Summary
A pesar de los avances en inmunohistoquímica multiplex e imágenes multiespectrales, la caracterización de la densidad y la agrupación de las principales células inmunes simultáneamente en el endometrio sigue siendo un desafío. Este artículo describe un protocolo detallado de tinción multiplex e imágenes para la localización simultánea de cuatro tipos de células inmunes en el endometrio.
Abstract
La inmunohistoquímica es el método más utilizado para la identificación y visualización de antígenos tisulares en la investigación biológica y el diagnóstico clínico. Se puede utilizar para caracterizar diversos procesos biológicos o patologías, como la cicatrización de heridas, la respuesta inmune, el rechazo de tejidos y las interacciones tejido-biomaterial. Sin embargo, la visualización y cuantificación de múltiples antígenos (especialmente para las células inmunes) en una sola sección de tejido utilizando tinción inmunohistoquímica convencional (IHC) sigue siendo insatisfactoria. Por lo tanto, las tecnologías multiplexadas se introdujeron en los últimos años para identificar múltiples marcadores biológicos en una sola muestra de tejido o un conjunto de diferentes muestras de tejido.
Estas tecnologías pueden ser especialmente útiles para diferenciar los cambios en las interacciones inmunes de célula a célula dentro del endometrio entre mujeres fértiles y mujeres con abortos espontáneos recurrentes durante la implantación. Este artículo describe un protocolo detallado para la tinción de fluorescencia multiplexada IHC para investigar la densidad y la agrupación de cuatro tipos principales de células inmunes simultáneamente en muestras endometriales cronometradas con precisión durante la implantación embrionaria. El método incluye la preparación de muestras, la optimización multiplex con marcadores para subtipos de células inmunes y el escaneo de las diapositivas, seguido de análisis de datos, con referencia específica a la detección de células inmunes endometriales.
Usando este método, la densidad y la agrupación de cuatro tipos principales de células inmunes en el endometrio se pueden analizar simultáneamente en una sola sección de tejido. Además, este documento discutirá los factores críticos y la solución de problemas para superar la posible interferencia de fluoróforos entre las sondas fluorescentes que se aplican. Es importante destacar que los resultados de esta técnica de tinción multiplex pueden ayudar a proporcionar una comprensión profunda de la interacción inmunológica y la regulación durante la implantación del embrión.
Introduction
El aborto espontáneo recurrente (RM) se puede definir como la pérdida de dos o más embarazos antes de las 24 semanas de gestación1. Esta condición reproductiva frecuente afecta hasta al 1% de las parejas en todo el mundo2,3. La fisiopatología es multifactorial y se puede dividir en causas impulsadas embriológicamente (principalmente debido a un cariotipo embrionario anormal) y causas impulsadas por la madre que afectan el endometrio y / o el desarrollo placentario. Esta manifestación puede ser el resultado de anomalías genéticas parentales, anomalías uterinas, afecciones protrombóticas, factores de endocrinología y trastornos inmunológicos4.
En los últimos años, la disfunción de las células inmunofectoras se ha implicado en la patogénesis de la pérdida temprana del embarazo5. Esto ha inspirado muchas investigaciones para dilucidar las poblaciones específicas de células inmunes en el endometrio durante el ciclo menstrual, la implantación y el embarazo temprano, con funciones específicas en el embarazo temprano. Entre estas células inmunes, las células asesinas naturales uterinas (uNK) juegan un papel crítico durante la implantación embrionaria y el embarazo, particularmente en los procesos de invasión trofoblástica y angiogénesis6. Los estudios han demostrado un aumento de la densidad celular uNK en el endometrio de mujeres con RM7,8,aunque este hallazgo no se asoció con un mayor riesgo de aborto espontáneo9. Sin embargo, esto estimuló la investigación que evalúa la densidad de otros tipos de células inmunes (como macrófagos, células dendríticas uterinas) en el endometrio en mujeres con RM10,11. Sin embargo, sigue siendo incierto si existe una alteración significativa en la densidad de células inmunes en el endometrio periimplantacional en mujeres con RM.
Una posible explicación para la incertidumbre es que la evaluación de la densidad de células inmunes endometriales podría ser difícil debido a los rápidos cambios en el endometrio durante la ventana de implantación. Durante el período de 24 h, cambios significativos en el endometrio alteran la densidad celular inmune y la secreción de citoquinas, introduciendo una fuente de variación en estos resultados12. Además, la mayoría de los informes se basan principalmente en el uso de tinción unicelular (por ejemplo, métodos tradicionales de IHC) que no pudieron examinar múltiples marcadores en la misma sección de tejido. Aunque la citometría de flujo se puede utilizar para detectar múltiples poblaciones celulares en una sola muestra, las grandes cantidades de células requeridas y la optimización que consume mucho tiempo dificultan la popularidad y la eficiencia de este método. Por lo tanto, el reciente avance en la tinción multiplex IHC podría resolver este problema mediante la inmunotinción de múltiples marcadores en la misma diapositiva para evaluar múltiples parámetros, incluido el linaje celular y la localización histológica de subpoblaciones inmunes individuales. Además, esta tecnología puede maximizar la información obtenida en caso de disponibilidad limitada de tejido. En última instancia, esta técnica puede ayudar a dilucidar las diferencias en las interacciones de las células inmunes en el endometrio entre las mujeres fértiles y las mujeres con RM.
