Summary
Metabolsk tilpasning er grunnleggende for T-celler da det dikterer differensiering, utholdenhet og cytotoksisitet. Her presenteres en optimalisert protokoll for overvåking av mitokondrie-respirasjon i ex vivo cytokin-differensierte primære T-celler.
Abstract
Under aktivering tilpasser metabolismen av T-celler seg til endringer som påvirker deres skjebne. En økning i mitokondrie oksidativ fosforylering er uunnværlig for T-celleaktivering, og overlevelsen av minne T-celler er avhengig av mitokondrieoppussing. Dette påvirker derfor det langsiktige kliniske utfallet av kreftimmunoterapi. Endringer i T-cellekvaliteten studeres ofte av strømningscytometri ved hjelp av kjente overflatemarkører og ikke direkte av deres metabolske tilstand. Dette er en optimalisert protokoll for måling av mitokondrie-respirasjon i sanntid av primære humane T-celler ved hjelp av en ekstracellulær fluksanalysator og cytokinene IL-2 og IL-15, som forskjellig påvirker T-cellemetabolismen. Det er vist at den metabolske tilstanden til T-celler tydelig kan skille seg ut ved å måle oksygenforbruket når du hemmer nøkkelkomplekser i metabolsk vei, og at nøyaktigheten av disse målingene er svært avhengig av optimal hemmerkonsentrasjon og hemmerinjeksjonsstrategi. Denne standardiserte protokollen vil bidra til å implementere mitokondrie respirasjon som en standard for T-celle fitness i overvåking og studier av kreft immunterapi.
Introduction
Riktig T-celleutvikling og funksjon er avgjørende for immunsystemets evne til å gjenkjenne og reagere på antigener. Mitokondrie oksidativ fosforylering (OxPhos) endres i henhold til tilstanden til T-cellen. Naive T-celler bruker hovedsakelig OxPhos til å produsere ATP, mens aktiverte T-celler gjennomgår en metabolsk overgang der glykolyse blir dominerende1. Etter effektorfasen går den lille gjenværende undergruppen av minne T-celler tilbake til en metabolsk tilstand dominert av OxPhos2,3. Endringene i OxPhos følger differensiering av T-celler i en slik grad at selv undergrupper av T-celler kan differensieres av deres spesifikke er OxPhos egenskaper1. På den annen side er OxPhos viktig for T-cellenes funksjon, og hemming av OxPhos har vist seg å blokkere spredning og cytokinproduksjon av T-celler4. Derfor er evnen til å kvantifisere egenskapene til T-cellen OxPhos på en presis og reproduserbar måte et kraftig verktøy for alle som arbeider med T-celler.
I denne protokollen måles egenskapene til T-cellen OxPhos ved hjelp av en ekstracellulær fluksanalysator. Kjernefunksjonen til denne analysatoren er å kontinuerlig måle oksygeninnholdet i vekstmediet til cellene som skal analyseres. Oksygen fjernet fra vekstmediet antas å bli tatt opp av cellene. Ved å behandle cellene med en rekke OxPhos-hemmere eller modifikatorer, er en dråpe i oksygenopptak forbundet med den hemmet eller modulerte funksjonen. For eksempel vil hemming av ATP-syntasen føre til redusert cellulært opptak av oksygen som ellers ville bli brukt til å produsere ATP ved oksidativ fosforylering. Annet utstyr, inkludert Clark-elektroden og Oroboros-instrumentet, tilbyr lignende funksjonalitet, og hvert instrument har forskjellige fordeler og mangler. Et bredt utvalg av celletyper kan brukes til studier i disse enhetene, men en spesielt utfordrende celletype er human primær T-lymfocytter5. På grunn av sin lille størrelse, dårlige overlevelse ex vivo, og ikke-tilhenger egenskaper, kan menneskelige primære T-celler være utfordrende å studere.
Dette er en protokoll for å studere mitokondrie respirasjon av menneskelige primære T-celler av en ekstracellulær analysator. Protokollen er delt inn i en optimaliseringskjøring, hvor optimale konsentrasjoner av cellenummer per brønn, samt den optimale konsentrasjonen av oligomycin og FCCP, bestemmes. Videre et analyseløp, der de optimaliserte forholdene brukes.
Ved hjelp av blodavledede menneskelige PBMCer og ex vivo primære T-cellekulturer, viser denne protokollen viktigheten av optimal inhibitorkonsentrasjon og relevansen av å bruke separat i stedet for en sekvensiell injeksjon av mitokondriehemmere når du arbeider med sensitive celletyper. Til slutt er det demonstrert at denne analysen robust kan oppdage subtile forskjeller i mitokondrie respirasjon ved polarisering med cytokiner IL-2 og IL-15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Eksperimenter ble utført i henhold til retningslinjene fra Herlev Hospital og Hovedstadsregionen i Danmark.
