Summary
Das Nadelstechen des Basalkopfes der schwarzen Pfefferpflanze ist eine kurze und zeitsparende Methode, um sie zu beschädigen. Hier haben wir detaillierte Schritte mit einem Video zur Infektion von schwarzen Pfefferpflanzen bereitgestellt.
Abstract
Piper nigrum L. (schwarzer Pfeffer) ist eine typische holzige Rebe, die weltweit eine wirtschaftlich wichtige Gewürzpflanze ist. Die Produktion von schwarzem Pfeffer wird erheblich durch die durch Phytophthora capsici verursachte Wurzelfäulekrankheit beeinträchtigt, die die Branchenentwicklung als "Engpassproblem" ernsthaft beeinflusst hat. Der molekulargenetische Mechanismus der Resistenz in schwarzem Pfeffer ist jedoch unklar, was zu langsamen Fortschritten bei der Entwicklung neuer schwarzer Pfeffersorten führt. Eine effektive Impfung und ein präzises Probenahmesystem für Phytophthora capsici an schwarzen Pfefferpflanzen sind für die Untersuchung dieser Pflanzen-Krankheitserreger-Interaktion unerlässlich. Das Hauptziel dieser Studie ist es, eine detaillierte Methodik zu demonstrieren, bei der der basale Kopf von schwarzem Pfeffer mit Phytophthora capsici beimpft wird, und gleichzeitig eine Referenz für die Impfung von holzigen Rebpflanzen zu liefern. Der Basalkopf der schwarzen Pfefferpflanze wurde gestochen, um sie zu beschädigen, und Myzelpellets bedeckten die drei Löcher, um die Feuchtigkeit zu speichern, damit der Erreger die Pflanze gut infizieren konnte. Diese Methode bietet eine bessere Möglichkeit, die Instabilität zu lösen, die durch traditionelle Impfmethoden verursacht wird, einschließlich Bodentränken oder Wurzeltauchen. Es bietet auch ein vielversprechendes Mittel, um die Wirkungsweise zwischen Pflanzen und anderen bodenbürtigen Pflanzenpathogenen in der landwirtschaftlichen Präzisionszüchtung zu untersuchen.
Introduction
Schwarzer Pfeffer (Piper nigrum L.) ist ein holziger Kletterer und eine der wichtigsten Gewürzpflanzen. Er ist als "König der Gewürze"1 bekannt und wird in über 40 Ländern und Regionen in Asien, Afrika und Lateinamerika angebaut. Phytophthora-Wurzelfäule ist die verheerendste Krankheit des schwarzen Pfeffers und wird durch den Oomyceten Phytophthora capsici verursacht. Dieser Erreger infiziert auch Kürbisgewächse, Auberginen, Chilischoten und Tomaten 2,3. Mit schwarzem Pfeffer kann manchmal eine ganze Ernte durch diese Krankheit dezimiert werden. Die Ausweitung der Pfefferanbauflächen ist aufgrund der Nichtverfügbarkeit resistenter Sorten eingeschränkt, was die Entwicklung der chinesischen Schwarzpfefferindustrie erheblich behindert hat. Eine effektive Impfung und ein präzises Probenahmesystem für Phytophthora capsici an schwarzen Pfefferpflanzen sind für die Untersuchung dieser Pflanzen-Pathogen-Interaktion unerlässlich.
Die Identifizierung und das Screening von Resistenzen in Keimplasmaressourcen ist die Grundvoraussetzung für die Erforschung der Pathogenität des Erregers und die Züchtung und Verwertung resistenter Sorten. Ein weit verbreiteter Ansatz ist die Verwendung einer Vielzahl von Identifizierungsmethoden, die auf Pflanzenarten und Krankheitserregergruppen basieren. Zu den derzeitigen Identifizierungsmethoden gehören die Identifizierung von Populationen, die Identifizierung von Einzelpersonen, die Identifizierung von Organen, die Identifizierung von Geweben, die Identifizierung von Zellen, die biochemische Identifizierung und die molekulare Identifizierung, die in den letzten Jahren entwickelt wurden 4,5. In diesen Bereichen gab es Erfolge, aber es gibt auch viele Probleme. Unabhängig davon, welche Methode gewählt wird, sind die grundlegenden Anforderungen an die Identifizierung von Pflanzenresistenzen konsistent, einschließlich klarer Ziele, zuverlässiger Ergebnisse und Methoden, die einfach, schnell und leicht zu standardisieren sind. Dieses Prinzip muss auch bei der Identifizierung von Schwarzpfefferresistenzen befolgt werden.
