Summary
Este protocolo de dissociação de células neurais destina-se a amostras com uma baixa quantidade de material inicial e produz uma suspensão de célula única altamente viável para análise a jusante, com medidas de fixação e coloração opcionais.
Abstract
Este protocolo de dissociação neural (uma adaptação do protocolo que acompanha um kit comercial de dissociação cerebral adulta) otimiza o processamento de tecidos em preparação para análises detalhadas a jusante, como citometria de fluxo ou sequenciamento unicelular. A dissociação neural pode ser conduzida através de dissociação mecânica (como o uso de filtros, técnicas de corte ou trituração de pipetas), digestão enzimática ou uma combinação dela. A natureza delicada das células neuronais pode complicar os esforços para obter a suspensão de célula única altamente viável e verdadeira com detritos celulares mínimos necessários para análise unicelular. Os dados demonstram que essa combinação de dissociação mecânica automatizada e digestão enzimática consistentemente produz uma suspensão unicelular altamente viável (>90%), superando as dificuldades acima mencionadas. Embora algumas das etapas exijam destreza manual, essas etapas diminuem o manuseio da amostra e a perda potencial de células. Este manuscrito detalha cada etapa do processo para equipar outros laboratórios para dissociar com sucesso pequenas quantidades de tecido neural em preparação para análise a jusante.
Introduction
O hipocampo foi descrito pela primeira vez por um anatomista bolonhesa, Giulio Cesare Aranzio, em 1500. Ao nomear esta nova estrutura, Aranzio foi provavelmente inspirado por sua estranha semelhança com o cavalo-marinho do gênero Hipocampo1. O hipocampo está envolvido em respostas ao estresse, mas é amplamente conhecido por seu papel no aprendizado e na memória. Mais especificamente, o hipocampo é responsável pela codificação e recuperação da memória declarativa e espacial1.
O hipocampo, ou hipocampo propriamente dito, é dividido nos subcampos CA1 (cornu ammonis), CA2 e CA31. Comparado com o resto do sistema nervoso, o hipocampo tem várias características únicas de definição, incluindo sua plasticidade e potencial para neurogênesecontínua 2. Neurogênese é o processo de proliferação e diferenciação de células-tronco neurais, seguida por sua integração na rede neuronal pré-existente. A neurogênese é restrita à zona subgranular do giro dentado e da zona subventricular dos ventrículos laterais (e das lâmpadas olfativas)3. Embora a neurogênese seja abundante em embriogênese, é um processo ao longo da vida 3,4. Como tal, essa discussão se concentrará na neurogênese adulta no hipocampo.
As zonas subventricular e subgranular são nichos neurogênicos contendo células ependísicas e vasculares, bem como linhagens imaturas e maduras de células-tronco neurais5. A microglia contribui para esses nichos como células imunes para regular a neurogênese6. Progenitoras neurais são progenias não-progenias de células-tronco de células-tronco neurais7. Três tipos de progenitores neurais estão presentes na zona subventricular: células tipo B radial, progenitores progenitores do tipo C e neuroblastos tipo A 3,8. As células progenitoras neurais do tipo B na zona subventricular podem se diferenciar em células tipo C que dividem lentamente8. Posteriormente, as células tipo C se diferenciam em células tipo A8. Esses neuroblastos migram através do fluxo migratório rostral para a lâmpada olfativa antes de se diferenciarem em interneurons ou oligodendrocytes9. Estes interneurônios de bulbo olfativos são fundamentais para a memória olfativa de curto prazo, e aprendizado associativo, enquanto os oligodendrocitos myelinatos axônios do corpus calosum9. A maioria da neurogênese adulta ocorre na zona subgranular do giro dentado, onde progenitores neurais radiais tipo 1 e não racial 2 são encontrados3. A maioria das células progenitoras neurais estão destinadas a se tornar neurônios dentes e astrócitos10. Conectados por junções de lacunas, os astrócitos formam redes para modular plasticidade, atividade sináptica e excitabilidade neuronal5. Como o neurônio excitatório primário do giro dentado, as células de grânulo fornecem entrada do córtex entorhinal para a regiãoCA3 11.