Dos grupos de mujeres fueron reclutadas del Hospital Príncipe de Gales, incluidas las mujeres de control fértil (FC) y las mujeres con aborto espontáneo recurrente inexplicable (RM). El control fértil se definió como las mujeres que tuvieron al menos un nacimiento vivo sin antecedentes de aborto espontáneo, y las mujeres RM se definieron como aquellas que tenían antecedentes de abortos espontáneos consecutivos ≥2 antes de las 20 semanas de gestación. Los sujetos de los dos grupos cumplieron con los siguientes criterios de inclusión: (a) edad entre 20 y 42 años, (b) no fumador, (c) ciclo menstrual regular (25-35 días) y estructura uterina normal, (d) no uso de ningún régimen hormonal durante al menos 3 meses antes de la biopsia endometrial, (e) no hidrosalpinx por histero-salpingograma. Además, todos los sujetos reclutados tenían cariotipo normal, histerosalpingografía tridimensional normal, hormona estimulante del folículo día 2 < 10 UI / L, progesterona lútea media > 30 nmol / L, función tiroidea normal y dieron negativo para anticoagulante lúpico y anticuerpos IgG e IgM anticardiolipina.
Para comprender mejor la base inmunológica de la RM, sería más deseable cuantificar y localizar simultáneamente los principales tipos de células inmunes presentes en el endometrio en el momento de la implantación. Este artículo describe todo el protocolo desde la preparación de la muestra, la optimización multiplex con marcadores para los subtipos de células inmunes y el escaneo de las diapositivas, seguido de un análisis de datos con referencia específica a la detección de células inmunes endometriales. Además, este artículo describe cómo determinar la densidad y la agrupación de los tipos de células inmunes simultáneamente en el endometrio.
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Protocol
El estudio fue aprobado por el Comité de Ética de Investigación Clínica conjunta de la Universidad China de Hong Kong-Nuevos Territorios del Clúster Este. Se obtuvo el consentimiento informado de los participantes antes de recoger las biopsias endometriales. Consulte la sección de introducción para conocer los criterios de inclusión de los grupos de control y RM.
1. Preparación de la muestra
- Asegúrese de que todas las mujeres en este estudio se sometan a una prueba diaria de tira reactiva de orina a partir del día 9 del ciclo menstrual en adelante para identificar el aumento de la hormona luteinizante (LH) para detectar la ovulación, y cronometrar las biopsias endometriales precisamente en el día7 después del aumento de LH (LH + 7).
- Obtenga un fragmento de0,5 cm 2 de biopsia endometrial utilizando un muestreador pipelle o Pipet Curet de mujeres fértiles y mujeres con RM inexplicable. Etiquete el recipiente y coloque la muestra inmediatamente en formalina tamponada neutra al 10% (pH 7) para la fijación durante la noche a temperatura ambiente.
NOTA: El volumen del fijador debe ser de 5 a 10 veces el del tejido. - Coloque el pañuelo en un cartucho para deshidratación en una máquina de procesamiento de tejidos antes de incrustarlo en cera de parafina fundida. Incrustar los tejidos en parafina a 58-60 °C.
- Deje que el bloque de parafina se enfríe durante la noche a temperatura ambiente. Utilice un microtomo para recortar los bloques de parafina a un grosor de 3 μm.
NOTA: El uso de agua destilada ayuda en el montaje adecuado del tejido y la adherencia a lo largo de la tinción multiplex. - Coloque la cinta de parafina en un baño de agua a 40-45 °C durante 30 s.
- Monte las secciones en portaobjetos de vidrio recubiertos de poli-L-lisina (0,1% p/v). Coloque los portaobjetos con el tejido hacia arriba y deje secar a 37 °C durante la noche. Guarde los portaobjetos en una caja de diapositivas lejos de temperaturas extremas hasta su uso posterior.
2. Determinar la concentración ideal de anticuerpos para la IHC multiplex utilizando la IHC convencional.
NOTA: Esto es importante para identificar el nivel de expresión y el patrón de cada marcador inmune en la muestra de endometrio, y determinar la secuencia de tinción de cada marcador, así como sus emparejamientos de fluoróforos de amplificación de señal de tiramida (TSA) asociados.
- Pruebe los anticuerpos para determinar su idoneidad para la IHC multiplex mediante el uso manual convencional de IHC13.
- Use tejidos de endometrio para pruebas de anticuerpos únicos.
- Incluya un control positivo (por ejemplo, bazo) y un control negativo (control de isotipos) para optimizar la condición de tinción de cada anticuerpo.
- Realice la tinción utilizando la dilución recomendada por la hoja de datos del anticuerpo.
- Realice tinciones adicionales utilizando concentraciones por encima y por debajo de la dilución recomendada utilizada en el paso 2.3.
NOTA: Un patólogo clínico debe evaluar los portaobjetos teñidos a ciegas para confirmar la localización del sondeo de anticuerpos y la integridad celular.
3. Método de tinción multiplex
- Preparación y fijación de diapositivas
- Coloque los portaobjetos (a partir del paso 1.6) planos con el tejido hacia arriba en un horno y hornee a 60 ° C durante al menos 1 h.
- Retire los portaobjetos del horno y déjelos enfriar durante al menos 20 minutos a temperatura ambiente antes de colocarlos en una rejilla deslizante vertical.
- Desparasabilice y rehidrate los portaobjetos fijos en formalina e incrustados en parafina con 10 minutos asignados a cada uno de los siguientes pasos: xileno (2x), 100% etanol (2x), 95% etanol (1x), 70% etanol (2x) y agua destilada (2x).