Unter natürlichen Feldbedingungen kann die Identifizierung von Krankheitsresistenzen durch viele Umweltfaktoren beeinflusst werden. Daher wurde vorgeschlagen, abgelöste Blätter und bewässerte Wurzeln im Labor zu verwenden, um Krankheitsresistenzen zu identifizieren. Junge Blätter von gesunden Pflanzen wurden in vitro im Labor geimpft, und die erkrankte Blattfläche wurde durch Impfung des Erregers gemessen, um die Krankheitsresistenz von Pflanzen zu identifizieren6. Die In-vitro-Blattimpfung kann jedoch nur zur allgemeinen Resistenzidentifizierung und nicht für molekulare Interaktionsstudien verwendet werden. Trotzdem zeigt sich der krankheitsresistente Status häufig in der bewässerten Wurzelimpfung, was zu Unsicherheit in der Folgestudie der molekularen Züchtung auf Krankheitsresistenz führt. Daher sind schnelle und einfache Indoor-Detektionsmethoden unerlässlich. Diese Studie zielt darauf ab, eine Methode zur Resistenzidentifikation im Labor bereitzustellen.
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Protocol
1. Vorbereitung von schwarzen Pfefferschneidepflanzen für Infektionen
- Nehmen Sie einen etwa 40 cm langen Fünfknotenschnitt mit einem Durchmesser von 0,5 cm aus einem gesunden und kräftig wachsenden orthotropen Zweig aus schwarzem Pfeffer mit einem desinfizierten Schnittmesser oder einer Gartenschere. Beschneiden Sie die unteren drei Knoten der plagiotropen Zweige, wobei die oberen beiden Knoten mit etwa 10 Blättern intakt bleiben.
- Bewurzelungssubstrat mit Erde und Tierdung (Kuhdung oder Schafdung) im Verhältnis 1:1 vorbereiten. Autoklavieren Sie das Wurzelsubstrat bei 121 °C für 20 min.
- Setzen Sie die Stecklinge in einem Winkel von ca. 50° in das Wurzelsubstrat ein, wobei der dritte Knoten nur die Oberfläche des Substrats und die Achselknospe auf diesem Knoten über dem Substrat berührt.
HINWEIS: Die hier verwendete Tasche hat folgende Abmessungen: Höhe von 40-60 cm, Durchmesser von 25-30 cm. - Gießen Sie 10-20 L Wasser über die Wurzeln der Pflanze. Stellen Sie die Stecklinge in ein Gewächshaus mit 90% Schatten bei einer Temperatur von 25-30 ° C für die Bewurzelung und das Wachstum.
2. Vermehrung von Phytophthora capsici (P. capsici)
HINWEIS: Ein Bestand an Phytophthora capsici-Kultur wird im Pflanzenschutzlabor des Gewürz- und Getränkeforschungsinstituts der Chinesischen Akademie der tropischen Agrarwissenschaften7 gehalten.
- Bürsten und reinigen Sie die Kartoffelknollen unter fließendem Leitungswasser und schneiden Sie dann 200 g Kartoffeln in Würfel von 1 cm3. Einige der Würfel in ein Becherglas mit 800 ml doppelt destilliertem Wasser (ddH2O) geben und 20 min kochen lassen.
- Filtern Sie die Brühe durch doppelte Gaze mit Schwerkraftfiltration. Kartoffeldextrose-Agar (PDA) vorbereiten, indem Sie dem Filtrat 20 g Dextrose und 15 g Agar hinzufügen und das Volumen bis zu 1 l mit ddH 2 O belegen. Autoklavieren Sie die Mischung bei 121 °C für 20 min8.
- Gießen Sie 20 ml des sterilisierten PDA in flüssiger Form in eine runde Petrischale mit einem Durchmesser von 9 cm in einer laminaren Luftstromhaube. Lassen Sie die PDA-Platten mit Deckeln über Nacht in der laminaren Luftstromhaube geöffnet, um Kondensation zu vermeiden.
- Verwenden Sie eine Impfschleife, um Myzelien aus dem Phytophthora capsici-Bestand in einem Reagenzglas aufzunehmen. Stellen Sie das Inokulum mit der Myzelseite in Kontakt mit dem PDA in einer Petrischale.
