Summary
유방 상피 세포와 내피 세포 사이 교차 토크는 중요한 유방암 진행에 기여, 종양 성장, 및 전이. 이 연구에서는, 스페로이드는 혈관 및/또는 림프 성 내피 세포와 함께 유방암 세포에서 만들어졌으며 유방암 연구를위한 체외 시스템으로서 자신의 적용성을 입증했습니다.
Abstract
유방암은 여성의 사망의 주요 원인입니다. 유방암 세포의 성장과 후속 전이의 성장은 진행을위한 핵심 요소입니다. 유방암 성장 촉진에 관여하는 기전은 MCF-7 세포와 같은 유방암 세포의 단일 배양을 사용하여 집중적으로 연구되었지만 종양 성장에 밀접하게 관여하는 혈관 및 림프 내피 세포와 같은 다른 세포 유형의 기여는 깊이 조사되지 않았습니다. 세포 세포 상호 작용은 종양 성장 및 진행에 있는 중요한 역할을 합니다. 신경전증, 또는 혈관의 발달은 종양 성장에 필수적이지만 림프 계는 암 세포 이동 및 후속 전이를위한 포털 역할을합니다. 최근 연구는 혈관 및 림프 내피 세포가 암세포 성장에 크게 영향을 미칠 수 있다는 증거를 제공합니다. 이러한 관측은 생체 내 유방암 성장 과정을 보다 현실적으로 반영하는 체외 모델 개발의 필요성을 암시한다. 또한, 동물 연구의 제한은 관련된 메커니즘을 더 잘 해명하기 위해 전 생체 모델의 개발을 필요로한다.
이 문서는 유방암 세포 (에스트로겐 수용체 양성 MCF-7 세포) 및 혈관 및 /또는 림프 내피 세포로 구성된 유방암 스페로이드의 발달을 설명합니다. 이 프로토콜은 두 가지 접근 법, 매달려 드롭 (금 본위제 및 저렴한) 및 96 웰 U-바닥 플레이트 (비싼)를 사용하여 듀얼 셀 스페로이드를 만드는 상세한 단계별 접근 방식을 설명합니다. 형성된 스페로이드를 섬세하게 집어 들고 미세한 크기 조정및 죽은 세포 염색을 사용하여 생존 가능성을 평가하는 방법에 대한 심층 지침이 제공됩니다. 더욱이, 스페로이드의 성장 패턴을 차별화하기 위해 성장특이적 항체로 단면화 및 염색을 위한 스페로이드를 고치는 절차가 묘사된다. 또한, 세포분석용 RNA를 추출하는 방법 및 전염된 세포와 함께 스페로이드를 준비하기 위한 세부 사항이 제공된다. 결론적으로, 이 문서는 유방암 연구를 위한 다세포 스페로이드를 준비하기 위한 심층적인 지침을 제공합니다.
Introduction
실험을 위해 동물을 사용하는 것은 한계가 있습니다. 동물 연구는 인간에 있는 질병 진행을 정확하게 모방할 수 없고, 동물과 인간은 병원체에 동일 반응이 없습니다. 또한, 동물의 고통과 윤리적 문제에 대한 우려로 인한 동물 실험 제한1,2 점점 더 제약 연구 프로그램. In vitro 동물의 사용을 우회하기 위해 널리 개발된 시스템; 더욱이, 인간 세포의 사용은 in vitro 병리학 및 치료 조사에 더 관련성이 있는 모델. 종래의 단층(2D) 세포 배양은 인간 조직을 어느 정도 모방하기 때문에 널리 사용된다. 그러나, 2D 단배양은 인간 장기를 모방하지 못하며, 2D 단배양은 원래 장기의 복잡한 미세 환경을 시뮬레이션할 수 없으며 in vivo 상황3,4,5,6. 추가적으로, 단층 세포 배양에서, 약 처리는 쉽게 파괴/모든 세포를 손상할 수 있었습니다. 중요한 것은, 다층 3차원(3D) 세포 배양으로 전환하여 이러한 한계 중 일부를 극복할 수 있다는 것입니다.7,8. 실제로, 3D 배양 모델은 1차 조직에서 세포의 세포 구조, 레이아웃 및 기능을 더 잘 반영하는 것으로 나타났습니다. 이러한 3D 배양은 기능성 기관과 유사한 다양한 세포주를 사용하여 형성될 수 있다. 실제로 3D 문화권에는 두 가지 모델이 있습니다. 한 모델은 클러스터를 형성하고 구체(스캐폴드 프리 모델)로 재구성하는 집계된 셀의 스페로이드를 생성합니다. 두 번째는 더 복잡한 구조를 가지고 장기 의 소형 버전으로 간주되는 다중 장기 특정 세포의 조합으로 구성된 오르가노이드를 산출합니다.9,10. 이로 인해 3D 배양 시스템은 많은 생물학적 및 임상 응용 분야의 혁신적인 기술을 나타냅니다. 따라서, 스페로이드와 오르가노이드는 재생 의학, 약물 선별 및 독성 연구와 관련된 질병 모델링 및 연구에 대한 수많은 응용 프로그램을 가지고 있습니다.6,11,12,13,14,15. 3D 기술에서 파생된 발암 성 스페로이드는 관련 세포 유형의 형태와 표현형을 재현하여 모방합니다. in vivo 종양 미세 환경, 및 종양 발달 중에 작동하는 세포 통신 및 신호 경로 모델16,17,18. 또한, 암 생물학 이해를 향상시키기 위하여는, 종양 스페로이드/organoids는 또한 잠재적인 환자 특정 항암 치료 (개인화)를 확인하고 그것의 효험, 독성 및 장기 효력을 평가하기 위하여 이용될 수 있습니다19,20,21,22. 스페로이드는 세포 및 3차원 조직 아키텍처를 보존하는 능력, 모방 능력 으로 인해 병리학, 질병 모델링 및 약물 검진을 조사할 수 있는 두드러진 기회를 열었습니다. in vivo 상황 및 세포 세포 상호 작용. 그러나 혈관/전신 성분의 부족, 기능성 면역 또는 신경계 와 같은 이 시스템의 한계를 알고 있어야 하며, 이 시스템은 동물 모델에 비해 환원주의적 접근법을 나타낸다. 실제로, 동물 모델과는 달리, 3D 구조는 인체 내의 생물학의 근사치만을 제공합니다. 3D 방법의 한계를 이해하면 연구원들이 더 큰 규모의 장기를 더 잘 나타내는 스페로이드를 생산하기 위한 보다 세련되고 유효한 프로세스를 설계하는 데 도움이 될 수 있습니다.23,24,25.
암은 전 세계적으로 사망의 주요 원인이며, 유방암은 여자26,27,28에서가장 흔한 암이다. 유방암의 복잡한 미세 환경을 모방하기 위하여는, 유방암 스페로이드는 유방 종양, 즉 상피 세포, 내피 세포, 섬유아세포 및/또는 면역 세포에서 중요한 역할을 하는 세포를 사용하여 배양되어야 합니다. 더욱이, 유방암을 대표하는 스페로이드의 경우, 여성 호르몬 수용체(에스트로겐/황체호르몬 수용체)의 발현, 환자 종양 조직 상태를 보존하는 능력, 치료에 대한 반응을 모방하는 능력도 고려해야 한다. 연구에 따르면 3D 공동배양 시스템은 생체 내의1차 조직과 유사한 세포 조직을 가지고 있으며, 자극에 실시간으로 반응할 수 있는 능력을 가지며, 기능성 안드로겐수용체(29,30,31,32)를갖는다. 따라서, 유사한 접근은 시험관내유방 종양을 모방하기 위하여 유용할 수 있었습니다. 현재 프로토콜의 목적은 유방암 스페로이드를 생성하는 새로운 방법을 확립하는 것입니다. 이 방법은 에스트로겐 수용체 양성 MCF-7 세포(상피 세포의 불멸의 인간 세포주) 및 혈관 내피 세포(HUVECs) 또는 림프 내피 세포(HMVEC-DNeo)를 활용하여 종양 내의 이들 세포 간의 상호 작용을 모방하거나 밀접하게 반영하는 모델을 생성한다. MCF-7 (에스트로겐 반응성) 및 내피 세포는 본 연구에서 스페로이드를 개발하는 데 사용되었지만, 유방 종양 질량의 ~80 %를 나타내는 섬유 아세포와 같은 다른 세포는 향후 유방 종양을 더 잘 표현하고 모방하기 위해 결합 될 수 있습니다.