- Coloque el estante de portaobjetos en una caja de diapositivas de plástico y sumérjalos en solución salina tamponada Tris (TBS, pH 7.6).
NOTA: Los portaobjetos deben permanecer húmedos desde este paso de rehidratación hasta el montaje en el paso final. - Fije las muestras sumergiendo las diapositivas en una caja de diapositivas de plástico llena de una mezcla de formaldehído diluido en metanol (1:9) durante 30 minutos en la oscuridad.
- Lave los portaobjetos dos veces en agua desionizada durante 2 minutos y luego proceda a la recuperación de antígenos.
- Recuperación de epítopos
- Coloque el estante de portaobjetos en una caja resistente al calor y llénelo con tampón de ácido cítrico (pH 6.0) para cubrir los portaobjetos.
- Coloque la caja en el microondas y caliente las diapositivas durante 50 s al 100% de potencia, seguida de 20 minutos al 20% de potencia para mantener la misma temperatura.
- Deje que los toboganes se enfríen durante aproximadamente 15 minutos a temperatura ambiente.
- Enjuague los toboganes en agua durante 2 minutos seguido de TBS-Tween 20 (TBST) durante 2 minutos.
NOTA: TBST se compone de 25 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl y 0.05% Tween 20 (v / v).
- Bloqueante
- Bloquee la actividad endógena de la peroxidasa en el tejido sumergiendo el portaobjetos en un frasco que contenga solución de bloqueo de peroxidasa (consulte la Tabla de materiales)durante 10 min.
- Lave los portaobjetos con TBST durante 5 min.
- Use una pluma de barrera hidrofóbica para marcar un límite alrededor de la sección de tejido en la diapositiva.
- Cubra las secciones de tejido con un tampón de bloqueo (ver la Tabla de Materiales)o albúmina sérica bovina (5%, p/v), e incube los portaobjetos en una cámara humidificada durante 15 min.
- Aplicación de anticuerpos y señales
- Retire los reactivos de bloqueo.
- Incubar con el anticuerpo primario de interés (p. ej., CD3, dilución 1:100 en diluyente de anticuerpos, ver Tabla 1)en una cámara humidificada a temperatura ambiente durante 30 min.
- Retire el anticuerpo primario. Lavar 3x con TBST durante 5 min cada vez.
- Incubar con el anticuerpo secundario marcado con el polímero de rábano picante peroxidasa (HRP)(Tabla 1)durante 15 min en una cámara humidificada a temperatura ambiente. Lavar 3x con TBST durante 5 min cada vez.
- Aplique la solución de trabajo TSA de fluoróforo opal (1:100 en diluyente de amplificación) e incube a temperatura ambiente durante 10 minutos para permitir la conjugación de fluoróforos a la muestra de tejido en los sitios primarios de unión de anticuerpos. Lavar con TBST por triplicado durante 5 min cada vez.
- Pelado a base de microondas
- Enjuague con el tampón de recuperación de antígenos (solución tampón de citrato, pH 6.0).
- Realice una extracción basada en microondas para eliminar el complejo primario-secundario-HRP para introducir el siguiente anticuerpo primario (por ejemplo, CD20).
- Coloque las diapositivas en el búfer de recuperación de antígenos, microondas al 100% de potencia durante 50 s seguidas de una potencia del 20% durante 20 minutos en recipientes aptos para microondas y enfríelas a temperatura ambiente durante 15 minutos.
- Repita los pasos 3.2.4 a 3.5.2 hasta que las muestras de tejido hayan sido sondeadas con todos los anticuerpos primarios.
- Contratinción y montaje
- Después de la extracción y el enfriamiento a base de microondas del tampón de recuperación de antígenos, enjuague las diapositivas en agua destilada y TBST.
- Incubar con solución de 4', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (1,0 μg/ml) durante 5 min en una cámara humidificada a temperatura ambiente.
- Lavar 3x con TBST durante 5 min cada vez. Lavar con agua una vez durante 5 min.
- Seque al aire la corredera y monte con el medio de montaje adecuado (consulte la Tabla de materiales).
NOTA: No se requerirá contratinción para las diapositivas monoplex que se utilizarán para el desarrollo de bibliotecas espectrales.
4. Imagen y análisis
- Preparación de diapositivas de la biblioteca espectral
- Cree diapositivas de biblioteca (imágenes de referencia de una sola mancha) para cada fluoróforo, DAPI y autofluorescencia con el mismo tejido de control para el análisis de imágenes multiespectrales.
- Usando las diapositivas de las muestras de biopsia endometrial de mujeres con RM y mujeres fértiles, realice los pasos 1.1 a 3.6.4 para la detección de anticuerpo único para cada diapositiva (sin más adición de anticuerpos o fluoróforos).
- Para cada detección de anticuerpos, manche una de las diapositivas con DAPI (como en el paso 3.6.2) y deje una diapositiva sin teñir para la detección de cualquier posible autofluorescencia tisular en el espectro.
- Utilice los filtros adecuados en la estación de trabajo para obtener la imagen de este conjunto de diapositivas para cada anticuerpo y cargarlas en la biblioteca de análisis de imágenes (como se describe en el paso 4.2).
- Una vez capturada la imagen, seleccione inForm como Spectral Library Source y cree la biblioteca espectral.
- A medida que se utilizan fluoróforos, seleccione Manchas/Fluores... en el menú.
- Al elegir las manchas o fluoróforos, reduzca las opciones seleccionando uno o más grupos. Seleccione Todo para mostrar todos los espectros compatibles con las imágenes.