As populações de células-tronco neurais podem ser isoladas usando estratégias de isolamento imunomagnético ou imunofluorescente12,13. O tecido neural é particularmente difícil de dissociar; esforços para fazê-lo muitas vezes resultam em amostras com má viabilidade celular e/ou não produzem a suspensão de célula única necessária para análise a jusante. A dissociação neural pode ser conduzida por meio de dissociação mecânica (como o uso de filtros, técnicas de corte ou trituração de pipetas), digestão enzimática ou uma combinação de técnicas14,15. Em estudo que avaliou os métodos de dissociação neural, foram comparadas15 a viabilidade e a qualidade da dissociação mecânica manual por trituração de pipetas versus combinações de trituração de pipetas e digestão com várias enzimas. A qualidade foi classificada com base na quantidade de aglomerados celulares e DNA ou detritos subcelulares na suspensão preparada15. As suspensões de tumores gliais submetidos apenas à dissociação mecânica manual apresentaram viabilidade celular significativamente menor do que os tratamentos com dispase ou uma combinação de DNase, colagenase e hialuronidase15. Volovitz et al. reconheceram a variação da viabilidade e da qualidade entre os diferentes métodos e enfatizaram que a dissociação inadequada pode reduzir a precisão da análise a jusante15.
Em um estudo separado, os autores compararam mais de 60 métodos diferentes e combinações de dissociação de células neuronais cultivadas14. Estes métodos incluíram oito variações diferentes de dissociação mecânica manual por trituração de pipetas, comparação da incubação com cinco enzimas individuais em três intervalos diferentes, e várias combinações de dissociação mecânica com digestão enzimática ou a combinação de duas enzimas14. Nenhum dos métodos mecânicos resultou em uma suspensão de célula única14. Quatro dos tratamentos enzimáticos únicos, dez dos tratamentos enzimáticos combinados, e quatro das combinações de dissociação mecânica com digestão enzimática produziram uma suspensão unicelular14. Digestão enzimática com TrypLE seguido por Trypsin-EDTA mais efetivamente dissociado amostras14. Aliás, amostras tratadas com TrypLE e/ou Trypsin-EDTA tendem a formar aglomerados gelatinosos14. Embora este estudo tenha sido realizado em células cultivadas, ele fala apenas das deficiências da trituração de pipetas ou da digestão enzimática.
Faltam comparações lado a lado de dissociação mecânica manual versus automatizada. No entanto, um grupo executou citometria de fluxo para comparar a dissociação mecânica manual e semi-automatizada de cérebros inteiros de camundongos em conjunto com os kits comerciais de dissociação enzimática papain ou trypsin16. O processamento com o dissociador produziu de forma mais consistente células viáveis16. Após a dissociação, os autores também isolaram células prominina-1, células precursoras neuronais e microglia16. Para duas das três populações celulares isoladas, a pureza das células isoladas foi ligeiramente maior quando as amostras foram processadas com o dissociador, em comparação commanualmente 16. Reiß et al. observaram que a variabilidade de pessoa para pessoa na técnica de pipetagem dificulta a reprodutibilidade do rendimento da população celular viável na dissociação tecidual16. Os autores concluíram que a dissociação mecânica automatizada padroniza o processamento da amostra16.
O método de dissociação descrito neste manuscrito é uma combinação de dissociação mecânica totalmente automatizada e digestão enzimática, utilizando soluções que acompanham um kit comercial de dissociação cerebral adulta17. Ao contrário dos protocolos padrão, este protocolo otimizado reduz a manipulação da amostra, produz uma suspensão de célula única altamente viável, e destina-se a processar quantidades mínimas de tecido inicial.
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Protocol
Os experimentos foram realizados de acordo com os padrões éticos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da UAMS. Camundongos fêmeas C57Bl6/J de 6 meses de idade foram comprados e agrupados (4 ratos por gaiola) sob um ciclo constante de 12 horas de luz/escuridão.
1. Preparação de reagentes
- Prepare a solução de estoque de manchas vivas/mortas fixas. Reconstitua a mancha fluorescente com 20 μL de sulfóxido de dimetila (DMSO).
- Enrole o frasco em papel alumínio, rotule-o como "Reconstituído", e armazene-o a -20 °C por até seis meses.
- Prepare uma solução salina de 0,9% com heparina. Diluir o conteúdo de um frasco de sódio heparina (10.000 unidades usp por 10 mL) em 1 L de água dupla destilada (ddH2O).
- Prepare o suficiente para aproximadamente 45 mL por animal e armazene a 4 °C por até uma semana.
- Faça 1% de paraformaldeído (PFA).
- Em um capô de fumaça, aqueça uma placa quente a 50 °C. Em um micro-ondas, aqueça 100 mL de ddH2O em um copo de vidro a aproximadamente 60 °C. Adicione uma barra de agitação magnética e transfira para a placa quente.
- No capô da fumaça, pese 1 g de PFA e adicione ao béquer de ddH2O. Adicione 0,1125 g de cristais NaOH e misture até dissolver (5-10 min).
- Adicione 0,4 g de NaPO4- monobásico e misture até dissolver (2-5 min). Filtrar a solução e ajustar o pH para 7.4 com HCl e NaOH.
- Esfrie no gelo ou a 4°C por 30 minutos antes de armazenar.
NOTA: As alíquotas de 1,5 mL podem ser armazenadas a -20 °C durante um ano. Evite ciclos de congelamento. Se, após o descongelamento, a solução ficar nublada ou um precipitado tiver se formado, a solução não deve ser utilizada.
ATENÇÃO: Tóxico, inflamável. Sempre trabalhe com PFA sob um capô ventilado usando equipamento de proteção individual adequado.
- Enzima liofilizada resuspend com 1 mL de Tampão A. Não vórtice a solução.
NOTA: Enzima A e Buffer A, bem como buffers A, Y e Z são reagentes no kit comercial de dissociação do cérebro adulto17. - Divida a enzima P em alíquotas de 50 μL e resuspend Enzima A em alíquotas de 10 μL. Por instruções de kit, armazene a -20 °C por até seis meses. Evite ciclos de congelamento.
2. Dia de experimento
- Esfrie a centrífuga de mesa a 4 °C.
- Coloque aliquot(s) de PFA na geladeira para descongelamento gradual.
- Coloque a mancha viva/morta reconstituída no escuro (por exemplo, uma gaveta) para descongelar à temperatura ambiente.
- Prepare o tampão de soro bovino (BSA). Adicione 0,5 g de BSA a 100 mL da solução tamponada de fosfato de 1x Dulbecco sem cálcio e magnésio (D-PBS), pH 7.2.
- Adicione uma barra de mexida e misture em uma placa de mexida por 30 minutos. Transfira para tubos cônicos de 50 mL e armazene a 4 °C.
NOTA: Use sempre o buffer BSA recém-preparado. - Prepare a diluição de trabalho de mancha viva/morta. Adicione 1 μL da solução de estoque de manchas vivas/mortas reconstituídas a 360 μL D-PBS e armazene-a no escuro (por exemplo, uma gaveta ou caixa) à temperatura ambiente. Prepare 50 μL da diluição de trabalho por amostra.
3. Perfusão
- Coloque a solução salina com heparina no gelo.
- Ligue o oxigênio, coloque a bola indicadora do medidor de fluxo no sistema vaporizador de anestesia animal de pequeno porte para 1 L/min. Certifique-se de que há pressão adequada de oxigênio e isoflurane.
- Ajuste o mostrador vaporizador para 3,5% (para indução e manutenção).
- Prime as linhas de bomba de perfusão com a solução salina/heparina. Defina a velocidade para 6 mL/min.
- Coloque o mouse na câmara de indução, ligue o respirador e espere vários minutos até que o mouse não responda. Confirme a profundidade suficiente da anestesia através da ausência de retirada do pedal para beliscar nociva.
- Coloque o mouse de costas na bandeja de dissecção com o nariz no cone do nariz. Realize uma confirmação secundária de anestesia total através da ausência de retirada do pedal para beliscar nociva. Coloque as quatro patas na bandeja.
- Pulverize o abdômen do animal com 20% de etanol.
- Usando fórceps, belisque o abdômen inferior e levante a pele. Use uma tesoura para cortar a pele e a pele até o fundo da caixa torácica.
- Faça duas incisões diagonais abaixo da caixa torácica em direção a cada ombro.
- Ressesseça cuidadosamente o diafragma (evitando os pulmões e o coração). Ressecante a caixa torácica para expor o coração.
- Corte cuidadosamente qualquer tecido conjuntivo ao redor do coração.
NOTA: As etapas 3.10-3.11 são críticas; realizar com proficiência e destreza. - Use a tesoura para prender o átrio direito (lobo escuro no canto superior esquerdo do coração). Desligue o fluxo de isoflurane para o respiro.
- Mantenha o coração firme com fórceps. Com o bisel da agulha borboleta virado para cima, fure o ventrículo esquerdo mantendo o nível da agulha e paralelo ao animal.
- Segure a agulha no lugar, ligue a bomba e perfunda pelo menos 30 mL da solução salina/heparina até que o fluido que sai do coração fique opaco e o fígado e pulmões pálidos em cores.
NOTA: As etapas 3.13-3.14 são críticas; realizar com proficiência e destreza. - Desligue a bomba, remova a agulha e transfira o mouse para a área de dissecção.
4. Dissecção
- Usando uma tesoura cirúrgica grande, decapite a cabeça.
- Corte a pele da parte de trás da cabeça até os olhos. Descasque a pele para trás para expor o crânio.
- Corte o crânio entre os olhos. Faça dois cortes na parte de trás do crânio, nas posições das 10 e 2 horas, em seguida, faça um corte longo (mantenha as pontas para evitar danificar o cérebro) ao longo da linha midsagittal do crânio até o corte original entre os olhos.
- Use fórceps para descascar as duas metades do crânio para os lados. Use uma espátula para remover o cérebro e coloque-o em uma placa de petri de vidro de 60 mm no gelo cheio de D-PBS frio (Figura 1).
- Use um bisturi ou navalha para separar cada hemisfério. Em seguida, remova as lâmpadas olfativas e o cerebelo.
- Use fórceps para remover o cérebro médio até que o hipocampo seja exposto.
- Proteja o cérebro com fórceps. Usando um segundo conjunto de fórceps, provoque suavemente o hipocampo de cada hemisfério, e transfira ambos o hipocampi para um tubo de 1,5 mL rotulado contendo D-PBS frio.
- Coloque o tubo de amostra contendo os dois hipocampi do rato no gelo.
5. Prepare a enzima Mix 1 e 2 para cada amostra
NOTA: Para volumes superiores a 2 mL, utilize uma pipeta sorológica de 10 mL; para volumes, 200 μL-2 mL, use uma pipeta de 1000 μL; para volumes, 21-199 μL, use uma pipeta de 200 μL; para volumes, 2-20 μL, use uma pipeta de 20 μL; para volumes abaixo de 2 μL, use uma pipeta de 0-2 μL.
- Para cada amostra, descongele uma alíquota cada de Enzima P e Enzima A à temperatura ambiente.
- Para enzime mix 1, combine 50 μL de Enzima P e 1900 μL de Buffer Z em um tubo C rotulado (Tabela de Materiais).
- Para enzima mix 2, adicione 20 μL de Buffer Y ao aliquot de 10 μL descongelado da Enzima A.
6. Protocolo de dissociação cerebral adulto17
NOTA: Ao trabalhar com amostras, os tubos devem ser colocados em um rack de tubo em temperatura ambiente, enquanto BSA e D-PBS permanecem no gelo, a menos que observados de outra forma.
- Ligue o dissociador.
- Use fórceps para transferir os pedaços de tecido hipocampi para o tubo C.
- Transfira 30 μL de enzima mistura 2 para o tubo C. Torça a tampa até sentir a tensão, em seguida, aperte até que clique.
- Coloque o tubo C de cabeça para baixo em uma posição do dissociador; a amostra será atribuída ao status Selecionado (Figura 2). Fixar o aquecedor sobre o tubo C.
- Pressione o ícone da pasta, selecione A pasta Favoritos , role e selecione o programa 37C_ABDK_02 . Clique em OK para aplicar o programa a todos os tubos C selecionados e toque em Iniciar (Figura 2).
- Rotule um tubo cônico de 50 mL por amostra.
- Coloque um coador de células de 70 μm em cada tubo cônico de 50 mL e molhado com 2 mL de tampão BSA.
- Após a conclusão do programa, remova o aquecedor e o tubo C do dissociador.
- Adicione 4 mL de tampão BSA à amostra e aplique a mistura ao coador celular no tubo cônico de 50 mL.
- Adicione 10 mL de D-PBS ao tubo C, feche-o e gire a solução suavemente. Aplique-o no coador de células no tubo cônico de 50 mL.
- Descarte o coador de células e o tubo C. Centrifugar a suspensão a 300 x g por 10 min a 4 °C. Então, aspire e descarte o supernatante.
7. Remoção de detritos
- Resuspenda a pelota com 1550 μL de D-PBS frio e transfira a suspensão para um tubo cônico de 15 mL rotulado.
- Adicione 450 μL de solução de remoção de detritos frios e pipeta para cima e para baixo (não vórtice).
NOTA: A Solução de Remoção de Detritos é um reagente no kit comercial de dissociação de Brian17. - Sobreponha suavemente 1 mL de D-PBS frio em cima da suspensão da célula, mantendo a ponta contra a parede do tubo cônico. Repita até que a sobreposição total seja de 2 mL.
NOTA: Este passo é crítico; realizar com proficiência e destreza. - Centrifugar a 3000 x g por 10 min a 4 °C com aceleração total e freio total.
NOTA: Se as fases não estiverem claramente separadas, repita as etapas 7.2-7.3. Centrifugar um tempo final em 1000 x g para 10 min a 4 °C. - A suspensão deve agora consistir em três camadas distintas (Figura 3). Aspire a camada mais alta. Varrer a ponta pipeta para frente e para trás para aspirar a camada média branca. Remova o máximo possível da camada média sem perturbar a camada mais baixa.
NOTA: Este passo é crítico; realizar com proficiência e destreza. - Adicione 2 mL de D-PBS frio e pipeta para cima e para baixo para misturar.