같은 스페로이드를 형성하는 몇 가지 방법이 있습니다: 1) 중력을 사용하는 걸이 액적 방법(33,34; 2) 외부자석(35)및 3) 저부착 플레이트(36,37)에서세포를 파종하여 수행되는 스페로이드 마이크로플레이트 방법을 사용하는 자기 적발 방법. 하나의 세포 유형만을 사용하는 기존 방법에 기초하여, 본 프로토콜은 생체 내 유방암 종양의 성장 조건을 더 잘 모방하기 위해 상피 및 내피 세포를 사용하여 최적화되어 있으며, 생체 내유방암 종양의 성장 조건을 더 잘 모방하였다38,39,40,41. 이 방법은 저렴한 비용으로 최소한의 장비 요구 사항으로 실험실에서 쉽게 달성 할 수 있습니다. 실험실의 필요/목표에 따라, 다른 접근 은 스페로이드를 형성 하 고 이러한 스페로이드에서 관련 된 세포 물질을 얻기 위해 사용 되었다. 이러한 맥락에서, DNA, RNA 또는 단백질 분석을 위해, 3D 스페로이드는 매달려 있는 낙하 방법과 함께 내피 및 상피 세포를 공동 배양하여 생성된다. 그러나, 기능적 연구를 위해, 예를 들어, 짧은 간섭 후 세포 성장을 모니터링 (siRNA) transfection 및/또는 호르몬 치료, 스페로이드는 U-바닥 플레이트를 사용하여 생성된다.
이 기술 프로토콜의 목적은 1) 유방암 다세포 형 스페로이드를 형성하는 1) 형성에 대한 상세한 단계별 설명을 제공하는 것입니다, 2) 조직학적 염색을위한 샘플을 준비, 및 3) RNA의 추출을위한 세포의 수집, DNA, 및 단백질. 저렴한 매달려 드롭 방법과 더 비싼 U-바닥 플레이트모두 스페로이드를 형성하는 데 사용됩니다. 여기서, 세포 증식, 세포 세포 증식, 세포 멸폐, 및 스페로이드 내내피 세포의 분포를 평가하기 위해 마커로 단면화 및 후속 면역스테인링을 위한 스페로이드를 준비하기 위한 프로토콜이 제공된다. 또한 이 프로토콜은 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 조직학적 데이터의 전체 단계별 분석을 보여 주습니다. 생물학적 데이터의 해석은 실험의 유형과 사용되는 항체에 따라 다릅니다. 고정 스페로이드의 단면 과 섹션의 후속 염색은 일상적인 병리학 실험실에 의해 수행되었다 (Sophistolab: info@sophistolab.ch)
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Protocol
1. 세포 배양
참고: 멸균 조건에서 세포 처리를 수행합니다.
- 인간 배꼽 정맥 내피 세포 (HUVECs) 하위 배양
- 콜라겐(5 μg/cm2)으로75cm2 플라스크를 실내 온도(RT) 또는 37°C에서 2-3h로 하룻밤(ON)하고 물로 헹구고 플라스크가 건조하도록 허용합니다.
- 글루타민(1x = 2mM), 항생제 항진화 용액(AA; 100 μg/mL 의 연쇄상 구균, 페니실린 100 μg/mL 및 0.025 μg/mL 의 amphotericin B), LSGS (2% v/v FCS, 하이드로코르티손 1 μg/mL, 인간 표피 성장 인자 10 ng/mL, 3 ng/mL 의 인간 표피/mL 표준 조직 배양 조건(37°C, 5% CO2)하에서헤파린의 10 μg/mL 및 10% FCS(태아 송아지 혈청). 세포가 70%-80%에 도달할 때까지 매2일마다 배지를 변경합니다.
- HBSS (Ca2 + 및 Mg 2+제외) 5 mL로 하위 컨물 재배를 세척하고 트립신 3 mL (0.25 % HBSS에서 희석 (Ca2 + 및 Mg 2+제외)를 추가하십시오.
참고: HBSS는 PBS로 교체할 수도 있습니다. - 세포를 37°C에서 2분 동안 배양(셀이 분리되고 반올림하는지 현미경으로 확인) FCS 배지(DMEM-F12 또는 EBM-2, 10% FCS)의 6mL을 추가하여 분리 반응을 중지한다.
- RT에서 5 분 동안 250 x g에서 세포 현탁액을 원심 분리하고 상체를 폐기하십시오.
- 75cm2 플라스크 또는 배양 접시에 성장 중간 및 종자에서 세포를 중단합니다.
- 미시간 암 재단-7 (MCF-7, 인간 유방 선암 세포) 하위 배양
- 인간 유방암 세포주를 성장시키는 75cm2 플라스크에서 성장 배지(DMEM/F12 배지는 상업적 글루타민(1x),항생제 항진균용액(AA; 연쇄상 구균의 100 μg/mL, 페니실린 100 μg/mL 및 amphotericin B의 0.025 μg/mL), 표준 조직 배양 조건하에서 10% FCS(37°C, 5%CO2). 매 2-3 일 마다 매체를 변경합니다.
- HBSS(Ca 2+ 및 Mg2+제외) 5mL로 하위 세포 배양(70%-80%의 합류)을 세척하고 3mL(Ca2+ 및 Mg 2+제외)에서 3mL(Ca 2+ 및 Mg2+제외)을 37°C에서 5분 동안 추가합니다(셀이 분리되어 있는지 현미경으로 확인).
참고: HBSS는 PBS로 교체할 수도 있습니다. - 10% FCS 배지의 8mL를 추가하여 분리 반응을 멈추고, RT에서 5분 동안 250 x g의 원심분리기를 제거하고 상체를 폐기하십시오.
- 75cm2 플라스크 또는 문화 접시에 성장 중간 및 접시에 펠릿을 중단합니다.
2. 스페로이드 형성
- 플레이트 5 x 105 셀/mL(HUVEC 및 MCF-7)을 3.5cm 원형 접시및 배양시 48h.
- 도금 된 세포를 24 시간 또는 원하는대로 치료하거나 변형하십시오.
- 96웰 U-bottom 플레이트에서 수행되는 선택적 단계: 1mL의 HBSS(Ca2+와 Mg2+)및 스테인 후벡을 사용하여 청색 염료(0.5 μg/mL) 및 MCF-7 셀을 사용하여 각각의 성장 배지에 희석된 37°C및 CO쿠바30분으로 37°C및 50%의 COcubato에 배치하였다.
- HBSS 1mL(Ca2+ 및 Mg2+제외)으로 셀을 세척하고, P1000 파이펫을 사용하여 각 라운드 접시에 효소 분리 시약 1mL(HUVEC의 경우 0.25%, MCF-7의 경우 0.5% 트립신)을 추가한 다음, 세포가 분리될 때까지 2-5분 동안 인큐베이트합니다.
- 각 셀 타입을 5mL 라운드-하부 폴리스티렌 튜브에서 따로 수집하고 P1000 파이펫을 사용하여 1mL의 1mL를 추가하여 효소 반응을 중지합니다. 5 분 동안 250 x g에서 세포 현탁액을 원심 분리합니다.