3. Infektion von schwarzem Pfeffer
- Inkubation
- Identifizieren Sie einen Bereich 5 cm über der Substratoberfläche und in der Nähe der Wurzeln am Stiel für die Impfung.
- Kernen Sie eine Myzelienscheibe mit einem Durchmesser von 0,5 cm am wachsenden Rand der Phytophthora capsici-Kultur auf PDA in einer Petrischale mit einem Stopperbohrer.
- Beschädigen Sie den Stiel mit einer Spritzennadel und machen Sie drei Löcher in einem dreieckigen Muster an der ausgewählten Impffläche. Bedecken Sie jedes Loch mit einer Myzelscheibe. Positionieren Sie die Löcher nahe beieinander, um sicherzustellen, dass der verwundete Bereich vollständig mit den Myzelscheiben bedeckt ist.
- Decken Sie die Myzelscheiben mit sterilisierten, angefeuchteten Wattepads ab, um das Austrocknen zu verhindern. Binden Sie das Pad mit einem Polyethylenstreifen auf den Stiel, um die Position der Impfscheiben beizubehalten.
HINWEIS: Um 8 Uhr nach der Impfung wurden die geimpften Löcher schwarz und die Läsion dehnte sich im Laufe der Zeit aus. Die Blätter färbten sich gelb und fielen ab, und die geimpfte Pflanze starb 7-10 Tage nach der Impfung. In den Kontrollanlagen entwickelten sich keine Läsionen. Die meisten Gene exprimierten nach der Impfung mit Phytophthora capsici im Vergleich zur Kontrollgruppe anders. Die histopathologische Analyse der infizierten Gewebe zeigte, dass Phytophthora capsici im Xylem besiedelte.
- Probieren Sie die Pflanzenmaterialien von Interesse und lagern Sie sie bei -80 ° C in flüssigem Stickstoff für die Verwendung in nachfolgenden Studien.
HINWEIS: Flüssiger Stickstoff, Plastiktüten, Markerstifte, Astscheren und andere Materialien wurden vor den Experimenten vorbereitet. - Nachdem die spezifischen Pflanzenmaterialien für die Verwendung beprobt wurden, autoklavieren Sie alle verbleibenden Pflanzenmaterialien, übrig gebliebene Phytophthora capsici-Kultur und -Kulturmedium sowie alle Instrumente und Laborutensilien, die bei dieser Impfarbeit verwendet werden.
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Representative Results
Abbildung 1 zeigt die Symptome von schwarzen Pfefferblättern nach der Impfung von P. capsici. Abbildung 2 zeigt die Symptome von schwarzen Pfefferstängeln nach P. capsici Impfung. Der Erreger infizierte den schwarzen Pfeffer am basalen Stamm; Symptome wie Blattvergilbung, Welken auftreten, Xylembräunung und allmähliches Auftreten von Gefäßschwärzungen. Abbildung 3 zeigt, dass die meisten Gene nach der Impfung mit Phytophthora capsici anders exprimiert wurden als in der Kontrollgruppe. Abbildung 4 hat gezeigt, dass Phytophthora capsici im Xylem durch die histopathologische Analyse infizierter Gewebe besiedelt wurde.