MERK: Denne protokollen inneholder instruksjoner for både en optimaliseringskjøring og en analysekjøring. Det er tydelig skrevet i teksten når instruksjonene er for en optimalisering kjøre eller en analyse kjøre. Kjør en optimaliseringskjøring før du fortsetter med analysene
1. Human perifer mononukleær (PBMC) isolasjon fra buffy strøk
- PBMC-isolasjon
- Samle buffy strøk fra riktig institusjon (samlet i blodoppsamlingsposer). Buffy coats stammer fra friske donorer. Ekskluder donorer som nylig har brukt smertestillende midler.
- Spray blodoppsamlingsposen som inneholder den buffy kappen med 70% etanol før du overfører til et laminært strømningsskap. Bruk alltid sterile teknikker og steril maskinvare for alle trinn
MERK: Forsikre deg om at de riktige autorisasjonene for håndtering av menneskelige blodprøver er innhentet. - Overfør blodet til et sterilt 50 ml sentrifugerør.
- Fortynn blodet minst 10% med ikke-supplert RPMI 1640.
- Hell 20 ml av det foretrukne tetthetsgradientmediet i et 50 ml sentrifugerør.
- Aspirat 25 ml av det fortynnede blodet i en serologisk pipette. Sett den elektriske pipettekontrolleren til laveste hastighet.
- Hold røret med tetthetsgradientmedium i en 45° vinkel og hvil den serologiske pipettespissen på innsiden av 50 ml sentrifugerøret. Slipp sakte ut 25 ml av det fortynnede blodet fra den serologiske pipetten.
- Pass på at det fortynnede blodet og tetthetsgradientmediet ikke blandes. Pass på at det fortynnede blodet hviler på toppen av tetthetsgradientmediet.
- Gjenta dette med påfølgende tetthet gradient middels rør til alt fortynnet blod er behandlet.
- Flytt rørene forsiktig til en sentrifuge og sentrifuge ved 1000 x g i 30 minutter i en utsvingsrotor ved romtemperatur (RT). Forsikre deg om at akselerasjonen og pausen er på et minimum.
MERK: Etter sentrifugering skal ulike lag være synlige. Det øverste, klare rosa-til-oransje laget består av blodplasma og blodplater. Det midterste hvite laget består av PBMC-ene etterfulgt av et klart lag som består av tetthetsgradientmediet, og til slutt et mørkt rødt lag nederst med røde blodlegemer. - Bruk en steril Pasteur pipette for å aspirere det PBMC-inneholdende hvite laget forsiktig til et 50 ml sentrifugerør.
MERK: Pass på at du ikke overfører tetthetsgradientmediet, da dette vil påvirke nedstrøms rensing. Overflødig plasma vil ikke påvirke resultatene. - Pool alle samlet PBMCs i samme 50 ml sentrifuge rør og topp opp til 50 ml med RPMI 1640.
- Sentrifuger cellene på 500 x g i 5 min ved RT (utfør de resterende sentrifugeringstrinnene ved denne innstillingen med mindre annet er spesifisert).
- Aspirer supernatanten og resuspend cellene i 30 ml RPMI 1640. Tell cellene ved hjelp av et hemocytometer eller automatisert celleteller.
- For kryopreservering, resuspend maksimalt 30 millioner celler per 1 ml frysemedium.
- Overfør cellene til kryorør og frys til -80 °C ved hjelp av en hastighetskontrollert frysebeholder (-1 °C per min). For langtidslagring, flytt PBMC-ene til -140 °C.
MERK: Begrens tiden cellene er i frysemediet på RT. Ved RT er DMSO svært giftig for celler.
2. Culturing av aktiverte humane primære T-lymfocytter
- Opptining av celler (dag 1)
- Forvarm 10 ml RPMI 1640 per prøve til rundt 37 °C.
- Ta ønsket antall celleampuller og oppbevar dem midlertidig på tørris.
- Resuspend de frosne cellene i 10 ml forvarmet RPMI 1640.
- Sentrifuger cellene i 5 min ved 500 x g ved RT.
- Kast supernatanten og vask cellene igjen ved å resuspendere i 10 ml RPMI 1640 og sentrifuge som beskrevet i 2.1.4.
- Kast supernatanten og resuspend cellene ved 2 x 106 celler per ml X-VIVO 15 medium + 5% menneskelig serum (heretter: T cellemedium).
- Plate 2 ml av cellene per brønn i en 24-brønns cellekulturplate og inkuberer over natten ved 37 °C og 5 % CO2.
- Aktivering av celler (dag 0)
- Vask CD3/CD28 perler ved å overføre 12,5 μL per 1 million celler til et mikrosenterrør. Tilsett 12,5 μL PBS per 12,5 μL perler.
MERK: Det er viktig å virvelere hetteglasset med perler før bruk. - Plasser mikrocentrifugerøret på en passende magnet i 1 min.
- Kast bufferen og resuspend perlene i det opprinnelige volumet av T-cellemedium (12,5 μL T-cellemedium per 12,5 μL av det opprinnelige volumet av perler).