- 조심스럽게 슈퍼나탄을 흡인시키고 스테로이드없는 배지의 1 mL에서 세포를 일시 중단 (EBM-2, 글루타민, 항생제 항마이코틱, 0.4 % FCS sf (숯 제거)).
참고: 스테로이드 없는 매체는 정상적인 성장 매체로 대체될 수 있습니다. - 각 셀 서스펜션의 100 μL을 Diluent II의 10mL로 희석하여 총 세포 수를 결정하고 치료 배지의 양을 계산합니다(EBM-2, 글루타민, 항생제 항마이코틱, 0.4% FCS sf, 차량/치료) 셀 현탁액5 x 103 세포/mL 또는 3.5m/10 xL 의 셀 현탁액을 획득하는 데 필요한 세포 현탁액을 갖는다.
- 셀 수
- 셀 카운터 바이알에 Diluent II 용액을 사용하여 기능 및 시작 버튼(설정 S3)을 눌러 기계를 켜고 플러시합니다.
- S4 설정 및 시작 을 눌러 신선한 Diluent II 솔루션으로 공백을 측정합니다.
- 딜루엔트 II 용액의 10mL에서 셀 서스펜션 100 μL로 신경환 유리병을 변경하고 샘플을 측정합니다: 설정 S4 및 프레스 스타트.
- 디지털 디스플레이의 mL당 셀 수를 기록합니다.
참고: 세포 계수는 다른 수동 또는 자동 시스템을 사용하여 수행 될 수있다 : 혈변 세포계 격자 라인, 광 산란 세포 계수 기술, 전기 임피던스, 셀 염색을 사용하여 이미징 기반 시스템, 예를 들어, trypan 블루.
- 96웰 U-하단 플레이트
- 각 셀 서스펜션(5 x 103 셀/mL)의 5mL를 준비하고 이를 혼합하여 1:1의 비율로 10mL의 최종 부피를 얻습니다.
- 수동 반복 파이펫을 사용하여 셀 서스펜션의 100 μL을 96웰 U-바닥 플레이트의 각 웰에 피펫을 피펫합니다.
- 표준 조직 배양 조건하에서 인큐베이터에 플레이트를 넣고 48 시간 후에 스페로이드 형성을 확인하십시오.
- 선택적 단계: 형광 스테레오 현미경을 사용하여 스페로이드(40x)의 사진을 찍습니다.
참고: 이 방법은 48h(면적 1-2 픽셀2)후에 96개의 스페로이드(1개의 스페로이드/웰)를 생성하며, 일반적으로 성장 연구에 사용됩니다.
- 매달려 드롭
- 셀 서스펜션(3.4 x 105 셀/mL)을 1:1 비율로 혼합하여 최종 부피를 2mL로 얻습니다.
- P20 파이펫을 사용하여 10cm 페트리 접시의 반전 뚜껑에 15 μL 방울의 형태로 세포 혼합물을 시드한다.
- 뚜껑을 방울로 반전시키고 접시 바닥에 5mL의 베이스 미디엄(EBM-2)을 추가하여 방울의 증발을 피하십시오.
참고: 이 메서드는 48시간 후에 하나의 스페로이드/드롭을 생성합니다. 뚜껑을 전환하는 동안 병합되지 않도록 방울이 서로 충분히 떨어져 있는지 확인합니다. 필요한 경우 10cm 이상의 페트리 요리를 사용하십시오.
- 셀 수
3. 스페로이드 성장 연구
- 96웰 U-바닥 플레이트에 HUVEC 및 MCF-7 세포 혼합물(5 x 102 셀/웰)의 플레이트 100 μL을 플레이트하고 인큐베이터에 배치합니다.
- 도금 후 48 시간, 반전 된 현미경 (밝은 필드)와 스페로이드 형성을 확인합니다. 96h 의 문화에서 사진 (치료 당 적어도 6 장의 사진, 40x)을 촬영하십시오.
- 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 사진을 열고 이미지를 300 픽셀 /인치로 처리하고 이미지를 티프 파일로 저장합니다.
- ImageJ 소프트웨어를 다운로드하여 엽니다. 파일 옵션을 클릭하고 열립니다.
- 관심 영역을 균일한 방식으로 포화 된 검은 영역으로 변환하여 이진 이미지 (흑백)를 갖습니다. 이에 대해 이미지 옵션을 선택하고 비트 | 유형을 선택합니다. 이제 이미지는 흑백입니다.
- 프리핸드 선택 도구를 사용하여 스페로이드의 테두리를 그립니다.
- 관심 영역을 계산하고 개체 또는 전경 픽셀을 배경 픽셀과 분리하려면 임계값 함수를 사용합니다: 이미지 옵션을 선택하고 조정을 선택하고 임계값을 클릭합니다.
- 이제 임계값 팝업 창이 열립니다. 위쪽 막대는 최소 임계값값을 나타냅니다: 값을 0으로 설정합니다. 아래쪽 막대는 최대 임계값값을 나타냅니다: 관심 영역이 완전히 빨갛게 될 때까지 막대를 이동합니다.
참고: 색상이 빨간색이 아닌 경우 임계값 창에서 빨간색을 선택합니다. - | 분석으로 이동 측정값을 설정하고 영역 및 둘레를선택합니다.
- 관심 영역을 측정하려면 분석 옵션을 선택하고 파티클 분석 도구를 사용합니다. 파티클 분석 창에서 측정할 크기를 설정합니다(스페로이드 크기에 따라 0.00003-무한대 또는 3-무한대)를 설정하여 요약 및 표시 결과를선택합니다. 그런 다음 확인을 클릭합니다.
- 결과는 차트에 표시됩니다. 측정값을 스프레드시트에 복사하여 데이터를 분석합니다.
참고: 영역은 총 픽셀 수로 계산됩니다. 계산을 위해 총 영역을 사용합니다.
4. 스페로이드 면역히스토화학 연구
- 샘플 준비
- HUVEC 및 MCF-7(5 x 103 셀/웰)의 세포 혼합물을 96h의 HUVEC 성장 배지에서 96웰 U-바닥 플레이트에 플레이트.
- P200 μL 파이펫의 절단 팁으로 약 50개의 스페로이드를 1.5mL 튜브로 수집합니다. 중력으로 튜브 의 바닥에 정착 한 다음 상체를 폐기 할 수 있습니다.
- 1 시간, RT에 대한 4 % PFA의 500 μL로 스페로이드를 수정합니다.
- PBS에서 2% 노벨 아가용용을 3-5분 간 자기 교반기가 있는 핫 플레이트를 사용하여 아가로즈 분말을 완전히 녹여 60°C로 식힙니다.
- P1000 파이펫으로 PFA를 제거하고, PBS의 500 μL로 스페로이드를 세척하고, 퇴적물을 허용합니다. 상부체를 폐기합니다.
- 조심스럽게 스페로이드와 1.5 mL 튜브에 아가로즈 용액의 파이펫 600 μL과 2 분 동안 177 x g의 수평 로터와 원심 분리기에 튜브를 배치합니다.
- 아가로즈 솔루션 중간에 짧은 문자열을 추가하여 튜브에서 플러그를 쉽게 제거합니다.
- 얼음이나 4°C에서 아가로즈 플러그를 단단히 고정시하십시오. 펠릿에서 건조하지 않도록 1.5mL 튜브에 PBS 500 μL을 추가합니다.
참고: 샘플은 후속 탈수, 파라핀 포함, 단면, 현미경 슬라이드로의 전송 및 IHC 염색(Sophistolab에 의해 수행됨)에 대비합니다.
- 이미지 수집 및 처리
- 스테레오 현미경을 사용하여 스페로이드 섹션의 이미지를 습득.