- Imágenes espectrales
NOTA: Las imágenes se capturaron utilizando la estación de trabajo Mantra con la biblioteca espectral establecida utilizando el software inForm Image Analysis.- Capture la imagen de las diapositivas teñidas de un solo anticuerpo con los filtros de epifluorescencia apropiados como se propone en la Tabla 2 (por ejemplo, DAPI, isotiocianato de fluoresceína [FITC], CY3, Texas Red y CY5) utilizando la estación de trabajo.
NOTA: Los filtros recomendados para los fluoróforos específicos utilizados en este protocolo se muestran en la Tabla 2. - Identifique un tiempo de exposición adecuado para una señal óptima examinando cada marcador en su canal de fluorescencia correspondiente.
NOTA: La señal óptima se determina de acuerdo con la referencia sobre la positividad y localización obtenida en la tinción de anticuerpo único. - Determinar un tiempo de exposición fijo para cada analito (combinación anticuerpo-fluoróforo) para estandarizar una comparación entre muestras.
NOTA: La determinación de la exposición fija depende de la intensidad en la muestra de intereses. - Escanee las diapositivas teñidas de multiplex en el modo de escaneo apropiado con el algoritmo de enfoque automático integrado.
NOTA: La biblioteca espectral establecida se utilizaría para diferenciar el cubo de imagen multiespectral en componentes individuales individuales (desmezcla espectral). Esto permitiría procesar la identificación basada en el color de todos los marcadores de interés utilizando los siguientes dos pasos principales: sesión de capacitación y sesión de análisis de imágenes.
- Capture la imagen de las diapositivas teñidas de un solo anticuerpo con los filtros de epifluorescencia apropiados como se propone en la Tabla 2 (por ejemplo, DAPI, isotiocianato de fluoresceína [FITC], CY3, Texas Red y CY5) utilizando la estación de trabajo.
- Análisis de imágenes
- Recuento celular de tipos seleccionados de células inmunitarias en el endometrio
- Capture un mínimo de 10 campos para su análisis con un aumento de 200x.
NOTA: Los campos se capturaron escaneando toda la sección sin ninguna selección. Esto puede garantizar la captura simultánea de todos los componentes celulares del endometrio, por ejemplo, el borde epitelial luminal, el estroma y las glándulas. - Para contar las celdas, haga clic en el botón Contar objetos en la barra de pasos para mostrar el panel Configuración de recuento de objetos.
- Marque la casilla Descartar objeto si toca un borde para la exclusión de cualquier objeto que toque el borde de la imagen, la región de proceso o la región de tejido.
- Si el tejido se ha segmentado, seleccione la categoría de tejido en la que se encuentran los objetos. No cuente objetos fuera de la categoría de tejido seleccionada.
- Seleccione el enfoque deseado para identificar objetos: basado en objetos o basado en píxeles (umbral).
NOTA: El enfoque basado en píxeles (umbral) debe seleccionarse en caso de una mancha confiable o consistente para la cual la aplicación de un umbral simple producirá los píxeles del objeto. El enfoque basado en objetos se recomienda cuando se requieren enfoques más avanzados basados en morfometría en caso de falta de consistencia y especificidad de tinción de objetos. - Seleccione la escalade señal deseada: Escala automática o Escala fija.
NOTA: Si se elige Escala automática, se escalará automáticamente cada plano de componente antes de realizar la segmentación de objetos. La opción de escala fija se recomienda cuando se requiere un mejor rendimiento de segmentación y las señales de tinción son consistentes y confiables. - Seleccione el componente principal para la segmentación de objetos en la lista desplegable.
- Ajuste el valor de señal mínima para el componente principal al valor de umbral deseado.
- Para rellenar automáticamente los taladros de los objetos, seleccione Rellenar taladros.
- Para detectar objetos que tocan otros objetos como objetos individuales, en lugar de como un solo objeto, active la casilla Refinar división después de activar la casilla Tamaño máximo (píxeles).
- Para excluir objetos en función de la redondez del objeto, marque la casilla Redondez y especifique la circularidad mínimadeseada.
- Contar todas las células del estroma (CD3−/CD20−/CD68−/CD56−y DAPI+),incluidas las células que rodean los vasos sanguíneos.
- Contar las células inmunitarias por separado,incluyendo linfocitos T (CD3+y DAPI+), células B (CD20+y DAPI+), macrófagos (CD68+ y DAPI+), y células uNK (CD56+ y DAPI+).
- Exprese los datos como los porcentajes de las células inmunes en relación con el número total de células estromales para cada imagen capturada, e informe el recuento final de células como un promedio de todos los campos.
- Utilice el Editor de vistas para ver las tablas de datos resultantes después del procesamiento. Exporte la tabla Contar datos.
- Cuantificación de la distribución espacial de las células inmunes endometriales
- Bajo un aumento de 200x, estime la función L utilizando el programa R para un rango de 0-20 μm considerado una distancia máxima de contacto célula-célula14.
NOTA: Se utilizó la caja de herramientas del lenguaje R 'spatstat' para medir la función L.- Denota el nivel de agrupamiento de diferentes pares de células inmunes en función del área bajo la curva (AUC) de su función L.
