in i samma öga i längdriktningen. För att få bilder i samma del av ögat, använd stabila landmärken och ett systematiskt tillvägagångssätt. För främre kammarbilder är bilden centrerad omedelbart intill hornhinnans topp och orienterad vertikalt så att närvaron av en hypopyon kan detekteras i underlägsen vinkel. För bakre segmentbilder är bilden centrerad på synnerven. Vi rekommenderar att du överväger att använda minst 3 raders genomsökningar för bedömning för att säkerställa att regional variabilitet fångas upp. I fall där inflammation är begränsad till perifera platser kan det vara till hjälp att skaffa volymskanningar. Insamlingen av volymgenomsökningar kan också hjälpa till att fånga regionala variationer men kommer att öka datalagringskraven.

Andra in vivo-analyser som kan användas för att karakterisera inflammation i PMU-musmodellen inkluderar bioluminescensavbildning13,35. Post-mortem-analyser som cytometrisk analys av flera parameterflöden kan utföras för att identifiera och kvantifiera infiltrerande immuncellstyppopulationer i den vattenhaltiga och bakre kammaren i ögat12,26. I PMU-modellen kännetecknas akut inflammation av ett medfött svar med ett dominerande neutrofilt infiltrat, följt av ett kroniskt och ihållande adaptivt T-celldominerande svar som kvarstår i över en månad35. Andra analyser av immunfunktionen som kan utföras på post-mortemvävnader inkluderar okulärvätska cytokinanalys. Dessutom kan andra nedströmsanalyser som mRNA-sekvensering och immunofluorescensavbildning användas för att bedöma gen- och proteinuttrycksmönster för retinala immuncellpopulationer vid uveit50,51.

PMU-modellen kan replikeras i andra gnagarsystem med hjälp av anpassningar som är lämpliga för de olika arterna. PMU-modellen har tidigare använts på råttor och kaniner38,39,40. Hos råttor utvecklas akut panuveit efter intravitreal injektion som försvinner spontant under 14 dagar utan att utveckla tecken på kronisk inflammation genom histologi24. Hos kaniner utnyttjar induktion av uveit två omgångar subkutan injektion före intravitreal injektion men genererar också en robust panuveit. En av fördelarna med att använda musmodellen är den färdiga tillgängligheten av många transgena och knockout-stammar som kan hjälpa till att förstå den grundläggande mekanismen för uveit52. Alla gnagarmodeller kan användas för preklinisk terapitestning om medlet administreras systemiskt eller som en topisk droppe. På grund av sin större storlek är dock rått- och kaninögon bättre modeller för användning i prekliniska studier av implanterbara eller lokala injektionsbehandlingsalternativ för uveit.

Sammanfattningsvis ger detta protokoll forskare som är intresserade av att studera mekanismerna för kronisk okulär inflammation med ett nytt verktyg som inte är beroende av tidigare immunisering med okulära antigener.