- 각 샘플에 대해 세 개의 이미지를 .jpg 파일로 저장합니다.
- ImageJ 소프트웨어를 엽니다. JPEG 이미지를 열고 파일을 클릭한 다음 열면.
- 이미지 옵션에서 색상 및 색상 디폰볼루션을 선택합니다.
- 색상 Deconvolution 1.7 창에서 H DAB 벡터를 선택하고 세 이미지가 나타납니다.
참고: 세 가지 이미지는 색상 1은 헤마톡실린 염색(파란색/보라색)만 나타내며 색상 2는 DAB 염색(갈색)만 나타냅니다. 두 개의 얼룩이 있는 이미지 분석에 색상 3이 필요하지 않습니다. - 색상 1 창을 선택하고 임계값을 설정합니다: 이미지 | 조정 하고 임계값을 클릭합니다. 임계값 창이 나타납니다.
- 최소 임계값을 0으로 설정하고 최대 임계값값을 조정하여 실제 신호에 영향을 주지 않고 배경 신호를 제거합니다. 적용을 클릭합니다.
- 영역 측정
- 분석을클릭하고 측정 설정을 선택합니다. 영역, 평균 회색 값및 최소 및 최대 회색 값을 선택하고 확인을 클릭합니다.
- 분석 옵션을 사용하여 핵크기를 측정한 다음 측정값을 선택합니다.
참고: 결과 창은 이미지(레이블), 이미지 크기(영역), IHC 이미지의 평균 픽셀 강도(평균) 및 최소 및 최대 회색 값(최소 및 최대 값)의 이름을 제공합니다. 계산에 평균 값을 사용합니다. - 색상 2의 경우 4.2.6-4.7.1.2 단계를 반복하고 이중 염색이 있는 경우 색상 3을 반복합니다.
- 세포 정량화
- 프로세스를클릭하고 옵션 바이너리를 선택하고 분수령을 선택하여 셀을 분리합니다.
- 분석하여 파티클 분석을클릭합니다. 파티클 분석 팝업 창에서 셀 크기를 설정하여 특이하지 않은 파티클을 제외합니다. 다음, 쇼 옵션에 드롭 다운 상자를 클릭 하 고 개요를 선택 합니다. 그런 다음 확인을 클릭합니다.
- 색상 2 (및 이중 염색이있는 경우 색상 3)에 대한 4.2.6-4.2.7 및 셀 정량화 단계 (섹션 4.2.7.2)를 반복합니다.
참고: 이제 세 개의 창이 나타납니다: 1) 요약 결과 (셀 수 계산, 총 면적, 평균 크기, 면적 및 평균의 %), 2) 결과 (계산되는 셀에 각각), 및 3) 그리기 창 (계산된 셀의 묘사 된 이미지).
- 영역 측정
5. 스페로이드에 라이브 / 죽은 얼룩
- DMSO에서 Calcein AM의 4m 스톡 솔루션을 준비 (얼룩 라이브 세포 녹색) 및 1.5 mL 튜브에서 DMSO (얼룩 죽은 세포 빨간색) 에티듐 호모이머의 2 mM.
- EBM-2에서 1:50을 희석한 칼신 AM과 에티듐 호모디머의 혼합물의 10 μL/웰을 추가하는 데 필요한 용액의 양을 계산합니다.
- 스테인링 혼합물을 스페로이드에 넣고 30-60분 동안 표준 조직 배양 조건하에서 인큐베이터에 플레이트를 넣습니다.
- 형광 스테레오 현미경을 사용하여 사진 (40x)을 획득하십시오.
6. 스페로이드의 단백질과 RNA 절연
- 세포 유형당 세포 현탁액을 3.4 x 105 셀/mL로 준비하고, 1:1의 비율로 혼합하고, 10cm 페트리 접시의 뚜껑에 15 μL 방울의 형태로 P20 파이펫을 사용하여 세포 혼합물을 시드한다. 뚜껑을 반전시키고 96h에 대한 표준 조직 배양 조건하에서 인큐베이터에 놓습니다.
- PBS의 5-6 mL을 사용하여 5mL 멸균 폴리스티렌 파이펫을 사용하여 15mL 라운드 바닥 폴리스티렌 튜브에서 스페로이드를 수집합니다.
참고: 15mL 원문 튜브도 사용할 수 있습니다. - 스페로이드 서스펜션을 250 x g에서 5분 동안 원심분리한 다음 수퍼나탄을 조심스럽게 흡인시합니다.
- 트립신(100%)과 파이펫 을 30s에 대고 피펫을 위아래로 추가하여 스페로이드를 분해하여 셀 서스펜션을 달성합니다.
- 트립신을 10% FCS 배지로 중화하고, 튜브를 250 x g에서 5분 동안 원심분리하고, 수퍼나티를 흡인시합니다.
- 제조업체의 프로토콜 (DNA없는 RNA 절연을위한 특정 키트)에 따르면, RNA 용해 버퍼300 μL을 사용하여 세포 펠릿을 용해하십시오.
참고: 리시스 버퍼는 RNA를 추출하기 위해 그대로 스페로이드(트립신 단계가 필요하지 없음)에 직접 첨가할 수 있습니다. 펠리시스 버퍼300 μL을 펠릿 스페로이드에 넣고 튜브를 얼음에 넣고 P200 파이펫을 사용하여 10회 세리라울 수 있습니다. 이어서, RNA를 위와 같이 분리한다. 매트릭스 간섭으로 인해 RNA 회수가 낮은 경우 스페로이드 해리가 필요할 수 있다. - 또는, 단백질 절연을 위해 Lysis 버퍼의 70 μL을 사용하십시오. 초음파 처리에 의해 2-4 s에 대해 균질화하고 BCA 분석 키트를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 단백질 농도를 결정합니다.
참고: 단백질 절연의 경우, 펠렛 스페로이드는 용해 버퍼에서 직접 용해될 수 있으며 초음파 처리가 가능합니다. 총 단백질 25μg을 사용하여 서부 블롯을 수행하십시오.
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Representative Results
상피 및 내피 공동 배양을 사용하는 스페로이드 모델은 체외 실험을 위해 유방 종양의 생체 조건에서 밀접하게 모방하는 데 필요합니다. 도 1의 계획은 유방암 상피 세포 및 혈관 또는 림프 내피 세포를 가진 스페로이드를 형성하는 프로토콜을 묘사한다(도1). 각 세포 유형은 3.5cm 원형 접시에 별도로 시드되고 성장 자극기/억제제로 처리되거나 Lipofectamine을 사용하여 올리고뉴클레오티드로 감염됩니다. 상피 또는 내피 세포의 컨물수 단층은 트립시화, 세척 및 1:1 비율로 혼합된 다음 수확됩니다. 세포는 이후 96웰 U-bottom플레이트(도 1A)또는 10cm 직경의 둥근 배양 접시의 반전 뚜껑에 도금되어 매달려 있는 낙하 배양(도1B)을용이하게 한다. 곧 파종 후, 세포는 각 우물 또는 드롭의 바닥에 세포의 평평하고 조밀 한 시트로 표시하고, 그 후, 그들은 시간 (24-48 h)로 집계, 따라서 48 h에서 그대로 스페로이드를 형성. 느슨하게 형성된 세포 응집체에 대한 손상을 방지하기 위해 플레이트는 적어도 24시간 동안 방해해서는 안 됩니다.