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Representative Results
El proceso esquemático general de realizar un ensayo multiplex de 4 colores para la detección de 4 tipos de células inmunes endometriales se muestra en la Figura 1. En resumen, el protocolo para esta tinción de inmunofluorescencia multiplex requirió 8 pasos clave: 1. Preparación de diapositivas, 2. Recuperación de epítopos, 3. Bloqueo, 4. Aplicación de anticuerpos primarios, 5. Aplicación secundaria de anticuerpos, 6. Amplificación de señales, 7. Eliminación de anticuerpos y 8. Contratinción y montaje. La representación y el análisis de imágenes se llevaron a cabo utilizando la estación de trabajo Mantra con la biblioteca espectral generada utilizando el software inForm Image Analysis para diferenciar los 4 tipos de células inmunes en la muestra de endometrio(Figura 2).
Se pueden identificar cuatro tipos de células inmunes endometriales en muestras de endometrio humano utilizando esta técnica de tinción multiplex: células T CD3 +, células B CD20 +, macrófagos CD68 + y células uNK CD56 +(Figura 3). Sin embargo, la interferencia de fluoróforos debe considerarse cuidadosamente para obtener una imagen clara y utilizable. Aunque esta tecnología multiespectral que utiliza la estación de trabajo Mantra puede soportar ensayos de hasta 8 plex, la aplicación de los 4 fluoróforos utilizados en este protocolo demostró un rendimiento óptimo sin interferencias de fluoróforos debido a las diferencias en los espectros de emisión de los fluoróforos. En contraste, la tinción multiplex que involucra 5-8 fluoróforos a menudo requiere más atención hacia la interferencia del fluoróforo resultante de la emisión de las longitudes de onda compartidas.
Para superar este inconveniente, sería necesaria la tinción monoplex para determinar el orden de cada anticuerpo en el múltiplex e identificar el nivel de expresión y el patrón de cada marcador inmune en la muestra de endometrio. Esto puede ayudar a determinar la secuencia de tinción de los marcadores y sus emparejamientos de fluoróforos TSA asociados. Una vez que se haya completado el ensayo monoplex para determinar el orden de anticuerpos que se aplicarán, el siguiente paso será seleccionar el fluoróforo para su detección después de la tinción multiplex. Se debe elegir un fluoróforo único para cada anticuerpo de interés. El número relacionado con cada fluoróforo sería aproximadamente la longitud de onda fluorescente emitida durante la excitación(Tabla 1 y Tabla 2). Un enfoque para prevenir la interferencia de fluoróforos es elegir pares de fluoróforos con longitudes de onda lo más alejadas posible entre sí (especialmente para los anticuerpos colocalizadores). Esto puede ayudar a reducir el exceso de superposición espectral y proporcionar una imagen nítida y un fenotipado más confiable. Además, la evaluación meticulosa encendiendo y apagando los láseres de la imagen compuesta multiplex en el software inForm también puede ayudar a reconocer los patrones de tinción para minimizar la saturación de fluoróforos(Figura 4).
Para el análisis de imágenes, el número de células T CD3+, células CD20+ B, macrófagos CD68+, células CD56 + uNK y células estromales en el estroma endometrial (CD3−/CD20−/CD68−/ CD56− y teñidas con DAPI) se puede contar automáticamente utilizando el software inForm Tissue Finder 14.0(Figura 5). Cada densidad de tipo de célula inmune se expresó como un porcentaje relativo al número total de células estromales (Figura 5). Del mismo modo, la cuantificación de la distribución espacial de las células inmunes endometriales se basó en la posición X e Y de cada célula inmune obtenida del sistema InForm(Figura 6). Usando el lenguaje R, se puede distinguir el nivel de agrupación de diferentes pares de células inmunes basadas en el AUC.
Figura 1:Diagrama de flujo de trabajo de tinción. Abreviaturas: BSA = albúmina sérica bovina; HRP = peroxidasa de rábano picante. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Estación de trabajo para captura y análisis de imágenes. (A) Estación de trabajo de imágenes Mantra, (B) imagen espectral sin procesar, (C) imagen compuesta, (D) segmentación de tejidos (compartimentos epitelial y estromal), (E) imagen compuesta de tejido endometrio que muestra cuatro marcadores de colores para identificar diferentes poblaciones celulares. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Imágenes espectrales. La inmunotinción multiplex de 4 tipos diferentes de células inmunes se realizó en las biopsias endometriales de (A) una mujer control fértil y (B) una mujer con RM inexplicable presentada como imagen multiespectral única. Después de la producción de una biblioteca de una sola teñida, la desmezcla espectral podría revelar imágenes de fluoróforos individuales que representan (C) CD3, (D) CD56, (E) CD68, (F) CD20, (G) DAPI. Luego se creó una imagen compuesta incorporando todos los fluoróforos después de la imagen multiespectral(H). Barras de escala = 50 μm (A, B). Abreviaturas: LE = epitelio luminal; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindol; RM = aborto espontáneo recurrente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4:Herramienta InForm Counts. La herramienta de recuentos del software inForm se activa seleccionando el icono de cuadro beige (indicado por ↓). (A) Preparación de imágenes, (B, C) segmentación de tejido para entrenamiento y automatización dibujados a mano, (D) segmentación de células individuales, (E) fenotipificación de las células en función de la intensidad del fluoróforo, (F) análisis de la intensidad del fluoróforo (el cuadro rojo que muestra el número de células positivas en la intensidad del fluoróforo seleccionado), y (G) exportación de los resultados para su uso (el cuadro rojo indica las opciones de exportación). Abreviatura: IHC = inmunohistoquímica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Conteo celular. (A) Fenotipado de las células para el conteo automático de células y (B) salida de las células teñidas positivamente en la región segmentada (por ejemplo, estromal) para una mayor comparación y análisis estadístico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Medición de la densidad espacial. (A) Detección automática de la posición de las células inmunes teñidas positivamente en la región segmentada (por ejemplo, estromal), (B) visualización de salida de la coordenada de cada célula inmune CD20+ teñida positivamente, y (C) determinación de la densidad espacial y la localización entre las células CD20+ y otras células inmunes en las regiones de tejido segmentadas utilizando Spatstat. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Orden | Anticuerpo | Clon | Clonalidad | Factor de dilución de anticuerpos | Ópalos | Factor de dilución del ópalo |
| 1 | CD3 | SP7 | Monoclonal | 1 de cada 100 | Ópalo 620 | 0.111111111 |
| 2 | CD20 | L26 | Monoclonal | 1 de cada 100 | Ópalo 650 | 0.215277778 |
| 3 | CD68 | SP251 | Monoclonal | 1 de cada 100 | Ópalo 520 | 0.111111111 |
| 4 | CD56 | CD564 | Monoclonal | 1 de cada 100 | Ópalo 690 | 0.111111111 |
Tabla 1: Lista de anticuerpos, clones y concentraciones utilizadas.