Disclosures

Författarna har inga ekonomiska konflikter att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöds av finansiering från National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA (KP) K08EY0123998, (KP) R01EY030431, (KP) R21 EY02939, UW vision research core grant (NEI P30EY01730), gåvor från Mark Daily, MD Research Fund och Christopher and Alida Latham Research fund, ett obegränsat avdelningsbidrag från Research to Prevent Blindness och karriärutvecklingspris från Research to Prevent Blindness (KP). Arbetet som utfördes i Bristol stöddes av ytterligare finansiering från Sight Research UK och The Underwood Trust.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AK-FLUOR Akorn Pharmaceuticals, IL, USA 10% Fluorescein sodium 100 mg/mL in 5 mL vial
AnaSed Akorn Animal Health, IL, USA NDC 59399-110-20 Xylazine 20 mg/mL
Betadine 5% Sterile Ophthalmic Prep Solution Alcon, TX, USA 8007-1
B-D Precision Glide Needles -25 G Becton, Dickinson and Company, NJ, USA 305122
B-D Precision Glide needle -30-G Becton, Dickinson and Company, NJ, USA 305106
Bond MAX, Bond Rx Leica Biosystems, IL,USA Automated IHC staining system
Chloramphenicol ointment Martindale Pharma, Romford, UK 1% w/w Chloramphenicol
EG1150H Leica Biosystems, IL,USA Tissue Embedding
Envisu R2300 Bioptigen/Leica OCT Machine
Freund's Incomplete Adjuvant BD Difco, NJ, USA 263910
GenTeal lubricant eye ointment Alcon, TX, USA ---
GenTeal lubricant eye gel Alcon, TX, USA ---
H37Ra lyophilized Mycobacteria extract BD Difco, NJ, USA 231141
Hamilton RN Needle (33/12/2)S Hamilton, Reno, NV 7803-05(33/12/2) 33 G
Hamilton syringe Hamilton, Reno, NV CAL7633-01 5 µL
Insulin needle Exel International, USA 26029 1 mL
Isoflurane
Ketaset Zoetis, USA 377341 Ketamine HCL 100 mg/mL
Microinjection Syringe Pump and Micro4Controller World Precision Instruments, FL, USA UMP3
Micron IV Phoenix Research Laboratories, Pleasanton, CA Alternative Imaging/OCT Machine
Nanofil 10 µL syringe World Precision Instruments, FL, USA NANOFIL
Nanofil Intraocular Injection Kit World Precision Instruments, FL, USA IO-KIT
Olympus SZX10 Olympus Dissection scope
PBS Gibco 14190
Phenylephrine Hydrochloride Ophthalmic Solution USP 2.5% Sterile 15 mL Akorn Pharmaceuticals, IL, USA 17478020115
RM2255 Leica Biosystems, IL,USA Tissue Sectioning
TB Syringe Becton, Dickinson and Company, NJ, USA 309602 1 mL
Tetracaine 0.5% Alcon, TX, USA 1041544
Tissue Tek VIP series Sakura Finetek USA, Inc.,CA. Histology Tissue Processing
Tropicamide 1% Chauvin Pharmaceuticals, Romford, UK Minims
Tylenol Johnson & Johnson Consumer Inc, PA, USA NDC 50580-614-01 Acetaminophen
Viscotears Novartis Pharmaceuticals, Camberley, UK Carbomer eye gel 0.2% w/w

