Summary
ここでは、ホールマウント免疫染色、多光子顕微鏡、および3D可視化および分析を使用した定量的および定性的な分析のために、卵巣全体をイメージングするための最適化されたプロトコルを紹介します。このプロトコルは、毒物学、臨床診断、および卵巣機能のゲノムアッセイに適用可能な、高スループットで信頼性が高く、再現性のある処理に対応します。
Abstract
女性の生殖能力と生殖寿命は、卵巣卵母細胞予備の質と量に依存します。減数分裂前期Iに入る雌生殖細胞の推定80%は、胎児卵母細胞消耗(FOA)および出生後生の最初の週に排除される。3つの主要なメカニズムは、発達中に生存し、思春期に入る女性の卵巣予備能を確立する卵母細胞の数を調節する。卵母細胞喪失の第1波では、卵母細胞の30〜50%が初期のFOA中に排除され、これは高い長い散在核元素-1(LINE-1)発現に起因する現象である。卵母細胞喪失の第2の波は、減数分裂品質チェックポイントによる減数分裂欠損を有する卵母細胞の排除である。卵母細胞喪失の第3波は、いくつかの卵母細胞が卵胞を形成できないときに、原始卵胞形成中に周産期に起こる。卵母細胞喪失のこれら3つの波のそれぞれを調節するものと、それらがマウスまたはヒトのいずれかの卵巣予備をどのように形成するかは不明のままである。
免疫蛍光と3Dビジュアライゼーションは、あまり情報量の少ない2Dセクションではなく、卵巣全体のコンテキストで卵母細胞の発生を画像化および分析するための新しい道を開きました。この記事では、全卵巣免疫染色および光学的クリアリングのための包括的なプロトコルを提供し、多光子顕微鏡を使用したイメージングおよび市販のソフトウェアを使用した3Dモデリングのための調製物を得る。C57BL/6Jマウスにおける卵巣発生中の卵母細胞消耗のダイナミクスを示し、卵母細胞排除の3つの波の間の卵母細胞喪失を定量化するために、この方法をどのように使用できるかを示す。このプロトコルは、卵母細胞の視覚化および定量化、ならびに他の定量的アプローチのために、出生前および出生後卵巣に適用することができる。重要なことに、このプロトコルは、毒物学、臨床診断、および卵巣機能のゲノムアッセイにおけるニーズを満たすことができる、高スループットで信頼性が高く、再現性のある処理に対応するために戦略的に開発されました。
Introduction
ほとんどの哺乳類の雌は、卵巣予備(OR)を構成する原始卵胞内に貯蔵された有限数の減数的に停止した卵母細胞で生まれます1,2。ORは、女性の全体的な生殖寿命と健康状態を決定します3.ORは通常、加齢とともにサイズが減少し、特定の遺伝毒性物質(放射線/化学療法)および環境ストレス(栄養失調)への曝露により早期に枯渇し、不妊症につながる可能性がある4,5,6。特発性女性不妊症は、ORから発達する卵の遺伝的および生理学的品質に起因することが多く、あまり理解されていない7,8。雌卵胞の授乳は出生によって大部分があらかじめ決められているため、ORの確立と維持に関与する調節メカニズムを理解することが不可欠です。
マウスにおいて、OR形成は、胚日(E)7.52の周りの始原生殖細胞(PGC)の仕様から始まる。PGCは生殖器の隆起に移動し、そこで約E10.59が常駐します。以下の広範な増殖は、不完全なサイトカイン作用で起こり、その結果、嚢胞の形成が起こり、それは開発の後半で分解される10,11。約E12.5で、性腺の性別が決定され、卵巣におけるPGC増殖が停止する。女性では、PGC(現在は卵母細胞)は、約E13.512,13で減数分裂前期I(MPI)に入る。卵母細胞は、拡張MPIを介して進行し、出生時の周りの指示段階で逮捕する。生後最初の1週間の間に、逮捕された各卵母細胞は顆粒膜細胞に囲まれ、それによって原始卵胞を形成する。
女性のORにおける始原卵胞の数は、アポトーシス、オートファジー、または壊死によるMPI停止の前および最中に起こる卵母細胞排除の波を生き残った卵母細胞の数に依存する14,15。第1波は胎児の発育中に発生し、FOAとして知られています。FOAは、雌(哺乳類および非哺乳類)における進化的に保存されたプロセスであり、それによって、雌種に応じて卵母細胞の推定50〜80%が排除される16、17、18、19。マウスでは、FOAはE15.5からE18.5の間に発生し、レトロトランスポゾンLINE-1配列の再活性化および発現が卵母細胞死を引き起こすことに起因している20,21。卵母細胞除去の第2波は、修復されていないDNA二本鎖切断(DSB)22,23などの減数分裂欠損を有する卵母細胞を排除する減数分裂チェックポイントを介して起こる。卵母細胞排除の次の波は、嚢胞の分解中に起こり、それぞれが単一の卵母細胞10、11、24、25を含む原始卵胞の形成中に最高潮に達する。
マウスでは、始原卵胞予備は思春期までに大部分が確立され、その後、始原卵胞が定期的な生殖サイクル中に成長のために活性化されるにつれて減少する。ORサイズは、個々の女性間およびマウスの異なる遺伝的系統間で異なる。しかし、ORサイズの遺伝的調節はよく理解されていない26,27,28,29。OR調節の遺伝学的研究は、出生前および出生後の発達中の卵母細胞除去の波を研究するための標準化されたプロトコルの欠如によって妨げられている。いくつかの卵母細胞定量化方法論がマウスにおいて開発されており、最も一般的で広く使用されているのは、組織学的切片30、31の組織形態学的評価である。この技術では、卵母細胞は、ヘマトキシリンおよびエオジン(H&E)および過ヨウ素酸シッフ(PAS)または蛍光マーカーなどの組織学的染色を有する連続切片上で同定される。この技術は、切片の厚さ、卵巣全体のすべての切片の効率的な回収、および個々の実験室の計数スキームを含む、すべての条件が一定であれば信頼性が高い。しかし、異なる研究所によって報告された数字はしばしば大きく異なるため、容易に比較することはできません。
さらに、遺伝的差異を考えると、異なるマウス系統の使用も卵母細胞数に影響を及ぼし得る。組織形態評価のために追加の計算アプローチが開発されており、フラクショメータアプローチを用いた卵母細胞の自動検出、計算アルゴリズムを用いた自動計数、および同じ卵母細胞の複数の計数を防止するための組織学的画像の3D再構成31、32、33、34、35、36が含まれる。.これらの改善が組織形態評価に追加されても、この技術は、特に大規模でハイスループットな研究では、比較的労働集約的である。収集されたデータは、計数スキーム、コンピュータアルゴリズム、および使用されるソフトウェアの違いにより、研究間で再現性および比較できない場合があります。
近年、新しい中分解能多光子および光シート顕微鏡法および光学組織透明化法の開発によって加速され、無傷の卵巣の3Dモデリングおよび解析技術は、卵母細胞数を効率的に定量し、タンパク質の局在およびダイナミクスを研究するための選択方法になりつつある37,38。これらの3D方法は、組織および器官がよりよく保存され、無傷で維持されるため、組織学的方法と比較して典型的に有利である。さらに、3D解析とモデリングは、2D解析では見逃される可能性のある臓器内の細胞ニッチまたは下部構造内および細胞ニッチまたは下部構造間の機能および相互作用に関する追加の洞察を提供します。
臓器全体の3D解析では、組織の歪みや損傷なしに、卵巣などの個々の臓器の固定、免疫染色、および光学的クリアリングプロトコルを最適化する必要があります。高解像度顕微鏡では、イメージングのためのサンプルマウントの追加最適化が必要であり、利用可能なイメージングプラットフォームに依存する場合があります。最後に、無傷の卵巣全体をイメージングすると、その後の計算分析のために大量のデータが生成されます。したがって、比較研究のために、および発生段階にわたって卵母細胞を計数するための標準化された3D方法を開発する必要がある。
このプロトコルは、標準的な免疫染色および以前に報告されたクリアリングプロトコルを使用し、シンプルでユーザーフレンドリーでハイスループットなアプローチに焦点を当てています38,39,40,41。このプロトコルは、出生後28日目(P28)までの多数の出生前および出生後の卵巣、および異なるマウス遺伝的背景からの様々なサイズの卵巣を分析するように最適化されている。免疫染色ステップは、すべてのステージで類似している。しかし、開嚢プロトコルは、そのサイズが大きいため、思春期卵巣では異なり、ScaleS4(0)およびCUBICは、それぞれ40,41の小卵巣および大型卵巣の場合である。さらに、全身灌流は、血球からの自己蛍光を防ぐために、固定前にP28マウスにおいて行われる。画像を取得するためのライトシート顕微鏡の代替として、Leica DIVE/4Tuneプラットフォーム上に多光子顕微鏡が構築され、このプロトコルにはさまざまな分析ツールを備えたIMARISの3D視覚化および分析ソフトウェアが選択されました。このプロトコルは従うのが簡単で、実践的ではないため、時間を節約できます。さらに、卵母細胞の定量化は、卵巣のサイズおよび卵母細胞の配置に依存して、比較的迅速である。
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Protocol
使用した全てのマウスは、遺伝子株C57BL/6Jのものであった( 材料表参照)。この株は完全に配列決定されており、卵巣の構造と機能に関する多くの研究の標準です。マウスはNIHガイドラインに従って飼育され、実施された手順はジャクソン研究所の施設動物ケアおよび使用委員会によって承認された。このプロトコールで使用される試薬および組成物は、それぞれ 材料 表および 表1に列挙されている。
1. 試薬の調製
- 固定液:1x PBS中に4%パラホルムアルデヒド(PFA)を調製する。例えば、24サンプル(0.5 mL/サンプル = 12 mL 全体)の場合、16% PFA 電子顕微鏡グレードの 3 mL を 1x PBS の 9 mL に加えます。
- 透過処理バッファー
- 透過処理バッファーが必要になる前日に、1x PBS を含む 250 mL のプラスチックビーカーにポリビニルアルコール (PVA) を測定します。PVAが完全に溶解するように溶液を一晩攪拌する。