| Teñir | Excitación máxima (nm) | Máximo de emisión (nm) | Detección esperada en el conjunto de filtros (nombre) | Color esperado |
| DAPI | 350 | 470 | DAPI | Azul |
| Ópalo 520 | 494 | 525 | FITC | Verde |
| Ópalo 620 | 588 | 616 | Cy3 y Texas Red | Ámbar |
| Ópalo 650 | 627 | 650 | Texas Red y Cy5 | Naranja |
| Ópalo 690 | 676 | 694 | Texas Red y Cy5 | Claro |
Tabla 2: Lista de fluoróforos con sus longitudes de onda máximas de excitación y emisión, detección esperada en conjuntos de filtros apropiados y colores observables.
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Discussion
Pasos críticos dentro del protocolo
Es importante tener en cuenta que la tinción multiplex requiere una optimización diligente. La recuperación de antígenos, utilizando tampón de citrato y tecnología de microondas, requiere optimización para garantizar la extracción completa de anticuerpos y mantener la viabilidad del tejido. A medida que los reactivos TSA se unen covalentemente a los sitios que rodean el antígeno, pueden inhibir potencialmente la unión de un anticuerpo primario posterior a través de un obstáculo estérico (también conocido como el "efecto paraguas"). Esto tiende a ocurrir cuando múltiples marcadores inmunes residen en un compartimento de una sola célula y causan interferencia de fluoróforos. Para identificar si habrá un efecto, sería fundamental realizar IHC / IF monoplex de antemano para identificar cualquier superposición en la localización de las células inmunes. Como se requeriría una tinción de muestra única para generar la biblioteca espectral, las bibliotecas de espectros validadas pueden facilitar la discriminación de señales individuales para evitar aún más la interferencia de fluoróforos. Si es necesario, las concentraciones primarias de anticuerpos y los tiempos de incubación, el emparejamiento fluoróforo-anticuerpo, las concentraciones de fluoróforos TSA y el orden de tinción pueden modificarse para minimizar la interferencia de fluoróforos. Del mismo modo, es importante equilibrar adecuadamente las concentraciones de HRP para prevenir la formación de dímeros TSA. Esto se puede lograr mediante la titulación de anticuerpos primarios y secundarios. Además, es de vital importancia recordar que las concentraciones y los tiempos de incubación de los anticuerpos primarios utilizados para la tinción multiplex pueden variar de los utilizados en la tinción única cromogénica convencional. Por lo tanto, la determinación de la concentración y el orden de los anticuerpos a aplicar para la tinción multiplex debe llevarse a cabo de antemano.
Modificaciones y solución de problemas
En este estudio, empleamos tinción inmunohistoquímica de fluorescencia múltiplex para detectar simultáneamente la interacción de cuatro tipos principales de células inmunes en biopsias de endometrio de mujeres con y sin RM. Esta técnica utiliza anticuerpos contra CD3 para células T, CD20 para células B, CD68 para macrófagos y CD56 para células uNK para distinguir entre estos tipos de células. Con base en este método, encontramos que los valores medios de densidad celularCD3+,CD68+y CD56+ en las mujeres RM fueron significativamente más altos que los de los controles fértiles15. La agrupación entre células CD56+ uNK y macrófagos CD68+ fue significativamente mayor en el grupo RM que en los controles fértiles. Además, el uso de este método reveló que las células CD56+ uNK parecían tener correlación numérica y espacial con los macrófagos CD68+ en ambos grupos de mujeres. Por el contrario, las células CD56+ uNK tienen una correlación numérica significativa pero no espacial con las células T CD3+ en mujeres con RM15. Este método también determina la relación espacial de múltiples tipos de células inmunes en el endometrio. Sin embargo, la positividad para un marcador específico puede ser límite en algunos casos. Para superar este problema, es recomendable incluir un control positivo y un control negativo para determinar el umbral de positividad al construir la biblioteca espectral. Además, la evaluación meticulosa encendiendo y apagando los láseres de la imagen compuesta multiplex en el software inForm también puede ayudar a reconocer los patrones de tinción para minimizar la saturación de fluoróforos.
Limitaciones de la técnica
La identificación de la interferencia de fluoróforos durante la interpretación de los datos es esencial para diferenciar entre la colocalización genuina de marcadores y los artefactos de desmezcla. Esta metodología de tinción multiplex utiliza reactivos basados en TSA impulsados por amplificación enzimática, lo que puede aumentar la intensidad del marcador de antígeno en 10-100 veces en comparación con los métodos indirectos convencionales de FI. Esto genera un riesgo de deposición de tiralamida hiperactiva, lo que podría resultar en un efecto paraguas y / o sangrado de señal. Para identificar la sobretinuación, los niveles de señal se pueden evaluar visualmente desmezclando imágenes en inForm y colocando el cursor sobre áreas brillantes y positivas en una imagen de tejido multiplex. Los niveles de señal generalmente deben permanecer por debajo de 30 e idealmente dentro de un factor 3 entre sí, particularmente para los fluoróforos espectralmente adyacentes. Las diferencias de más de 5 veces en las señales para los fluoróforos espectralmente adyacentes pueden conducir a la interferencia de fluoróforos y causar artefactos de desmezcla. Si los niveles de señal de cualquier fluoróforo muestran más de 3 veces la diferencia con el fluoróforo adyacente, las concentraciones de fluoróforo TSA deben ajustarse para lograr el equilibrio de la señal. Una vez que se confirma que la señal está en el rango correcto, la relación señal-fondo debe mantenerse en < 1:10 para garantizar que la tinción positiva no se detecte falsamente desde el fondo inespecífico.
Como la diafonía espectral también puede crear una interferencia significativa de fluoróforos, el orden de tinción debe ajustarse para separar los tintes espectralmente adyacentes tanto en la secuencia como en la expresión de los marcadores. Aunque esta tecnología multiespectral que utiliza la estación de trabajo Mantra admite ensayos de hasta 8 plex, la aplicación de 4 fluoróforos, a saber, Opal 520, 540, 620 y 690, demuestra el mejor rendimiento sin interferencia de fluoróforos. El uso de fluoróforos ≥5 a menudo requiere más optimización y validación para evitar la diafonía espectral debido a los perfiles espectrales de los fluoróforos que comparten longitudes de onda próximas. En otras palabras, el número de objetivos que pueden detectarse simultáneamente mediante este enfoque solo está limitado por el número de bandas de longitud de onda y los conjuntos de filtros de excitación / emisión disponibles. Por lo tanto, para descartar una posible sobretinción de un fluoróforo TSA que bloquea la aplicación adicional de otros fluoróforos TSA y / o para identificar la diafonía de la señal, es esencial ser meticuloso al encender y apagar las capas de la imagen compuesta multiplex en el software inForm; interpretar correctamente los patrones de tinción de la tinción única de IHC; y buscar señales obvias de pérdida, ganancia o idénticas en un plano correspondientes a la localización en otro plano.
La tinción multiespectral requiere anticuerpos emparejados con fluoróforos específicos para detectar simultáneamente múltiples marcadores. Este emparejamiento fluoróforo-anticuerpo sigue dos reglas: i) los fluoróforos asignados para marcadores coexpresados deben estar separados espectralmente, y ii) los objetivos más abundantes deben emparejarse con fluoróforos con menor brillo o viceversa. El orden de tinción también debe organizarse de modo que los anticuerpos secuenciales no se colocalicen en los mismos compartimentos celulares en las células teñidas. Por lo tanto, aparte de las concentraciones de anticuerpos y los tiempos de incubación, que son factores críticos en los métodos de tinción convencionales, se deben considerar parámetros adicionales, como el emparejamiento adecuado de fluoróforos-anticuerpos, las concentraciones de fluoróforos TSA, la secuencia de tinción y la exposición de un anticuerpo específico a uno o más tratamientos de microondas, para una tinción multiplex exitosa. Debido a la alta variabilidad en las muestras de estudio, un protocolo multiplex dado puede no generar el mismo resultado en otros tipos de muestras de estudio.
Todo el proceso de tinción secuencial del múltiplex Opal puede tomar de uno a varios días dependiendo del número de marcadores involucrados en el panel y los tiempos de incubación de anticuerpos primarios. Por el contrario, los métodos estándar de FI generalmente permiten la visualización de 4-5 marcadores en una sola ronda de tinción. Cabe señalar que las condiciones optimizadas utilizando el método IHC convencional necesitan una mayor optimización antes de proceder a los procedimientos de tinción multiplex, que implican múltiples tratamientos adicionales de microondas y la aplicación de fluoróforos TSA que en última instancia afectarán la intensidad de tinción de cada anticuerpo. Actualmente, los enfoques de imágenes que utilizan tecnologías multiespectrales pueden requerir instrumentación costosa y dedicada. Además, solo puede limitarse a las regiones de interés seleccionadas por imágenes. Por lo tanto, esto puede no ser óptimo para laboratorios con recursos limitados y la exploración de tejidos con objetivos de antígenos inciertos.
Importancia con respecto a los métodos existentes
Una fortaleza particular de este método actual es la capacidad de medir la densidad de múltiples tipos de células inmunes en el endometrio simultáneamente a diferencia de los métodos convencionales de IHC que solo pueden etiquetar uno o dos tipos de células en una sola sección de tejido. La citometría de flujo es otro método que puede analizar las proporciones relativas de diferentes tipos de células inmunes en la muestra endometrial; sin embargo, no sería capaz de proporcionar información espacial entre varios tipos de células inmunes y la distribución específica dentro de diferentes compartimentos endometriales. Además, el agotamiento del tejido es una preocupación seria en la práctica clínica, especialmente durante los ensayos clínicos y cuando se utilizan muestras de biopsia. Estos dos métodos convencionales requerirían un gran número de muestras (ya sean secciones o células) para optimizar el procedimiento y para detectar múltiples tipos de células inmunes en el endometrio de mujeres con y sin RM.