U-바닥 플레이트에서, MCF-7 세포의 파종은 내피 세포 또는 림프세포가 아니지만, 48h(도2A,B)이후의 스페로이드 형성을 초래하였다. 더욱이, MCF-7 플러스 내피 세포 또는 림프세포의 파종은 또한 스페로이드형성(도 2C,D,각각)을 초래하였다. 스페로이드를 종양 성장을 연구하는 모델로서 검증하기 위해, 성장 자극 용액에 대한 응답으로 스페로이드 크기의 시간 의존적 변화를 측정/정량화하고 처리되지 않은 대조군과 비교하였다(도2). 도 2E의 포토마이크로그래프는 대표적인 MCF-7 스페로이드의 시간 의존성(24-120h)의 순차적 성장을 보여준다. 도 2F의 선 그래프는 성장 자극기 유무에 관계없이 처리될 때 시간이 지남에 따라 MCF-7 스페로이드 영역의 변화를 묘사합니다. 스페로이드 크기는 ~100 μm에서 ~200 μm로 5일 동안 증가; 더욱이, 성장 자극기(그림2F)로처리된 스페로이드에서 증가된 성장속도가 관찰되었다. 장기 치료(168h)는 MCF-7 생존가능성을 감소시켰기 때문에, 잠재적으로 스페로이드(그림3)의중심에 있는 저산소 조건으로 인해, 3D 구조 성장은 96h까지 연구되었다. MCF-7 세포와 HUVEC로 형성된 스페로이드는 MCF-7단독으로 형성된 스페로이드에 비해 168h에서 더 적은 수의 죽은 세포를 보여준다.
초기 실험에서는 4일간의 배양 후에 스페로이드 크기의 작은 성장만 관찰하였다. 스페로이드를 형성하기 위해 시드된 세포의 수가 많기 때문일 수 있다는 가설이 있었습니다. U-바닥 배양 판에서, 스페로이드의 성장은 우물의 오목한 모양에 의해 제한되었을 수 있습니다. 성장은 시드 된 세포의 초기 수에 의존 했기 때문에, 다른 세포 숫자는 테스트 하 고 스페로이드 성장을 모니터링 하는 최적의 조건을 설정 하는 스페로이드를 형성 하는 데 사용 되었다. 도 4에나타난 바와 같이, 연구 결과는 스페로이드 성장 연구의 경우, 500 개의 세포 /잘 파종하여 스페로이드를 형성하는 것이 성장 조절 요인에 대한 응답으로 4-6 일 동안 스페로이드의 성장을 모니터링할 수 있어 신뢰할 수 있고 재현 가능한 것으로 나타났습니다. 조직학적 또는 면역 조직학적 관측에 가장 적합한 스페로이드는 5 x 103 세포의 시드 후 4일째에 수득되었다. 이 와 같은 초기 농도는 세포 단백질 또는 RNA 추출을 위해 사용되었다. 초기 세포 농도를 7.5 x 103 세포/웰 이상증가시킴으로써 스페로이드 형성을 개선하지 못했고, 세포가 제대로 집계되지 않았고 불규칙한 구조를 가정하였다(도4).
세포 조성, 증식 및 세포멸 상태를 평가하기 위해 유방암 세포와 내피 세포로 형성된 스페로이드의 조직학적 섹션은 H&E 및 Ki67(희석 1:300) 및 클리브 카스파세-3(희석 1:500) 항체를 사용하여 검사하였다. 최종 샘플 준비 프로세스는 주의/주의 및 정밀도가 필요합니다. 그림 5A는 스페로이드를 절개하기 위한 아가로즈로 컬렉션 및 통합에 대한 워크플로우를 묘사합니다. 도 5B에서의광현미경그래프-C는 일반적으로 사용되는 전환제인 리포펙타민(0.17% 최종 농도)의 존재(도 5B)및 부재(도5C)에서MCF-7 스페로이드 형성의 차이를 나타낸다. 조직학적 섹션의 밝은 필드 현미경 이미지는 두 세포유형(도 5D-G)의균일한 혼합물의 원형, 컴팩트한 구조를 보여준다. 스페로이드의 구조와 세포의 형상은 Lipofectamine(도 5D)의존재에서 제어 올리고 뉴클레오티드와 함께 트랜스퍼전에 따른 이상을 보여주지 않았다. 더욱이, 증식 마커를 발현하는 세포, Ki67은, 스페로이드에 균질하게 분포되었다; 그러나, 증식 세포의 고리도 스페로이드(도5E)의표면에서 관찰되었다. 클리드 카스파세-3 염색은 배양 4일 후 세포세포(도 5F)를보였다. 조직학적 섹션은 특정 마커를 사용하여 스페로이드내상피 세포 및 내피 세포의 분포를 평가하는 데 유용합니다. 내피 세포에 대한 특정 마커로서 CD31을 사용하여, 3D 구조 내에서 그들의 분포를 결정할 수 있다. 모든 세포가 헤마톡슬린(세포의 핵의 청색 염색)으로 염색되기 때문에, CD31 발현의 계산은 치료 또는 트랜스페션(프로토콜 섹션 4.2.7.1)에 따라 내피 세포를 포함하는 스페로이드의 영역을 제공할 수 있다. 더욱이, 이중 염색 분석기를 수행함으로써, 예를 들어 도 5G,CD31 얼룩 내피 세포(red) 및 Ki67 얼룩증 증식 세포(brown)에 도시된 바와 같이 더 많은 정보를 가질 수 있다. 프로토콜 섹션 4.2.7.2에 이어, 도 5G는 55%가 상피 세포이고, 45%는 내피 세포이고, 세포의 25%가 증식하고 있는 것으로 나타났다.
스페로이드의 구조는 또한 살아있는 염료를 가진 세포의 표지에 따라 면역 형광 분석을 사용하여 공부될 수 있습니다. HUVEC 및 MCF-7 세포의 Confluent 2D 배양물은 파란색(HUVEC) 및 녹색(MCF-7) 염료로 별도로 염색하였다. 그 후, 스테인드 셀은 1:1 비율로 채취되고 혼합되었고 스페로이드 형성을 위해 우물에서 시드되었다. 염색된 형광세포의 이미지는 파종후(도 6A)및 3일간의 배양(도6B)후에 찍은 것이다. 살아있는 세포와 죽은 세포의 비율을 평가하기 위한 목적으로, 4일 된 스페로이드는 칼신-AM(녹색)과 에티듐 호모디머(적색)(도 6C)로염색되었다. MCF-7 및 HUVEC로 형성된 스페로이드는 동결 세포를 위한 표준 프로토콜(10% DMSO 및 10% FCS로 보충된 성장 매체)을 사용하여 성공적으로 동결/보존할 수 없었습니다. 냉동 및 해동 된 구체형에서 세포 응집체의 파열과 세포 생존능력의 증가된 손실이 분명했습니다. 도 6D의 대표적인 이미지는 죽은 세포와 살아있는 세포를 위해 염색된 갓 해동된 스페로이드를 보여줍니다. 그것은 스페로이드가 동결 조건에 매우 민감하다는 것을 보여줍니다.
실험 조건에서 5일간의 배양 후, 약 100개의 스페로이드의 용해가 충분한 단백질(~3μg/mL) 또는 RNA(~60 ng/μL)를 수집하여 분석을 위해 필요하였다. 도 7은 향후 RT-PCR에 의한 향후 마이크로어레이 분석 또는 분석을 위해 서부 블로팅 또는 RNA 절연을 수행하기 위해 단백질 추출을 위한 세포 용해(hanging drops 방법으로 생성된) 스페로이드 컬렉션(hanging drops 방법으로 생성된)으로부터의 워크플로우를 나타낸다. 마이크로어레이 분석을 위한 스페로이드에서 이질세포 집단으로부터 RNA/DNA의 분리는 몇 가지 유용한 정보를 가져올 수 있다. 그러나, 주요 세포 특이적 메커니즘 또는 세포 세포 상호 작용을 식별하기 위해, 스페로이드 세포는 마이크로어레이 분석에 사용되는 특정 세포로부터 FACS 분석 및 RNA를 사용하여 효소(trypsin 또는 accutase) 해리 후 분리될 수 있다. 더욱이, 항생제 내성 세포주(예를 들어, EGFP 및/또는 푸오마이신 저항세포주를 이용하여)는 세포 상호작용의 특정 세포 유형의 역할을 해결하기 위해 스페로이드에서 사용될 수 있었다. 추가적으로, 유전자 침묵 공구는 특정 세포 세포 상호 작용 문제점을 해결하기 위하여 세포를 설계하기 위하여 이용될 수 있습니다.