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. American Academy of Ophthalmology. Aao 2019-2020 Basic and Clinical Science Course, Section 09: Uveitis and Ocular Inflammation. American Academy of Ophthalmology. , (2019).
  2. Caspi, R. R. Animal models of autoimmune and immune-mediated uveitis. Drug Discovery today. Disease Models. 3 (1), 3-9 (2006).
  3. DeVoss, J., et al. Spontaneous autoimmunity prevented by thymic expression of a single self-antigen. The Journal of Experimental Medicine. 203 (12), 2727-2735 (2006).
  4. Caspi, R. R., et al. A new model of autoimmune disease. Experimental autoimmune uveoretinitis induced in mice with two different retinal antigens. Journal of Immunology. 140 (5), 1490-1495 (1988).
  5. Tang, J., Zhu, W., Silver, P. B., Su, S. -B., Chan, C. -C., Caspi, R. R. Autoimmune uveitis elicited with antigen-pulsed dendritic cells has a distinct clinical signature and is driven by unique effector mechanisms: Initial encounter with autoantigen defines disease phenotype. The Journal of Immunology. 178 (9), 5578-5587 (2007).
  6. Broekhuyse, R. M., Kuhlmann, E. D., Winkens, H. J. Experimental melanin-protein induced uveitis (EMIU) is the sole type of uveitis evoked by a diversity of ocular melanin preparations and melanin-derived soluble polypeptides. Japanese Journal of Ophthalmology. 40 (4), 459-468 (1996).
  7. Pennesi, G., et al. A humanized model of experimental autoimmune uveitis in HLA class II transgenic mice. The Journal of Clinical Investigation. 111 (8), 1171-1180 (2003).
  8. Caspi, R. R. Understanding autoimmune uveitis through animal models. The Friedenwald lecture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (3), 1872-1879 (2011).
  9. Bansal, S., Barathi, V. A., Iwata, D., Agrawal, R. Experimental autoimmune uveitis and other animal models of uveitis: An update. Indian Journal of Ophthalmology. 63 (3), 211-218 (2015).
  10. Smith, J. R., Hart, P. H., Williams, K. A. Basic pathogenic mechanisms operating in experimental models of acute anterior uveitis. Immunology and Cell Biology. 76 (6), 497-512 (1998).
  11. Rosenbaum, J. T., McDevitt, H. O., Guss, R. B., Egbert, P. R. Endotoxin-induced uveitis in rats as a model for human disease. Nature. 286 (5773), 611-613 (1980).
  12. Chu, C. J., et al. Multimodal analysis of ocular inflammation using the endotoxin-induced uveitis mouse model. Disease Models & Mechanisms. 9 (4), 473-481 (2016).
  13. Gutowski, M. B., Wilson, L., Van Gelder, R. N., Pepple, K. L. In vivo bioluminescence imaging for longitudinal monitoring of inflammation in animal models of uveitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (3), 1521-1528 (2017).
  14. World Health Organization. Global tuberculosis report 2019. World Health Organization. , (2019).
  15. Biswas, J., Badrinath, S. S. Ocular morbidity in patients with active systemic tuberculosis. International Ophthalmology. 19 (5), 293-298 (1995).
  16. Donahue, H. C. Ophthalmologic experience in a tuberculosis sanatorium. American Journal of Ophthalmology. 64 (4), 742-748 (1967).
  17. El-Asrar, M. A., Abouammoh, M., Al-Mezaine, H. S. Tuberculous uveitis. Middle East African Journal of Ophthalmology. 16 (4), 188-201 (2009).
  18. Bodaghi, B., et al. Chronic severe uveitis: etiology and visual outcome in 927 patients from a single center. Medicine. 80 (4), 263-270 (2001).
  19. Cunningham, E. T., Forrester, J. V., Rao, N. A., Zierhut, M. Post-infectious uveitis. Ocular Immunology and Inflammation. 24 (6), 603-606 (2016).
  20. Wroblewski, K. J., Hidayat, A. A., Neafie, R. C., Rao, N. A., Zapor, M. Ocular tuberculosis: a clinicopathologic and molecular study. Ophthalmology. 118 (4), 772-777 (2011).
  21. Yeh, S., Sen, H. N., Colyer, M., Zapor, M., Wroblewski, K. Update on ocular tuberculosis. Current Opinion in Ophthalmology. 23 (6), 551-556 (2012).
  22. Tagirasa, R., Parmar, S., Barik, M. R., Devadas, S., Basu, S. Autoreactive T cells in immunopathogenesis of TB-associated uveitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (13), 5682-5691 (2017).
  23. Agrawal, R., et al. Insights into the molecular pathogenesis of ocular tuberculosis. Tuberculosis. 126, 102018 (2021).
  24. Pepple, K. L., et al. Primed mycobacterial uveitis (PMU): Histologic and cytokine characterization of a model of uveitis in rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (13), 8438-8448 (2015).
  25. Pepple, K. L., Choi, W. J., Wilson, L., Van Gelder, R. N., Wang, R. K. Quantitative assessment of anterior segment inflammation in a rat model of uveitis using spectral-domain optical coherence tomography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (8), 3567-3575 (2016).
  26. Pepple, K. L., Wilson, L., Van Gelder, R. N. Comparison of aqueous and vitreous Lymphocyte populations from two rat models of experimental uveitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (6), 2504-2511 (2018).
  27. Basu, S., Elkington, P., Rao, N. A. Pathogenesis of ocular tuberculosis: New observations and future directions. Tuberculosis. 124, 101961 (2020).
  28. Basu, S., Rao, N., Elkington, P. Animal models of ocular tuberculosis: Implications for diagnosis and treatment. Ocular Immunology and Inflammation. , 1-7 (2020).