- 溶解したPVAに水素化ホウ素ナトリウムを加え、混合物を約3〜5分間均質化させる。溶液が泡立つことを期待してください。
- 溶液にTriton X-100を加え、Triton X-100が溶解したらバッファーを使用します。
注:PVAは溶解に長い時間(少なくとも3時間)を要し、抗体の浸透は溶解度に依存します。より大きな卵巣の場合、PVAを完全に溶解することが重要です。
- ブロッキングバッファ
- ウシ血清アルブミン(BSA)を1x PBSでビーカーに測定する。BSAが溶解するまで溶液を攪拌する。
- グリシン、Triton X-100、ペニシリン - ストレプトマイシン、およびアジ化ナトリウムを加える。溶液が均質になるまで攪拌する。緩衝液をボトルに移し、4°Cで保存した。 使用前に正常なヤギ血清を加えてください。
- 洗浄バッファー:PBSを1x PBSを入れたビーカーに入れてPVAを測定します。PVAが溶解するように溶液を一晩攪拌する。トリトンX-100とアジ化ナトリウムを加える。バッファーを混合したら、4°Cで保存します。
- ScaleS4(0)溶液(pH 8.1):≤100°Cで攪拌しながらビーカー内のPBS中のD-ソルビトールを溶解する。 溶液に尿素を加え、尿素が溶解したら、火を止め、溶液が完全に溶解するまで攪拌させる。グリセロールとジメチルスルホキシドを加え、溶液が均質になるまで攪拌する。溶液を室温で暗所に保管する。
注:ScaleS4(0)溶液は、卵巣をクリアする最初の日に新鮮にする必要があります。 - スケールキュービック-1ソリューション
- 温度≤100°Cで攪拌しながらPBSを入れたビーカーに尿素を溶解する。 N,N,N',N'-テトラキス(2-ヒドロキシプロピル)エチレンジアミンを別のビーカーに測定し、溶解した尿素を加え、試薬が完全に溶解するまで≤100°Cの温度で攪拌する。すべての試薬が溶液になったら、火を止め、室温で冷却します。暗闇の中で保管してください。
- 溶液を濾過フラスコに移すことによってそれを脱気する。フラスコをチューブで真空に取り付け、フラスコを覆い、溶液中の気泡が消えるまで真空をオンにします。この脱気の後に溶液を使用してください。
注:このソリューションは、暗闇の中で保存して最大1ヶ月間使用できます。
- スクロース溶液:スクロースを1x PBSに溶解する。その後、使用前に溶液を脱気する。
メモ:使用前に溶液を新しく準備してください。 - スケールキュービック-2ソリューション
- スクロースをPBSを入れたビーカーに温度≤100°Cで攪拌しながら溶解する。 尿素を加え、尿素が溶解するまで≤100°Cの温度で攪拌する。火を止めます。
- トリエタノールアミンとトリトンX-100を加える。溶液が均質になるまで攪拌する。溶液を室温まで冷却し、暗闇に保存する。使用前に溶液を脱気する。
注:このソリューションは、暗闇の中で保存して最大1ヶ月間使用できます。
2. 出生前卵巣の解剖と固定(図1A)
- 承認された制度的プロトコルに従って、成人女性(≥8週間)および男性を交配する。毎朝膣栓を確認してください。
注:膣栓の朝は、性交後0.5日(d.p.c)またはE0.5として指定されています。 - 解剖の日に、4%パラホルムアルデヒド(PFA)および約0.5mLのアリコートをベンチ側(妊娠中の女性あたり〜4本)に置いた微量遠心チューブに調製する。
注:PFAは有害物質であり、化学フードの下で取り扱う必要があります。 - 妊娠中の女性ごとに約10mLの1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を含む3つの100mmプレートを準備する(子宮の採取、中腎卵巣複合体の解剖、および卵巣の単離のため)。
- 好ましい発生段階の胚を運ぶ妊娠中の女性を安楽死させ、解剖に進む。一度に1〜2匹以下の女性を安楽死させる。妊娠中のマウスの安楽死(例えば、CO2 曝露に続いて子宮頸部脱臼)のために承認されたプロトコールを使用する。
- 女性が安楽死させられたら、腹部に70%エタノールを噴霧する。鉗子を使用して腹部皮膚を持ち上げ、はさみを使用して腹部と体壁を通してV字型の切開を行います。切開部の両側に沿って切断し、皮膚を剥がして子宮内の内臓および胎児を露出させる。
- 鉗子とはさみで、胎児のいる子宮を腹部脂肪と卵巣動脈と静脈から切断して分離します。子宮を取り出し、1x PBSを含む100mmプレートに入れます。子宮壁を切断し、卵黄嚢を穿刺することによって胎児をPBSに放出する。臍帯を切る。
注:妊娠15日未満の胎児の場合、母親の安楽死と子宮からの除去は胎児の急速な死を確実にします。妊娠15日以上経過した胎児は、斬首によって安楽死させなければなりません。 - 胎児を新鮮な1x PBSで新しいプレートに移します。E15.5胎児を斬首するには、2つの後肢を鉗子でプレート上で繊細にピンで留めて胎児を固定します。利き手に握られた2対目の鉗子を使用して、鉗子の突起の間に首を持ち、胎児の頭を切り取るために絞るか、はさみを使用して首を切る。
- 利き手の鉗子で、前肢の下を切り、上半身を優しく引き離します。次に、利き手鉗子の一方の端点を腹腔内に垂直に腹腔に挿入し、鉗子の他方の端点は外側にとどまる。鉗子を閉じ、体壁をつまんで切り、内臓を露出させます。
- 同じ鉗子で、腎臓と生殖器官が見えるようになるまで、腸や肝臓などの器官を静かに取り除きます。胎児の性別を決定する:E15.5では、精巣は楕円形である間、卵巣は細長いソーセージのような形をしています。
注:初期の段階では、性別を決定するためにジェノタイピングが必要な場合があります。 - 1対の鉗子を使用して、女性の胎児を下に保持し、他の鉗子を使用して各中腎卵巣複合体をつかみ、腎臓およびミュラー管から静かに分離する。1x PBSで卵巣を新しいプレートに入れ、中腎を付着させたままにしますが、卵巣が露出していることを確認するために周囲の組織を取り除きます。両方の卵巣を微量遠心チューブ内の約0.5mLの4%PFAに入れ、4°Cで一晩固定する。翌日、PFAを70%エタノールで置き換える。
- E18.5卵巣の解剖および固定のために、上記のように胎児を子宮から分離し、次いでセクション3で説明された思春期前の子犬のためのプロトコルに従う(図1B)。
3. 思春期前卵巣の解剖と固定(図1B)
- 4%PFAと約0.5mLのアリコートを1.5mLのチューブに準備し、ベンチ側(子犬あたり約1本のチューブ)に置きます。1x PBS(子犬1匹あたり〜1枚)で35mmプレートを準備します。承認された制度的プロトコルを使用して子犬を安楽死させる。
注:断頭は、8日齢以下のマウスに対する安楽死の好ましい方法である。新生児マウスは、3〜4インチの解剖ハサミまたは5〜7インチのメイヨーハサミを使用して首を切ることができます。 - 蛁歯の距離を測定することによって子犬の性別を決定する, これは、女性よりも男性の大きいです.鋭い断頭ハサミを使用して、女性の子犬を斬首します。開いたカットのサイドダウンの体をペーパータオルの上に置き、血液を排出します(〜5〜10秒)。
- 各足の足パッドにピンを置いて、子犬を背中に固定します。腹部に70%エタノールをスプレーする。鉗子を使って子犬の皮膚を体から遠ざけ、はさみを使って下腹部の皮膚に小さなV字型の切開を行います。
- はさみを皮膚の下の切開部に挿入し、腹部の両側に沿って切断する。鉗子を使用して皮膚を優しく剥がし、下腹部を明らかにします。腸を静かに上に動かし、膀胱の隣の子宮角を見つけます。腎臓に向かって各子宮の角をたどり、各腎臓の下に周囲の脂肪組織を持つ卵巣を見つけます。
- 卵巣を解剖するには、卵巣と卵管の下の子宮角を1組の鉗子(鉗子A、 図1B)で保持し、静かに体から持ち上げます。別の一対の鉗子(鉗子B)を用いて、脂肪パッド内の卵巣および卵管が第2の対の鉗子の上に見えるように、第1の対の鉗子の下を静かにつかむ。次に、はさみで2対目の鉗子の下に切るか、慎重に引っ張って卵巣と付着組織を切り離します。
- 単離した臓器を1x PBSのプレートに入れる。余分な脂肪組織、卵管、子宮角をトリミングして、卵巣をきれいにして隔離します。卵巣を囲む滑液包を繊細に開き、卵巣全体を露出させます。
- 図1B、P5に示すように、卵巣を損傷することなく滑液包膜をトリミングし、丘陵(卵巣と生殖管の間の靭帯状構造)の周囲に組織を残して卵巣を処理する。卵巣がトリミングされたら、それらを4%PFAに入れ、卵巣を4°Cで一晩固定する。翌日、4%PFAを70%エタノールと交換し、免疫染色プロトコールステップまで卵巣を4°Cで保存した。
4. 思春期卵巣の灌流、解剖、固定(図1C)
- 機関が承認したプロトコールに従ってマウスを灌流し、マウスを化学ヒュームフード内の深い麻酔下で投与する。灌流装置および試薬を準備する。 42 の詳細なプロトコルを参照してください。
注:灌流は、血管系全体の血液を組織固定液で置き換える終末安楽死手順です。 - 思春期の雌マウス(P28)の体重を測定し、マウスの体重(典型的には13g〜15g)を記録する。使用する承認済み麻酔薬の量を計算します。
注:ここでは、体重10gあたり0.35mLのトリブロモエタノールをこのプロトコールで使用した。 - 20 G 針付きの 10 mL 使い捨てシリンジを使用して、承認された麻酔薬でシリンジを満たします。20 G の針を 26 G x 3/8 の針と交換してください。
- 片手で背頸部の皮膚をこすりつけてマウスを慎重に拘束します。マウスを裏返して腹部を露出させます。以前に計算された量の麻酔薬を腹腔内に注入する。麻酔が効くまで(つまり、マウスが動かなくなるまで)、マウスをカバー付きの容器に入れます。
- マウスの動きが止まったら、足を軽くつまんで反応がないことを確認し、マウスが完全に麻酔されていることを確認してから灌流を開始します。マウスを背中に置き、足パッドを通して4本の脚すべてをボードにそっと固定します。脚が伸びすぎず、リラックスした姿勢で固定されていることを確認します。
- マウスに腹部から胸部領域に70%エタノールをスプレーする。鉗子を使って腹部の皮膚を優しくつまんで持ち上げてから、はさみを使って皮膚と体壁を小さなV字型の切り込みにします。