그림 1: 스페로이드 형성의 워크플로우. 2D 배양에서 MCF-7 및 HUVEC 또는 LEC 세포는 다양한 원하는 치료 후에 별도로 재배되고 수집됩니다. 스페로이드는 세포 대 세포 집계에 의한 3D 구조의 형성을 촉진하는(A)96웰 U-bottom 플레이트에서 세포의 직접 혼합에 의해 생성되거나 중력의 힘을 통해 스페로이드 형성을 지원하는(B)매달려 낙하 배양을 사용함으로써 생성된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 시간이 지남에 따라 스페로이드 형성 및 개발. 이미지는 MCF-7 세포(패널 A)에의해 스페로이드의 형성을 묘사, 내피 또는 림프 세포에 의해 스페로이드 형성의 부족 (HUVECs; (패널B)) 동일한 밀도로 도금되고, MCF-7 세포에 의해 스페로이드 형성 플러스 HUVEC 또는 LEC가 1:1 비율로 혼합하였다(패널C,D). 또한 시간이 지남에 따라 스페로이드의 크기가 증가(24h, 48h, 72h, 96h 및 120 h)를 묘사하였다. 이 스페로이드는 MCF-7 플러스 HUVEC의 혼합물로부터 1:1 비율로 형성되었으며 96웰 U-bottom plate(패널 E)의500 셀/웰밀도로 시드하였다(스케일 바 = 200 μm, 40x). 라인그래프(Panel F)는성장 자극(Treatment) 스페로이드에 비해 제어(CTR)의 시간 의존적 성장을 나타낸다. 스페로이드의 부위는 치료되지 않은 스페로이드와 처리된 스페로이드 사이에서 측정되고 비교되었다. 결과는 각각의 대조군과 비교하여 ± SEM, *** p < 0.001을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 스페로이드 장기 문화와 생존가능성. 포토마이크로그래프는 MCF-7 세포로 단독으로 형성된 스페로이드의 세포 생존가능성을 96h(패널A)및 168h(패널C)로나타내고, 패널 B와 D는 MCF-7 플러스 HUVEC(1:1 비율)로 만든 스페로이드의 세포 생존가능성을 96h(패널B)및 168h 패널(D) 10μm(μm)로 나타낸다. 세포는 칼신 (빨강, 죽은 세포) 및 에티듐 호모디머 (녹색, 살아있는 세포)로 염색되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: MCF-7 플러스 HUVEC 스페로이드의 세포 파종 밀도 및 시간 의존성장 프로파일. 1:1 비율로 혼합된 HUVECs 및 MCF-7 세포는 밀도 증가(102-104 세포/웰)에서 시드되었고, 스페로이드의 성장을 24-96h 이상 모니터링하였다. 현미경 밝은 필드 이미지는 시간이 지남에 따라 스페로이드 성장을 평가하기 위해 (스케일 바 = 200 μm, 40x)를 촬영하였다. 500 개의 세포 /웰의 밀도에 세포는 스페로이드 성장을 연구하기에 최적의 크기를 제공했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 단면 및 조직 학적 염색을위한 스페로이드 포함. 패널 A: HUVECs / MCF-7 구체형의 수집 및 통합을위한 워크플로우를 묘사 만화아가로즈에. 아가로즈 플러그에 스페로이드를 파라핀을 포함시키고 파라핀 블록의 단면에 파라핀을 삽입한 후, 시료는 표준 조직학적 염색에 사용되었다. 패널 B 및 C쇼 대표 MCF-7 플러스 후베C 스페로이드는 리포펙타민 2000 없이 처리되며, 각각 (스케일 바 = 200 μm, 40x). 패널 D-G는 특정 마커로 얼룩진 스페로이드 섹션의 대표적인 이미지를 보여줍니다. 패널 D는 스페로이드 구조(스케일 바 = 100 μm)를 평가하기 위해 헤마톡시린-에오신으로 염색된 스페로이드를 나타낸다. 패널 E에 염색은 Ki67로 긍정적으로 얼룩진 세포를 증식하는 것을 묘사합니다. 패널 F는 클리드 카스파세-3(스케일 바 = 50 μm)로 긍정적으로 염색된 스페로이드에서 세포 세포를 나타낸다. 패널 G는 이중 염색을 가진 스페로이드 단면을 묘사합니다: CD31 (내피 세포 마커) 및 Ki67 (증식 마커) (스케일 바 = 100 μm). 스페로이드와 염색의 단면은 Sophistolab (info@sophistolab.ch)에 의해 수행되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 세포 분포 및 생존가능성을 보여주는 MCF-7/HUVEC 스페로이드의 형광 이미지. 패널 A와 B는 녹색 염료로 염색된 블루 염료와 MCF-7 세포로 염색된 HUVECs를 가진 대표적인 스페로이드를 묘사합니다. 스페로이드 내의 HUVEC 및 MCF-7의 국소화는 파종후(A)및 스페로이드형성(B)(스케일 바 = 250 μm) 후에 변화한다. 패널 C-D는 칼신/에티듐 호모디머로 염색된 스페로이드를 정상 배양 조건(C) 및 동결 후(D)(Scale bar =100 μm)에서 3D 구조에서 살아있는(녹색) 및 죽은 세포(빨간색)를 식별한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 생화학 적 분석을위한 스페로이드 수집의 회로도 표현. 스페로이드를 수확하는 계획을 보여주는 만화, 분리 또는 방출 세포, 단백질 분석 또는 RNA 추출을위한 용액에서 중단. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
2D 세포 배양에 비해 혁신적인 3D 스페로이드 배양 기술은 기관의 미세 환경, 세포 세포 상호 작용 및 체외에서약물 반응을 재구성하는 더 강력하고 강력한 도구입니다. 이것은 유방암 연구를 위한 다세포 (상피 및 내피) 세포주에서 스페로이드의 대형을 기술하는 첫번째 프로토콜입니다. 이 프로토콜은 최대 5일 동안 스페로이드의 스페로이드 3D 성장을 보장하고, 파라핀 포함, 단면 및 조직학적 얼룩 후 스페로이드를 검사할 수 있습니다. 흥미롭게도, 스페로이드 내의 세포 원소는 여전히 세포 성장을 촉진하고 증식 및 세포 자극에 반응하는 수용체를 표현합니다. 설명된 프로토콜은 단백질 또는 RNA/DNA 분석을 위한 충분한 생물학적 물질을 생성한다. 실험실 조건과 저렴한 비용으로 쉽게 달성된 위의 공동 배양 시스템은 특히 유방암 치료와 약물 감수성 검사에서 향후 적용에 유리할 수 있습니다. 또한, 이러한 프로토콜은 상피 및 내피 세포 유형에 적용될 수 있다.