Abbildung 1: Die Symptome von schwarzen Pfefferblättern nach der P. capsici-Impfung 7. CK: Kontrollgruppe; Geimpft: nach der Impfung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Das Symptom des schwarzen Pfeffers stammt nach der P. capsici-Impfung 7. Geimpft: nach der Impfung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Detaillierte Expressionsprofile der Gene in den schwarzen Pfefferwurzeln. Fehlerbalken in den Abbildungen kennzeichnen den Standardfehler von Expressionsebenen aus drei biologischen Replikationen. CK-8, CK-12, CK-24, CK-48, 8, 12, 24 und 48 auf der x-Achse beziehen sich auf 8, 12, 24 und 48 h auf der Kontrolle und 8, 12, 24 bzw. 48 h nach der Inokulation mit P. capsici. Die y-Achse stellt die relative Expressionsebene im Vergleich zu Ubiquitin dar. Jede Spalte stellt den Mittelwert zuzüglich SD (Standardabweichung) von drei biologischen Replikaten dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Histopathologische Analyse infizierter Gewebe. Der Vergleich zwischen Toluidinblau O Färbung allein (linke Spalte) und Baumwollblau und Safranin O Doppelfärbung (rechte Spalte) (20X). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
In dieser Studie wurde der Basalkopf gestochen, um ein wirksames Impfsystem in der schwarzen Pfefferpflanze zu schädigen und bereitzustellen. Myzelpellets bedeckten dann die drei Löcher, um Feuchtigkeit zu speichern und es dem Erreger zu ermöglichen, die Pflanze gut zu infizieren. Nach der Impfung färbten sich die Blätter gelb und fielen ab und die geimpften Pflanzen starben. In den Kontrollanlagen entwickelten sich keine Läsionen. Die meisten Gene exprimierten nach der Impfung mit Phytophthora capsici im Vergleich zur Kontrollgruppe anders. Pilzkrankheiten sind für strukturelle und physiologische Störungen in einer beträchtlichen Anzahl von Kulturen verantwortlich, was zu einer verminderten Produktivität und wirtschaftlichen Verlusten für ihre Produzenten führt. Strukturstudien mit histologischen Techniken zur Art und Weise der Penetration und Besiedlung von Pflanzengeweben durch Pilze liefern einen detaillierten Hinweis auf die Wechselwirkungen zwischen dem Erreger und dem Pflanzengewebe. Diese Studien haben wichtige Aspekte aufgedeckt, um den Monozyklus von Krankheiten zu verstehen. Die histopathologische Analyse infizierter Gewebe zeigte , dass Phytophthora capsici im Xylem besiedelt war. Diese Methode bietet ein besseres Mittel zur Lösung der Instabilität, die durch traditionelle Impfmethoden verursacht wird, einschließlich Bodentränken oder Wurzeltauchen. Eine effektive Impfung und ein präzises Probenahmesystem für Phytophthora capsici an schwarzen Pfefferpflanzen sind für die Untersuchung dieser Pflanzen-Krankheitserreger-Interaktion unerlässlich. Es bietet auch ein vielversprechendes Mittel, um die Wirkungsweise zwischen Pflanzen und anderen bodenbürtigen Pflanzenpathogenen in der landwirtschaftlichen Präzisionszüchtung zu untersuchen.
Gleichzeitig stellt dieses Protokoll eine effizientere Möglichkeit dar, Referenz für die Inkubation von holzigen Reben bereitzustellen. In früheren Studien wurden Krankheitserreger durch Wurzeltauchen mit Sporensuspensionen geimpft, die in V8 medium9 kultiviert wurden. Es dauert 7 Tage, bis die Sporensuspension fertig ist, während die Verwendung von PDA zur Kultivierung von Phytophthora capsici nur 5 Tage dauert. Die PDA-Platte wurde mit durchlässigem chirurgischem Klebeband versiegelt, um eine Kontamination durch andere Bakterien und Pilze zu vermeiden. Die Kulturen wurden bei Raumtemperatur gehalten. Die in dieser Studie verwendete Methode kann mehr Zeit sparen und schneller durchgeführt werden. Schwarzer Pfeffer ist eine holzige Rebe mit vielen Zuckern und Phenolen10, und die von Phytophthora capsici produzierten Zoosporen kommen im Allgemeinen in Böden vor, was es schwierig macht, schwarze Pfefferreben zu infizieren und Infektionsinstabilität in der Wurzel11 zu verursachen. Dieses Protokoll liefert bessere Ergebnisse und ermöglicht eine starke Interaktion zwischen Reben und bodenbürtigen Krankheitserregern. Der Nachweis des dynamischen Prozesses zwischen Pflanzen und Krankheitserregern ist sichtbar und bequem.