- 皮膚フラップを体腔から持ち上げ、はさみを皮膚と体壁の下に挿入します。皮膚と体壁を胸骨の胸腔の端まで頭に向かってまっすぐに切ります。
- 胸骨の両側の肋骨を肩甲骨のすぐ下まで慎重に切断して胸腔を開きます。胸郭の下の肺を穿刺しないように注意してください。皮膚/肋骨フラップを鉗子でつかみ、ピン留めして内臓を露出させます。
- 胸腺など、心臓への明確なアクセスを妨げる可能性のある組織を優しくトリミングします。胃腸管を含むすべての臓器を露出させ、下腹部を含む全身が灌流されていることを視覚的に確認できるようにします。
- 解剖はさみを使用して心臓の右心房を切り取り、システムから血液を放出します。鉗子で心臓を優しく保持し、左心室に灌流針(蠕動ポンプコントローラに接続)を挿入します。
- 肝臓、腎臓、生殖管などの組織(図1E、F)がピンク色から白色に変わるまで、穏やかだが一定の圧力で約10mLのPBSをポンプで送る。次に、PBSを新しく作った1%PFAと交換し、約10mLのPFAで、またはマウスの下半身(例えば、尾)にけいれんが起こるまで灌流を続ける。
注:これらの固定振戦は、灌流が成功したことを示します。 - 灌流が完了したら、腎臓の下の卵巣を含む脂肪パッドを見つけ、脂肪パッド、卵巣、子宮角を含む生殖管全体を静かに解剖し、4%PFAのバイアルにその管を置きます。卵巣を室温で一晩(〜16〜24時間)固定する。次いで、免疫染色プロトコールを開始する前に、4%PFAを70%エタノールで少なくとも1日間交換し、卵巣をトリミングする(図1E、F)。
5. ホールマウント卵巣免疫染色(図2A)
注:免疫染色プロトコル中、特にバッファーを交換する場合は、延長されたインキュベーション期間中の汚染を防ぐために、滅菌技術を実践してください。
- 図2Aに示すように、24ウェルプレートですべての免疫染色ステップを実行します。試薬の容量を他のフォーマットに合わせて調整します。小さな出生前および思春期前の卵巣を失うことを避けるために、バッファーを慎重に交換してください。
注:48ウェルプレートや96ウェルプレートなどの他のフォーマットを使用することもできますが、ウェルが深く、開口部が狭いため、卵巣を紛失または損傷することなくバッファーを吸引することは困難です。 - 1日目
- 1 mL の PBS/ウェルを、清潔な 24 ウェルプレートに必要なウェル数にピペットします。200 μLのピペットチップの先端を切り取って広い開口部を作り、それを使用して70%エタノールを含む1.5 mLチューブから思春期前卵巣をウェルに穏やかに移します。思春期卵巣の場合は、1000 μLのピペットチップを使用し、チップを切断して転写します。
メモ:先端の開口部が広いため、転写中の組織の損傷を防ぎます。 - すべてのサンプルがウェルに移されたら、新しいチップを使用してPBSを吸引し、新鮮な0.8mLのPBS/ウェルと交換します。試料を室温で〜100〜150rpmのシェーカーで一晩インキュベートする。透過処理バッファーの調製を開始する(表1およびセクション 1 を参照のこと)。
注:新しい先端は卵巣が先端に付着するのを防ぎ、PBSインキュベーションステップにより、卵巣はPBS中で平衡化し、染色前に再水和することができます。
- 1 mL の PBS/ウェルを、清潔な 24 ウェルプレートに必要なウェル数にピペットします。200 μLのピペットチップの先端を切り取って広い開口部を作り、それを使用して70%エタノールを含む1.5 mLチューブから思春期前卵巣をウェルに穏やかに移します。思春期卵巣の場合は、1000 μLのピペットチップを使用し、チップを切断して転写します。
- 2日目
- 透過処理バッファーの調製を終える。ウェルからPBSを吸引し、ウェルあたり0.8mLの透過処理バッファーと交換する。プレートをシェーカーに戻し、サンプルを室温で4時間インキュベートする。
- 4時間のインキュベーション後、透過処理バッファーを完全に吸引し、0.5 mL のブロッキングバッファーと交換します ( 表 1 およびセクション 1 を参照)。蒸発を防ぐためにプレートをパラフィルムで密封し、シェーカー上のしっかりと覆われた容器に入れ、室温で一晩(16〜24時間)ブロッキングバッファー中で穏やかな攪拌でサンプルをインキュベートする。
- 3日目
- ブロッキングバッファーで希釈することにより一次抗体を調製する。卵母細胞を視覚化するには、出生前および思春期前の卵巣の両方にラット抗生殖細胞核酸性ペプチダーゼ(GCNA)/TRA98、思春期前卵巣と思春期卵巣の両方にウサギ抗DEADボックスヘリカーゼ4(DDX4)/マウス血管ホモログ(MVH)などの卵母細胞マーカーを使用します。出生前の卵巣におけるLINE-1 ORF1p発現を定量するために、ウサギ抗LINE-1 ORF1pまたは別の利用可能な抗体を使用する。
注:GCNA/TRA98シグナルは思春期卵巣では検出できません。 - サンプルからブロッキングバッファーを吸引し、0.5 mL の希釈一次抗体と交換します。蒸発を防ぐためにパラフィルムでプレートを密封してください。インキュベーション中のサンプルの乾燥を防ぐために、カバー付きの容器にプレートを置きます。容器をシェーカーの上に置き、サンプルを室温で3〜4日間インキュベートする。
- ブロッキングバッファーで希釈することにより一次抗体を調製する。卵母細胞を視覚化するには、出生前および思春期前の卵巣の両方にラット抗生殖細胞核酸性ペプチダーゼ(GCNA)/TRA98、思春期前卵巣と思春期卵巣の両方にウサギ抗DEADボックスヘリカーゼ4(DDX4)/マウス血管ホモログ(MVH)などの卵母細胞マーカーを使用します。出生前の卵巣におけるLINE-1 ORF1p発現を定量するために、ウサギ抗LINE-1 ORF1pまたは別の利用可能な抗体を使用する。
- 7日目
- プレートからパラフィルムを静かに除去し、サンプルから一次抗体混合物を吸引する。一次抗体混合物を4°Cで保存し(最大1ヶ月または3回使用)、後で新鮮な抗体(例えば、以前に使用した混合物の5mLあたり2μLの新鮮な抗体アリコート)を補充して再利用します。
- サンプルにウェルあたり1 mLの洗浄バッファー( 表 1およびセクション1を参照)を加え、プレートを数秒間静かに揺らして残留抗体を洗い流します。洗浄バッファーを慎重に吸引し、0.8 mL の新鮮な洗浄バッファーと交換し、プレートを室温で一晩振る。
- 8日目
- 一晩洗浄バッファーを吸引し、0.8 mL の新鮮な洗浄バッファーと交換し、室温で2時間振とうします。新鮮な洗浄バッファーでさらに2時間洗浄工程を繰り返します。
- 最後の洗浄後、洗浄バッファーをブロッキングバッファーで希釈した0.5mLの二次抗体ミックス、例えばヤギ抗ラットAlexa Fluor 555およびヤギ抗ウサギAlexa Fluor 647で1:1,000希釈で交換してください。各免疫染色実験のために新鮮な二次抗体混合物を調製する。
- インキュベーション中の蒸発を防ぐために、プレートをパラフィルムでシールします。試料を室温で暗所で、またはアルミニウム箔で覆われたプレート中で、穏やかな攪拌で3日間インキュベートする。
メモ:この手順とその後のすべての手順は、暗闇の中またはアルミホイルラップで行われます。
- 11日目
- 二次抗体混合物を吸引し、1mLの洗浄緩衝液で初期洗浄を行う。プレートを数秒間静かに揺らして、残留二次抗体を洗い流します。
- 洗浄バッファーを吸引し、0.8 mL の新鮮な洗浄バッファーと交換し、光から保護した振とうしながら室温で2時間サンプルをインキュベートします。洗浄工程を2回繰り返し、合計3回の洗浄を行う。3回目の洗浄の後、クリアリングステップ(セクション6)に進みます。
免疫染色された全マウント卵巣の透明化(図2A)。
メモ: すべてのクリアリング手順は、アルミホイルで包むか、不透明な容器に入れて、暗闇の中で実行してください。クリアリングステップは、思春期前卵巣と思春期卵巣で異なります。
- 11日目[出生前および思春期前卵巣はワンステッププロトコルでクリアされる]
- 最後の洗浄後、洗浄バッファーを吸引し、0.8 mL の新しく作られた ScaleS4(0) 溶液と交換します (表 1 およびセクション 1 を参照)。プレートをパラフィルムで密封し、イメージング前に室温で3〜4日間振とうしながら暗所でサンプルをインキュベートする。
- 必要に応じて、ScaleS4(0)ソリューションを毎日新しいソリューションに置き換えます。透明な卵巣が透明になり、見えにくくなるので、溶液を交換する際には注意してください。クリア後、サンプルのセットアップとイメージングに進みます(セクション7)。
メモ: ソリューションを変更しても、画質は大幅に向上しませんでした。毎日の変更により、小さくてほとんど透明なサンプルが失われる可能性が高くなります。
- 11-15日目[思春期卵巣は2段階のプロトコルでクリアされる]
- 最後の免疫染色洗浄後、洗浄バッファーを吸引し、0.8mLのScaleCUVIC-1と交換する( 表1 およびセクション1を参照)。プレートをパラフィルムで密封し、暗所で3日間37°Cでサンプルを穏やかに振とうした。ScaleCUBIC-1 ソリューションを毎日新しいソリューションに置き換えてください。
- 15日目に、穏やかに振とうしながら室温で0.8 mLのPBS中でサンプルを10分間3回洗浄した。PBSをPBSで新たに調製した0.8mLの脱気20%スクロースと交換する。室温で1時間静かに振る。
- 20%スクロース溶液を0.8mLのScaleCUBIC-2溶液( 表1 およびセクション1を参照)と交換し、プレートをパラフィルムで密封し、ScaleCUBIC−2溶液の毎日の変化で室温で穏やかに振る。4〜5日間クリアし、画像に進みます。溶液を交換するときは、透明で見にくいため、サンプルの損失を避けるために注意してください。サンプルのセットアップとイメージングに進みます(セクション7)。
7. 多光子顕微鏡によるサンプルのセットアップとイメージング
注:以下に説明するすべてのステップは、最大作動距離2.2mmのマルチ浸漬16x/NA0.6対物レンズ(浸漬液体=グリセロール)を備えた、パルス持続時間が120fsの2つのチューナブルモードロックTi:Sapphire Multi光子レーザーを備えたライカダイブ/4TUNE/FALCONで行われました。画像取得ソフトウェアの詳細については、材料表を参照してください。補足表 S1 および補足図 S1 は、このプロトコルに使用される設定を示しています。その他のイメージングプラットフォームについては、顕微鏡コアに相談するか、メーカーの仕様/推奨事項に従ってください。
- サンプル設定
- サンプルをマウントするためのセットアップを準備します。例えば、粘着性のある柔軟なシリコーンガスケットを使用して、接着剤をうまく作成します。1つの25 mm x 25 mm No. 1.5マイクロカバースリップに接着剤ウェルを置き、卵巣が配置されるウェルを作成します(図2B)。
注:厚さ1mmのガスケットは、あらゆるサイズの卵巣に対応します。このセットアップは、卵巣がガラス底の皿のマウント剤に置かれたときに発生する可能性のあるイメージング中の卵巣の動きを排除するため、推奨されます。 - 先端を切り取ったピペットチップ(出生前および思春期前は20 μL)を使用して、約5〜10 μLのScaleS4(0)溶液で卵巣を接着剤の中央に移し、 図2Bに示すようにします。思春期卵巣の場合は、卵巣を移すのに十分な距離まで先端を切り取った200 μLのピペットチップを使用してください。約15~20 μLのScaleCUBIC-2溶液を接着剤ウェルの中央に加えます。
メモ:溶液が多すぎると顕微鏡ステージに漏れる可能性があり、溶液が少なすぎると画質が低下します。解剖顕微鏡を使用して、透明化した卵巣が透明になり、見えにくくなるため、サンプルを移送します。 - 卵巣を透明化溶液を1滴ずつ個々のウェルに移したら、別のカバーガラスを接着剤ウェルにそっと置き、プレスしてシールを作成し、2つのカバースリップに挟まれた透明化溶液の小さなプールにサンプルを所定の位置に保ちます(図2B)。イメージングのために、カバースリップ「サンドイッチ」を3Dプリントされた顕微鏡アダプタスライド(例えば、43 )に置きます。
注:接着剤井戸は、「サンドイッチ」を分解して水洗った後に再利用可能です。
- サンプルをマウントするためのセットアップを準備します。例えば、粘着性のある柔軟なシリコーンガスケットを使用して、接着剤をうまく作成します。1つの25 mm x 25 mm No. 1.5マイクロカバースリップに接着剤ウェルを置き、卵巣が配置されるウェルを作成します(図2B)。
- 画像化(補足表S1および補足図S1)
- 顕微鏡コアまたは製造元のガイドラインに従って、顕微鏡とソフトウェアの電源を入れます。取り付けたサンプルを顕微鏡ステージに置き、接眼レンズを覗いて、低電力LED蛍光灯で照らされたサンプルを見つけます。
- サンプルが見つかったら、レーザーをオンにし、各検出器を特定のAlexa Fluor染料/マーカーに割り当てます。複数のレーザーの場合は、シーケンシャルな画像取得が可能です。レーザーを切り替える前にスタック全体を取得します。
注: このプロトコルでは、555 nm と 647 nm の両方の蛍光色素分子の画像取得に 1 つのレーザーを使用しました。 - 顕微鏡コアまたは製造元の仕様に従って、画像取得用のパラメータを設定します。可能であれば、双方向画像取得を使用して、スキャン時間を短縮し、効率を向上させます。行平均(1)、フレーム平均(1)、フレーム累積(1)など、その他の設定を調整します。
メモ: 双方向画像取得により、レーザーは X 軸上を移動するときに両方向にスキャンできます。 - Z-Stack は、開始位置 (サンプル下部/下部ガラスカバー) と終了位置 (サンプル上部/上部ガラスカバーの上部) を特定してセットアップします。思春期前卵巣の場合は2μm、思春期卵巣の場合は5μmの Zステップサイズ を選択します。
- Z補正機能を有効にし、この機能内で 励起ゲインをアクティブにします。サンプルの底部と上部のZ補正を設定するには、下部(低強度)と上部スタック(高強度)の両方に レーザー強度 を選択します。 補足図S1「線形Z補償」を参照して、励起ゲインボックスが選択され、下部(0)と上部(347.75)のレーザー強度がそれぞれ10と12に設定されています。
- タイリングモードは、単一の視野でキャプチャできない大きなサンプルに使用します。画像ナビゲーターをアクティブにし、長方形のマーキング ツールを使用してサンプル全体をキャプチャするために必要なタイルの数を指定します。
- 画像取得を開始します。複数のタイルを含む画像の場合は、 ナビゲーター で画像取得を開始して、すべてのタイルをキャプチャします。画像の取得が完了したら、まずすべての画像 を保存し 、複数のタイルが取得された場合は、 モザイクマージツール を実行してタイルを1つの画像にマージします。
- マージしたファイルを別のプロジェクトフォルダに保存して、ギガバイトサイズの画像を簡単に操作できるようにします。3D画像可視化および解析ソフトウェアで画像処理用のファイルを転送します。図3は、2つのマーカー( GCNA およびDDX4)を用いて異なる段階で撮影された代表的な画像を示す。
8. 画像処理
注:以下に説明するすべてのステップは、IMARISの3D画像視覚化および解析ソフトウェアを使用して開発および実行されました。
- 画像を 3D 画像ビジュアライゼーションおよび解析ソフトウェアにインポートし、必要に応じて、ファイルを元の形式 (.lif、.czi、.lsm、.lei、.oib、.oif、.nd2 など) から .ims 形式に変換します。
- 必要に応じて、ガウスフィルタで画像を処理してピクセル化を減らします(図4A)。 3D ビュー 機能を使用して、画像を配置し、フレームオプションの選択を解除します( フレーム を削除します)。
メモ: 他にもオプションのフィルタがあり、ピクセレーションを下げたり、背景の強度を下げたりするためにも使用できます。 - イメージを特定の縮尺に拡大し、 スナップショット機能を使用します。環境設定を次のように設定します。「 300 DPI」を選択し、「TIFF イメージとして保存」と 「背景を透明」を選択します。イメージのスナップショットを撮って保存します。 図 3 に 、組み立てられた完全なイメージを示します。
9. 卵母細胞定量
注: 全卵巣免疫蛍光および 3D 画像の視覚化および解析は、スポット機能を使用して全卵巣の卵母細胞数 (図 3 および図 4) の推定に使用できます。GCNAシグナルは、図4(P5)に示すように、出生前および思春期前の卵巣の卵母細胞を定量するために使用することができる。思春期卵巣では、DDX4シグナルを使用して、成長していない卵胞(「リング状」構造、閉じた矢印)および成長している卵胞(大きな構造、開いた矢印、図4、P28)の2つの卵母細胞集団を定量化します。
- ステップ 9.2 の Spots 機能を使用して卵母細胞を定量化するためのパラメーターとして使用する卵母細胞のサイズを決定します。
- イメージを開き、「 スライス」 オプションを選択して Z スタックイメージを開きます。
- 測定パネルの「線」オプションを選択し、卵母細胞/マーカーの一方のエッジから最も広い点で他方のエッジまで線を引いて距離を測定し、カウントする卵母細胞のタイプ/サイズの XY 直径を決定します。スタック内を移動し、同じタイプの複数の卵母細胞の直径の範囲を取得します。卵母細胞数のサイズ選択基準として最短の長さを使用します。
-
スポット機能: 3D ビューオプションを選択し、シーンパネルで新しいスポットを追加機能を有効にして、アルゴリズムパネルを開きます。ステップ9.1で取得した卵母細胞サイズを持つサイズ選択フィルタが使用されるため、すべてのアルゴリズム設定の選択を解除します。
- 単一の進む矢印をクリックして、ソースチャンネルに移動します。優先マーカーの付いたチャンネルを選択し、ステップ9.1で取得した推定XY直径に入力します。例えば、出生前の卵母細胞には7μm、P5卵母細胞には11μmの推定XY直径を使用する(GCNA = 緑色シグナル;図3および図4A)。
- DDX4シグナルに30μmを使用して、P5卵巣の増殖卵胞中の卵母細胞数を推定する(DDX4 = マゼンタシグナル;図 3 および 図4A)。思春期卵巣の場合、卵母細胞の定量にDDX4シグナルを使用します。例えば、 図4Aに示すように、XY直径15μmおよび80μmを使用して、それぞれ非成長卵胞および成長卵胞内の卵母細胞を同定する。
メモ:選択するサイズは、画像取得基準や使用する顕微鏡の種類によって異なる場合があります。卵母細胞が多い卵巣は、より優れた自動卵母細胞検出のためにより小さなサイズの選択を必要とするため、選択は遺伝子株間でも異なる可能性があります。 - サイズ選択後、 モデルPSF伸び と バックグラウンド減算をアクティブにします。これらは自動的に決定されます。 単一の進む矢印 を選択して、 スポットのフィルター パネルに移動します。 品質 フィルターを追加し、しきい値を決定します。卵母細胞数の正確な推定を確実にするために、閾値が調整されるように画像を拡大し、ほとんどの卵母細胞を選択する閾値を選択する。 二重矢印 をクリックして、自動カウントを終了します。
- [編集]タブを使用して選択した卵母細胞を手動でチェックし、欠落した卵母細胞を選択するか、自動しきい値で選択された非卵母細胞粒子の選択を解除します。さらに分析するために、[全体] タブの下の [統計] タブにデータを記録します。
注: スポットのカウントに使用されるパラメーターは保存して別のサンプル セットに使用できますが、バッチ分析を実行する前に手動チェックを実行することをお勧めします。 - パラメータを保存するには、[ 作成 ]タブをクリックし、[ バッチのパラメータを保存]をクリックします。
注:核マーカー(GCNA+卵母細胞、 図4A)はスポット機能によって容易に識別され、多くの手動調整を必要としない場合があります。しかし、細胞質マーカー(DDX4+卵母細胞、図 3 (P28、閉じた矢印)および 図4A)は、正しいサイズ/タイプの卵母細胞の同定を確実にするために、より多くの手動調整を必要とする。
10. 卵巣におけるタンパク質発現の定量
注: スポット 機能 (セクション 9 およびステップ 10.1) とサーフェス機能 (ステップ 10.2) の両方を使用して、特定のマーカーの卵母細胞発現 を 定量化するには、いくつかの方法があります。 スポット 機能は、核マーカー(GCNA)などの明確な局在パターンを有するタンパク質に使用でき、 表面 特徴は、E15.5およびE18.5卵巣におけるLINE-1 ORF1p強度が測定された 図5A に示すように、不均一な局在化パターンを有するタンパク質に使用することができる。2つのサンプル間で目的のタンパク質の強度(例えば、タイムポイント、治療、または遺伝子型)を計算して比較するには、同じ特性を有する画像を収集します。より強い信号を持つサンプルを使用して、他のサンプルに保存して使用できるパラメータを決定します。
- Spots特徴を有するタンパク質発現を得るには、まずハイライトされた卵母細胞を同定する(セクション9)。
- 次に、 スポット 機能で、[ 統計 ] タブを選択し、[ 詳細] タブを選択します。 下向き矢印 をクリックして [特定の値]を選択すると、その下に別のタブが開き、さまざまな測定値が表示されます。サーフェス生成に使用するチャンネルの強度 平均 を選択します(または、強度 中央値などの他の強度測定値を選択します)。
- 結合/平均統計情報を取得するには、「 平均値」 基準を選択します。完了したら、さらに分析するためにデータをエクスポートして保存します。
- サーフェスフィーチャーでタンパク質の発現を得るには、画像を開き、「3D ビュー」オプションを選択し、シーンパネルで「新しいサーフェスを追加」機能を有効にしてアルゴリズムパネルを開きます。不要な場合はすべてのアルゴリズム設定の選択を解除し、単一の進む矢印をクリックしてソースチャンネルに移動します。
- 測定する抗体シグナルを含む チャンネル を選択します。選択するその他のプロパティは、ユーザー固有のオプションです。ここでは、マーカーとしてLINE-1シグナルを用いた。 サーフェスの詳細 と 背景の減算(ローカルコントラスト) の値は、それぞれデフォルト値の 1.42 と 5.33 に保たれました。
- 進む矢印をクリックして、しきい値パネルに移動します。両方のサンプルにおいて同等である閾値を選択する(例えば、ここでは、E18.5におけるLINE-1式が閾値を選択するために使用された)。デフォルトのシードポイント直径 7.10 で [有効] を選択します (この値は画像に最適ですが、予想されるフィーチャのピクセルサイズによって異なる場合があります)。
- 進む矢印をクリックして、フィルターサーフェスパネルに移動します。使用した品質フィルターを使用し、閾値と同様に、両方の卵巣サンプルにおけるタンパク質の発現に基づいて値を基準とした。フィルタプロパティを選択したら、二重順矢印をクリックしてサーフェスの生成を完了します。
- 強度値を取得するには、[ 統計 ]タブを選択し、[ 詳細] タブを選択します。 下向き矢印 をクリックして [特定の値]を選択すると、その下に別のタブが開き、さまざまな測定値が表示されます。
- サーフェス生成に使用するチャンネルの強度 平均 を選択します(または、強度 中央値などの他の強度測定値を選択します)。
- 結合/平均統計情報を取得するには、「 平均値」 基準を選択します。完了したら、データをエクスポートして保存し、さらに分析します(図5C)。
11. 計算補正による損傷卵巣の全卵母細胞数の推定
注:解剖中に軽度の卵巣損傷が発生した場合、総卵母細胞数を計算的に推定することが可能な場合があります。 図6に示すように、卵母細胞数の推定には、同じ系統および発生段階の無傷の卵巣を使用することをお勧めします。E15.5で卵巣で行ったシミュレーションでは、≥30%の損失を補正すると、実際の数値から有意に偏差が生じることが示されています(図6C)。
- IMARISで無傷の卵巣の画像を開き、フレーム機能を選択します。「フレーム設定」で、「ボックス」、「グリッド」、「目盛り」、および「軸」の各ラベルを選択します。「位置 X/Y/Z」タブで、「200 μm」を選択して、すべての X/Y/Z 位置に 200 μm のスペースを含む目盛りを生成します。
注:目盛りは、X、Y、Z平面にグリッド/定規を作成し、特定の領域内の卵母細胞を識別します。 - スポット機能を有効にして、セクション9で強調表示されている卵母細胞を特定します(図4)。シミュレーションに使用されているすべての無傷の卵巣で識別された卵母細胞を使用して 3D モデルを作成するには、スポットフィーチャーの「ポイントスタイル/品質」タブの下にある「球」を選択します。
メモ: ピクセル幅は、「ポイントスタイル/品質」タブで変更することもできます。 - ステップ 11.1 で生成されたボックスを使用して、無傷の卵巣の 3D モデルを 図 6A に示すのと同じ向きに整列させます。
- 200μmの目盛り(ステップ11.1)を使用して、各卵巣の体積の50%以内に収まる卵母細胞を選択する。 [スポット ] 機能をクリックし、[ ラベルの編集 ] を選択して、 図 6A に示すように、50% 領域内にある卵母細胞を色で分類します。
注:卵母細胞が領域に分類されると、各クラスに属する卵母細胞の数が提供されます。 - 50%領域にズームインし、 目盛り を 200 μmから 50 μm に変更して、卵母細胞識別のためのより小さな定規を作成します。すべての画像でズーム % を維持します。50 μm の目盛りを目安に、50% 領域を 5 等分します。
注: 図6Aで強調されているように、各部分内の卵母細胞は体積の10%を表し、無傷の卵巣は5つの異なる色で分類された卵巣の上半分の卵母細胞を示し、各色は10%の体積領域内の卵母細胞を表す。 - 図6A、Bに示すように各10%領域の卵母細胞数を記録する。10、20、30、40、および 50% 刻みの卵母細胞の平均数を計算します。
- ステップ11.1~11.6で強調表示されているものを使用して、損傷した部分卵巣の卵母細胞数を取得します。損傷した卵巣を無傷の卵巣と同じ向きに配置し、上記のように欠損体積/パーセンテージを推定します。
- 卵巣 全体 における総卵母細胞数を推定するために、部分卵巣から得られた数に類似の体積について計算された平均卵母細胞数を加える(図6B)。
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Representative Results
卵巣全体の免疫染色およびイメージングは、同じ技術およびマーカーを使用して、異なる発生段階における卵巣における卵母細胞またはタンパク質発現の可視化および定量を可能にする(図3)。このプロトコルは、複数の段階での卵巣の分析と複数のマウス系統からの卵巣の分析が必要な大規模プロジェクトのために開発されました。ここでは、遺伝子解析の標準株であるC57BL6/J株について収集したデータを紹介します。ここで提示された技術は単純であり、結果は14〜19日以内に得ることができ(図2D)、出生前、思春期前、および思春期の雌からの卵巣に使用することができる(図1および図2A、B)。
このアプローチは、卵巣卵母細胞予備の形成中に自然に起こる卵母細胞喪失のダイナミクスを研究するために使用された。マウスを含む多くの生物において、卵母細胞数は、卵母細胞が減数分裂〜E13.5に入る頃に胎児期にピークに達すると考えられている。卵母細胞数は、レトロトランスポゾンLINE-120,21の発現に機械的に関連している胎児卵母細胞消耗(FOA)のまだ完全には理解されていないプロセス(〜E15.5からE18.5まで)のために減少する。減数分裂品質チェックポイント22、23による異常な卵母細胞の排除のために、E18.5〜P0の後により多くの卵母細胞が排除される。このプロトコールを使用してこれらのプロセスを調べるために、図3に示すように、DDX4およびGCNAを卵母細胞マーカーとして使用して、異なる発生段階で卵巣を免疫染色および画像化しました。
GCNAおよびDDX4を発現する小さな卵母細胞は、E15.5以降に見られ、MPI中に卵母細胞を表すか、原始卵胞内の指示で逮捕されます。強いDDX4発現を有するより大きな増殖卵母細胞は、P2卵巣において既に検出されており、そこでは、それらは卵胞の第1波を表す可能性が最も高い44。より大きな卵母細胞の増加は、P5およびP28卵巣において見られる。多光子顕微鏡で得られた画像(図4A)をIMARISソフトウェアを使用して処理し、核GCNAシグナルとDDX4信号によって描写されたサイズに基づいて、大小の増殖卵母細胞を同定するために3Dレンダリングを実施した(図4Aおよびビデオ1)。卵母細胞をプロトコールに記載されるように計数し、結果を図4Bに要約した。以前の研究と一致して、我々はE15.5からE18.5(〜32%)およびE18.5からP2(〜24%)への有意な卵母細胞損失を観察した。女性が思春期(P28)に達するまでに、E15.5に存在する卵母細胞の〜30%だけが生存している。
この方法はまた、1週間以内に原始卵胞予備を完全に排除することが示されている放射線照射などの遺伝毒性治療の結果を観察するためにも使用することができる23、38、45。放射線で処理した卵巣全体と、図3の未処理対照との間に有意な視覚的差異が明らかである(治療雌および未処理雌からのP28卵巣を比較)。放射線被ばくのないP28卵巣では、DDX4で標識された2つの卵母細胞集団を観察した。原始卵胞における豊富な小さな卵母細胞(閉じた矢印);そして、増殖卵胞(例えば、原発性、二次性、および前房)に典型的に見出される様々なサイズのより大きな卵母細胞(図3)。対照的に、P7で0.5Gyのγ放射線に被曝した女性の卵巣は、2D切片で以前に観察されたように、始原卵胞に小さな卵母細胞が完全に欠如している。興味深いことに、同様のサイズのより大きな卵母細胞だけが放射線を生き延びた。これらは、放射線46に対して耐性があることが知られているので、P7卵巣ですでに成長している第1波卵胞である可能性がある(図3、P28)。
卵母細胞数の定量化に加えて、このプロトコルは、卵母細胞の発生に関与する他のタンパク質の免疫染色および定量分析に使用することができる。例えば、LINE-1レトロトランスポゾンによって産生されるRNA結合シャペロンタンパク質であるLINE-1ORF1pタンパク質に対する抗体を用いた(図5)。E15.5からE18.5へのLINE-1要素の存在量の増加は、卵母細胞排除を引き起こすことが提案されている20、21。実際、IMARISにおける多光子撮影画像およびシグナル強度解析を用いて、LINE-1 ORF1pレベルは、この間に卵母細胞において有意に増加することが観察され、これは 図4Bに示すように卵母細胞数の有意な減少と相関する。
卵巣の一部が損傷または失われた状況では、 図6に示すように、同じ系統および発生段階の卵巣を使用して、欠損領域内の卵母細胞の数を計算的に推定することができる。E15.5卵巣からのデータは、計算補正の精度をテストするためのシミュレーションに使用された。最大30%の組織損傷を有する卵巣内の卵母細胞は、無傷の卵巣内の卵母細胞と比較して≤10%の偏差を有すると計算上推定することができ、3D卵巣染色およびモデリングが貴重な組織からのデータの回収に効果的に使用できることが示唆される。E15.5で卵巣で行ったシミュレーションでは、≥30%の損失を補正すると、実際の数値から有意に偏差が生じることが示されています(図6C)。
図1:出生前および出生後の段階からの卵巣解剖および女性からの灌流。 (A-C)異なる段階からの卵巣解剖には異なる技術が必要であり、ビデオの説明を補完するために模式的に描かれている。(D)出生後5日目の卵巣(P5)はP28よりもはるかに小さく、プロトコルに記載されているように異なるクリアリングプロトコルが必要である。(E,F)卵巣の適切な灌流は、赤血球からのバックグラウンド染色を排除するために重要である。灌流されていない生殖管と卵巣はピンク色を呈し、灌流された器官は白くなります。略語: RI = 非灌流生殖管。画像A-Cは BioRender.com で作成されました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:マウス卵巣全体の免疫染色、 透明化、およびイメージング。(A)フローチャートは、出生前/思春期前および思春期の卵巣に対する免疫染色および透明化プロトコルのための共有および特定のステップを示しています。(B)クリアされた卵巣は、2つのカバースリップで挟まれた接着剤井戸の中央にクリアリング溶液の滴に取り付けられる。イメージングのために、取り付けられたサンプルは3Dプリントされたアダプタースライドに入れられます。(C)卵母細胞マーカーDDX4で免疫染色された非灌流対灌流卵巣のグレースケール多光子画像は、灌流後の改善された画質およびより低い非特異的染色を示す。閉じた矢印は、原始卵胞に典型的な細胞質DDX4染色の薄い層を有する卵母細胞を示し、開いた矢印は、成長している卵胞内のより大きな卵母細胞を示す。アスタリスクは血管からの自己蛍光を示す。(D)卵母細胞マーカーGCNA(緑色)およびDDX4(マゼンタ)で免疫染色されたP5卵巣の共焦点対多光子画像からの3Dレンダリングは、共焦点顕微鏡からの有意な球面収差を示し、多光子からの実質的に何も示さない。スケールバー = 100 μm (C, D) および 50 μm ( D の差し込み図)。略語:GCNA = 生殖細胞核酸性ペプチダーゼ;DDX4 = デッドボックスヘリカーゼ4。イメージ A は BioRender.com で作成されました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:異なる発達段階の卵巣の代表的な3Dレンダリング画像。 出生前および出生後の卵巣において、GCNA(緑色)およびLINE-1 ORF1p(青色)またはDDX4(マゼンタ)で免疫染色されたマウント卵巣全体の多光子画像からの3Dレンダリング。個々のチャネルは、核および細胞質シグナルを示すためにグレースケールで提示される。白いボックスは、左下のインセットで拡大された領域を概説します。P28については2つの異なる卵巣が示されている。対照非照射雌由来の卵巣(上段)は、始原卵胞中に小さな卵母細胞の大きな集団を含む(挿入図参照)。対照的に、0.5Gyのγ線(IR)でP7で照射された雌の卵巣は、始原卵胞に小さな卵母細胞を完全に欠いている(挿入図参照)。閉じた矢印は、始原性卵胞に典型的な細胞質DDX4染色の薄い層を有する卵母細胞を示し、開いた矢印は、成長している卵胞内のより大きな卵母細胞を示す。スケールバー = 100 μm;P28インセット用30μm;他のすべてのインセットの場合は 10 μm。インセットには、IMARISで生成された3Dレンダリング画像の拡大ビューが含まれており、遠近法のために低倍率の画像とはわずかに異なる場合があります。略語:非IR=非照射のコントロール;IR = P7に0.5Gyのγ照射;GCNA = 生殖細胞核酸性ペプチダーゼ;DDX4 = デッドボックスヘリカーゼ4;LINE-1 = 長く散在する核元素-1。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:画像処理、卵母細胞の3D表示、定量化結果 (A)多光子画像からの3Dレンダリング(左)は、ガウスフィルタ(中央)を使用してIMARISで処理され、スポット特徴(右)を使用して、大小の卵母細胞が同定された。例としてP5およびP28卵巣が示されている。スケールバー = 100 μm (P5);10 μm (P5 インセット);300 μm (P28);50 μm (P28 インセット)。(B)GCNA陽性の小卵母細胞を、スポット特徴を用いて異なる段階の卵巣で定量した(上)。発生中の卵母細胞数の減少を説明するために、E15.5でカウントされた最も初期の段階に存在する平均数と比較して、各段階で卵母細胞の平均%が計算された(下段)。E15.5からE18.5への卵母細胞数の大幅な減少に注意してください。統計解析±はGraphPad Prismソフトウェアを用いて行い、一元配置分散分析により分析し、有意性はボンフェローニの 事後多重 比較検定により決定した。* P ≤ 0.05;P ≤ 0.0001;ns>0.05。略語:GCNA = 生殖細胞核酸性ペプチダーゼ;ns = 有意ではない。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:胎児卵母細胞におけるLINE-1 ORF1p発現の検出および定量。 (A)多光子画像からの3Dレンダリングは、E15.5およびE18.5胎児卵母細胞(緑色のGCNAでマークされる)におけるLINE-1 ORF1p(青色)発現を示す。(B)パネル Aの一番上の行の画像を使用してIMARISで生成された3Dサーフェス。(c)LINE-1 ORF1p強度解析は、E15.5よりもE18.5における卵母細胞当たりのLINE-1 ORF1pの発現が高いことを示す。スケールバー = 100 μm;10 μm(パネル A のインセット);30 μm(パネル B のインセット)。統計解析±はGraphPad Prismソフトウェアを用いて行い、スチューデン トのt検定によって分析し、有意性はMann-Whitney U 検定によって決定した。P ≤ 0.0001;ns>0.05。略語:GCNA = 生殖細胞核酸性ペプチダーゼ;LINE-1 = 長く散在する核元素-1。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:損傷卵巣サンプル中の総卵母細胞数を計算補正を用いて推定する方法。 (A)無傷の卵巣において、5つの10%領域が赤、青、灰色、マゼンタ、および茶色で強調表示されたGCNA陽性(緑色)E15.5卵母細胞のモデル。無傷の卵巣の後に続く各画像は、10%の増分領域が最大50%欠落したシミュレートされた卵巣を表す。(b)損傷試料中の卵母細胞数を推定する計算方法の概略図。(C)シミュレートされた卵巣中の総卵母細胞数を、元の無傷の卵巣の数(100%と考えられる)と比較し、その差を%偏差として提示した。10-50%の体積が欠落している6つの個々の卵巣からのシミュレーション。スケールバー = 80 μm。略称:GCNA=生殖細胞核酸性ペプチダーゼ。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
ビデオ 1: P5 卵巣の卵母細胞の 3D レンダリングと 3D モデリング。このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
| ソリューションとバッファー | 試薬 | 組成 |
| 固定 | パラホルムアルデヒド | 4% (v/v) |
| 透過処理バッファー | ポリビニルアルコール(PVA) | 0.2% (ワット/V) |
| 水素化ホウ素ナトリウム | 0.1% (対比) | |
| トリトンX-100 | 1.5% (v/v) | |
| ブロッキングバッファ | ウシ血清アルブミン(BSA) | 3% (ワット/V) |
| 1 M グリシン (pH 7.4) | 2% (ワット/バイ) | |
| トリトンX-100 | 0.1% (v/v) | |
| 200xペニシリン - ストレプトマイシン | 1% (v/v) | |
| 10% アジ化ナトリウム | 0.2% (v/v) | |
| ヤギ血清 | 10% (v/v) | |
| 洗浄バッファー | ティッカー | 0.2% (ワット/V) |
| トリトンX-100 | 0.15% (v/v) | |
| 10% アジ化ナトリウム | 0.1% (v/v) | |
| スケールS4(0)溶液(pH 8.1) | D-ソルビトール | 40% (税抜率) |
| 尿素 | 24% (税抜率) | |
| グリセロール | 10% (v/v) | |
| ティッカー | 20% (v/v) | |
| スケールキュービック-1ソリューション | 尿素 | 25% (ワット/V) |
| N,N,N',N'-テトラキス(2-ヒドロキシプロピル)エチレンジアミン | 25% (v/v) | |