생체 내에서 존재하는 복잡한 조직을 체외에서 모방하는 것은 매우 어렵습니다. 이는 생체 내 조직이 신경, 혈관, 메센키메 및 면역 세포를 포함하는 많은 상호 작용 성분으로 구성되어 있기 때문이다30,42. 이 프로토콜의 목적은 실제 종양 상태에 접근하기 위해 두 개의 상이한 세포 유형을 가진 3D 공동 배양 시스템을 사용하여 이러한 한계 중 일부를 극복하는 것이다. 여기서, 스페로이드는 세포 세포 상호 작용, 세포 간 공간으로 방출된 세포 간 인자에 대한 감수성, 및 스페이스로이드의 중심에 있는 저산소 조건을 포함하여 생체 내 실정을 가능한 한 모방하기 위해 상피 종양 세포또는 림프세포와 병용하여 형성되었다. 이 프로토콜은 성장 인자, 신호 인자 및 호르몬에 대한 세포 반응 의 테스트에 최적화되어 있으며, 이는 신호 캐스케이드및 표적 유전자 전사를 신속하게 활성화하고 단백질 발현 및수송을 자극30,31. 스페로이드에서는 생체 내에서는아니지만, 자극에 대한 종양 세포의 반응은 신속하고 자주 평가될 수 있다.
본 연구에서는, 스페로이드에 있는 내피 세포는 모세 혈관 같이 구조물을 형성하지 않는 것처럼 보입니다. 내피 세포는 고밀도에서 저밀도 및 단층층에서 도금될 때 모세혈관을 형성하는 것으로 나타났기 때문에, MCF-7을 내피 세포 비로 낮추면 스페로이드 내의 모세혈관 형성이 발생할 수 있다. 대안적으로, 특정 매트릭스 단백질 또는 마모겔의 첨가는 모세관 형성을 촉진할 수 있다. 스페로이드에서 모세혈관 과 같은 구조의 부족은 MCF-7 세포에 의해 방출되는 요인이 내피 세포 증식을 촉진하고 그 반대의 경우도 마찬가지이기 때문에 MCF-7 플러스 내피 세포 대 내피 세포의 장점을 희석시키지 않습니다. 이러한 상호 작용은 MCF-7만 스페로이드에서 발견되지 않은 상태로 유지됩니다.
여러 연구는 5 x 103 세포 /웰 스페로이드를 형성하기 위해 종자 세포에 적절한 농도였다 것으로 나타났습니다43,44,45,46,47; 그러나, 96웰 U-바닥 플레이트에서, 이 수의 세포는 실험 조건에서 스페로이드의 조정된 성장을 제한하였다. 따라서, 각각의 새로운 연구에서는, 각각의 새로운 세포 유형에 대해, 약물 치료 후 3D 시스템의 성장을 모니터링하여 스페로이드 크기에 대한 치료의 효과를 결정하는 것이 중요하다.
현재 프로토콜의 한계는 이전에 형성된 구체형의 배양이 고전적인 DMSO 방법에 의해 동결 및 해동 후에 계속될 수 없다는 것이다. 사실, 해동했을 때, 대부분의 세포는 죽었다. 유리화는 세포를 살아 있게 하는 대안이 될 수있다(48).
기술적 세부 사항에 주의하여 오류를 방지하고 잘 형성된 스페로이드를 생산하고 유지하기 위해 필요합니다. 한 가지 과제는 면역 염색을 위한 샘플 준비(섹션 4.1)입니다. 1.5mL 튜브로 스페로이드를 배관하여 이송을 용이하게 하기 위해, 구멍의 영역이 스페로이드 자체보다 더 큰 가위로 절단된 P200 팁을 사용하는 것이 중요하다. 그렇지 않으면 전송이 구를 파괴할 수 있습니다. 또 다른 과제는 스페로이드가 테스트 튜브의 바닥에 정착 한 후 매체를 흡인하는 방법입니다. 이와 관련하여, 스페로이드의 포부를 피하기 위해 진공 펌프 대신 P1000 파이펫을 사용하는 것이 좋습니다. 단면을 위한 스페로이드를 준비하는 중요하고 섬세한 단계는 펠렛 스페로이드에 아가로즈를 추가하는 것입니다. 한 번 아가로즈에 매달려 있던 스페로이드는 실온에서 수평 원심분리기를 사용하여 미생물 체증 관의 바닥으로 빠르게 펠릿화되어야 하며 아가로즈가 중합되기 전에.
전반적으로, MCF-7 및 내피 세포로 만든 2세포 스페로이드는 종양 내내세포 또는 내피 세포의 성장을 유도하는 세포 세포 상호 작용 및 메커니즘을 조사하기 위한 실행 가능한 대안을 제공한다. 스페로이드는 종양 또는 암 성장을 표적으로 하는 치료제의 효능을 평가하는 모형으로 봉사할 수 있었습니다. 중요한 것은, 이 2세포 모형은 종양 성장에 관련있는 그밖 세포 모형을 포함하기 위하여 더 즉흥적으로 일 수 있었습니다. 이러한 맥락에서, 유방 종양 질량의 80%를 구성하는 섬유아세포는 MCF-7, 내피 세포 및 섬유아세포 스페로이드를 형성하기 위해 포함될 수 있다. 더욱이, 유전자 침묵 및 유전자 조작 세포는 세포 세포 상호 작용, 호르몬 수용체 (에스트로겐 / 프로게스테론), 성장 인자 및 종양 /암 성장에 대한 신호 경로뿐만 아니라 새로운 항암 분자의 효능을 테스트하는 데 사용될 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 암 연구 재단 / 스위스 암 리그 보조금 KFS-4125-02-2017RKD 및 국립 보건 연구소에 의해 지원되었다 EKJ에.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm × 20 mm tissue-culture treated culture dishes | Corning | CLS430167 | |
| 149MULTI0C1 | |||
| 35 x 10 mm Tissue Culture Dish | Falcon | 353001 | |
| 5 mL Serological Pipet, Polystyrene, Individually Packed, Sterile | Falcon | 357543 | |
| Adobe Photoshop | Version: 13.0.1 (64-bit) | ||
| Antibiotic Antimycotic Solution (100×) | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| Calcein-AM | Sigma-Aldrich | 17783 | |
| CD31 (cluster of differentiation 31) | Cell Marque | 131M-95 | monoclonal mouse ab clone JC70 |
| CellTracker Green CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate) | Invitrogen | C7025 | |
| CK8/18 (cytokeratins 8 and 18) | DBS | Mob189-05 | monoclonal mouse ab, clone 5D3 |
| CKX41 Inverted Microscope | Olympus Life Science | Olympus DP27 digital camera | |
| Cleaved Caspase 3 | Cell Signaling | 9661L | polyclonal rabbit ab |
| Collagen (rat tail) | Roche | 11 179 179 001 | |
| Coulter ISOTON II Diluent | Beckman Coulter | 844 80 11 | Diluent II |
| Coulter Z1, Cell Counter | Coulter Electronics, Luton, UK | ||
| Dehydrated Culture Media: Noble Agar | BD Difco | BD 214220 | |
| Dermal Microvascular Endothelial Neonatal, Pooled Donors (HMVEC-DNeo) | Lonza | CC-2516 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham | Sigma-Aldrich | D6434 | |
| EBM-2 Endothelial Cell Growth Basal Medium-2 | Lonza | 190860 | |
| Ethidium homodimer | Sigma-Aldrich | 46043 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Thermo Fisher Scientific | SH30070 | |
| Fetal Calf Serum Charcoal Stripped (FCS sf) | Thermo Fisher Scientific | SH3006803 | |
| Fluorescence stereo microscopes Leica M205 FA | Leica Microsystems | ||
| GlutaMAX Supplement (100x) | Gibco | 35050038 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Gibco | 14175053 | |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
| HUVEC – Human Umbilical Vein Endothelial Cells | Lonza | CC-2517 | |
| ImageJ | National Institute of Health, USA | Wayne Rasband Version: 1.52a (64-bit) |
|
| Ki67 | Cell Marque | 275R-16 | monoclonal rabbit ab, clone SP6 |
| Leica fully motorized fluorescence stereo microscope | Leica Microsystems | M205 FA | |
| Leica Histocore Multicut Rotary Microtome | 149MULTI0C1 | ||
| Low Serum Growth Supplement Kit (LSGS Kit) | Gibco | S003K | |
| MCF-7 cells – human breast adenocarcinoma cell line | Clinic for Gynecology, University Hospital Zurich | Provived from Dr Andrè Fedier obtained from ATCC | |
| Nunclon Sphera 96U-well plate | Thermo Fisher Scientific | 174925 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) 1x | Gibco | 10010015 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Protein Lysis Buffer | Cell Signaling, Danvers, USA | 9803 | |
| Quick-RNA Miniprep Kit | Zymo Research | R1055 | |
| RNA Lysis Buffer | Zymo Research | R1060-1-100 | Contents in Quick-RNA Miniprep Kit |
| Rotina 46R Centrifuge | Hettich | ||
| Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mL | Falcon | 352003 | |
| Sonicator | Bandelin electronics, Berlin, DE | ||
| Tecan Infinite series M200 microplate reader | Tecan, Salzburg, AU | ||
| Tissue Culture Flasks 75 | TPP | 90076 | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T3924 |
References
- Sakamoto, K. The pathology of Mycobacterium tuberculosis infection. Veterinary Pathology. 49 (3), 423-439 (2012).
