Summary
该协议详细介绍了从 委内瑞拉链霉菌 无细胞转录翻译（TX-TL）系统合成高产量重组蛋白的增强方法。
Abstract
链霉菌 属是临床抗生素和工业化学品的主要来源。 委内瑞拉链霉菌 ATCC 10712是一种快速生长的菌株，是氯霉素，jadomycin和pikromycin的天然生产者，这使其成为下一代合成生物学底盘的有吸引力的候选者。因此，加速 委内瑞拉链球菌 ATCC 10712以及其他 链霉菌 属模型开发的遗传工具对于天然产物工程和发现是非常理想的。为此，该方案提供了专用 的委内瑞拉链球菌 ATCC 10712无细胞系统，以实现高G + C（%）基因的高产异源表达。该方案适用于96孔或384孔板形式的小规模（10-100μL）间歇反应，而反应可能可扩展。无细胞系统坚固耐用，可以在最小的设置中实现一系列重组蛋白的高产量（约5-10 μ M）。这项工作还结合了广泛的质粒工具集，用于实时测量mRNA和蛋白质合成，以及标记蛋白质的凝胶内荧光染色。该方案还可以与高通量基因表达表征工作流程或研究放线菌基因组中存在的高G + C（%）基因的酶途径相结合。
Introduction
无细胞转录-翻译 （TX-TL） 系统为合成生物学提供了一个理想的原型设计平台，以实现快速的设计-构建-测试-学习周期，这是合成生物学的概念工程框架1。此外，人们对在开放反应环境中用于高价值重组蛋白生产的 TX-TL 系统的兴趣日益浓厚，例如，在抗体-药物偶联物中掺入非标准氨基酸3。具体而言，TX-TL需要细胞提取物，质粒或线性DNA以及能量溶液来催化批量或半连续反应中的蛋白质合成。虽然 大肠 杆菌 TX-TL 是主要的无细胞系统，但许多新兴的非型号 TX-TL 系统已引起不同应用的关注4，5，6，7，8。TX-TL 的主要优势包括灵活的可扩展性（纳升至升级）9，10、强大的再现性和自动化工作流程8、11、12。特别是，TX-TL的自动化允许加速遗传部分和调节元件的表征8，12，13。
在反应设置方面，TX-TL需要一次和二次能量源，以及氨基酸，辅因子，添加剂和模板DNA序列。核苷酸三磷酸盐（NTPs）为驱动初始mRNA（ATP，GTP，CTP和UTP）和蛋白质合成（仅ATP和GTP）提供了主要能量来源。为了提高TX-TL产量，NTP通过二次能源的分解代谢再生，例如麦芽糖14，麦芽糖糊精15，葡萄糖14，3-磷酸甘油酯（3-PGA）16，磷酸烯醇丙酮酸盐17和L-谷氨酸18。这种固有的代谢活动令人惊讶地具有多功能性，但研究很少，特别是在新兴的TX-TL系统中。每种能源在ATP产率、化学稳定性和成本方面都有不同的性质和优势，这是扩大TX-TL反应的重要考虑因素。到目前为止，目前 大肠杆菌 TX-TL的方案对于模型绿色荧光蛋白（GFP）已达到4.0mg / mL（~157μM），使用3-PGA（30mM），麦芽糖糊精（60mM）和D-核糖（30 mM）的混合物作为二次能量源19。
最近，人们对研究TX-TL系统中的二次代谢物生物合成途径的兴趣日益浓厚20，21，22。具体而言，放线菌是继发代谢物的主要来源，包括抗生素和农药23，24。他们的基因组富含所谓的生物合成基因簇（BGC），其编码二次代谢物生物合成的酶途径。为了研究放线菌遗传部分和生物合成途径，最近开发了一系列基于链霉菌的TX-TL系统5，6，25，26。这些专门的链霉菌TX-TL系统具有潜在的益处，原因如下：[1]为链霉菌spp.26的酶提供天然蛋白质折叠环境;[2] 获得高G+C（%）基因表达的最佳tRNA库;[3]活跃的初级代谢，可能被劫持以提供生物合成前体;和[4]提供天然细胞提取物中存在的二次代谢的酶，前体或辅因子。因此，最近建立了一个高收益的 S.venezuelae TX-TL 工具包来利用这些独特的功能5。
委内瑞拉链霉菌 是合成生物学的新兴宿主，在工业生物技术领域具有丰富的历史5，27，28，29 ，并作为研究放线菌细胞分裂和遗传调控的模型系统30，31，32。主要类型菌株 S. venezuelae ATCC 10712具有相对较大的基因组，为8.22 Mb，G + C含量为72.5%（加入号：CP029197），编码7377个编码序列，21个rRNA，67个tRNA和30个生物合成基因簇27。在合成生物学中， S. venezuelae ATCC 10712是生物合成途径异源表达的有吸引力的底盘。与大多数其他 链霉菌 染色剂不同，它提供了几个关键优势，包括快速的倍增时间（约40分钟），广泛的遗传和实验工具5，28，缺乏菌丝结块以及在液体培养基中孢子28，33。一些研究还证明了 委内瑞拉链球菌 用于多种次级代谢物的异源生产，包括聚酮类，核糖体和非核糖体肽34，35，36，37，38。这些组合特征使该菌株成为合成生物学和代谢工程应用的有吸引力的微生物宿主。虽然 委内瑞拉链球菌 不是异源基因表达的主要 链霉菌 模型，但随着进一步的发展，它已准备好在天然产物发现中得到更广泛的应用。
本手稿介绍了高产委内瑞拉链球菌 TX-TL 系统的详细实验方案（图 1），该系统已从先前发表的原始协议进行了更新26。在这项工作中，能量溶液和反应条件已经过优化，使用标准质粒pTU1-A-SP44-mScarlet-I，在4小时，10μL间歇反应中将mScarlet-I报告蛋白的蛋白质产量提高到260μg/mL。该质粒经过专门设计，可实现检测蛋白质表达的各种方法。该协议也得到了简化，而能源系统已经过优化，以降低建立无细胞反应的复杂性和成本，而不会影响产量。除了优化的TX-TL系统外，还开发了一个遗传部分库，用于微调基因表达，并作为实时监测TX-TL的荧光工具，从而为链霉菌属和相关放线菌的基因表达和天然产物生物合成途径原型化创建了一个多功能平台。
在这项工作中，推荐的标准质粒（pTU1-A-SP44-mScarlet-I）可用于在新实验室中建立委内瑞拉链球菌TX-TL工作流程，并且可以在AddGene上使用（参见补充表S1）。pTU1-A-SP44-mScarlet-I为用户提供了研究其他开放式阅读框架（ORF）的灵活性。mScarlet-I ORF是针对委内瑞拉链球菌基因表达而优化的密码子。SP44启动子是一种强的构成性启动子，在大肠杆菌和链霉菌spp.39中均具有高活性。质粒具有两个独特的限制性内切酶位点（NdeI，BamHI），允许使用联合C端FLAG标签和荧光素砷发夹（FlAsH）粘合剂标签系统在框架内对新的ORF进行亚克隆。或者，在亚克隆新基因后，可以通过包含终止密码子来去除这两个标签。使用该碱基载体，已经证明了一系列蛋白质的高产表达，即来自土霉素生物合成途径的蛋白质和来自Streptomyces rimosus的未表征的非核糖体肽合成酶（NRPS）（图2）。在mRNA检测方面，pTU1-A-SP44-mScarlet-I标准质粒含有dBroccoli适配体（在3'-未翻译区域），用于使用3，5-二氟-4-羟基苄叉亚氮烷（DFHBI）探针进行检测。为了提高灵活性，AddGene上还提供了EcoFlex40兼容MoClo部件的工具集，包括EcoFlex兼容的链霉菌穿梭载体（pSF1C-A-RFP/ pSF2C-A-RFP）和一系列pTU1-A-SP44变体质粒，表达超级折叠绿色荧光蛋白（sfGFP），mScarlet-I，mVenus-I和β葡萄糖醛酸酶（GUS）。特别是，pSF1C-A质粒来自pAV-gapdh28，并固化为MoClo组装的BsaI / BsmBI位点。pSF1C-A-RFP/pSF2C-A-RFP 相当于 EcoFlex40 的 pTU1-A-RFP/pTU2-A-RFP，但包含链霉菌属中偶联和染色体整合的附加功能。使用phiC31整合酶系统28。
该协议的第一阶段涉及 委内瑞拉链球菌 ATCC 10712或密切相关菌株的生长，中等指数阶段的细胞收获，细胞洗涤步骤以及S30A和S30B缓冲液中的平衡。该阶段需要三天，细胞生长的时间可用于制备剩余的组分，如下所述。然后通过超声处理裂解收获的细胞，澄清并进行径流反应。在制备的最后阶段，可以制备细胞提取物以在-80°C下长期储存，以最大限度地减少活性损失。对于使用此方案组装TX-TL反应，提出了 链霉菌 预混液（SMM），并可选择最小能量溶液格式（MES），可提供相当的产量。此外，建议将 委内瑞拉链球菌 ATCC 10712的新鲜培养物从-80°C的甘油储备到GYM琼脂平板上，并在28°C下孵育至少48-72小时，直到单个菌落可见。以下步骤应仅使用新鲜培养物。
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Protocol
注：有关GYM培养基和琼脂平板以及S30A和S30B洗涤缓冲液的配方，请参见表1和表2。
1. 准备解决方案和一般指导
- 制备后将所有溶液，细胞（生长后）和细胞提取物保存在冰上，除非有例外。
- 在室温下储存1M Mg-谷氨酸盐，4M K-谷氨酸盐，40%（w / v）PEG 6000，1 g / mL聚乙烯磺酸的库存，以及在-80°C下储存所有其他库存。 尽量减少冻融循环的次数，以避免化学降解。
- 对于能量溶液储备（见 表3）如3-PGA（需要pH调节）的制备，请遵循 大肠杆菌 TX-TL协议41中提供的指导。
注：所有组分均完全溶于ddH 2 O中，并作为等分试样储存在-80°C冰箱中。 - 在冰上解冻单个股票或能量溶液（稍后描述）。将氨基酸储备在42°C下加热，涡旋约15-30分钟以溶解所有氨基酸。
- 当一些氨基酸（L-Cys，L-Tyr，L-Leu）沉淀在冰上时，同时尽量减少休息时间，将该溶液留在室温下并使用涡旋溶解。
- 加入库存溶液和水的计算体积（表3），并使用涡旋充分混合。
- 将能量溶液以每管20-100μL等分试样等分，或根据需要在冰上等分，并储存在-80°C直至进一步使用。
2. 委内瑞拉链球菌 ATCC 10712细胞的制备
- 第1天培养基/缓冲液制备和过夜预培养
- 在2 L挡板烧瓶中制备1L无菌GYM液体培养基，如 表1所述。请参阅设备/化学/试剂来源 的材料表 。
- 在250 mL锥形瓶中制备1 x 50 mL无菌GYM液体培养基，如 表1所述。
- 准备100毫升1 M HEPES-KOH pH 7.5，100 mL 1 M MgCl2和500 mL 4 M NH4Cl溶液，以制作1 L S30A和1 L S30B洗涤缓冲液。有关食谱，请参见 表 2 。
- 准备过夜的预培养。将无菌的50 mL GYM液体培养基在250 mL锥形瓶中预热至28°C30分钟。
- 将来自GYM琼脂平板的单个 委内瑞拉链球菌 ATCC 10712（或相关菌株）接种到预热的50 mL GYM液体培养基中，并在28°C，200rpm下孵育16小时（过夜预培养）。
- 第2天 - 准备白天的预培养和主要成长培养。
- 将50 mL无菌健身房液体培养基在250 mL锥形瓶中预热28°C30分钟。
- 将1 mL过夜预培养物转移到预热的50 mL GYM液体培养基中，并在28°C，200rpm下孵育8小时（白天预培养）。
- 在此生长期之后，在1 mL（1 cm路径长度）塑料比色皿中使用无菌GYM培养基进行1：10稀释，在分光光度计中检查OD600 。
注意：OD600 应至少达到 3-4。如果生长不良，建议重复步骤2.2.1-2.2.2。 - 将0.25 mL日间预培养物分培养到2 L挡板烧瓶中的1 L液体GYM培养基中。
- 在28°C，200rpm下摇动过夜14小时。
- 第3天 - 收获细胞
- 在上一个孵育期（14小时）之后，记录主培养物的OD600 。用新鲜的GYM培养基以1：10稀释过夜培养物，用于OD 600 测量。
注意：OD600 在此阶段应已达到 3.0-4.0。 - 如果OD 600<3.0，则将振荡速度增加到250-300 rpm并生长，直到达到OD 600 3.0。再生长不超过2小时（总共16小时）。
- 如果OD 600>3.0，将培养物转移到离心容器中，并在湿冰上快速冷却30分钟。
- 在等待细胞培养物在冰上冷却的同时，准备4mL新鲜的1M二硫磷脂醇（DTT），S30A和S30B缓冲液，如 表1所述，并将它们保存在冰上。参见化学/试剂来源 的材料表 。
- 预先称量空的50 mL离心管，并在-20°C下预冷。
- 在冰上加入2 mL 1 M DTT到1 L S30A缓冲液中并混合均匀。
注意：仅在使用前将DTT添加到S30A和S30B洗涤缓冲液中。 - 在6，000× g，4°C，10分钟下离心细胞，并以快速和单一的运动小心地丢弃上清液。
注意：如果沉淀受到干扰，请用剩余的GYM培养基最大化细胞保留并继续实验方案。 - 加入500mL S30A缓冲液，并通过剧烈摇动离心瓶直到细胞团块均匀分散来重悬细胞。
- 将细胞在6，000× g，4°C，6分钟下离心，并小心地丢弃上清液。
注意：尽管此时细胞沉淀会更坚固，但一些细胞将保持悬浮状态（见 图1）。按照2.3.7中所述进行处理，并保留尽可能多的细胞。 - 重复步骤 2.3.8-2.3.9。
- 在冰上加入2 mL 1 M DTT到1 L S30B缓冲液中并混合均匀。向细胞中加入500mL S30B缓冲液。重复步骤 2.3.9。
- 将细胞沉淀重悬于10mL S30B缓冲液中，并转移到预称量，预冷的50mL离心管中。如果需要，用额外的5-10mL S30B缓冲液转移残留细胞。用 S30B 填充至 50 mL。
- 在6，000× g，4°C，10分钟下离心细胞，并小心地丢弃上清液。
- 重复步骤 2.3.13。
- 用100-200μL移液器小心地吸出剩余的S30B上清液。
- 称量湿细胞沉淀。
注意：1 L过夜健身房培养物（OD 600 = 3.0 ）的典型湿细胞沉淀重量约为4.5g。 - 对于每1g湿细胞，加入0.9mL S30B缓冲液。使用巴斯德移液器或涡旋重悬细胞。
- 短暂（〜10秒）离心至500× 克 以沉淀细胞。
注意：此时可以暂停实验方案，细胞可以在液氮或干冰上冷冻并储存在-80°C下。 为了安全起见，在处理液氮时，请穿戴适当的个人防护装备（PPE），包括面罩和手套。
- 在上一个孵育期（14小时）之后，记录主培养物的OD600 。用新鲜的GYM培养基以1：10稀释过夜培养物，用于OD 600 测量。
3.通过超声处理进行细胞裂解，得到粗细胞提取物
注意：在此阶段，用户可以选择通过超声处理以1 mL级分（选项1）或作为更大的细胞悬浮液（5 mL）在50 mL管（选项2）中破坏细胞。下面详细介绍了这两种选择，以确保可重复性，因为细胞悬浮液的最终体积可能由于先前收获和洗涤步骤中细胞的损失而发生变化。新用户应首先尝试选项 2.1 以建立协议。
- 通过超声处理 1 mL 级分进行细胞裂解
- 使用1 mL移液器吸头（切断吸头末端以增加孔径），将1 mL细胞悬浮液转移到2 mL微量离心管中。
注意：如果细胞被冷冻，在细胞裂解之前，在温水中快速解冻含有沉淀的50 mL管。一旦颗粒开始解冻，立即将管子转移到湿冰上，并冷却10分钟。 - 将每个微量离心管放入冰水烧杯中，使用塑料管架固定管以进行超声处理。
注意：由于细胞提取物对过热的敏感性，确保管子不升温以防止蛋白质沉淀和酶活性降低至关重要。 - 使用尖端直径为3 mm的超声探头，并用70%（v / v）乙醇和双蒸馏水（ddH 2O）清洁。将超声器尖端降低到细胞悬浮液中，直到其低于液体表面约1厘米。
- 将以下设置输入声波器：20 kHz频率，65%振幅，10 s脉冲导通时间，10 s脉冲关断时间，1分钟总超声处理时间。
- 运行超声处理协议。在前两个静息周期中，将管向上/向下和向侧面移动，以确保细胞均匀超声处理。记录能量输入。
注意： 为了安全起见，在超声处理过程中应佩戴适当的听力保护装置。随着细胞被破坏，粘度将降低，苍白的奶油湿细胞沉淀应变成均匀的棕色液体。推荐的能量输入为每mL湿电池240 J。如果细胞仅部分裂解，悬浮液仍将呈现奶油色，具有粘稠的细胞团块，特别是在管的侧面。 - 将管倒置2-3次，并重复超声处理一个或两个10秒的循环，频繁混合直到细胞完全被破坏。
- 使用1 mL移液器吸头（切断吸头末端以增加孔径），将1 mL细胞悬浮液转移到2 mL微量离心管中。
- 通过超声处理5 mL细胞悬浮液进行细胞裂解
- 如果细胞被冷冻，在细胞裂解前在温水中快速解冻含有沉淀的50mL管并摇动。一旦颗粒开始解冻，立即将管子转移到湿冰上，并冷却10分钟。
- 以500 x g 短暂旋转管以沉淀细胞。
- 将50 mL管放入冰水烧杯中进行超声处理。
注意：由于细胞提取物对过热的敏感性，确保管子不升温以防止蛋白质沉淀和酶活性降低至关重要。 - 使用具有6 mm直径尖端的超声探头，并用70%（v / v）乙醇和ddH2 O清洁（参见 图1中6 mm探头的可视化示意图）。将超声器尖端降低到细胞悬浮液（〜5mL）中，直到它在液体表面以下〜1厘米。
- 将以下设置输入声波器：20 kHz 频率、65% 振幅、10 s 脉冲导通时间、10 s 脉冲关断时间、每 mL 湿电池 1 分钟总超声处理时间（总共 5 分钟）。
- 运行超声处理协议。在前两个静息周期中，将管向上/向下和向侧面移动，以确保细胞均匀超声处理。
注意： 为了安全起见，在超声处理过程中应佩戴适当的听力保护装置。随着细胞的破坏，粘度会降低，苍白的奶油湿细胞沉淀应该变成均匀的棕色液体。记录能量输入。建议最佳能量输入为每mL湿细胞240 J（5分钟超声处理总共约1200 J）。 - 如果某些单元格保持不变，请遵循步骤 3.1.5 中的指导。
- 将细胞提取物转移到2 mL微量离心管中。
4. 细胞提取物澄清和径流反应
- 在4°C下以16，000× g 离心裂解细胞10分钟以除去细胞碎片。将上清液作为1 mL等分试样转移到1.5mL微量离心管中。
- 对细胞提取物进行径流反应。将含有细胞提取物的1.5mL管在30°C下在加热块或培养箱上孵育60分钟，无需摇晃。
- 将细胞提取物在4°C下以16，000× g 离心10分钟。 将上清液池入15 mL离心管中。通过倒置管五次直到均匀来混合上清液，然后将其保持在冰上。轻轻反转以避免形成气泡。
- 用S30B缓冲液将10μL细胞提取物稀释100倍，并使用Bradford测定法测量总蛋白浓度，并进行三次技术重复（参见 补充材料S2 以获得Bradford测定指导）。
- 如果蛋白质浓度为20-25mg / mL，则将细胞提取物作为100μL等分试样转移到新的1.5mL管中，在液氮中闪冻，并储存在-80°C。
注意： 为安全起见，在处理液氮时应穿戴适当的个人防护用品，包括面罩和手套。 - 如果蛋白质浓度为<20 mg/mL，重复粗提液制备步骤，以确保高质量的细胞提取物和 TX-TL 产量与先前发表的工作相当5。
5. 质粒DNA模板的制备
- 根据制造商的说明，使用适当的质粒DNA纯化试剂盒，从在50 mL LB培养物（含100 mg / mL卡苄青霉素）中生长的新鲜转化的大肠杆菌质粒菌株（DH10β，JM109）中纯化pTU1-A-SP44-mScarlet-I质粒（pUC19来源）。
- 将质粒洗脱在2×300μL无核酸酶水中并结合组分。
- 加入0.1体积（66μL）的3M乙酸钠（pH 5.2）。
- 加入0.7体积（462μL）异丙醇。
- 将DNA在-20°C孵育30分钟。
- 在4°C下以16，000× g 离心30分钟并弃去上清液。
- 向DNA沉淀中加入2mL 70%（v / v）乙醇。
- 将试管倒置3-4次以重悬质粒DNA沉淀。
- 在4°C下以16，000× g 离心5分钟并弃去上清液。
- 重复步骤5.7-5.9并除去所有可见液体。
- 用真空离心机风干DNA沉淀10-30分钟或干燥5分钟。
- 用600μL无核酸酶的ddH 2 O重悬干燥的沉淀。
- 使用分光光度计测量DNA浓度和纯度。
- 准备50-100μL等分试样并储存在-20°C。
注意：由于无细胞反应的体积限制，建议使用500-1000 ng /μL范围内的高DNA浓度。将质粒DNA储备稀释至80 nM;168 ng/μL pTU1-A-SP44-mScarlet-I 质粒相当于 80 nM。
6. 链霉菌 预混液（SMM）溶液的制备
- 氨基酸溶液
- 使用氨基酸采样器套件，按照制造商在线提供的说明，避免手动错误并缩短制备时间。
- 使用ddH 2 O将20x氨基酸储备溶液稀释至6mM（5mM L-Leu）的终浓度。
- 在2.4x SMM溶液中进一步稀释至 2.4mM（2mM L-Leu）（见 表3）。
注意：TX-TL反应中的最终浓度为1 mM 19x氨基酸和0.83 mM L-Leu。
- 能源解决方案和添加剂
- 按照表3中描述的配方制备2.4x SMM溶液中的其他组分。
- 或者，按照表3中描述的配方准备2.4倍最小能量溶液（MES）。
7. 建立标准 委内瑞拉链球菌 TX-TL反应
- 在冰上解冻细胞提取物， SMM （或 MES）溶液和质粒DNA。将384孔板预冷至-20°C。
- 建立TX-TL反应，其中25%的体积是质粒DNA，33.33%是细胞提取物，41.67%是 SMM 溶液;将它们放在冰上以避免开始时间偏差。
注：提供了标准的TX-TL模板（表4），用于根据反应次数计算所需试剂的体积。33 μL反应的标准体积如下：11μL细胞提取物，13.75μLSMM和8.25μL质粒DNA。 - 在低速设置下轻轻涡旋混合物约5秒，以确保溶液均匀。避免起泡/气泡形成。
- 将10μL等分试样作为技术一式三份转移到384孔板的三个孔中，而不会引入气泡。用透明盖子密封板，以400× g 旋转5秒。
- 在28°C下孵育反应，在培养箱（用于终点读数）或读板器中，无需摇晃。
注意：反应通常需要3-4小时才能完成。请参阅 补充材料 S2 ，了解读板器和 mScarlet-I 标准测量的指导。
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Representative Results
提供该详细实验方案作为示例，以帮助用户建立基于委内瑞拉链球菌ATCC 10712模型菌株的链霉菌TX-TL系统（图1）。用户可以寻求研究其他链霉菌菌株;然而，具有较长倍增时间或不同生长偏好的其他菌株的生长/收获阶段将需要定制优化才能达到峰值结果。对于代表性结果，对来自pTU1-A-SP44-mScarlet-I标准质粒的mScarlet-I荧光蛋白（图2和图3）进行了优化，以通过一系列检测方法（SDS-PAGE，荧光）在委内瑞拉链球菌TX-TL中提供高产表达。此外，该标准质粒被修饰以证明从S. rimosus合成的一系列次级代谢物酶（图2）5。最后，展示了放大天然产物生物合成的潜在工作流程，作为使用血红素生物合成早期阶段的模型途径的示意图。该工作流程可能适用于其他二级代谢物生物合成途径。作为指导原则，该方案应从AddGene上提供的表达质粒中为sfGFP提供2.8μM的最小产量，为mScarlet-I / mVenus提供3.5μM的最小产量。这些数字允许在先前的数据中观察到的典型批次变化（高达28%）5，尽管在最佳批次（未发表的数据）下已经实现了大于10μM mScarlet-I的产量。
使用五种不同的方法测量mScarlet-I基因的 委内瑞拉 链球菌TX-TL
显示了pTU1-A-SP44-mScarlet-I标准质粒的表达，使用五种不同的方法测量mScarlet-I表达：1.使用dBroccoli适配体实时荧光测量mRNA，2.使用FlAsH标签系统实时荧光测量未成熟的mScarlet-I蛋白，3.成熟mScarlet-I蛋白的实时荧光测量，4.使用FlAsH标签对mScarlet-I进行凝胶内荧光染色， 和 5.总无细胞蛋白的考马斯蓝染色。对于这些数据，将反应设置在2mL微量离心管中作为33μL反应（对于终点样品）或作为10μL技术一式三份在384孔板中的读板中。使用pET15b-mScarlet-I质粒单独纯化三标记（N端His6，C端Flag和C端FlAsH）mScarlet-I蛋白以创建用于测量的校准标准，该质粒在补充材料S2中进一步描述。这些实验的数据如图3所示。有关凝胶内荧光染色方法的更多详细信息，请参见补充材料 S3。
委内瑞拉链球菌 早期血红素生物合成的 TX-TL
为了作为天然产物生物合成途径的模型，使用pTU1-A-SP44-hemC-hemD/cysGA-hemB表达质粒5进行了尿卟啉原III（尿系III）的"一锅"生物合成。选择该模型生物合成途径是因为uro'gen III对氧具有高度敏感性，并且迅速氧化（六个电子的损失）为尿卟啉III，其显示出强烈的红色荧光。如前所述，这使得使用荧光测量和/或HPLC-MS（图4）可以轻松地实时检测反应5。此外，使用批次或半连续方法研究这些反应。半连续反应是一种策略，它使用微透析装置42，43提供额外的能量（NTP，二次能量源）和氨基酸，以延长反应时间并提高蛋白质合成产量。在这里，半连续方法用于放大血红素模型反应，并将TX-TL蛋白从反应产物中分离出来，以促进HPLC-MS的纯化和分析。有关方法的更多详细信息，请参见补充材料 S4 或数据，请参阅以前的工作5。半连续无细胞反应也在早期的工作中描述42，43。此处演示的示例示意图工作流程（图4）可能适用于其他天然产物生物合成途径。
图1： 委内瑞拉链霉菌 TX-TL方案概述。 图示了协议摘要，包括建议的三天时间范围。该方案分为细胞生长，细胞收获，细胞洗涤，超声处理，澄清，径流反应，预混液（SMM）制备，质粒DNA制备和TX-TL反应组装的不同阶段。文本中详细介绍了完整的协议，以及指南和实用技巧。缩写： SMM = 链霉菌 预混液;TX-TL = 转录-翻译。 请点击此处查看此图的放大版本。
图2：高G+C（%）基因的高产蛋白合成（A）sfGFP、mVenus-I和mScarlet-I荧光蛋白的合成。（B）从梨状链霉菌合成生物合成酶。缩写： EV = 空矢量;NRPS = 非核糖体肽合成酶。该数字是从5修改而来的。请参阅实验方案和补充文件，了解反应设置和方法。请点击此处查看此图的放大版本。
图3：使用pTU1-A-SP44-mScarlet-I质粒测量TX-TL五通。 （A）质粒设计包括以下特征：SP44是活性链霉菌属和大肠杆菌中的强构成性启动子;pET-RBS来源于pET表达质粒，在链霉菌属和大肠杆菌中均具有高活性5，40;链霉菌密码子优化的mScarlet-I基因，编码红荧光蛋白衍生物44;C端FLAG标签，用于亲和色谱纯化或蛋白质印迹检测;C端FlAsH标签，用于荧光标记，用于凝胶内染色或新生蛋白质合成的实时测量;dBroccoli 适配体，用于使用DFHBI探针进行实时mRNA测量;Bba_B0015转录终止子，在委内瑞拉链球菌ATCC 107125中非常有效;氨苄西林耐药标志物;和 pUC19 复制的起源。（B）实时mRNA表达，用dBroccoli适配子和DFHBI探针检测（激发483-14nm，发射530-30nm）。（C）使用FlAsH-EDT2荧光探针进行实时新生蛋白质合成检测（激发500-10nm，发射535-10nm）。（D）mScarlet-I合成的实时荧光测量（激发565-10nm，发射600-10nm）。（E） 使用 FlAsH-EDT2 荧光探针进行凝胶内染色。（F）用纯化的His6-mScarlet-I标准品对总TX-TL蛋白进行考马斯蓝染色进行比较。反应在方案中描述的条件下用40 nM质粒DNA模板运行。所有荧光数据都表示为RFU，误差线（三个技术重复的标准偏差）表示在灰色阴影区域内。缩写： TX-TL = 转录-翻译;FlAsH = fluorescein arsenical hairpin;DFHBI = 3，5-二氟-4-羟基亚苄基咪唑啉酮;RFU = 相对荧光单位。请点击此处查看此图的放大版本。
图4： 委内瑞拉链球菌 TX-TL半连续反应的工作流程示意图。 天然产物TX-TL的示例工作流程，使用HPLC-MS的早期血红素生物合成操纵子和下游分析。反应和分析在补充材料中有详细说明。该数字是从5修改 而来的。缩写： SMM = 链霉菌 预混液;TX-TL = 转录-翻译;ALA = 5-氨基乙酰丙酸;SPE = 固相萃取;ESI-MS = 电子喷雾电离质谱;HPLC-MS = 高效液相色谱-质谱。 请点击此处查看此图的放大版本。
表1：GYM细菌生长培养基和GYM琼脂平板的配方。请点击此处下载此表格。
表2：用于制备S30A和S30B洗涤缓冲液的试剂。 该信息改编自Kieser等人。45 缩写：DTT = 二硫代甲状腺素醇。 请点击此处下载此表格。
表3：制造 委内瑞拉S.MES 和SMM解决方案的配方。 缩写： MES = 最小能量溶液;SMM = 链霉菌 预混液;NTP = 核苷三磷酸;PEG 6000 = 聚乙二醇 6000;3-PGA = 3-磷酸甘油酯;G6P = 葡萄糖-6-磷酸;PVSA = 聚乙烯磺酸。 请点击此处下载此表格。
表4：委内瑞拉 链球菌 TX-TL反应 的配方。缩写： MES = 最小能量溶液;SMM = 链霉菌 预混液;TX-TL = 转录-翻译。 请点击此处下载此表格。
补充表S1：用于 委内瑞拉链球菌 TX-TL工作流程 的质粒。缩写：TX-TL = 转录-翻译。 请点击此处下载此表格。
辅助材料 S2：mScarlet-I 校准标准品制备和读板器测量。请点击此处下载此文件。
补充材料S3：FlAsH标签方法。 缩写：FlAsH = fluorescein arsenical hairpin。请点击此处下载此文件。
补充材料S4：半连续反应，纯化和HPLC-MS。请点击此处下载此文件。
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Discussion
在这份手稿中，描述了一种高收益的委内瑞拉链球菌TX-TL协议，并提供了详细的步骤，这些步骤对于有经验的用户和新用户来说都是直接的。现有链霉菌45和大肠杆菌TX-TL41方案的几个特征已被移除，以建立委内瑞拉链球菌TX-TL5，26的最小但高产量的方案。这里推荐的工作流程是确保委内瑞拉链球菌在所选的丰富培养基中迅速生长，以便能够在晚上接种最终培养物。这允许在第二天早上的生长高峰期收获细胞，并允许用户在同一天收获和制备活性细胞提取物。通过遵循这种简化的协议，预计单个研究人员可以在三天的框架内方便地完成该协议。还为委内瑞拉链球菌TX-TL系统提供了一个补充质粒工具包，包括一个强表达质粒系统（pTU1-A-SP44-mScarlet-I），它为mRNA/蛋白质分析提供了广泛的功能。该标准质粒由构成性SP44启动子提供动力，该启动子在一系列链霉菌属中具有高活性。和大肠杆菌39。为了证明委内瑞拉链球菌TX-TL工具包的初始潜力，代表性结果显示了一系列荧光蛋白，二次代谢物酶的高产量合成以及模型天然产物途径（来自血红素生物合成）的生物合成。
总体而言，该方案包含 委内瑞拉链球菌 TX-TL系统的详细说明，以及制备TX-TL反应的三种基本组分的实用技巧：（1）细胞提取物，（2） 链霉菌 预混液（SMM）溶液和（3）质粒DNA。该协议不需要专门的设备，只需要常规的微生物学和生物化学技能;因此，大多数实验室都可以使用它。该方案适用于小规模（10-100 μL）和更大规模反应（~2.5 mL），尽管反应尺寸/曝气的一些优化可能会影响蛋白得率。推荐的反应体积为2 mL管中的33μL或384孔板中的10μL。粗提取物需要五天时间才能由一个人从甘油储备开始准备。每升（L）培养物产生至少5mL细胞提取物（相当于〜1500×10μL TX-TL反应） - 这是保守估计值，并解释了洗涤步骤和细胞提取物澄清过程中的样品损失。协议的每个阶段都是独立的，可以由用户进行优化以满足他们的需求。所有无细胞系统的一个主要限制是批次变异46，47。一般因素包括移液错误、用户体验、培养基批次变化和设备差异。我们专门引入了预混液，以最大限度地减少移液误差，并提供涵盖介质和设备使用的详细说明。迄今为止，该协议可由至少五个英国研究小组的一系列用户重复。然而，目前尚不清楚生物变异对无细胞批次变异性的作用是什么。除了全球基因表达调控差异外， 链霉菌 属的基因组可塑性也被广泛报道，并且是潜在的贡献者48。为了研究批次变异，建议从四个过夜生长的单菌落中生长到最多四个单独的1L培养物。以前，在四个生物批次之间观察到高达28%的变化（就标准偏差而言）（每批4升，提供约20 mL细胞提取物）5。基于这些数据，新用户的合理最小目标值是sfGFP的2.8μM和使用AddGene上可用的质粒的3.5μM mScarlet-I / mVenus-I - 这些靶标比先前数据中观察到的平均值低30%。如果需要下游HPLC-MS分析，可以从预混液中除去PEG 6000，尽管预计总TX-TL收率可降低多达50%。
就专门的 链霉菌 无细胞系统的潜力5，6而言，人们越来越希望为天然产物等生物勘探应用开发新的湿实验室工具。 链霉菌 属沉浸在天然产物发现的历史中，包括抗生素，除草剂和药物49。从全基因组测序项目和最新的生物信息学工具中获得的知识不断增加50，51，52 揭示了微生物基因组中BGC编码的天然产物的空前水平53。解锁这种遗传信息（预计将包含对生物技术有用的新药物/化学品和酶）将需要开发新的合成生物学策略，包括新的表达系统和一系列代谢工程工具54。基于 链霉菌的专用TX-TL系统有利于研究放线菌和相关基因组的基因和调节元件，原因如下：[1]天然蛋白质折叠环境的可用性26，[2]获得用于高G + C（%）基因表达的最佳tRNA库，以及[3]用于生物合成前体潜在供应的活性初级代谢。此外，无细胞系统的一个关键优势是使用下一代测序13 和声学液体处理机器人对遗传部分和基因表达进行高通量表征8，11，12。总之， 委内瑞拉链球菌 TX-TL工具包5 为天然产物的合成生物学领域提供了一个补充工具。 委内瑞拉链球菌 TX-TL工具包将支持 委内瑞拉沙星 作为模型系统的进一步发展，并提供一种设计新型合成生物学部件/工具和探索次级代谢物生物合成途径和酶的方法。
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Disclosures
作者声明他们没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
作者希望感谢以下研究支持：EPSRC [EP/K038648/1] 为SJM提供PSF作为PDRA;惠康信托基金会在伦敦帝国理工学院为澳博与PSF赞助了ISSF奖学金;英国皇家学会研究资助[RGS\R1\191186];肯特大学SJM的惠康信托SEED奖[217528/Z/19/Z];和肯特大学KC的全球挑战研究基金（GCRF）博士奖学金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.5 L UltraYield Flask | Thomson | 931136-B | |
| 3-PGA (>93%) | Sigma | P8877 | |
| 384 Well Black/Clear Bottom Plate | ThermoFisher | 10692202 | |
| Ammonium chloride (98%) | Fluorochem | 44722 | |
| ATP, CTP, UTP, GTP (100 mM solution, >99%) | ThermoFisher | R0481 | |
| Carbenicillin (contact supplier for purity) | Melford | C46000-25.0 | |
| D-(+)-glucose (contact supplier for purity) | Melford | G32040 | |
| DFHBI (≥98% - HPLC) | Sigma | SML1627 | |
| DTT (contact supplier for purity) | Melford | MB1015 | |
| FlAsH-EDT2 (contact supplier for purity) | Santa Cruz Biotech | sc-363644 | |
| Glucose-6-phosphate (>98%) | Sigma | G7879 | |
| HEPES Free Acid (contact supplier for purity) | Melford | B2001 | |
| L-glutamic acid hemimagnesium salt tetrahydrate (>98%) | Sigma | 49605 | |
| Magnesium chloride (98%) | Fluorochem | 494356 | |
| Malt extract | Sigma | 70167-500G | |
| PEG-6000 | Sigma | 807491 | |
| Pierce 96-well Microdialysis Plate, 10K MWCO | ThermoFisher | 88260 | |
| Poly(vinyl sulfate) potassium salt | Sigma | 271969 | |
| Potassium glutamate (>99%) | Sigma | G1149 | |
| RTS amino acid sampler | 5 Prime | 2401530 | |
| Sodium chloride (99%) | Fluorochem | 94554 | |
| Supelclean LC-18 SPE C-18 SPE column (1 g) | Sigma | 505471 | |
| Yeast Extract | Melford | Y1333 | |
| Equipment | |||
| Platereader | BMG | Omega |
References
- Carbonell, P., et al. An automated Design-Build-Test-Learn pipeline for enhanced microbial production of fine chemicals. Communications Biology. 1, 66 (2018).
- Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. A user's guide to cell-free protein synthesis. Methods Protocols. 2 (1), 24 (2019).
- Zimmerman, E. S., et al. Production of site-specific antibody-drug conjugates using optimized non-natural amino acids in a cell-free expression system. Bioconjugate Chemistry. 25 (2), 351-361 (2014).
- Wiegand, D. J., Lee, H. H., Ostrov, N., Church, G. M. Cell-free protein expression using the rapidly growing bacterium Vibrio natriegens. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (145), e59495 (2019).
- Moore, S. J., et al. A Streptomyces venezuelae cell-free toolkit for synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 10 (2), 402-411 (2021).
- Xu, H., Liu, W. -Q., Li, J. Translation related factors improve the productivity of a Streptomyces-based cell-free protein synthesis system. ACS Synthetic Biology. 9 (5), 1221-1224 (2020).
- Yim, S. S., et al. Multiplex transcriptional characterizations across diverse bacterial species using cell-free systems. Molecular Systems Biology. 15 (8), 8875 (2019).
- Moore, S. J., et al. Rapid acquisition and model-based analysis of cell-free transcription-translation reactions from nonmodel bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (19), 4340-4349 (2018).