- Centrifugar a 1000 x g por 10 min a 4 °C com aceleração total e freio completo. Aspire e descarte o supernaspe. Resuspense a pelota em 1 mL de buffer BSA.
NOTA: As células podem ser resuspendidas no buffer apropriado e, em seguida, rotuladas magneticamente e isoladas em preparação para sequenciamento de células únicas neste momento.
8. Contagem celular
- Execute a contagem de células de acordo com o protocolo do fabricante do contador de células disponível (uma opção é notada na Tabela de Materiais)
9. Mancha viva/morta
- Centrifugar os 900 μL restantes (de 7,7) a 1000 x g por 10 min a 4 °C com aceleração total e freio completo.
- Enquanto a amostra estiver girando, rotule um tubo de fluxo por amostra e enrole-o em papel alumínio para limitar a exposição à luz.
- Aspire e descarte o supernaspe.
- Resuspend a pelota em 50 μL de mancha viva/morta diluída (previamente preparada).
NOTA: Esta etapa deve ser realizada em uma configuração de baixa luz. Desligue as luzes da sala aérea para conseguir isso. - Transfira cada amostra para o tubo de fluxo rotulado correspondente e incubar à temperatura ambiente por 8-10 min no escuro (por exemplo, uma gaveta ou caixa).
- Adicione 500 μL de tampão BSA e centrífuga a 1000 x g por 10 min a 4 °C com aceleração total e freio completo.
- Aspire e descarte o supernaspe.
NOTA: A pelota pode não ser visível; Deixe uma pequena quantidade de tampão para trás para não aspirar involuntariamente a pelota. As células podem ser resuspendidas no buffer apropriado, bloqueadas e manchadas com anticorpos específicos das células neste momento. Consulte o Arquivo Suplementar 1 para o protocolo de amostra18.
10. Fixação (opcional)
- Resuspense a pelota em 200 μL de 1% pfa (previamente preparado). Incubar por 15 min a 4 °C.
- Lave adicionando 500 μL de D-PBS e centrífuga a 300 x g por 10 min a 4 °C.
- Aspire o supernatante.
NOTA: A pelota pode não ser visível; Deixe uma pequena quantidade de tampão para trás para não aspirar involuntariamente a pelota. - Resuspense a pelota em 200 μL de D-PBS e armazene a 4 °C por até 3 dias.
11. Citometria de fluxo
- Rotule as tampas do filtro nos novos tubos.
- Usando uma pipeta de 1 mL, pipeta cada amostra na tampa do filtro.
- Centrifugar brevemente a 200 x g a 4 °C, permitindo apenas que a centrífuga atinja 200 x g antes de parar a corrida.
- Prossiga para o núcleo de citometria de fluxo para análise a jusante.
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Representative Results
As amostras foram processadas com um citômetro de fluxo em uma instalação central, e os dados resultantes foram avaliados com um pacote de software para análise de fluxo. Anteriormente, foram analisados os controles de compensação- a mancha viva/morta e o controle negativo. Se forem utilizados vários fluorochromes, os controles de fluorescência menos um (FMO) e os controles de uma única mancha devem ser preparados para cada anticorpo. A compensação pela sobreposição espectral para as amostras experimentais foi calculada com base nos controles analisados. Para identificação da população celular, foi utilizada uma estratégia hierárquica de gating. O portão primário excluiu detritos na dispersão dianteira (tamanho da célula) versus dispersão lateral (granularidade) lote19,20. Posteriormente, foram excluídas as células mortas (Figura 4, Figura 5, Figura 6, Figura Suplementar 1, Figura Suplementar 2, Figura Suplementar 3 e Figura Suplementar 4). O portão seguinte excluiu as células positivas para a Proteína Básica de Mielina (Figura Suplementar 4). Das células remanescentes, foram criadas parcelas de densidade de células positivas para cada fluorocromo (Figura Suplementar 4). A frequência de cada população celular neuronal foi calculada a partir do terceiro portão (Figura Suplementar 4). As amostras processadas com dissociação mecânica manual21 e digestão enzimática produziram uma população substancialmente menor de células de interesse (Arquivo Suplementar 221, Figura 4 e Figura Suplementar 1). Por outro lado, tanto amostras fixas quanto frescas preparadas por meio de dissociação mecânica automatizada e digestão enzimática devolveram uma população de células de interesse várias vezes maior (Figura 5, Figura 6, Figura Suplementar 2 e Figura Suplementar 3).
Figura 1: Cérebro de rato. (A) Devidamente perfundido. (B) Não perfundido. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Status selecionado na etapa 6.4. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Suspensão em camadas tri-camadas na etapa 7.5: Tampão (camada superior), detritos celulares, solução de remoção de detritos e células (camada inferior). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Análise representativa de amostras fixas processadas utilizando uma combinação de dissociação manual por trituração de pipetas pasteur e digestão enzimática. Primeira de duas amostras processadas simultaneamente. a Percentual de células que são a população celular de interesse. (B) Percentual da população de interesse que são células vivas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Análise representativa de amostras frescas processadas utilizando uma combinação de dissociação mecânica automatizada e digestão enzimática. Primeira de duas amostras processadas simultaneamente. a Percentual de células que são a população celular de interesse. (B) Percentual da população de interesse que são células vivas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Análise representativa de amostras fixas processadas utilizando uma combinação de dissociação mecânica automatizada e digestão enzimática. Primeira de duas amostras processadas simultaneamente. a Percentual de células que são a população celular de interesse. (B) Percentual da população de interesse que são células vivas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura suplementar 1: Análise representativa de amostras fixas processadas utilizando uma combinação de dissociação manual de trituração de pipeta Pasteur e digestão enzimática. Em segundo lugar, duas amostras processadas simultaneamente. a Percentual de células que são a população celular de interesse. (B) Percentual da população de interesse que são células vivas. Clique aqui para baixar este Arquivo.
Figura suplementar 2: Análise representativa de amostras frescas processadas utilizando uma combinação de dissociação mecânica automatizada e digestão enzimática. Em segundo lugar, duas amostras processadas simultaneamente. a Percentual de células que são a população celular de interesse. (B) Percentual da população de interesse que são células vivas. Clique aqui para baixar este Arquivo.
Figura suplementar 3: Análise representativa de amostras fixas processadas utilizando uma combinação de dissociação mecânica automatizada e digestão enzimática. Em segundo lugar, duas amostras processadas simultaneamente. a Percentual de células que são a população celular de interesse. (B) Percentual da população de interesse que são células vivas. Clique aqui para baixar este Arquivo.
Figura suplementar 4: Análise representativa de amostras manchadas e fixas processadas utilizando uma combinação de dissociação mecânica automatizada e digestão enzimática. a Percentual de células que são a população celular de interesse. (B) Percentual da população de interesse que são células vivas. (C) Células MBP. (D) células PSA-NCAM+ (Células Precursoras Neuronais). (E) células ACSA2+ (Astrócitos). (F) células CD31+ (Endotelial). (G) células CD11b+ (Microglia). Clique aqui para baixar este Arquivo.
Arquivo Suplementar 1: Protocolo de coloração. Um protocolo de coloração de amostras para a imunostenção de marcadores de superfície celular. Clique aqui para baixar este Arquivo.
Arquivo suplementar 2: Protocolo de dissociação manual adaptado e enzimático. Este método é adaptado de um protocolo21 publicado anteriormente. Clique aqui para baixar este Arquivo.
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Discussion
Várias etapas neste protocolo de dissociação neural requerem técnica proficiente e destreza-perfusão, aspiração supernante e remoção de mielina. Durante todo o processo de perfusão, os órgãos internos devem permanecer intactos (além de remover o diafragma e cortar o coração); isso inclui evitar as câmaras superiores do coração com a agulha borboleta. Enquanto a quantidade de soro fisiológico com heparina necessária varia, o fluido transparente que flui do coração indica que o processo está completo. O cérebro deve ser completamente e devidamente perfundido, nesse ponto ele vai parecer off-white (Figura 1). Com a perfusão, a etapa de remoção de glóbulos vermelhos torna-se ímega, eliminando o excesso de manipulação das amostras que podem resultar em perda celular. Posteriormente, a etapa de remoção de detritos requer uma mão firme. Para que a centrifugação resulte em camadas claramente definidas após a sobreposição D-PBS (Figura 3), as camadas não devem ser perturbadas em trânsito ou durante a tubulação. Além disso, ao aspirar as duas camadas superiores, a suspensão suficiente deve ser removida para eliminar detritos celulares excessivos, deixando ainda uma amostra grande o suficiente para trás. Este é um passo fundamental, pois as células mortas são mais propensas a se ligar sem especificamente e se tornar autofluorescentes22,23, enfatizando ainda mais a importância de escolher um método que consistentemente resulte em alta viabilidade celular. Finalmente, ao aspirar o supernasce, a pelota pode nem sempre ser visível. Uma pequena quantidade de sobrenante residual deve ser deixada para garantir que a amostra não seja descartada acidentalmente.
Há vantagens e desvantagens em fixar as amostras. Nem todos os marcadores de anticorpos são compatíveis com a fixação, limitando a análise a jusante dependendo das populações celulares de interesse. Além disso, o uso de PFA excessivamente concentrado ou a saída das células no fixador por um longo período de tempo pode resultar em autofluorescência e leituras falsas positivas, confundindo assim os resultados24,25. Usando uma solução pfa de 1% e minimizando a exposição das células, a probabilidade de leituras falso-positivas é muito reduzida. Como este procedimento é detalhado e tem muitas variáveis de tempo, o uso de células frescas coloca laboratórios sob restrições estritas de tempo para garantir que as células permaneçam viáveis. A fixação preserva a estrutura celular para análise no dia seguinte.
A análise unicelular pode fornecer insights fundamentais sobre a eficácia do tratamento, função celular e mecanismos de ação de doenças ou tratamentos. Os métodos de exemplo incluem DNA unicelular e sequenciamento de RNA 26,27, citometria pelo tempo de voo22,28, citometria de fluxo e imunohistoquímica. Com o sequenciamento de mRNA unicelular, a expressão genética no momento da coleta de amostras pode fornecer insights específicos do tipo celular26. Por exemplo, um grupo de pesquisa realizou sequenciamento de RNA unicelular em receptores de dopamina D1 e D2 expressando subtipos médios de neurônios espinhosos do estriato dorsomedial27. O grupo redefiniu a transcrição de neurônios espinhosos médios detectando novos genes marcadores específicos do subtipo e identificando genes que foram relatados anteriormente e incorretamente como expressos diferencialmente devido à falta de resolução unicelular27. Ho et al. destacaram o potencial de sequenciamento de RNA unicelular na descoberta de alvos de drogas específicas do tipo celular27. Com o sequenciamento de DNA unicelular, mudanças na expressão genética podem ser descritas medindo modificações de DNA e histona, acessibilidade de cromatina e conformação de cromatina26. Na medição da metilação do DNA de um núcleo único, Liu et al. construíram um atlas de metilome de DNA unicelular de 45 regiões cerebrais do camundongo e identificaram 161 tipos de células neuronais29. A preparação da amostra para sequenciamento de células únicas é mais complexa, especialmente o isolamento de células únicas e remoção de detritos. Mattei et al. examinaram o efeito da dissociação enzimática e mecânica no perfil transcriômico e proteótipo, observando que os métodos de dissociação neural introduzem inerentemente um nível de viés30. Vários grupos têm notado a importância de trabalhar de forma eficiente, dissecando no gelo e usando inibidores transcricionais 26,30,31. Mattei et al. também identificaram genes e proteínas afetados para informar a análise30. No entanto, essas técnicas ainda fornecem insights detalhados sobre blocos de construção celular que são incomparáveis pela transcrição de tecido em massa26,27.
A citometria de fluxo é uma poderosa ferramenta analítica que pode identificar e medir simultaneamente parâmetros de populações unicelulares usando sondas fluorescentes. Algumas aplicações de citómetros de fluxo incluem análise de ciclo celular, classificação celular, viabilidade, fenotipagem, proliferação celular e análises funcionais 32,33. A maioria dessas aplicações utiliza manchas superficiais devido à acessibilidade de proteínas da superfície celular. Essas proteínas podem ser manchadas para identificar populações celulares específicas com base na linhagem, estágio de desenvolvimento e função 19,32,33. Por exemplo, as amostras podem ser manchadas pela superfície para identificar populações de astrócitos, células endoteliais, células precursoras neuronais e microglia34. Uma vantagem primária ao colorir proteínas superficiais de células vivas é ser capaz de classificar as células, mantendo a opção de realizar uma análise mais a jusante34. Embora as técnicas de coloração da superfície sejam bastante padrão, a coloração intracelular é um procedimento mais delicado. Com a citometria de fluxo intracelular, as células devem ser fixadas e permeabilizadas antes da coloração para permitir que o anticorpo atravesse a membrana celular 20,32,33,34. Idealmente, a morfologia celular permanecerá intacta; no entanto, a permeabilização corre o risco de desnaturação de proteínas, o que afetaria negativamente a detecção de anticorpos22,34. Alguns métodos de análise mais a jusante não são mais uma opção uma vez que as células são fixas20. Embora as desvantagens da coloração intracelular sejam mais pronunciadas do que a coloração da superfície, a primeira permite a detecção e análise de moléculas intracelulares que de outra forma não seriam plausíveis. Além disso, os procedimentos de coloração da superfície celular e intracelular podem ser acoplados para identificar definitivamente certos tipos de células ou avaliar parâmetros adicionais simultaneamente 20,28,34.
Existem vários métodos de dissociação neural que podem ser usados para preparar a suspensão unicelular necessária para análise celular, embora não sejam igualmente eficazes. Comparado com kits padronizados e as técnicas acima mencionadas, este método particular de dissociação neural destina-se ao processamento de pequenas quantidades de tecido, produz uma suspensão unicelular altamente viável (>90%) e agiliza o experimento. Com este protocolo, outros laboratórios estão equipados para realizar a dissociação neural de forma confiável e reprodutível.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos à Aimee Rogers por fornecer treinamento prático e suporte contínuo ao produto. Agradecemos à Dra. Agradecemos a Meredith Joheim e ao Grupo de Comunicação Científica da UAMS pela edição gramatical e formatação deste manuscrito. Este estudo foi apoiado pelo NIH R25GM083247 e NIH 1R01CA258673 (A.R.A).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 02-682-003 | Basix, assorted color |
| 15 mL Falcon Tubes | Becton Dickinson Labware Europe | 352009 | Polystyrene |
| 25 mL Serological Pipets | Fisher Scientific | 14-955-235 | |
| 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube | Falcon | 352052 | |
| 500 mL Vacuum Filter/ Storage Bottle System | Corning | 431097 | |
| 70 μm cell strainer | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Adult Brain Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-107-677 | Contains Enzyme P, Buffer Z, Buffer Y, Enzyme A, Buffer A, Debris Removal Solution |
| Aluminum Foil | Fisher Scientific | 01-213-105 | |
| Anti-ACSA-2-PE-Vio770, mouse, clone REA969 | Miltenyi Biotec | 130-116-246 | |
| Anti-Myelin Basic Protein | Sigma-Aldrich | M3821-100UG | |
| Anti-PSA-NCAM-PE, human, mouse and rat, Clone 2-2B | Miltenyi Biotec | 130-117-394 | |
| BD LSRFortessa | BD | ||
| BSA | Sigma-Aldrich | A7906-50G | |
| CD11b-VioBlue, mouse, Clone REA592 | Miltenyi Biotec | 130-113-810 | |
| CD31 Antibody | Miltenyi Biotec | 130-111-541 | |
| Ceramic Hot Plate Stirrer | Fisher Scientific | 11-100-100SH | |
| Dimethyl Sulfoxide | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Ethanol | Pharmco by Greenfield Global | 111000200 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Fine Scissors - Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 | Perfusion |
| FlowJo | BD | (v10.7.0) | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| Gibco DPBS (1X) | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
| Glass Beaker | Fisher Scientific | 02-555-25A | |
| Heparin sodium | Fresenius Kabi | 504011 | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher | L34965 | |
| Magnetic Stir Bar | Fisher Scientific | 14-513-51 | |
| Noyes Spring Scissors | Fine Science Tools | 15012-12 | Dissection |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 441244-3KG | Prilled, 95% |
| Pipette tips GP LTS 20 µL 960A/10 | Rainin | 30389270 | |
| Pipette Tips GP LTS 250 µL 960A/10 | Rainin | 30389277 | |
| Pipette tips RT LTS 1000 µL FL 768A/8 | Rainin | 30389213 | |
| Rainin Pipet-Lite XLS (2, 20, 200, 1000 μL) | Rainin | 30386597 | |
| RBXMO FITC XADS | Fisher Scientific | A16167 | |
| Round Ice Bucket with Lid | Fisher Scientific | 07-210-129 | |
| Round-Bottom Tubes with Cell Strainer Cap | Falcon | 100-0087 | |
| S1 Pipet Fillers | ThermoFisher Scientific | 9541 | |
| Spatula & Probe | Fine Science Tools | 10090-13 | Dissection & Perfusion |
| Surflo Winged Infusion Set 23 G x 3/4" | Termuno | SV-23BLK | Butterfly needle |
| Test Tube Rack | Fisher Scientific | 14-809-37 | |
| Thermo Scientific Legend XTR Centrifuge | ThermoFisher | discontinued | Or other standard table top centrifuge |
| Variable-Flow Peristaltic Pump | Fisher Scientific | 13-876-2 | Low-flow model |
| VetFlo Starter Kit for Mice | Kent Scientific | VetFlo-MSEKIT | Anesthesia mask, tubing, induction chamber, charcoal canisters |
| VetFlo Vaporizer Single Channel Anesthesia System | Kent Scientific | VetFlo-1210S | 0.2–4 LPM |
| Vi-CELL XR Cell Viability Analyzer | Beckman Coulter Life Sciences | 731196 | Cell Counting |
| Vi-CELL XR 4 Bags of Sample Vials | Beckman Coulter Life Sciences | 383721 | Cell Counting |
References
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