  29. Mattapallil, M. J., et al. The Rd8 mutation of the Crb1 gene is present in vendor lines of C57BL/6N mice and embryonic stem cells, and confounds ocular induced mutant phenotypes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (6), 2921-2927 (2012).
  30. Underwood, W., Anthony, R. AVMA guidelines for the euthanasia of animals: 2020 edition. 2013 (30), 2020-2021 (2020).
  31. Donovan, J., Brown, P., et al. Handling and restraint. Current protocols in immunology. Coligan, J. E., et al. , John Wiley & Sons, Inc. Chapter 1, Unit 1.3 (2006).
  32. Tremoleda, J. L., Kerton, A., Gsell, W. Anaesthesia and physiological monitoring during in vivo imaging of laboratory rodents: considerations on experimental outcomes and animal welfare. EJNMMI Research. 2 (1), 44 (2012).
  33. Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections. Cold Spring Harbor protocols. 2014 (6), 655-658 (2014).
  34. Paques, M., et al. Panretinal, high-resolution color photography of the mouse fundus. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (6), 2769-2774 (2007).
  35. John, S., Rolnick, K., Wilson, L., Wong, S., Van Gelder, R. N., Pepple, K. L. Bioluminescence for in vivo detection of cell-type-specific inflammation in a mouse model of uveitis. Scientific Reports. 10 (1), 11377 (2020).
  36. Fortmann, S. D., Lorenc, V. E., Hackett, S., Campochiaro, P. A. Murine Vitreous Tap (MurViTap): a novel technique to extract uncontaminated mouse vitreous humor, quantify retinal vascular permeability, and compare proteins secreted by diseased and normal retina. Investigative ophthalmology & visual science. 58 (8), 5978 (2017).
  37. Caspi, R. R. Understanding autoimmunity in the eye: from animal models to novel therapies. Discovery Medicine. 17 (93), 155-162 (2014).
  38. Mruthyunjaya, P., et al. Efficacy of low-release-rate fluocinolone acetonide intravitreal implants to treat experimental uveitis. Archives of Ophthalmology. 124 (7), 1012-1018 (2006).
  39. Jaffe, G. J., Yang, C. S., Wang, X. C., Cousins, S. W., Gallemore, R. P., Ashton, P. Intravitreal sustained-release cyclosporine in the treatment of experimental uveitis. Ophthalmology. 105 (1), 46-56 (1998).
  40. Pepple, K. L., et al. Uveitis therapy with shark variable novel antigen receptor domains targeting tumor necrosis factor alpha or inducible t-cell costimulatory ligand. Translational Vision Science & Technology. 8 (5), 11 (2019).
  41. Mattapallil, M. J., et al. Characterization of a New epitope of IRBP that induces moderate to severe uveoretinitis in mice with H-2b haplotype. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (9), 5439-5449 (2015).
  42. Silver, P. B., Chan, C. C., Wiggert, B., Caspi, R. R. The requirement for pertussis to induce EAU is strain-dependent: B10.RIII, but not B10.A mice, develop EAU and Th1 responses to IRBP without pertussis treatment. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (12), 2898-2905 (1999).
  43. Li, Q., Peng, B., Whitcup, S. M., Jang, S. U., Chan, C. C. Endotoxin induced uveitis in the mouse: susceptibility and genetic control. Experimental Eye Research. 61 (5), 629-632 (1995).
  44. Astley, R. A., Coburn, P. S., Parkunan, S. M., Callegan, M. C. Modeling intraocular bacterial infections. Progress in Retinal and Eye Research. 54, 30-48 (2016).
  45. Lau, P. E., Jenkins, K. S., Layton, C. J. Current evidence for the prevention of endophthalmitis in anti-VEGF intravitreal injections. Journal of Ophthalmology. 2018, 8567912 (2018).
  46. Nche, E. N., Amer, R. Lens-induced uveitis: an update. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 258 (7), 1359-1365 (2020).
  47. Chu, C. J., et al. Assessment and in vivo scoring of murine experimental autoimmune uveoretinitis using optical coherence tomography. PLoS ONE. 8 (5), 63002 (2013).
  48. Harimoto, K., Ito, M., Karasawa, Y., Sakurai, Y., Takeuchi, M. Evaluation of mouse experimental autoimmune uveoretinitis by spectral domain optical coherence tomography. The British Journal of Ophthalmology. 98 (6), 808-812 (2014).
  49. Li, Y., Lowder, C., Zhang, X., Huang, D. Anterior chamber cell grading by optical coherence tomography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (1), 258-265 (2013).
  50. Bell, O. H., et al. Single eye mRNA-seq reveals normalisation of the retinal microglial transcriptome following acute inflammation. Frontiers in Immunology. 10, 3033 (2019).
  51. Lipski, D. A., et al. Retinal endothelial cell phenotypic modifications during experimental autoimmune uveitis: a transcriptomic approach. BMC Ophthalmology. 20 (1), 106 (2020).
  52. Agarwal, R. K., Silver, P. B., Caspi, R. R. Rodent Models of Experimental Autoimmune Uveitis. Autoimmunity. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Perl, A. , Humana Press. Totowa, NJ. 443-469 (2012).

Tags

Immunologi och infektion utgåva 178
Primed Mycobacterial Uveitis (PMU) som en modell för postinfektiös uveit
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

John, S., Bell, O. H., Wilson, L.,… More

John, S., Bell, O. H., Wilson, L., Copland, D. A., Pepple, K. L. Primed Mycobacterial Uveitis (PMU) as a Model for Post-Infectious Uveitis. J. Vis. Exp. (178), e62925, doi:10.3791/62925 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter