Summary
대사 적응은 분화, 지속성 및 세포 독성을 지시하기 때문에 T 세포의 기본입니다. 여기서, 생체외 사이토카인-분화된 인간 일차 T 세포에서 미토콘드리아 호흡을 모니터링하기 위한 최적화된 프로토콜이 제시된다.
Abstract
활성화하는 동안, T 세포의 신진 대사는 그들의 운명에 영향을 미치는 변화에 적응합니다. 미토콘드리아 산화 인산화의 증가는 T 세포 활성화에 필수적이며, 기억 T 세포의 생존은 미토콘드리아 리모델링에 의존한다. 결과적으로, 이것은 암 면역 요법의 장기적인 임상 결과에 영향을 미칩니다. T 세포 질의 변화는 종종 대사 상태에 의한 것이 아니라 잘 알려진 표면 마커를 사용하는 유세포 측정에 의해 연구됩니다. 이것은 세포외 플럭스 분석기와 T 세포 대사에 다르게 영향을 미치는 사이토카인 IL-2 및 IL-15를 사용하여 일차 인간 T 세포의 실시간 미토콘드리아 호흡을 측정하기 위한 최적화된 프로토콜입니다. T 세포의 대사 상태는 대사 경로에서 주요 복합체를 억제할 때 산소 소비량을 측정함으로써 명확하게 구별될 수 있으며, 이러한 측정의 정확도는 최적의 억제제 농도 및 억제제 주입 전략에 크게 의존한다는 것을 보여준다. 이 표준화 된 프로토콜은 암 면역 요법을 모니터링하고 연구하는 T 세포 적합성의 표준으로 미토콘드리아 호흡을 구현하는 데 도움이됩니다.
Introduction
정확한 T 세포 발달 및 기능은 면역계가 항원을 인식하고 반응하는 능력에 필수적입니다. 미토콘드리아 산화적 인산화(OxPhos)는 T 세포의 상태에 따라 변화한다. Naïve T 세포는 주로 OxPhos를 사용하여 ATP를 생산하는 반면, 활성화 된 T 세포는 글리코 분해가 지배적이되는 대사 전이를 겪습니다1. 이펙터 단계 후에, 기억 T 세포의 작은 잔여 서브세트는 OxPhos2,3에 의해 지배되는 대사 상태로 되돌아간다. OxPhos의 변화는 T 세포의 서브세트조차도 그들의 특이적인 OxPhos 특성1에 의해 분화될 수 있는 정도까지 T 세포의 분화를 따른다. 반대로, OxPos는 T 세포의 기능에 중요하며, OxPhos의 억제는 T 세포의 증식 및 사이토카인 생산을 차단하는 것으로 입증되었습니다4. 따라서, T 세포 OxPhos의 특성을 정확하고 재현 가능한 방식으로 정량화하는 능력은 T 세포로 작업하는 모든 사람들에게 강력한 도구입니다.
이 프로토콜에서, T 세포 OxPhos의 특성은 세포외 플럭스 분석기를 사용하여 측정된다. 이 분석기의 핵심 기능은 분석하고자 하는 세포의 성장 배지의 산소 함량을 지속적으로 측정하는 것이다. 성장 배지로부터 제거된 산소는 세포에 의해 흡수되는 것으로 가정된다. 세포를 다양한 OxPhos 억제제 또는 개질제로 처리함으로써, 산소 흡수의 감소는 억제되거나 변조된 기능과 관련된다. 예를 들어, ATP 신타제의 억제는 산화적 인산화에 의해 ATP를 생산하는데 달리 사용될 산소의 감소된 세포 흡수를 야기할 것이다. Clark 전극 및 Oroboros 장비를 포함한 다른 장비는 유사한 기능을 제공하며 각 장비마다 다른 장점과 단점이 있습니다. 이러한 장치의 연구에 다양한 세포 유형을 사용할 수 있지만, 특히 도전적인 세포 유형 중 하나는 인간 원발성 T 림프구5입니다. 그들의 작은 크기, 열악한 생존 ex 생체 및 비-부착성 특성으로 인해, 인간 일차 T 세포는 연구하기가 어려울 수 있다.
이것은 세포외 분석기에 의한 인간 일차 T 세포의 미토콘드리아 호흡을 연구하기 위한 프로토콜이다. 프로토콜은 최적화 실행으로 나뉘며, 웰 당 세포 수의 최적 농도와 올리고 마이신 및 FCCP의 최적 농도가 결정됩니다. 또한 최적화된 조건이 사용되는 Assay가 실행됩니다.
혈액 유래 인간 PBMCs 및 생체외 일차 T 세포 배양물을 사용하여, 이 프로토콜은 민감한 세포 유형으로 작업할 때 미토콘드리아 억제제의 순차적 주사 대신에 별도의 사용의 최적 저해제 농도와 관련성의 중요성을 입증한다. 마지막으로, 이 검정이 사이토카인 IL-2 및 IL-15와의 분극시 미토콘드리아 호흡의 미묘한 차이를 견고하게 검출할 수 있음이 입증된다.
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Protocol
실험은 Herlev Hospital과 덴마크의 수도권의 지침에 따라 수행되었습니다.
참고: 이 프로토콜에는 최적화 실행과 분석 실행에 대한 지침이 포함되어 있습니다. 최적화 실행 또는 어세이 실행에 대한 지침이 있을 때 텍스트에 명확하게 기록됩니다. 분석 실행을 계속하기 전에 최적화 실행 실행
1. 버피 코트로부터의 인간 말초 혈액 단핵 (PBMC) 분리
- PBMC 분리
- 적절한 기관에서 버피 코트를 수집하십시오 (혈액 수집 가방에 수집). 버피 코트는 건강한 기증자에게서 유래합니다. 최근에 진통제를 사용한 기증자는 제외하십시오.
- 버피 코트가 들어있는 혈액 수집 백을 층류 캐비닛으로 옮기기 전에 70 % 에탄올로 스프레이하십시오. 모든 단계에 대해 항상 멸균 기술과 멸균 하드웨어를 사용하십시오.
참고: 인간 혈액 샘플의 취급에 대한 올바른 허가를 받았는지 확인하십시오. - 혈액을 멸균된 50 mL 원심분리 튜브로 옮긴다.
- 보충되지 않은 RPMI 1640으로 혈액을 적어도 10 % 희석하십시오.
- 바람직한 밀도 구배 배지 20 mL를 50 mL 원심분리 튜브에 붓는다.
- 희석된 혈액 25 mL를 혈청학적 피펫에 흡인시킨다. 전기 피펫 컨트롤러를 최저 속도로 설정하십시오.
- 밀도 구배 배지가있는 튜브를 45 ° 각도로 잡고 혈청 학적 피펫 팁을 50 mL 원심분리 튜브의 안쪽에 놓습니다. 혈청학적 피펫으로부터 희석된 혈액 25 mL를 천천히 방출한다.
- 희석 된 혈액과 밀도 구배 배지가 혼합되지 않았는지 확인하십시오. 희석 된 혈액이 밀도 구배 배지 위에 놓여 있는지 확인하십시오.
- 희석 된 모든 혈액이 처리 될 때까지 후속 밀도 구배 배지 튜브로 이것을 반복하십시오.
- 튜브를 1000 x g 에서 30분 동안 원심분리기와 원심분리기로 조심스럽게 이동시키고 실온에서 스윙아웃 로터(RT)로 옮깁니다. 가속과 브레이크가 최소한인지 확인하십시오.
참고 : 원심 분리 후 다양한 층이 표시되어야합니다. 상단의 투명한 분홍색에서 주황색까지의 층은 혈장과 혈소판으로 구성됩니다. 중간 백색 층은 PBMCs와 밀도 구배 매체로 구성된 명확한 층으로 구성되고, 마지막으로 적혈구가있는 바닥에 진한 적색 층으로 구성됩니다. - 멸균된 파스퇴르 피펫을 사용하여, PBMC 함유 백색 층을 50 mL 원심분리 튜브에 조심스럽게 흡인시킨다.
참고: 밀도 구배 매체를 전송하면 다운스트림 정화에 영향을 미치므로 전송하지 마십시오. 과도한 플라즈마는 결과에 영향을 미치지 않습니다. - 수집된 모든 PBMC를 동일한 50 mL 원심분리 튜브에 풀링하고 RPMI 1640으로 최대 50 mL를 충전한다.
- 세포를 RT에서 5분 동안 500 x g 에서 원심분리한다(달리 명시되지 않는 한 이 설정에서 나머지 원심분리 단계를 수행함).
- 상청액을 흡인하고 세포를 RPMI 1640의 30 mL에 재현탁시킨다. 혈구측정기 또는 자동화된 세포 계수기를 사용하여 세포를 계수하십시오.
- 냉동 보존을 위해, 동결 배지 1 mL당 최대 3천만 개의 세포를 재현탁한다.
- 세포를 냉동 튜브로 옮기고 속도 조절된 냉동 용기(분당 -1°C)를 사용하여 -80°C가 될 때까지 동결시킨다. 장기간 보관하려면 PBMC를 -140°C로 옮깁니다.
참고: 셀이 RT에서 동결 배지에 있는 시간을 제한하십시오. RT에서 DMSO는 세포에 매우 독성이 있습니다.
2. 활성화된 인간 일차 T 림프구의 배양
- 세포의 해동 (1 일째)
- 샘플 당 RPMI 1640 mL를 약 37°C로 미리 가온한다.
- 원하는 수의 세포 앰플을 가져 와서 드라이 아이스에 임시로 보관하십시오.
- 동결된 세포를 10 mL의 미리 가온된 RPMI 1640에 재현탁시킨다.
- 세포를 RT에서 500 x g 에서 5분 동안 원심분리한다.
- 상층액을 버리고 2.1.4에 기재된 바와 같이 RPMI 1640 및 원심분리기 10 mL에 재현탁하여 세포를 다시 세척한다.
- 상청액을 버리고 X-VIVO 15 배지 + 5% 인간 혈청 mL당 2 x 106 세포에서 세포를 재현탁시킨다 (이하: T 세포 배지).
- 세포를 웰 당 2 mL의 플레이트를 24-웰 세포 배양 플레이트에서 플레이트하고, 37°C 및 5% CO2에서 밤새 인큐베이션한다.
- 세포의 활성화 (Day 0)
- 1백만 세포당 12.5μL의 비드를 마이크로원심분리 튜브로 옮겨 CD3/CD28 비드를 세척한다. 비드 12.5 μL 당 PBS 12.5 μL를 첨가한다.
참고 : 사용하기 전에 구슬의 바이알을 와류하는 것이 중요합니다. - 마이크로원심분리 튜브를 1분 동안 적합한 자석 상에 놓는다.
- 완충액을 버리고, 비드를 T 세포 배지의 원래 부피 (비드의 원래 부피의 12.5 μL 당 12.5 μL의 T 세포 배지)에 재현탁시킨다.
- 1:2의 비율에 해당하는 세포 백만 개당 12.5 μL의 비드를 첨가한다(비드: 세포).
- 세포를 각각 약 5 백만 개의 세포가있는 두 가지 조건으로 나눕니다.
- 표 1에 언급된 바와 같은 조건에 정확한 부피의 사이토카인을 첨가한다.
- 세포를 37°C 및 5% CO2에서 3일 동안 인큐베이션한다.
- 1백만 세포당 12.5μL의 비드를 마이크로원심분리 튜브로 옮겨 CD3/CD28 비드를 세척한다. 비드 12.5 μL 당 PBS 12.5 μL를 첨가한다.
- 세포 배양 (3 일과 5 일째)
- 세포를 재현탁시키고 각 웰에서 부피의 절반을 새로운 웰로 옮겨 세포를 나눕니다. 동일한 부피의 신선한 T 세포 배지를 각 웰에 첨가한다.
- 표 1에 언급된 바와 같이 각 조건에 새로운 사이토카인을 첨가한다.
3. 세포외 플럭스 분석
- 센서 카트리지의 수화(0일차)
- 센서 카트리지의 포장을 풀고 유틸리티 플레이트에서 센서 카트리지를 조심스럽게 분리합니다.
- 센서 카트리지를 거꾸로 놓고 센서 프로브에 닿지 않도록 주의하십시오.
- 유틸리티 플레이트에 200μL의 교정제를 채우고(자세한 내용은 재료 표 참조) 센서 카트리지를 유틸리티 플레이트에 다시 조심스럽게 교체합니다.
- 대안적으로, 임의의 기포 형성을 제거하기 위해, 센서 카트리지를 밤새 멸균된 초순수에서 인큐베이션하고, 분석의 아침에 미리 예열된 교정제로 교체한다.
- 센서 카트리지 플레이트를 37°C에서 하룻밤 동안 CO2 조절되지 않은 가열 캐비닛에서 인큐베이션합니다.
참고: 과도한 CO2 가 센서 카트리지에 영향을 미치므로 CO2 규제가 적용되지 않는 캐비닛을 사용하는 것이 매우 중요합니다. Flux 분석기(자세한 내용은 재료 표 참조)가 37°C까지 예열되도록 사용 최소 하루 전에 켜져 있는지 확인하십시오.
- 세포 코팅 및 미토콘드리아 억제제의 제조 (Day 1)
- NaHCO3 (pH 8.3, 0.1 M, 1128 μL), Cell-Tak (1 mg/mL, 48 μL) 및 NaOH (1.0 M, 24 μL)를 함유하는 코팅 용액 (표 참조)을 준비한다.
참고 : 코팅 용액은 항상 신선하게 만들고 사용해야합니다. - 신선한 XF 세포 배양 플레이트를 열고 새로 제조된 코팅 용액 12 μL를 각 웰에 첨가한다. 모든 웰의 바닥에 코팅 용액의 균일 한 분포를 보장하십시오.
- 뚜껑을 켠 상태에서 플레이트를 RT에서 30분 동안 인큐베이션하고 나머지 액체 용액을 모든 웰에서 버립니다.
- 플레이트를 멸균수 200 μL로 세척하고 액체를 버린다.
- 플레이트를 200 μL의 세포 배양 등급 멸균 PBS로 세척하고 액체를 버린다.
- 플레이트를 RT에 두고 적어도 30분 동안 건조시키십시오.
- NaHCO3 (pH 8.3, 0.1 M, 1128 μL), Cell-Tak (1 mg/mL, 48 μL) 및 NaOH (1.0 M, 24 μL)를 함유하는 코팅 용액 (표 참조)을 준비한다.
- XF 세포 배양 플레이트 내의 플레이트 T 세포 (제1일)
- 실험 설정에 따라 적합한 XF RPMI 배지와 글루코스, 피루베이트 및 글루타민을 혼합하여 50mL의 분석 배지를 제조하였다(권장 수준: 4mM 글루코스, 1mM 피루베이트 및 3mM 글루타민).
- CO2 조절되지 않은 인큐베이터에서 37°C로 가열하고 pH를 7.4로 설정합니다. 세포를 도금하고 올리고마이신 및 FCCP 용액을 준비하기에 충분한 배지가 있는지 확인하십시오 (3.4 절).
- 최적화 실행 또는 분석 실행을 위해 웰당 셀 수가 증가함에 따라 플레이트 레이아웃을 설계합니다. 배경 측정을 위해 미디어로 채워지고 미디어로 주입 된 4 개의 웰을 사용하십시오.
- 섹션 2.3에서 제조된 T 세포를 계수하고(바람직한 방법에 의해) 플레이트 레이아웃에 따라 코팅 용액으로 코팅된 XF 세포 배양 플레이트의 각 웰에 정확한 수의 세포를 피펫한다.
참고: 각 웰의 최종 부피는 다를 수 있지만 우물 바닥을 덮기에 충분해야 합니다. - XF 세포 배양 플레이트를 10분 동안 RT에서 1000 x g 에서 원심분리하여 T 세포를 코팅된 표면에 부착시킨다.
- 세포를 200 μL의 분석 배지로 세척하고, 배지를 버리고, 180 μL의 분석 배지를 첨가한다.
참고: 거꾸로 된 광학 현미경을 사용하여 웰을 육안으로 검사하여 세포가 부착되어 웰 표면에 고르게 분포되어 있는지 확인하십시오. - XF 세포 배양 플레이트를 CO2 조절되지 않은 가열 캐비닛에서 30분 동안 인큐베이션하여 플레이트의 온도가 37°C가 되도록 한다.
- 최적화를 위해 올리고마이신 및 FCCP로 센서 카트리지 로딩(1일차)
참고: 올리고마이신 및 FCCP 농도가 이미 최적화되었다면 섹션 3.5에서 계속하십시오.- 단계 3.4.2 및 3.4.3에 기재된 바와 같이 분석 매질에서 올리고마이신 및 FCCP의 작동 용액을 제조한다 (단계 3.3.1에서 제조됨).
- 올리고마이신 작동 용액: 5 μM 용액 (2 mL의 분석 매질 + 1 mM 올리고마이신 스톡의 10 μL) 및 3 μM 용액 (8 mL의 분석 배지 + 24 μL의 1 mM 올리고마이신 스톡)을 준비한다.
- FCCP 작업 용액: 2 μM 용액 (2 mL의 분석 배지 + 300 μM FCCP 스톡의 13.2 μL) 및 1.3 μM 용액 (8 ml의 분석 배지 + 300 μM FCCP 스톡의 34.6 μL)을 준비합니다.
- 올리고마이신 또는 FCCP의 작동 용액을 센서 카트리지의 주입 포트에 로드합니다(표 2).
메모. 주입 포트에는 공기만 포함되지 않는 것이 중요합니다. 어떤 이유로든 모든 주입 포트가 사용되지 않는 경우, 빈 포트는 분석 매질로 채워져야 합니다. - 테이블 위의 플레이트 가장자리를 부드럽게 노크하여 주입 포트의 잠재적 인 거품을 제거하십시오.
- 어세이 실행을 위한 올리고마이신, FCCP 및 안티마이신 A가 있는 로딩 센서 카트리지 로딩(Day 1)
- 이전 최적화 실행에서 확인된 최적 농도에 따라 분석 매질(단계 3.3.1에서 제조됨)에서 올리고마이신, FCCP의 용액을 준비한다. 또한, 20 μM 안티마이신 A 용액을 제조하였다.
- 20μL의 올리고마이신 또는 FCCP를 플레이트 레이아웃에 따라 센서 카트리지의 주입 포트 A에 로드합니다. 22μL의 20μM 안티마이신 A를 모든 웰의 주입 포트 B에 첨가한다. 일단 웰에 주입된 항마이신 A의 결과적인 농도는 2 μM이 될 것이다.
- Flux 분석기 소프트웨어에서 실험 프로토콜 설정.
- 플레이트 레이아웃당 각 조건에 대해 그룹 및 플레이트 맵을 지정합니다.
- 주입 전략에 따라 프로토콜을 설계한다(표 3 및 그림 1).
참고: Assay 실행을 실행할 때 주입 C 및 D를 생략할 수 있습니다. - 분석 설정을 저장하고 분석에 포함시키는 데 필요한 정보를 입력한 다음 시작을 누릅니다.
- 플럭스 분석기는 섹션 3.5에서 준비된 센서 카트리지를 요청합니다. 뚜껑을 분리하고 분석기의 지시에 따라 센서 카트리지를 삽입합니다.
참고: 이 분석은 체크 표시로 표시된 센서를 교정하고 검사합니다. 성공적인 교정 후에, 분석기는 섹션 3.3에서 제조된 XF 세포 배양 플레이트를 요청할 것이다. 유틸리티 플레이트는 분석기로부터 분출되고 XF 세포 배양 플레이트로 대체되어 분석을 시작한다.
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Representative Results
OxPhos 특성의 올바른 결정은 T 세포를 연구 할 때 없어서는 안될 도구입니다. 그러나 분석 조건이 최적화되지 않은 경우 오해의 소지가 있거나 잘못된 결과가 발생할 위험이 큽니다. 이 프로토콜에서, 사용되는 올리고마이신 및 FCCP의 웰 당 세포 수 및 농도의 최적화에 강한 초점이 있다. 설명된 셋업에서, 올리고마이신 및 FCCP는 동일한 웰에 증분적으로 첨가되어, 미토콘드리아 조절제의 농도를 증가시킨다. 올리고마이신 및 FCCP의 최적 농도는 고원에 도달하는 농도로서 웰의 결과 OCR 곡선으로부터 결정될 수 있다.
대표적인 실행에서, 올리고마이신은 증가하는 농도로 첨가되고 ATP 신타제 (전자 수송 사슬의 콤플렉스 V)를 억제하여, 감소된 미토콘드리아 호흡을 초래한다. OCR의 고원은 웰의 누적 농도가 1 μM에 도달 한 후에 도달합니다. 이러한 농도 및 증가된 농도로부터 OCR은 더 이상 감소되지 않았다(도 1A). 비커플러 FCCP의 증분 농도로 처리된 웰의 경우, 0.2 μM의 FCCP가 첨가된 후 고원에 도달할 때까지 OCR 수준이 예상대로 증가하였고, 이는 이 농도에서 완전한 결합이 얻어졌다는 것을 나타낸다(도 1B). 웰당 플레이팅된 세포의 최적화는 정확하고 재현 가능한 검정을 위해 중요하다. 사용된 세포 수가 너무 낮으면, 세포에 의해 분석 배지로부터 제거된 산소 수준이 너무 낮아서 분석기에 의해 정확하게 측정될 수 없다. 반면에 웰 당 세포 수가 너무 많으면 세포의 산소 소비가 너무 높아서 각 측정 후 시스템이 분석 매체의 산소 수준을 보충 할 수 없게되어 점점 저산소 환경과 잘못된 OxPhos 특성화로 이어질 수 있습니다.
대표적인 실행에서, 세포를 웰 당 200,000 및 400,000 세포의 밀도로 시딩하였다 (도 2A-C). 200,000개의 셀이 있는 실행의 경우 초기 OCR은 웰당 400,000개의 셀이 있는 실행의 약 절반입니다. FCCP 처리의 경우 최대 OCR은 61.6 pmol / min (200,000 세포) 대 190,4 pmol / min (400,000 세포)입니다. 올리고마이신 처리 후, 200,000개의 세포로 실행되는 OCR은 한 자리 OCR(6.4pmol/min)로 붕괴된다. 이것은 올리고마이신으로 처리된 웰 당 400,000개의 세포(각각 25.8 pmol/min)로 실행의 OCR보다 낮다.
따라서, 최적화 실행으로부터, 1 μM 올리고마이신 및 0.2 μM FCCP를 사용하여 미래의 검정을 위해 웰당 400,000 세포의 세포 수가 요구되었다는 것이 명백하다. 제조업체가 권장하는 고전적인 설정에서 올리고 마이신 및 FCCP는 항 마이신 A의 최종 첨가와 함께 순차적으로 첨가됩니다. T 세포의 경우, 올리고마이신 처리가 FCCP 처리 후 결합 해제를 제한하는 것을 알 수 있기 때문에 최적의 접근법이 아님을 알 수 있다(도 3A, B). 이 제시된 방법에서는 각 조건을 중복 웰에서 실행하고 한 웰을 올리고 마이신으로 처리하고 다른 웰을 FCCP로 처리하고 두 웰 모두에 항 마이신 A를 최종 첨가하는 것이 좋습니다. 이러한 접근법을 사용함으로써, 올리고마이신 처리는 FCCP 처리 후 OCR에 영향을 미치지 않는다. 이 접근법은 약물이 순차적으로 첨가되는 고전적인 설정과 동일한 미토콘드리아 특성을 결정할 수있게합니다 (그림 3C)
마지막으로, 사이토카인인 IL-2 및 IL-15의 효과가 생체외 배양된 인간 일차 T 세포의 대사에 분화될 수 있는지 여부를 조사하였다. 실제로, IL-15 배양된 세포는 이전에 보여진 바와 같이1 더 높은 최대 호흡 및 예비 호흡 능력을 보유하였다(도 4A-E). 기저 호흡 및 ATP 생산은 영향을 받지 않았다. 종합하면, 이러한 데이터는 생체외 배양된 인간 일차 T 세포의 미토콘드리아 호흡이 세포외 플럭스 분석기를 사용하여 성공적으로 분석될 수 있음을 보여준다.
도 1: 생체외 배양된 인간 일차 T 세포에서 올리고마이신 억제제 및 FCCP의 적정 동안 측정된 산소 소모율(OCR). (A) 0-1.25 μM의 최종 농도에서 올리고마이신을 단계적으로 적정하는 동안 OCR. (b) 0-0.5 μM 최종 농도에서 FCCP의 단계적 적정 동안 OCR. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 생체외 배양된 인간 일차 T 세포에서의 OCR 측정에 대한 세포 농도의 영향. 생체외 배양된 인간 일차 T 세포의 OCR 측정은 (A) FCCP 또는 (B) 올리고마이신의 주사 후 웰 당 200,000 또는 400,000 세포로 배양하였다. (C) 웰 당 200,000 또는 400,000 세포를 사용하는 인간 일차 T 세포의 기저 호흡, 최대 호흡, ATP 생산 및 예비 호흡 능력. 세 가지 독립적 인 실험을 대표합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 미토콘드리아 조절제의 단일 또는 순차적 주사. (A) 올리고마이신 및 FCCP(a,b) 또는 안티마이신 A(c)를 단일 개별 주사 또는 순차적 주사로서 기준선 및 주사 후 동안 대표적인 OCR 측정. (b) 단일 주사 또는 순차 주사로서 올리고마이신 또는 FCCP의 주사 전(기저 호흡) 또는 주사 후 OCR 값. (C) 주입 및 측정 전략의 개략적 표현. 하나의 독립적 인 실험의 대표 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 사이토카인-분화된 인간 일차 T 세포에서의 미토콘드리아 호흡의 차이. (A-D) 7일 동안 IL-2 또는 IL-15로 배양된 인간 일차 T 세포의 기저 호흡, 최대 호흡, ATP 생산, 및 예비 호흡 능력 (n=3). (e) 올리고마이신 또는 FCCP (a) 또는 안티마이신 A(b)의 주사와 함께 (A-D)의 대표적인 플롯. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 사이토카인 | [재고] | 희석 인자 | [결승전] | |
| 조건 1 | IL-2 | 3 x 106 U/mL | 30,000 | 100 U/mL |
| 조건 2 | IL-15 | 2 x 105 U/mL | 2,000 | 100 U/mL |
표 1: T 세포의 대사 변화를 안내하는데 사용되는 사이토카인 배양물의 제조.
| 올리고마이신 | 증권 시세 표시기 | |||||
| 작업 졸. | 최종 conc. | 집. | 작업 졸. | 최종 conc. | 집. | |
| 포트 A | 5.0 μM | 0.50 μM | 20 μL | 2.0 μM | 0.2 μM | 20 μL |
| 포트 B | 3.0 μM | 0.75 μM | 22 μL | 1.30 μM | 0.3 μM | 22 μL |
| 포트 C | 3.0 μM | 1.0 μM | 24 μL | 1.30 μM | 0.4 μM | 24 μL |
| 포트 D | 3.0 μM | 1.25 μM | 27 μL | 1.30 μM | 0.5 μM | 27 μL |
표 2: 미토콘드리아 억제제 및 조절제의 제조를 위한 전략. 최적화 실행을위한 준비 농도, 작업 농도 및 주입 전략.
| 행동 | 세부 정보 | 측정 세부 정보 |
| 기준선 | 기준선 측정 | 3 측정 |
| 주사 | 포트 A 주입 | 3 측정 |
| 주사 | 포트 B 주입 | 3 측정 |
| 주사 | 포트 C 주입 | 3 측정 |
| 주사 | 포트 D 주입 | 3 측정 |
| 치수를 재다 | 추가 측정 | 선택적 |
표 3: 각각 3개의 측정치가 있는 4개의 주사를 사용하여 미토콘드리아 억제제 및 조절제의 적정을 통한 최적화 실행의 프로토콜 설계.
| 미토콘드리아 산화 인산화의 요소 | 설명 | ||
| 기저 호흡 | 기저 호흡은 미토콘드리아 억제제의 첨가 전에 자극된 T 세포에 의해 소비되는 산소의 속도의 기준선 척도이다. 이는 미토콘드리아 양성자 누출로 인한 세포 ATP 수요를 충족시키기 위해 사용되는 산소 소비의 척도입니다. 이와 같이, ATP 합성 및 양성자 누출을 공급하기 위해 생성된 양성자 전류의 개요를 제공한다. 그러나, 이는 또한 성장 배지에 존재하는 기질, 분석 전의 세포의 자극 및 다른 외인성 인자에 따라 변경될 수 있는 척도이기도 하다. 따라서 기저 호흡은 세포의 세포 대사 상태에 영향을 미치는 것으로 여겨지는 둘 이상의 다른 세포 유형 및 / 또는 다른 치료법을 비교하는 데 사용되는 측정입니다. 기저 호흡은 미토콘드리아 조절제 (올리고마이신 또는 FCCP)를 추가하기 전과 안티마이신 A를 첨가 한 후 OCR의 차이로 계산됩니다. |
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| 최대 호흡 | 이 측정은 산화 인산화를 위해 소비 될 수있는 산소의 최대 속도입니다. 산화적 인산화에 의해 소비되는 산소의 속도는 미토콘드리아 내부 막을 가로질러 양성자를 펌핑하는 전자 수송 사슬의 능력과 ADP로부터 ATP를 인산화하기 위해 양성자 구배를 사용하는 ATP 신타제의 능력에 의해 결정된다. ATP 합성효소의 속도는 자유 ADP 기질에 의해 제한되고, 이에 의해 세포의 일반적인 에너지 상태에 의해 제한된다. 세포를 미토콘드리아 언커플러 FCCP로 치료할 때, 양성자는 미토콘드리아 내부 막을 가로질러 자유롭게 다시 횡단할 수 있다. 이것은 세포가 불포화 에너지 수요를 경험하는 상황을 모방하며, 따라서 최대 호흡은 전자 수송 사슬에 의해 소비 될 수있는 최대 산소 속도의 척도입니다. 최대 호흡은 FCCP로 처리된 세포와 항마이신 A로 처리된 세포의 OCR의 차이로서 계산된다. |
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| ATP 매출액 | ATP 결합 호흡은 올리고마이신을 이용한 ATP 합성효소의 억제 후 OCR의 차이로서 측정된다. 산화적 인산화에 의한 ADP의 인산화를 위해 소비되는 산소는 이 과정이 정지됨에 따라 더 이상 사용되지 않을 것이다. 따라서 ATP 결합 호흡은 산화적 인산화에 의해 생성된 ATP에 상대적이다. AT 연결 호흡의 변화는 세포의 변경된 ATP 요구에 대한 미토콘드리아의 반응입니다. ATP 연결 호흡은 미토콘드리아 조절제 (올리고마이신 또는 FCCP)를 추가하기 전과 올리고마이신을 첨가한 후 OCR의 차이로 계산됩니다. |
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| 여분의 호흡 능력 | 예비 호흡 용량은 증가 된 에너지 수요에 대한 응답으로 ATP를 생산하기위한 이론적 인 추가 용량의 척도입니다. 그것은 기저 호흡과 최대 호흡의 차이로 정의됩니다. 예비 호흡 능력의 변화는 미토콘드리아 및 세포 적합성 및 유연성의 지표가 될 수 있습니다. | ||
표 4: 플럭스 분석기를 사용하여 연구되는 미토콘드리아 호흡의 다양한 성분에 대한 설명
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Discussion
산화 인산화의 상세하고 정확한 정량화는 T 세포의 에너지 상태를 설명 할 때 없어서는 안될 도구입니다. 미토콘드리아 적합성의 상태는 T 세포 활성화 잠재력, 생존 및 분화와 직접적으로 관련될 수 있다1,5. 이러한 프로토콜을 이용하면, 산화적 인산화의 다양한 특성을 확인할 수 있다(자세한 설명은 표 4 참조). 산화 인산화의 이러한 특성의 정확한 정량화는 T 세포의 에너지 상태에 대한 상세한 통찰력을 제공합니다. 그러나 신뢰할 수 있는 결과를 얻으려면 실험을 설정할 때 세심한 주의를 기울여야 합니다.
이 프로토콜에서는 다음 세 가지 최적화 단계가 먼저 셀 번호를 최적화하는 것이 좋습니다. 산소 농도를 정확하게 측정하는 플럭스 분석기의 능력은 시그모이드 곡선을 따릅니다. 너무 작거나 너무 큰 산소의 변화는 기계의 작동 간격을 벗어나므로 올바르게 측정되지 않습니다. 이를 위해서는 전체 실험에서 사용할 셀 번호의 최적화가 필요합니다. 너무 적은 수의 세포가 분석되면 산소 소비의 변화가 너무 낮아 정확하게 측정 할 수 없습니다. 세포가 너무 많으면, 분석 매질에서 산소 고갈의 위험이 있다. 따라서 초기 실행이 권장되며, 셀 수는 웰당 100,000-400,000개 셀입니다. 세포 수 대 기저 호흡을 플로팅 할 때, 최적의 세포 수는 곡선의 선형 범위에있을 것입니다. 설정을 최적화 할 때, 휴식과 활성화 된 세포 사이에 미토콘드리아 활성에 기하 급수적 인 차이가있을 수 있으므로 그에 따라 최적화해야합니다.
둘째, 억제제 농도의 적정. 세포를 올리고마이신 및 FCCP로 치료할 때, 사용되는 억제제의 최적 농도를 확인하는 것이 중요하다. 너무 낮은 농도는 차선책의 억제와 미토콘드리아 호흡의 잘못된 측정을 초래할 것이다. 사람들은 완전한 억제가 얻어지도록 보장하기 위해 억제제의 가장 높은 권장 농도를 사용하는 것이 일반적입니다. 이것은 또한 억제제의 너무 높은 농도가 pleiotropic 효과를 가질 수 있기 때문에 문제가됩니다. FCCP와 같은 언커플러는 또한 미토콘드리아 이외의 막에 영향을 미치므로 원형질막 탈분극, 미토콘드리아 억제 및 세포 독성을 포함한 다양한 바람직하지 않은 효과를 초래합니다. 이 프로토콜에서, 올리고마이신 및 FCCP의 적정은 세포 수 최적화와 동시에 수행된다. 최적화 실행 동안, 올리고마이신 또는 FCCP의 증가된 농도는 네 개의 이용가능한 기질 포트를 사용하여 첨가된다. 생성된 OCR 다이어그램에서, 최적 농도는 OCR이 꾸준한 고원에 도달하는 농도로서 시각적으로 결정될 수 있다. 일단 올리고마이신 및 FCCP의 농도가 적정되면, 이들 농도는 실험 전반에 걸쳐 사용되어야 한다.
셋째, 억제제의 순차적 대 단일 개별 첨가. 고전적인 Seahorse 분석은 전형적으로 FCCP의 첨가에 이어 첫 번째 올리고마이신의 순차적 첨가로 수행된다. T 세포 및 다른 민감한 세포에서, 이러한 순차적 첨가는 최대 호흡의 잘못된 정량화를 초래할 수 있다. 차례로, 예비 호흡 용량의 측정 된 수준은 그들보다 낮은보고됩니다. 이것의 중대한 예에는 음성인 예비 호흡 능력의 값이 포함된다. 이것은 물론 생물학적으로 가능하지 않으며 올리고마이신 처리에 의한 미토콘드리아의 사전 감작화에 의해 유발된다. 이 프로토콜에서, 세포는 올리고마이신 또는 FCCP로만 처리되는 것이 좋습니다 (예시적인 비교를 위해 도 3C 참조).
마지막으로, 이 최적화된 프로토콜은 IL-15-보충된 인간 일차 T 세포 배양물이 그들의 미토콘드리아 호흡에 기초하여 IL-2-보충된 세포와 명확하게 구별될 수 있는 방법을 보여주기 위해 사용된다. IL-15-배양된 세포는 기억 T 세포1,6에 연결된 대사 상태인 더 높은 최대 호흡 및 예비 호흡 능력을 보유한다. 이러한 관찰은 IL-15를 기억 T 세포 서브세트8에 연결시키는 이전의 연구들과 일치한다. 또한, IL-2 배양된 세포와 비교하였을 때 기저 호흡에 차이가 있으나 ATP 생산에서는 나타나지 않았다. 이것은 이들 세포가 더 분화된 세포와 관련된 경로인 기초 대사 요구를 준수하기 위해 그들의 글리콜 능력을 사용한다는 것을 나타낸다. 종합하면, 인간 기억 T 세포 모델이 IL-15 보충을 사용하여 시험관내에서 확립될 수 있음을 보여준다. 기억 세포의 발달을 촉진하기 위해 IL-15가 풍부한 환경을 사용하는 것은 이전에 입증되었으며 그 발견을 더욱 뒷받침한다8.
이 방법에서, 올리고마이신, FCCP 및 안티마이신 A는 옥포스의 특성을 정량화하는데 사용되었다. 유사한 효과를 갖는 다른 화합물이 존재하며, 이는 잠재적으로 T 세포에 더 적합할 것이다. 예를 들어 FCCP 대신 언커플러 BAM15를 사용하여 미토콘드리아 막의 탈분극을 감소시키고 세포독성을 피하는 것입니다9. 이 방법에서, 올리고마이신, FCCP 및 안티마이신 A가 지난 십 년 동안 해마 실험에 권장된 미토콘드리아 조절제였기 때문에, 이들 화합물은 고려되지 않았다. 따라서 이러한 화합물의 사용은 OxPhos와 함께 일하는 검토자 및 다른 연구자들에 의해 인정됩니다. Seahorse flux 분석기의보다 숙련 된 사용자는 이러한 대체 화합물을 사용하는 것이 좋지만 이러한 화합물의 사용은이 논문의 범위를 벗어납니다.
미토콘드리아 OxPhos 모니터링은 T 세포 기능을 이해하고 암 면역 요법을 개선하는 데 필수적인 도구입니다. 앞서 언급한 바와 같이, IL-15 확장 세포는- 덜 분화된 기억 표현형을 갖는- CAR T 세포 요법에 대한 반응을 개선하는 것으로 나타났는데, 이는 이들이 덜 고갈되고 증가된 항종양 활성을 갖기 때문이다10. 이 최적화 된 프로토콜은 전임상 및 임상 환경 모두에서 T 세포의 품질을 연구하는 효과적인 도구가 될 수 있습니다. 결론적으로, 이 프로토콜은 대사 분석에서 생체외 배양된 인간 일차 T 세포의 사용을 위한 세포 수 및 저해제 농도를 최적화하기 위한 단계를 구현한다.
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Disclosures
저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
Kasper Mølgaard와 Anne Rahbech는 Tømmermester Jørgen Holm og Hustru Elisa f. Hansens Mindelegat로부터 보조금을 받았습니다. Kasper Mølgaard또한 Børnecancerfonden으로부터 보조금을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well tissue culture plate | Nunc | 142485 | |
| Anti-CD3xCD28 beads | Gibco | 11161D | |
| Antimycin A | Merck | A8674 | |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)-phenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Cell-Tak | Corning | 354240 | For coating |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D9170 | |
| Human Serum | Sigma Aldrich | H4522 | Heat inactivated at 56 °C for 30 min |
| IL-15 | Peprotech | 200-02 | |
| IL-2 | Peprotech | 200-15 | |
| Lymphoprep | Stemcell Technologies | 07801 | |
| Oligomycin | Merck | O4876 | |
| PBS | Thermo Fisher | 10010023 | |
| RPMI 1640 | Gibco-Thermo Fisher | 61870036 | |
| Seahorse Calibrant | Agilent Technologies | 102416-100 | |
| Seahorse XF 1.0 M glucose solution | Agilent Technologies | 103577-100 | |
| Seahorse XF 100 mM pytuvate solution | Agilent Technologies | 103578-100 | |
| Seahorse XF 200 mM glutamine solution | Agilent Technologies | 103579-100 | |
| Seahorse XF RPMI medium, pH7.4 | Agilent Technologies | 103576-100 | XF RPMI media |
| Seahorse XFe96 Analyser | Agilent Technologies | Flux analyzer | |
| Seahorse XFe96 cell culture microplates | Agilent Technologies | 102416-100 | XF cell culture plate |
| Seahorse XFe96 sensor cartridge | Agilent Technologies | 102416-100 | |
| Sodium Bicarbonate concentrate 0.1 M (NaHCO3) | Sigma Aldrich | 36486 | |
| Sodium Hydroxide solution 1 N (NaOH) | Sigma Aldrich | S2770-100ML | |
| X-VIVO 15 | Lonza | BE02-060F | |
| T cell beads magnet DynaMag-2 Magnet | Thermo Fisher | 12321D | |
| Seahorse wave | Flux analyzer software |
References
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- Krauss, S., Brand, M. D., Buttgereit, F. Signaling takes a breath--new quantitative perspectives on bioenergetics and signal transduction. Immunity. 15 (4), 497-502 (2001).
- vander Windt, G. J. W., et al. CD8 memory T cells have a bioenergetic advantage that underlies their rapid recall ability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (35), 14336-14341 (2013).
- Chang, C. -H., et al. Posttranscriptional control of T cell effector function by aerobic glycolysis. Cell. 153 (6), 1239-1251 (2013).
- vander Windt, G. J. W., Chang, C. -H., Pearce, E. L. Measuring bioenergetics in T cells using a Seahorse extracellular flux analyzer. Current Protocols in Immunology. 113, 1-14 (2016).
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