- Tilsett 12,5 μL per million celler som tilsvarer et forhold på 1:2 (perler: celler).
- Del cellene i to forhold med rundt 5 millioner celler i hver.
- Tilsett riktig volum cytokiner i forholdene som nevnt i tabell 1.
- Inkuber cellene i 3 dager ved 37 °C og 5 % CO2.
- Vask CD3/CD28 perler ved å overføre 12,5 μL per 1 million celler til et mikrosenterrør. Tilsett 12,5 μL PBS per 12,5 μL perler.
- Dyrking av celler (dag 3 og 5)
- Resuspend cellene og dele dem ved å overføre halvparten av volumet fra hver brønn til en ny brønn. Tilsett samme volum fersk T-cellemedium i hver brønn.
- Tilsett nye cytokiner i hver tilstand som nevnt i tabell 1.
3. Ekstracellulær fluksanalyse
- Hydrering av sensorpatronen (dag 0)
- Pakk ut sensorpatronen og fjern sensorkassetten forsiktig fra strømplaten.
- Plasser sensorkassetten opp-ned, pass på at du ikke berører sensorsondene.
- Fyll bruksplaten med 200 μL kalibrant (se Materialtabell for detaljer) og sett sensorpatronen forsiktig tilbake i bruksplaten.
- Alternativt, for å eliminere enhver bobleformasjon, inkuber sensorpatronen i sterilt ultrarent vann over natten og erstatt den med en forvarmet kalibrant om morgenen på analysen.
- Inkuber sensorpatronplaten ved 37 °C i et ikke-CO2-regulert varmeskap over natten.
MERK: Det er svært viktig å bruke et ikke-CO2-regulert skap siden overflødig CO2 vil påvirke sensorpatronen. Kontroller at Flux-analysatoren (se Materialfortegnelse for detaljer) er slått på minst én dag før bruk for å la den varme opp til 37 °C.
- Cellebelegg og tilberedning av mitokondriehemmere (dag 1)
- Forbered en beleggløsning (se Materialtabell) som inneholder NaHCO3 (pH 8,3, 0,1 M, 1128 μL), Cell-Tak (1 mg/ml, 48 μL) og NaOH (1,0 M, 24 μL).
MERK: Beleggløsning skal alltid gjøres og brukes friskt. - Åpne en frisk XF-cellekulturplate og tilsett 12 μL av den nylagde beleggløsningen til hver brønn. Sørg for jevn fordeling av beleggløsning i bunnen av alle brønnene.
- Inkuber platen på RT med lokket på i 30 min og kast den gjenværende væskeløsningen fra alle brønnene.
- Vask platen med 200 μL sterilt vann og kast væsken.
- Vask platen med 200 μL cellekultur klasse steril PBS og kast væsken.
- La platen stå på RT og la den tørke i minst 30 min.
- Forbered en beleggløsning (se Materialtabell) som inneholder NaHCO3 (pH 8,3, 0,1 M, 1128 μL), Cell-Tak (1 mg/ml, 48 μL) og NaOH (1,0 M, 24 μL).
- Plate T-celler i XF-cellekulturplaten (dag 1)
- Forbered 50 ml analysemedier ved å blande egnede XF RPMI-medier med glukose, pyruvat og glutamin i henhold til eksperimentelt oppsett (Anbefalte nivåer: 4 mM glukose, 1 mM pyruvat og 3 mM glutamin).
- Varm opp til 37 °C i en ikke-CO2-regulert inkubator og sett pH på 7,4. Sørg for at det er nok medier til å plate celler og forberede oligomycin- og FCCP-løsninger (avsnitt 3.4).
- Design et plateoppsett med et økende antall celler per brønn for optimaliseringskjøring eller analysekjøring. Bruk fire 4 brønner, fylt med medier og injisert med media, for bakgrunnsmålinger.
- Tell T-celler fremstilt i avsnitt 2.3 (ved foretrukket metode) og pipette riktig antall celler til hver brønn av XF-cellekulturplaten belagt med beleggløsningen, i henhold til plateoppsettet.
MERK: Det endelige volumet på hver brønn kan variere, men må være nok til å dekke bunnen av brønnen. - Sentrifuger XF-cellekulturplaten ved 1000 x g ved RT i 10 minutter for å feste T-cellen til den belagte overflaten.
- Vask cellene med 200 μL analysemedier, kast mediet og tilsett 180 μL analysemedier.
MERK: Inspiser brønnene visuelt ved hjelp av et invertert lysmikroskop for å sikre at cellene er festet og jevnt fordelt over brønnoverflaten. - Inkuber XF-cellekulturplaten i det ikke-CO2-regulerte varmeskapet i 30 minutter for å sikre at platens temperatur er 37 °C.
- Lastesensorpatron med oligomycin og FCCP for optimaliseringskjøring (dag 1)
MERK: Hvis konsentrasjonene oligomycin og FCCP allerede var optimalisert, fortsetter du i pkt. 3.5.- Forbered arbeidsløsninger for oligomycin og FCCP i analysemedier (utarbeidet i trinn 3.3.1) som beskrevet i trinn 3.4.2 og 3.4.3.
- Oligomycin arbeidsløsninger: lag 5 μM løsning (2 ml analysemedier + 10 μL 1 mM oligomycin lager) og 3 μM løsning (8 ml analysemedier + 24 μL 1 mM oligomycin lager).
- FCCP arbeidsløsning: Forbered 2 μM-løsning (2 ml analysemedier + 13,2 μL 300 μM FCCP-lager) og en 1,3 μM-løsning (8 ml analysemedier + 34,6 μL 300 μM FCCP-lager)
- Legg arbeidsløsningene til enten oligomycin eller FCCP i injeksjonsportene på sensorkassetten (tabell 2).
NOTAT. Det er viktig at ingen injeksjonsporter bare inneholder luft. Hvis ikke alle injeksjonsporter av en eller annen grunn brukes, må tomme porter fylles med analysemedier. - Bank forsiktig kantene på platen på bordet for å fjerne potensielle bobler i injeksjonsportene.
- Lastesensorpatron med oligomycin, FCCP og antimycin A for analysekjøring (dag 1)
- Forbered løsninger av oligomycin, FCCP i analysemedier (utarbeidet i trinn 3.3.1) i henhold til de optimale konsentrasjonene som er identifisert i en tidligere optimaliseringskjøring. Lag også en 20 μM antimycin A-løsning.
- Legg 20 μL av enten oligomycin eller FCCP i injeksjonsport A på sensorpatronen i henhold til plateoppsettet. Tilsett 22 μL 20 μM antimycin A til injeksjonsport B av alle brønner. Den resulterende konsentrasjonen av antimycin A som en gang ble injisert i brønnen, vil være 2 μM.
- Sette opp eksperimentell protokoll i Flux-analysatorprogramvare.
- Tilordne gruppene og platekartet for hver betingelse per plateoppsett.
- Utform protokollen i henhold til injeksjonsstrategien (tabell 3 og figur 1).
MERK: Når du kjører analysekjøringer, kan injeksjon C og D utelates. - Lagre analyseoppsettet, fyll ut informasjonen som kreves for å bli inkludert for analysen, og trykk på Start.
- Fluksanalysatoren vil be om sensorpatronen som er klargjort i avsnitt 3.5. Ta av lokket og sett inn sensorpatronen som anvist av analysatoren.
MERK: Analysen kalibrerer og kontrollerer sensorer som indikeres av merker. Etter vellykket kalibrering vil analysatoren be om XF-cellekulturplaten som er utarbeidet i avsnitt 3.3. Verktøyplaten kastes ut av analysatoren og erstattes med XF-cellekulturplaten for å starte analysen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En riktig bestemmelse av OxPhos egenskaper er et uunnværlig verktøy når du studerer T-celler. Men hvis analyseforholdene ikke er optimalisert, er det en betydelig risiko for villedende eller feilaktige resultater. I denne protokollen er det et sterkt fokus på optimalisering av cellenummer per brønn og konsentrasjoner av oligomycin og FCCP som skal brukes. I det beskrevne oppsettet tilsettes oligomycin og FCCP trinnvis til samme brønn, noe som øker konsentrasjonen av mitokondriemodulatorene. Den optimale konsentrasjonen av oligomycin og FCCP kan bestemmes ut fra brønnenes resulterende OCR-kurver som konsentrasjonen der et platå nås.
I det representative løpet tilsettes oligomycin i en økende konsentrasjon og hemmer ATP-syntase (Kompleks V i elektrontransportkjeden), noe som resulterer i redusert mitokondrie-respirasjon. Et platå i OCR nås etter at den akkumulerende konsentrasjonen av brønnene nådde 1 μM. Fra denne konsentrasjonen og økende konsentrasjoner ble OCR ikke redusert ytterligere (figur 1A). For brønner behandlet med en inkrementell konsentrasjon av uncoupler FCCP, økte OCR-nivåene som forventet til de nådde et platå etter at 0,2 μM FCCP ble tilsatt, noe som indikerer at ved denne konsentrasjonen ble full frakobling oppnådd (figur 1B). Optimalisering av celler belagt per brønn er viktig for en korrekt og reproduserbar analyse. Hvis det brukte cellenummeret er for lavt, er oksygennivået som fjernes fra analysemediet av cellene for lavt til å måles riktig av analysatoren. På den annen side, hvis antall celler per brønn er for høyt, kan oksygenforbruket av cellene bli så høyt at systemet ikke kan fylle opp oksygennivåene til analysemediet etter hver måling, noe som fører til et stadig mer hypoksisk miljø og feilaktig OxPhos-karakterisering.
I det representative løpet ble cellene sådd med en tetthet på 200 000 og 400 000 celler per brønn (figur 2A-C). For en løpetur med 200 000 celler er den første OCR omtrent halvparten av et løp med 400 000 celler per brønn. For FCCP-behandling er maksimal OCR 61,6 pmol/min (200 000 celler) versus 190 4 pmol/min (400 000 celler). Etter oligomycinbehandling kollapser OCR i oppkjøringen med 200 000 celler i ensifret OCR (6,4 pmol/min). Dette er lavere enn OCR i løpet, med 400.000 celler per godt behandlet med oligomycin (henholdsvis 25.8 pmol/min).
Derfor, fra optimaliseringskjøringen, er det klart at et cellenummer på 400.000 celler per brønn var nødvendig for fremtidige analyser, ved hjelp av 1 μM oligomycin og 0,2 μM FCCP. I det klassiske oppsettet anbefalt av produsenten, legges oligomycin og FCCP sekvensielt med det endelige tilskuddet av antimycin A. For T-celler er dette ikke den optimale tilnærmingen, da oligomycinbehandlingen kan sees for å begrense frakoblingen etter FCCP-behandling (figur 3A, B). I denne presenterte metoden anbefales det å kjøre hver tilstand i dupliserte brønner og behandle den ene brønnen med oligomycin og den andre med FCCP, med et endelig tillegg av antimycin A for begge brønnene. Ved å bruke denne tilnærmingen påvirker oligomycinbehandlingen ikke OCR etter FCCP-behandling. Denne tilnærmingen gjør det mulig å bestemme de samme mitokondrieegenskapene som det klassiske oppsettet, hvor legemidler tilsetts i rekkefølge (figur 3C)
Til slutt ble det undersøkt om effekten av cytokiner IL-2 og IL-15 kunne differensieres på metabolismen av ex vivo dyrket menneskelige primære T-celler. Faktisk hadde IL-15-dyrkede celler høyere maksimal åndedretts- og ekstra åndedrettskapasitet, som vist før1 (figur 4A-E). Basal respirasjon og ATP-produksjon ble ikke påvirket. Samlet viser disse dataene at mitokondrie-respirasjonen av eks vivo-dyrkede humane primære T-celler kan analyseres ved hjelp av den ekstracellulære fluksanalysatoren.
Figur 1: Oksygenforbruk (OCR) målt under titrering av inhibitorer oligomycin og FCCP i eks vivo dyrket humane primære T-celler. (A) OCR under trinnvis titrering av oligomycin fra 0-1,25 μM sluttkonsentrasjon. (B) OCR under trinnvis titrering av FCCP fra 0-0,5 μM endelig konsentrasjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Påvirkningen av cellekonsentrasjon på OCR-målinger i ex vivo-dyrkede primære T-celler. OCR-målinger av ex vivo dyrket humane primære T-celler med 200.000 eller 400.000 celler per brønn etter injeksjon av enten (A) FCCP eller (B) Oligomycin. (C) Basal respirasjon, maksimal åndedrettsvern, ATP-produksjon og ledig åndedrettskapasitet for humane primære T-celler som bruker 200.000 eller 400.000 celler per brønn. Representant for tre uavhengige eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Enkel eller sekvensiell injeksjon av mitokondriemodulatorer. (A) Representative OCR-målinger under baseline og etter injeksjon av oligomycin og FCCP (a,b) eller antimycin A (c) som enkeltinjeksjoner eller som sekvensielle injeksjoner. (B) OCR-verdier før injeksjon (basal respirasjon) eller etter injeksjon av oligomycin eller FCCP som enkeltinjeksjoner eller sekvensielle injeksjoner. (C) Skjematisk representasjon av injeksjons- og målestrategi. Representant for ett uavhengig eksperiment Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Forskjeller i mitokondrie respirasjon i cytokin-differensierte humane primære T-celler. (A-D) Basal respirasjon, maksimal respirasjon, ATP-produksjon og ekstra åndedrettskapasitet for humane primære T-celler dyrket med IL-2 eller IL-15 i syv dager (n = 3). (E) Representative plott av (A-D), med injeksjoner av Oligomycin eller FCCP (a) eller antimycin A (b). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Cytokin | [Lager] | Fortynningsfaktor | [Endelig] | |
| Tilstand 1 | IL-2 | 3 x 106 U/ml | 30,000 | 100 U/ml |
| Betingelse 2 | IL-15 | 2 x 105 U/ml | 2,000 | 100 U/ml |
Tabell 1: Fremstilling av cytokinkulturer som brukes til å veilede metabolske endringer i T-celler.
| Oligomycin | FCCP | |||||
| Fungerende sol. | Siste innrømmelse. | Vol. | Fungerende sol. | Siste innrømmelse. | Vol. | |
| Port A | 5,0 μM | 0,50 μM | 20 μL | 2,0 μM | 0,2 μM | 20 μL |
| Port B | 3,0 μM | 0,75 μM | 22 μL | 1,30 μM | 0,3 μM | 22 μL |
| Port C | 3,0 μM | 1,0 μM | 24 μL | 1,30 μM | 0,4 μM | 24 μL |
| Port D | 3,0 μM | 1,25 μM | 27 μL | 1,30 μM | 0,5 μM | 27 μL |
Tabell 2: Strategi for fremstilling av mitokondriehemmere og modulatorer. Forberedelseskonsentrasjoner, arbeidskonsentrasjoner og injeksjonsstrategier for en optimaliseringskjøring.
| Handling | Detaljer | Detaljer for måling |
| Grunnlinje | Planlagte mål | 3 målinger |
| Innsprøytning | Port A injeksjon | 3 målinger |
| Innsprøytning | Port B injeksjon | 3 målinger |
| Innsprøytning | Port C-injeksjon | 3 målinger |
| Innsprøytning | Port D injeksjon | 3 målinger |
| Måle | Flere målinger | Valgfri |
Tabell 3: Protokollutforming av et optimeringsløp med titrering av mitokondriehemmere og modulatorer ved bruk av 4 injeksjoner med 3 målinger i hver.
| Element av mitokondrie oksidativ fosforylering | Forklaring | ||
| Basal åndedrett | Basal respirasjon er et grunnleggende mål på oksygenhastigheten som forbrukes av de stimulerte T-cellene før tilsetning av mitokondriehemmere. Det er et mål på oksygenforbruket som brukes til å møte cellulær ATP-etterspørsel som følge av mitokondrie protonlekkasje. Som sådan gir den en oversikt over protonstrømmen som genereres for å levere ATP-syntese og protonlekkasje. Det er imidlertid også et tiltak som kan endres avhengig av substratene som finnes i vekstmediene, stimulering av celler før analyse og andre ekstrinsiske faktorer. Basal respirasjon er derfor et tiltak som brukes til å sammenligne to eller flere forskjellige celletyper og / eller forskjellige behandlinger som antas å påvirke cellenes cellulære metabolske tilstand. Basal respirasjon beregnes som forskjellen i OCR før du tilsetter mitokondriemodulatorer (oligomycin eller FCCP) og etter tilsetning av antimycin A |
||
| Maksimal åndedrett | Dette tiltaket er den maksimale oksygenhastigheten som kan konsumeres for oksidativ fosforylering. Oksygenhastigheten som forbrukes av oksidativ fosforylering bestemmes både av elektrontransportkjedens evne til å pumpe protoner over den indre mitokondriemembranen, og ATP-syntasens evne til å bruke protongradienten til fosforylatol ATP fra ADP. Hastigheten til ATP-syntasen er begrenset av gratis ADP-substrat og dermed av cellens generelle energiske tilstand. Ved behandling av cellene med mitokondrie-uncoupler FCCP, kan protoner fritt traversere tilbake over den indre mitokondriemembranen. Dette etterligner en situasjon der cellene opplever en usaturabel energibehov, og maksimal åndedrett er derfor et mål på maksimal oksygenhastighet som kan konsumeres av elektrontransportkjeden. Maksimal respirasjon beregnes som forskjellen i OCR av celler behandlet med FCCP og celler behandlet med antimycin A |
||
| ATP-omsetning | ATP-koblet respirasjon måles som forskjellen i OCR etter hemming av ATP-syntasen ved bruk av oligomycin. Oksygenet som ellers ville bli konsumert for fosforylering av ADP ved oksidativ fosforylering, vil ikke lenger bli brukt da denne prosessen blir arrestert. ATP-koblet respirasjon er derfor relativ til ATP produsert ved oksidativ fosforylering. Endringer i AT-koblet respirasjon er et svar fra mitokondriene på en endret ATP-etterspørsel fra cellen ATP-koblet respirasjon beregnes som forskjellen i OCR før du tilsetter mitokondriemodulatorer (oligomycin eller FCCP) og etter tilsetning av oligomycin |
||
| Ekstra åndedrettskapasitet | Den ekstra åndedrettskapasiteten er et mål på en teoretisk ekstra kapasitet til å produsere ATP som svar på økt energisk etterspørsel. Det er definert som forskjellen mellom basal respirasjon og maksimal åndedrett. Endringer i ledig åndedrettskapasitet kan være en indikator på mitokondrie og celletrening og fleksibilitet. | ||
Tabell 4: Forklaring av de ulike komponentene i mitokondrie-respirasjon som studeres ved hjelp av fluksanalysatoren
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detaljert og korrekt kvantifisering av oksidativ fosforylering er et uunnværlig verktøy når du beskriver energitilstandene til T-celler. Tilstanden til mitokondrie fitness kan være direkte relatert til T celleaktiveringspotensial, overlevelse og differensiering1,5. Med denne protokollen er det mulig å bestemme de ulike egenskapene til oksidativ fosforylering (se tabell 4 for en detaljert forklaring). Presis kvantifisering av disse egenskapene til oksidativ fosforylering gir en detaljert innsikt i energitilstandene til T-celler. For å oppnå pålitelige resultater må det imidlertid tas stor forsiktighet når du setter opp eksperimentet.
I denne protokollen anbefales de tre trinnene for optimalisering først, optimalisering av cellenumre. Evnen til en fluksanalysator til å måle oksygenkonsentrasjoner riktig følger en sigmoidkurve; endringer i oksygen som er for små eller for store, vil falle utenfor maskinens driftsintervall og vil derfor ikke måles riktig. Dette krever en optimalisering av cellenumre som skal brukes gjennom hele eksperimentet. Hvis for få celler blir analysert, er endringene i oksygenforbruket for lave til å måles riktig. Hvis det er for mange celler, er det fare for oksygennedbrytning i analysemediene. En første kjøring anbefales derfor, med celletall fra 100 000-400 000 celler per brønn. Når du tegner inn cellenummer kontra basal respirasjon, vil det optimale celleantallet være i det lineære området av kurven. Når du optimaliserer oppsettet, vær oppmerksom på at det kan være en eksponentiell forskjell i mitokondrieaktivitet mellom hvile og aktiverte celler, og derfor må optimaliseres deretter.
For det andre, titrering av inhibitorkonsentrasjoner. Ved behandling av cellene med oligomycin og FCCP er det viktig å identifisere de optimale konsentrasjonene av inhibitorene som skal brukes. En for lav konsentrasjon vil resultere i en suboptimal hemming og feil måling av mitokondrie respirasjon. Det er vanlig at folk bruker de høyeste anbefalte konsentrasjonene av inhibitorene for å sikre at en full hemming oppnås. Dette er også problematisk da for høye konsentrasjoner av inhibitorene kan ha pleiotrope effekter. Uncouplers som FCCP utøver også sine effekter på andre membraner enn mitokondrie, noe som resulterer i en rekke uønskede effekter, inkludert plasmamembrandepolarisering, mitokondriehemming og cytotoksisitet. I denne protokollen gjøres titrering av oligomycin og FCCP samtidig med cellenummeroptimalisering. Under en optimaliseringskjøring tilsettes økende konsentrasjoner av oligomycin eller FCCP ved hjelp av de fire tilgjengelige substratportene. I det resulterende OCR-diagrammet kan den optimale konsentrasjonen visuelt bestemmes som konsentrasjonen der OCR når et jevnt platå. Når konsentrasjonen av oligomycin og FCCP er titrert, skal disse konsentrasjonene brukes gjennom hele eksperimentet.
For det tredje, sekvensiell versus enkelt individuell tilsetning av inhibitorer. Klassiske Seahorse-analyser utføres vanligvis med sekvensiell tilsetning av den første oligomycin etterfulgt av tilsetning av FCCP. I T-celler og andre sensitive celler kan et slikt sekvensielt tillegg resultere i en feilaktig kvantifisering av maksimal respirasjon. I sin tur vil de målte nivåene av ledig åndedrettskapasitet rapportere lavere enn de er. Alvorlige eksempler på dette er verdier av ledig åndedrettskapasitet som er negative. Dette er selvfølgelig ikke biologisk mulig og er forårsaket av en pre-sensibilisering av mitokondriene ved oligomycinbehandling. I denne protokollen anbefales det i stedet at celler bare behandles med enten oligomycin eller FCCP (se figur 3C for illustrerende sammenligning).
Til slutt brukes denne optimaliserte protokollen til å vise hvordan IL-15-supplerte humane primære T-cellekulturer tydelig kan skilles fra IL-2-supplerte celler basert på deres mitokondrie-åndedrett. IL-15-dyrkede celler har høyere maksimal respirasjon og ekstra åndedrettskapasitet, en metabolsk tilstand knyttet til minne T-celler1,6. Disse observasjonene er i tråd med tidligere studier som knytter IL-15 til minne T celle delsett8. I tillegg ble det observert en forskjell i basal respirasjon, men ikke i ATP-produksjon sammenlignet med IL-2-dyrkede celler. Dette indikerer at disse cellene bruker sin glykolytiske kapasitet til å overholde basale metabolske krav, en vei forbundet med mer differensierte celler. Samlet sett er det vist at en T-cellemodell for menneskelig minne kan etableres in vitro ved hjelp av IL-15 tilskudd. Bruk av et IL-15-rikt miljø for å fremme utviklingen av minneceller har tidligere blitt demonstrert og støtter funnene ytterligere8.
I denne metoden har oligomycin, FCCP og antimycin A blitt brukt til å kvantifisere egenskapene til OxPhos. Andre forbindelser eksisterer med lignende effekter, som potensielt vil være bedre egnet for T-celler. Et eksempel ville være å bruke uncoupler BAM15 i stedet for FCCP for å redusere depolarisering av mitokondriemembranen og for å unngå cytotoksisitet9. I denne metoden har disse forbindelsene ikke blitt vurdert, da oligomycin, FCCP og antimycin A har vært de anbefalte mitokondriemodulatorene for Seahorse-eksperimenter det siste tiåret. Bruken av disse forbindelsene er derfor anerkjent av anmeldere og andre forskere som arbeider med OxPhos. Mer erfarne brukere av Seahorse flux analysator oppfordres til å bruke disse alternative forbindelsene, men bruken av disse er utenfor omfanget av dette papiret.
Overvåking av mitokondrie OxPhos er et viktig verktøy for å forstå T-cellefunksjon og forbedre kreftimmunoterapier. Som tidligere nevnt ble IL-15 utvidede celler - med en mindre differensiert hukommelsesfenotype - vist seg å forbedre responsen på CAR T-celleterapier, da de var mindre utmattet og hadde økt antitumoraktivitet10. Denne optimaliserte protokollen kan være et effektivt verktøy for å studere kvaliteten på T-celler i både prekliniske og kliniske omgivelser. Til slutt implementerer denne protokollen trinn for å optimalisere celletall og inhibitorkonsentrasjoner for bruk av ex vivo-dyrkede humane primære T-celler i metabolske analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Kasper Mølgaard og Anne Rahbech fikk tilskudd fra Tømmermester Jørgen Holm og Hustru Elisa f. Hansens Mindelegat. Kasper Mølgaardalso fikk stipend fra Børnecancerfonden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well tissue culture plate | Nunc | 142485 | |
| Anti-CD3xCD28 beads | Gibco | 11161D | |
| Antimycin A | Merck | A8674 | |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)-phenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Cell-Tak | Corning | 354240 | For coating |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D9170 | |
| Human Serum | Sigma Aldrich | H4522 | Heat inactivated at 56 °C for 30 min |
| IL-15 | Peprotech | 200-02 | |
| IL-2 | Peprotech | 200-15 | |
| Lymphoprep | Stemcell Technologies | 07801 | |
| Oligomycin | Merck | O4876 | |
| PBS | Thermo Fisher | 10010023 | |
| RPMI 1640 | Gibco-Thermo Fisher | 61870036 | |
| Seahorse Calibrant | Agilent Technologies | 102416-100 | |
| Seahorse XF 1.0 M glucose solution | Agilent Technologies | 103577-100 | |
| Seahorse XF 100 mM pytuvate solution | Agilent Technologies | 103578-100 | |
| Seahorse XF 200 mM glutamine solution | Agilent Technologies | 103579-100 | |
| Seahorse XF RPMI medium, pH7.4 | Agilent Technologies | 103576-100 | XF RPMI media |
| Seahorse XFe96 Analyser | Agilent Technologies | Flux analyzer | |
| Seahorse XFe96 cell culture microplates | Agilent Technologies | 102416-100 | XF cell culture plate |
| Seahorse XFe96 sensor cartridge | Agilent Technologies | 102416-100 | |
| Sodium Bicarbonate concentrate 0.1 M (NaHCO3) | Sigma Aldrich | 36486 | |
| Sodium Hydroxide solution 1 N (NaOH) | Sigma Aldrich | S2770-100ML | |
| X-VIVO 15 | Lonza | BE02-060F | |
| T cell beads magnet DynaMag-2 Magnet | Thermo Fisher | 12321D | |
| Seahorse wave | Flux analyzer software |
References
- vander Windt, G. J. W., et al. Mitochondrial respiratory capacity is a critical regulator of CD8+ T cell memory development. Immunity. 36 (1), 68-78 (2012).
- Krauss, S., Brand, M. D., Buttgereit, F. Signaling takes a breath--new quantitative perspectives on bioenergetics and signal transduction. Immunity. 15 (4), 497-502 (2001).
- vander Windt, G. J. W., et al. CD8 memory T cells have a bioenergetic advantage that underlies their rapid recall ability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (35), 14336-14341 (2013).
- Chang, C. -H., et al. Posttranscriptional control of T cell effector function by aerobic glycolysis. Cell. 153 (6), 1239-1251 (2013).
- vander Windt, G. J. W., Chang, C. -H., Pearce, E. L. Measuring bioenergetics in T cells using a Seahorse extracellular flux analyzer. Current Protocols in Immunology. 113, 1-14 (2016).
- Buck, M. D., O'Sullivan, D., Pearce, E. L. T cell metabolism drives immunity. Journal of Experimental Medicine. 212 (9), 1345-1360 (2015).
- Rivadeneira, D. B., Delgoffe, G. M. Antitumor T-cell reconditioning: Improving metabolic fitness for optimal cancer immunotherapy. Clinical Cancer Research. 24 (11), 2473-2481 (2018).
- Cieri, N., et al. IL-7 and IL-15 instruct the generation of human memory stem T cells from naive precursors. Blood. 121 (4), 573-584 (2013).
- Kenwood, B. M., et al. Identification of a novel mitochondrial uncoupler that does not depolarize the plasma membrane. Molecular Metabolism. 3 (2), 114-123 (2013).
- Alizadeh, D., et al. IL15 enhances CAR-T cell antitumor activity by reducing mTORC1 activity and preserving their stem cell memory phenotype. Cancer Immunology Research. 7 (5), 759-772 (2019).