- Morrisey, E. E., Hogan, B. L. Preparing for the first breath: genetic and cellular mechanisms in lung development. Developmental Cell. 18 (1), 8-23 (2010).
- Goodman, T. T., Ng, C. P., Pun, S. H. 3-D tissue culture systems for the evaluation and optimization of nanoparticle-based drug carriers. Bioconjugate Chemistry. 19 (10), 1951-1959 (2008).
- Yang, L., et al. Tumor organoids: From inception to future in cancer research. Cancer Letters. 454, 120-133 (2019).
- Velasco-Velázquez, M. A., Popov, V. M., Lisanti, M. P., Pestell, R. G. The role of breast cancer stem cells in metastasis and therapeutic implications. The American Journal of Pathology. 179 (1), 2-11 (2011).
- Imamura, Y., et al. Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer. Oncology Reports. 33 (4), 1837-1843 (2015).
- Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).
- Russell, S., Wojtkowiak, J., Neilson, A., Gillies, R. J. Metabolic profiling of healthy and cancerous tissues in 2D and 3D. Scientific Reports. 7 (1), 15285 (2017).
- Sakalem, M. E., De Sibio, M. T., da Costa, F., de Oliveira, M. Historical evolution of spheroids and organoids, and possibilities of use in life sciences and medicine. Biotechnology Journal. 16 (5), (2021).
- Zanoni, M., et al. Modeling neoplastic disease with spheroids and organoids. Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 97 (2020).
- Corrò, C., Novellasdemunt, L., Li, V. S. W.
- Ding, Y., et al. Three-dimensional tissue culture model of human breast cancer for the evaluation of multidrug resistance. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (9), 1959-1971 (2018).
- Little, M. H.
- Rimann, M., Graf-Hausner, U. Synthetic 3D multicellular systems for drug development. Current Opinion in Biotechnology. 23 (5), 803-809 (2012).
- Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
- Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), 601-610 (2007).
- Weigelt, B., Ghajar, C. M., Bissell, M. J. The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer. Advanced Drug Delivery Reviews. 69-70, 42-51 (2014).
- Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
- Fong, E. L., et al. Modeling Ewing sarcoma tumors in vitro with 3D scaffolds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (16), 6500-6505 (2013).
- Hauptmann, S., et al. Integrin expression on colorectal tumor cells growing as monolayers, as multicellular tumor spheroids, or in nude mice. International Journal of Cancer. 61 (6), 819-825 (1995).
- Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), New York, N.Y. 920-926 (2018).
- Ashok, A., Choudhury, D., Fang, Y., Hunziker, W.
- Lehmann, R., et al. Human organoids: a new dimension in cell biology. Molecular Biology of the Cell. 30 (10), 1129-1137 (2019).
- Verjans, E. T., Doijen, J., Luyten, W., Landuyt, B., Schoofs, L. Three-dimensional cell culture models for anticancer drug screening: Worth the effort. Journal of Cellular Physiology. 233 (4), 2993-3003 (2018).
- Bombonati, A., Sgroi, D. C. The molecular pathology of breast cancer progression. The Journal of Pathology. 223 (2), 307-317 (2011).
- DeSantis, C., Ma, J., Bryan, L., Jemal, A.
- Solanki, M., Visscher, D. Pathology of breast cancer in the last half century. Human Pathology. 95, 137-148 (2020).
- Djomehri, S. I., Burman, B., Gonzalez, M. E., Takayama, S., Kleer, C. G. A reproducible scaffold-free 3D organoid model to study neoplastic progression in breast cancer. Journal of Cell Communication and Signaling. 13 (1), 129-143 (2019).
- Xu, H., et al. Organoid technology and applications in cancer research. Journal of Hematology & Oncology. 11 (1), 116 (2018).
- Yu, J., Huang, W. The progress and clinical application of breast cancer organoids. International Journal of Stem Cells. 13 (3), 295-304 (2020).
- Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. The Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (51), e2720 (2011).
- Tung, Y. C., et al. High-throughput 3D spheroid culture and drug testing using a 384 hanging drop array. The Analyst. 136 (3), 473-478 (2011).
- Türker, E., Demirçak, N., Arslan-Yildiz, A. Scaffold-free three-dimensional cell culturing using magnetic levitation. Biomaterials Science. 6 (7), 1745-1753 (2018).
- Froehlich, K., et al. Generation of multicellular breast cancer tumor spheroids: comparison of different protocols. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 21 (3-4), 89-98 (2016).
- Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biology. 10, 29 (2012).
- Kaushik, G., Ponnusamy, M. P., Batra, S. K. Concise review: Current status of three-dimensional organoids as preclinical models. Stem Cells. 36 (9), Dayton, Ohio. 1329-1340 (2018).
- Marconi, A., Quadri, M., Saltari, A., Pincelli, C.
- Saltari, A., et al. CD271 down-regulation promotes melanoma progression and invasion in three-dimensional models and in zebrafish. The Journal of Investigative Dermatology. 136 (10), 2049-2058 (2016).
- Yamauchi, M., et al. A novel in vitro survival assay of small intestinal stem cells after exposure to ionizing radiation. Journal of Radiation Research. 55 (2), 381-390 (2014).
- Jabs, J., et al. Screening drug effects in patient-derived cancer cells links organoid responses to genome alterations. Molecular Systems Biology. 13 (11), 955 (2017).
- Arruabarrena-Aristorena, A., et al. FOXA1 mutations reveal distinct chromatin profiles and influence therapeutic response in breast cancer. Cancer Cell. 38 (4), 534-550 (2020).
- Carey, S. P., Starchenko, A., McGregor, A. L., Reinhart-King, C. A. Leading malignant cells initiate collective epithelial cell invasion in a three-dimensional heterotypic tumor spheroid model. Clinical & Experimental Metastasis. 30 (5), 615-630 (2013).
- Park, S., et al. Differential functions of splicing factors in mammary transformation and breast cancer metastasis. Cell Reports. 29 (9), 2672-2688 (2019).
- Truong, D. D., et al. A human organotypic microfluidic tumor model permits investigation of the interplay between patient-derived fibroblasts and breast cancer cells. Cancer Research. 79 (12), 3139-3151 (2019).
- Zhang, J., et al. Energetic regulation of coordinated leader-follower dynamics during collective invasion of breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (16), 7867-7872 (2019).
- Jeong, Y. H., et al. Vitrification for cryopreservation of 2D and 3D stem cells culture using high concentration of cryoprotective agents. BMC Biotechnology. 20 (1), 45 (2020).