| トリトンX-100 | 15% (v/v) | |
| スクロース溶液 | 蔗糖 | 20%(対比) |
| スケールキュービック-2ソリューション | 蔗糖 | 50% (w/v) |
| 尿素 | 25% (ワット/V) | |
| トリエタノールアミン | 10% (ワット/バイ) | |
| トリトンX-100 | 0.1% (v/v) |
表1:ソリューションとバッファ
補足図S1:画像取得嗜好。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足表S1:画像取得設定。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
この記事では、生殖細胞定量とタンパク質局在化のためのハイスループットおよび比較研究のための出生前および出生後の卵巣の詳細な3D免疫染色およびイメージングプロトコルを紹介します。我々は、卵巣(N=6-12)の卵母細胞数を、2-4個の24ウェルプレートが通常一度に処理される10-16個の異なる株の6つの発生時点で分析するために開発した。この方法は、他の器官または細胞マーカーに適合させることができる。例えば、このプロトコルは、適切な抗体を使用して、卵巣内の顆粒膜細胞などの体細胞を標識および視覚化するために使用でき、体細胞間相互作用の研究または他の卵巣細胞タイプの開発を容易にする。
このプロトコールと抗体の組み合わせの1つの制限は、異なる濾胞段階の決定的な同定である。顆粒膜細胞核の層によって濾胞期を同定するために免疫蛍光および2Dイメージングに使用されるDNA染色は、3Dアプローチには不十分である。4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)またはヘキストは、大きな組織の中央で限られた光浸透および減衰信号のために、全臓器染色にはほとんど使用されない。ヨウ化プロピジウム(PI)は、組織の奥深くまで浸透することができる小分子であるが、スペクトルの重なりのために多光子イメージング系上で捕捉することは困難である。濾胞段階のより良好な分解能は、抗ミュラーホルモン(AMH)またはFOXL247、48などの顆粒膜細胞に特異的な追加のマーカーによって達成することができる。しかし、これらのマーカーは、より大きな成長卵胞を区別するのに役立つが、原始卵胞と原始卵胞を区別しない。これらの初期段階の特定のマーカーが利用可能になるまで、DDX4またはGCNAなどの卵母細胞マーカーは、卵胞発達の最良の指標を提供する。さらに、このプロトコルは出生前の男性生殖腺に対して機能するが、そのサイズが制限要因である可能性がある出生後精巣ではまだテストされていない。さまざまなサイズの卵巣における生殖細胞のより優れた可視化と定量化のための重要な問題を以下に列挙し、下流分析のための良質の免疫染色を確実にするために取られた技術とステップを強調します。
最初の重要なステップは、固定前後の卵巣の損傷を防ぐことです。損傷した卵巣は臓器構造の一部を欠いている可能性があり、卵母細胞数に影響を与え、実験結果を歪めます。損傷を防ぐために、余分な体細胞組織は、卵巣を移すための鉗子でつかむために解剖後により大きな卵巣に付着したままにする。さらに、より小さな卵巣の場合、卵巣が先端に容易に収まるように十分に広く切断されたピペットチップでそれらを移すことで、損傷を避けることができる。軽微な組織損傷の結果、卵巣の一部が欠損した場合、損傷したサンプル中の総卵母細胞数を同じタイプの無傷のサンプルを使用して外挿できる計算方法によって軽減することができる(図6)。
しかし、計算シミュレーションの結果、被害面積の大きさが大きくなると予測精度が低下することが明らかになりました( 図6C)±、それぞれ10、20、30%±1.5±10.2%、97.2%、90.3%です)。シミュレーションに基づいて、損失が >30% のサンプルを分析から除外することをお勧めします。同じサンプルタイプからの複数の無傷の卵巣を使用して、損傷サンプルで欠損しているものと同様の領域の卵母細胞の平均数を計算した。次いで、この数を用いて、損傷を伴う卵巣中の卵母細胞の総数を予測した。欠損領域に当接する同じ卵巣に類似したサイズの領域を使用して、代替として使用してもよいが、試験はしなかった。
もう1つの問題は、自己蛍光を引き起こす可能性のある細胞を汚染することを避けることです。思春期卵巣の場合、上記のように、1x PBSおよび1%PFAの両方を用いて灌流を行い、自家蛍光を引き起こす血液細胞を排除する必要があります(図2C)。PBSによる灌流は、臓器、特に卵巣および腎臓が血液から取り除かれ、1%PFAに切り替える前に白くなるまで継続されるべきである(図1E、F)。PBSによる非効率的な灌流は、小さな卵母細胞の可視化をマスクして困難にする可能性のある高いバックグラウンドをもたらす。PFAの割合が低い(1%)または高い(4%)灌流は、PBS単独の灌流よりも画質が良くなります。したがって、PFAのより低い割合が使用された。
抗体染色の最適化には、いくつかの変数に注意が必要です。透過処理ステップでは、4時間がこのアッセイに理想的であることが判明し、4時間より長い期間(6〜8時間試験)は染色を全く生じない。大規模な免疫染色実験に使用される抗体の量とコストは高くなる可能性があるため、このプロトコルは、免疫染色の品質を損なうことなく抗体ミックスを再利用するためにテストおよび最適化されました。再利用のためには、抗体混合物は、プロトコールに記載されているように新鮮な抗体で補充されなければならない。洗浄ステップは免疫染色の品質にとっても重要であり、イメージング中により良いシグナル対ノイズ比を達成するためにはより長く行う必要があり、選択した抗体ごとに決定する必要があります。最良の結果を得るには、ScaleS4(0)クリアリングソリューションを用途ごとに新しく準備することをお勧めしますが、ScaleCUBIC-1とScaleCUBIC-2は室温で暗所で約1〜2ヶ月間保存できます。
ScaleCUBIC-1 クリアリングは 37 °C で行われます。重要なことに、より高い温度は試薬沈殿をもたらし、免疫染色の品質に影響を与える可能性があるため、避けるべきです。イメージング用に複数のサンプルを取り付けると、時間がかかることがあります。寒天または他のプロトコールで使用される他の包埋方法は、労働集約的であり、試料47、49、50のさらなる再透明化を必要とするかもしれない。再利用可能なシリコンガスケットは、カバースリップで使いやすく、他のサンプルサイズに対応するためにさまざまなサイズと深さで提供される接着ウェルとして使用できます。高品質の画像を実現するには、十分な量のクリアリングソリューションを使用する必要があります。少なすぎると画質が低下し、溶液が多すぎると顕微鏡に漏れる可能性があります。このステップは、サイズに応じて特定のサンプル用に最適化する必要があります。ガラス底の皿を使用することもできますが、わずかな動きでも画像が歪むため、イメージングのためにサンプルを固定する必要があります。シリコンガスケットは、画像化のためのサンプルを固定化するために、ガラス底皿および上部カバースリップと組み合わせて使用され得る。しかし、これは、卵巣のサイズのために両側からのイメージングが必要な場合、サンプルを反転させる能力を制限する。
この大規模で高スループットのアプローチのもう1つの重要な選択肢は、2つの調整可能なスペクトル物理学マルチフォトン(MP)レーザーを使用したLeica DIVE/4TUNE/FALCONプラットフォームでのイメージングでした。DIVEプラットフォームを使用する利点には、サンプルマウントの容易さ(上記)、光学的歪みの最小化(共焦点プラットフォームと比較して)、および最も重要なのは、イメージング速度と集録画像データの管理が含まれます。高倍率(16倍)のマルチフォトンレーザーでサンプルをイメージングすると、LAS Xソフトウェアによる画像取得に同様の設定を使用して、ライカダイブまたはSP8の共焦点レーザーよりもはるかに高速で、光損傷が少なくなります。MPビームは低く、その蛍光色素分子励起は焦点に高度に局在し、より多くの空間/軸イメージングステップ(複合:最大で〜300〜400セクション、MP:>800セクション)にもかかわらず、光損傷を与えることなく低倍率でより多くの深さを達成する。
16x/NA0.6対物レンズは、サンプルの途中で最大信号に最適に設定された機械的補正カラーを介して、光軸に沿ったサンプルとマウント剤の分布によるわずかな屈折率の不一致を補正することができます。さらに、卵母細胞などの球状構造は、所定のピンホール設定におけるマウント剤およびサンプル屈折率の不一致による共焦点面(信号)の深さ依存的な局在化が起こり得るため、共焦点画像取得によって歪む可能性がある(図2D)。蛍光シグナルは、焦点が合っていない信号を除去するために装置の内部ピンホールを介して捕捉されるため、固有の光学的歪み(球面収差)がサンプルの奥深くで悪化する可能性があり、これはより大きな卵巣(すなわち、〜400〜600マイクロメートルの厚さ)にとって問題となる。
レンズ補正の設定を同じにすることで、発光波長が変化するDIVE MPシステムで球面収差をほとんど検出できないため、定量化と共局在化の研究が簡素化されます(図2D)。最後に、高出力パルスレーザーは、特にZ深度励起補正とともに使用する場合、サンプルの奥深くでより低い蛍光色素濃度を励起することができます。さらに、通常の光電子増倍管と雪崩光子計数検出器を組み合わせたMPハイブリッド検出器(HyD-RLD)によっても、弱い信号の捕捉が強化され、広範囲の発光波長にわたって30倍以上の信号検出が可能になります。
ライトシート(LS)多光子顕微鏡は、3D組織画像化47のための別の新たなプラットフォームである。しかし、LSは、寒天の埋め込みやイメージング用のセットアップなど、巨視的なサンプルのセットアップ時間を必要とします。さらに、サンプルの回転で高倍率で取得した画像は、100 GB>大きなファイルを生成する可能性があり、これは光シートシャドーイングアーチファクト(外部媒体とサンプル内部の屈折率の不一致、またはサンプル表面の歪みによる)を除去するために必要になる場合があります。接着剤ウェルに溶液中にサンプルを取り付ける提示された方法は、簡単で高速です。