Como se describe en este protocolo, el flujo de trabajo de Opal está diseñado para la detección de hasta siete marcadores en la misma sección de tejido mediante el uso de la estación de trabajo Mantra. Además, la reactividad cruzada de las especies durante la selección de anticuerpos no es una limitación de esta tecnología. De hecho, una ventaja de esta tecnología es que permite el uso de anticuerpos criados en la misma especie para detectar hasta siete marcadores. Este enfoque implica la detección con reactivos fluorescentes TSA seguidos de un tratamiento de microondas para eliminar cualquier tinción inespecífica. Después de la extracción a base de microondas, se puede realizar otra ronda de tinción para la detección adicional del objetivo sin el riesgo de reactividad cruzada de anticuerpos. Además, este método de detección de TSA se puede realizar en un mínimo de 3 días para combinar hasta 7 fluorocromos y al mismo tiempo producir resultados confiables para detectar objetivos de proteínas de baja expresión. Otra ventaja de la tinción multiplex sobre el estudio tradicional de IHC es su mayor eficiencia, ya que la medición está automatizada, lo que puede eliminar el sesgo subjetivo. Los datos cuantitativos generados representan los resultados finales del ensayo.
Aplicaciones futuras
El rango de aplicación de este protocolo multiplex es inmenso. Es importante destacar que este es el primer artículo que describe el método para la detección de la expresión de marcadores de inmunofluorescencia multiplexada utilizando mantra Workstation y el análisis de imágenes utilizando el software InForm 2.2.1 para proporcionar resultados precisos y reproducibles en la diferenciación de múltiples poblaciones de células inmunes en mujeres con y sin RM. Es importante destacar que la localización de múltiples objetivos en la misma sección de tejido puede proporcionar una visión única de sus interacciones celulares. En última instancia, esto conducirá a una mejor comprensión del microambiente de las células inmunes durante la implantación del embrión en mujeres con RM para establecer un tratamiento específico dirigido.
Además, nuestros métodos actuales ayudaron a demostrar que varias células inmunes y sus interacciones pueden ser importantes para la función del endometrio. Esto se demuestra por los cambios significativos en la densidad de tres de cada cuatro tipos de células inmunes endometriales y un aumento significativo en la agrupación entre las células CD68 + y CD56 +. Por el contrario, las interacciones anormales de estos tipos de células inmunes pueden ser factores predisponentes para la RM. Es importante destacar que, a diferencia de la detección de un solo subtipo de células inmunes endometriales, la aplicación de esta tinción multiplex IHC puede proporcionar una comprensión profunda de la regulación inmunológica de la implantación embrionaria. Además, la cuantificación y una mayor comprensión de las características espaciales en el microambiente inmune pueden ayudar a arrojar luz sobre la biología de esta enfermedad en el contexto de las inmunoterapias.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado por el Fondo Fiduciario Obstétrico y Ginecológico de Hong Kong en 2018 y el Fondo de Salud e Investigación Médica de Hong Kong (06170186, 07180226).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amplification Diluent | Perkin Elmer | FP1498 | Fluorophore diluent buffer |
| Antibody diluent | Perkin Elmer | ARD1001EA | Diluting the antibody |
| CD3 | Spring Bioscience | M3072 | Primary antibody |
| CD20 | Biocare Medical | CM004B | Primary antibody |
| CD56 | Leica | NCL-CD56-504 | Primary antibody |
| CD68 | Spring Bioscience | M5510 | Primary antibody |
| Citrate Buffer Solution, pH 6.0 (10x) | Abcam | AB64214 | Antigen retrieval solution |
| EMSURE Xylene (isomeric mixture) | Merck | 108297 | Dewaxing |
| Ethanol absolute | Merck | 107017 | Ethyl alcohol for rehydration |
| HistoCore BIOCUT Manual Rotary Leica Microtome | Leica | RM2125RTS | Sectioning of paraffin-embedded tissue |
| inForm Advanced Image Analysis Software | Perkin Elmer | inForm® Tissue Finder Software 2.2.1 (version 14.0) | Data Analysis software |
| Mantra® Workstation | Akoya Biosciences | CLS140089 | Spectral imaging |
| Microwave | Panasonic | Inverter | Microwave stripping |
| Opal 520 | Perkin Elmer | FP1487A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 620 | Perkin Elmer | FP1495A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 650 | Perkin Elmer | FP1496A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 690 | Perkin Elmer | FP1497A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Oven | Memmert | U10 | Dewaxing |
| Peroxidase Blocking Solution | DAKO | S2023 | Removal of tissue peroxidase activities |
| Poly-L-lysine coated slide | FISHER SCIENTIFIC | 120-550-15 | Slide for routine histological use |
| PolyHRP Broad Spectrum | Perkin Elmer | ARH1001EA | Secondary antibody |
| ProLong™ Gold Antifade Mountant | ThemoFisher Scientific | P36930 | Mounting |
| Spatstat | / | Version 2.1-0 | Spatial point pattern analysis |
| Spectral DAPI | Perkin Elmer | FP1490A | Nucleic acid staining |
| Tissue Processor | Thermo Fischer | Excelsior ES | Tissue processing for dehydration and paraffination |
| Tris Buffer Saline (TBS), 10x | Cell Signaling Technology | 12498S | Washing solution |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1370-1L | Nonionic detergent |
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