Die Bewässerungswurzelmethode ist schnell und zeitsparend, aber ein Problem bleibt für schwarzen Pfeffer ungelöst. Phytophthora capsici ist ein bodenbürtiger Erreger, der im Allgemeinen Pflanzenwurzeln über Sporangien und Zoosporen12 infiziert. In der Natur kann sich die Sporangia über Regen und Bewässerung ausbreiten. Sobald sich die Zoosporen an der Pflanzenoberfläche festsetzen, können sich die Keimröhren schnell entwickeln und in das Pflanzengewebe eindringen, was zu einer Infektionführt 13,14. Dies kann zu Unsicherheit führen, dass die Wahl von Hyphen als Infektionsquelle der Sporensuspension ähnlich ist. Die in dieser Studie verwendete Methode beginnt damit, den Basalkopf der schwarzen Pfefferpflanze zu stechen, um ihn zu beschädigen. Der geschädigte Bereich wird dann mit Phytophthora capsici bedeckt und Feuchtigkeit wird zurückgehalten, so dass der Erreger die Pflanze gut infizieren kann. Diese Methode ist besser geeignet, die Instabilität zu lösen, die durch traditionelle Impfmethoden verursacht wird, einschließlich Bodendurchnässen oder Wurzeltauchen. Es ist auch eine vielversprechende Methode, um die Wirkungsweise zwischen Pflanzen und anderen bodenbürtigen Pflanzenpathogenen in der landwirtschaftlichen Präzisionszüchtung zu untersuchen.
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Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom National Key R&D Program of China (2020YFD1001200), dem China Agriculture Research System (CARS-11), dem spezifischen Forschungsfonds der Innovationsplattform für Akademiker der Provinz Hainan (YSPTZX202154), der Natural Science Foundation of Hainan Province of China (321RC652) und der Natural Science Foundation of China (Nr. 31601626) finanziell unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar powder | Solarbio | A8190 | |
| Clean bench | Haier | ||
| Dextrose | Xilong Scientific | 15700501 | |
| High temperature sterilizing oven | Zaelway | ||
| Petri dish plates | Biosharp | BS-90-D |
References
- Gordo, S. M., et al. High-throughput sequencing of black pepper root transcriptome. BMC Plant Biology. 12 (1), (2012).
- Leonian, L. H. Stem and fruit blight of Peppers caused by Phytophthora capsici sp. Nov. Phytopathology. 12 (9), 401-408 (1922).
- Ding, X., et al. Priming maize resistance by its neighbors: Activating 1,4-benzoxazine-3-ones synthesis and defense gene expression to alleviate leaf disease. Frontiers in Plant Science. 6, 830 (2015).
- Fonseca, C. E. L., Vianda, D. R., Hansen, J. L., Pell, A. N. Associations among forage quality traits, vigor, and disease resistance in alfalfa. Crop Science. 39 (5), 1271-1276 (1999).
- Altier, N. A., Thies, J. A. Identification of resistance to Pythium seedling disease in Alfalfa using a culture plate method. Plant Disease. 79 (4), 341-345 (1995).
- Pratt, R. G., Rowe, D. E. Evaluation of simplified leaf inoculation procedures for identification of quantitative resistance to Sclerotinia trifoliorum in Alfalfa seedling. Plant Disease. 82 (10), 1161-1164 (1998).
- Hao, C., et al. De novo transcriptome sequencing of black pepper (Piper nigrum L.) and an analysis of genes involved in phenylpropanoid metabolism in response to Phytophthora capsici. BMC Genomics. 17 (1), 1-14 (2016).
- Dong, C., et al. Field inoculation and classification of maize ear rot caused by Fusarium verticillioides. Bio-protocol. 8 (23), 3099 (2018).
- English, J. T., Laday, M., Bakonyi, J., Schoelz, J. E., Érsek, T. Phenotypic and molecular characterization of species hybrids derived from induced fusion of zoospores of Phytophthora capsica and Phytophthora nicotianae. Mycological Research. 103 (8), 1003-1008 (1999).
- Chatterjee, S., et al. Antioxidant activity of some phenolic constituents from green pepper (Piper nigrum L.) and fresh nutmeg mace (Myristica fragrans). Food Chemistry. 101 (2), 515-523 (2007).
- Pfender, W. F. Production of sporangia and release of zoospores by Phytophthora megasperma in soil. Phytopathology. 67 (5), 657-663 (1977).
- Nagila, A., Schutte, B. J., Sanogo, S., Idowu, O. J. Chile pepper sensitivity to mustard seed meal applied after crop emergence. HortScience. 56 (2), 1-7 (2021).
- Lamour, K. H., Stam, R., Jupe, J., Huitema, E. The oomycete broad-host-range pathogen Phytophthora capsica. Molecular Plant Pathology. 13 (4), 329-337 (2012).
- Hardham, A., Gubler, F. Polarity of attachment of zoospores of a root pathogen and pre-alignment of the emerging germ tube. Cell Biology International Reports. 14 (11), 947-956 (1990).