さらに、このアプローチにより、1つのセットアップで、反転や回転なしに、1つの井戸に複数の卵巣をイメージングできます。しかし、カバースリップ「サンドイッチ」をひっくり返すことは、より大きな卵巣のために必要かもしれません。DIVEシステムのイメージングは、共焦点やLSよりも高速です。16倍の倍率で、思春期前卵巣を3〜5分(Zステップ2μm)で、思春期卵巣を1時間(Zステップ5μm)で画像化する。さらに、LAS X で生成されるファイルは管理可能なサイズ(2 ~ 20 GB)であり、ダウンストリーム分析用の多数のサンプルにとっても重要です。この免疫染色プロトコルは、DIVEプラットフォームと組み合わせて使用するように最適化されていますが、免疫染色されたサンプルは、いくつかの変更を加えた他のMP/LSプラットフォームを使用して画像化することができます。
3Dモデリングプロトコルによる卵巣全体染色の利点は、2D解析における手動データ取得と比較して、効率的で比較的簡単なデータ解析です。IMARISの3D可視化および解析ソフトウェアが選ばれたのは、市販されており、多くの顕微鏡コアで提供されており、プログラミングスキルを必要とせず、ライカのLAS XやZEISSのZENなどの多くの画像取得ソフトウェアプラットフォームと互換性があるためです。IMARISでは、標準パラメータはプロトコルセクションで強調表示されているように設定され、これらのパラメータはわずかな変更で他の画像やサンプルに使用できるため、再現性と効率が向上します。
画像解析と定量化はIMARISソフトウェア用に最適化されています。ただし、同様の分析は、同様の原則に従って、他の商用またはオープンソースのデータ視覚化ソフトウェアでも行うことができます。結論として、定量的および定性的な分析のために卵巣全体をイメージングするための最適化されたプロトコルがここで提示された。これは、毒物学検査、臨床および診断目的、ならびに卵巣の充足性および機能の調節因子のゲノムワイド分析にますます必要とされるハイスループット処理の要求に意図的に適合された。
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Disclosures
著者らは、開示する利益相反はありません。
Acknowledgments
この研究は、国立衛生研究所の助成金(R01 HD093778からE.B-FおよびT32 HD007065からR.B)によって支援されました。放射線実験に協力してくれたザカリー・ブーシェに感謝します。原稿を批判的に読んでくれたメアリー・アン・ヘンデルに感謝します。私たちは、この出版物に記載されている顕微鏡検査作業の専門家の支援に対するジャクソン研究所のSonia Erattupuzhaと顕微鏡コアサービス、および3Dプリントされたアダプタースライドの設計のためのジャクソン研究所の科学機器サービスのJarek Trapszoの貢献に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Benchtop Incubator | Benchmark Scientific | H2200-H | 37 °C incubator |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 97061-416 | |
| C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 000664 | mouse inbred strain |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D1435 | Hazardous material |
| D-Sorbitol | Sigma-Aldrich | S6021 | |
| Dumont #5 Forceps | FST | 91150-20 | |
| FastWells Reagent Barriers | GraceBio | 664113 | Sticky and flexible silicone gasket (adhesive well) |
| Fine Scissors | FST | 91460-11 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G2025 | |
| Glycine | ThermoFisher Scientific | BP381-500 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21246 | Dilution 1:1000 |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A-21434 | Dilution 1:1000 |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| IMARIS Software | Oxford Instruments | Version 9.7.0 | Image visualization and analysis software |
| Insight X3 | Spectra-Physics | InSight X3 Tunable Ultrafast Laser | Laser for Multiphoton Imaging |
| LASX software | Leica | Version 3.5.6 | Image acquisition software |
| Leica DIVE/4TUNE/FALCON | Leica | Leica Dmi8, 2P-M-ready: # 158005406 | Multiphoton Microscope |
| MaiTai HP | Spectra-Physics | Mai Tai DeepSee One Box Ultrafast Laser | Laser for Multiphoton Imaging |
| Masterflex Pump Controller | SPW Industrial | Model: 7553-50 | Peristaltic pump for perfusion |
| Mayo Scissors | FST | 14010-17 | 5” –7” blunt/blunt scissors for decapitation |
| Micro Cover Glasses, Square, No. 1.5 25x25mm | VWR | 48366-249 | |
| Mini BioMixer | Benchmark Scientific | B3D1020 | shaker/nutator for 37 °C incubator |
| Nikon Ergonomic SMZ1270 | Leica | SMZ1270 | stereomicroscope |
| Paraformaldehyde 16% (formaldehyde aqueous solution) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Hazardous material |
| PBS Tablets, Phosphate-buffered Saline | ThermoFisher Scientific | BP2944100 | Dissolve in Milli-Q water |
| Penicillin-Streptomycin, 200x, Dual Antibiotic Solution | ThermoFisher Scientific | ICN1670249 | |
| Polyvinyl alcohol (PVA) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Quadrol (N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropylethylenediamine) | Sigma-Aldrich | 122262 | |
| Rabbit anti-DDX4/MVH | Abcam | ab27591 | Dilution 1:500 |
| Rabbit anti-LINE-1 ORF1p | Abcam | ab216324 | Dilution 1:500 |
| Rat anti-TRA98/GCNA | Abcam | ab82527 | Dilution 1:500 |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Hazardous material |
| Sodium borohydride | Sigma-Aldrich | 452882 | Hazardous material |
| Sucrose | ThermoFisher Scientific | S0389 | |
| Tekmar Orbital Shaker | Bimedis | VXR-S10 | shaker for room temperature |
| Triethanolamine | Sigma-Aldrich | 90279 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| UNOLOK Infusion Set | MYCO Medical | 7001-23 | needles for perfusion |
| Urea | Amresco | 97061-920 | |
| X-Cite 120LED | Excelitas | S/N XT640-W-0147 | low-power LED fluorescence lamp |
References
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