- Zawada, J. F., et al. Microscale to manufacturing scale-up of cell-free cytokine production--a new approach for shortening protein production development timelines. Biotechnology and Bioengineering. 108 (7), 1570-1578 (2011).
- Geertz, M., Shore, D., Maerkl, S. J. Massively parallel measurements of molecular interaction kinetics on a microfluidic platform. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (41), 16540-16545 (2012).
- McManus, J. B., Emanuel, P. A., Murray, R. M., Lux, M. W. A method for cost-effective and rapid characterization of engineered T7-based transcription factors by cell-free protein synthesis reveals insights into the regulation of T7 RNA polymerase-driven expression. Archives of Biochemistry and Biophysics. 674, 108045 (2019).
- McManus, J. B., et al. A method for cost-effective and rapid characterization of genetic parts. bioRxiv. , (2021).
- Park, J., Yim, S. S., Wang, H. H. High-throughput transcriptional characterization of regulatory sequences from bacterial Biosynthetic Gene Clusters. ACS Synthetic Biology. , (2021).
- Caschera, F., Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie. 99, 162-168 (2014).
- Caschera, F., Noireaux, V. A cost-effective polyphosphate-based metabolism fuels an all E. coli cell-free expression system. Metabolic Engineering. 27, 29-37 (2015).
- Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. coli RNA polymerase and sigma factor 70. Journal of Biological Engineering. 4, 8 (2010).
- Karim, A. S., Heggestad, J. T., Crowe, S. A., Jewett, M. C. Controlling cell-free metabolism through physiochemical perturbations. Metabolic Engineering. 45, 86-94 (2018).
- Cai, Q., et al. A simplified and robust protocol for immunoglobulin expression in Escherichia coli cell-free protein synthesis systems. Biotechnology Progress. 31 (3), 823-831 (2015).
- Garenne, D., Thompson, S., Brisson, A., Khakimzhan, A., Noireaux, V. The all-E. coli TXTL toolbox 3.0: New capabilities of a cell-free synthetic biology platform. Synthetic Biology. , (2021).
- Goering, A. W., et al. In vitro reconstruction of nonribosomal peptide biosynthesis directly from DNA using cell-free protein synthesis. ACS Synthetic Biology. 6 (1), 39-44 (2017).
- Khatri, Y., et al. Multicomponent microscale biosynthesis of unnatural cyanobacterial indole alkaloids. ACS Synthetic Biology. 9 (6), 1349-1360 (2020).
- Zhuang, L., et al. Total in vitro biosynthesis of the nonribosomal macrolactone peptide valinomycin. Metabolic Engineering. 60, 37-44 (2020).
- Hoskisson, P. A., Seipke, R. F. Cryptic or silent? The known unknowns, unknown knowns, and unknown unknowns of secondary metabolism. mBio. 11 (5), 02642 (2020).
- Bentley, S. D., et al. Complete genome sequence of the model actinomycete Streptomyces coelicolor A3(2). Nature. 417 (6885), 141-147 (2002).
- Li, J., Wang, H., Kwon, Y. -C., Jewett, M. C. Establishing a high yielding Streptomyces-based cell-free protein synthesis system. Biotechnology and Bioengineering. 114 (6), 1343-1353 (2017).
- Moore, S. J., Lai, H. -E., Needham, H., Polizzi, K. M., Freemont, P. S. Streptomyces venezuelae TX-TL - a next generation cell-free synthetic biology tool. Biotechnology Journal. 12 (4), (2017).
- Kim, W., et al. Comparative genomics determines strain-dependent secondary metabolite production in Streptomyces venezuelae strains. Biomolecules. 10 (6), 864 (2020).
- Phelan, R. M., et al. Development of next generation synthetic biology tools for use in Streptomyces venezuelae. ACS Synthetic Biology. 6 (1), 159-166 (2017).
- Song, J. Y., et al. Complete genome sequence of Streptomyces venezuelae ATCC 15439, a promising cell factory for production of secondary metabolites. Journal of Biotechnology. 219, 57-58 (2016).
- Bush, M. J., Bibb, M. J., Chandra, G., Findlay, K. C., Buttner, M. J. Genes required for aerial growth, cell division, and chromosome segregation are targets of WhiA before sporulation in Streptomyces venezuelae. mBio. 4 (5), 00684 (2013).
- Schumacher, M. A., et al. The crystal structure of the RsbN-σBldN complex from Streptomyces venezuelae defines a new structural class of anti-σ factor. Nucleic Acids Research. 46 (14), 7405-7417 (2018).
- Ramos-León, F., et al. A conserved cell division protein directly regulates FtsZ dynamics in filamentous and unicellular actinobacteria. Elife. 10, 63387 (2021).
- Bush, M. J., Tschowri, N., Schlimpert, S., Flärdh, K., Buttner, M. J. c-di-GMP signalling and the regulation of developmental transitions in Streptomycetes. Nature Reviews. Microbiology. 13 (12), 749-760 (2015).
- Ehrlich, J., Gottlieb, D., Burkholder, P. R., Anderson, L. E., Pridham, T. G. Streptomyces venezuelae, n. sp., the source of chloromycetin. Journal of Bacteriology. 56 (4), 467-477 (1948).
- Inahashi, Y., et al. Watasemycin biosynthesis in Streptomyces venezuelae: thiazoline C-methylation by a type B radical-SAM methylase homologue. Chemical Science. 8 (4), 2823-2831 (2017).
- Jakeman, D. L., et al. Antimicrobial activities of jadomycin B and structurally related analogues. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (3), 1245-1247 (2009).
- Kodani, S., Sato, K., Hemmi, H., Ohnish-Kameyama, M. Isolation and structural determination of a new hydrophobic peptide venepeptide from Streptomyces venezuelae. Journal of Antibiotics. 67 (12), 839-842 (2014).
- Akey, D. L., et al. Structural basis for macrolactonization by the pikromycin thioesterase. Nature Chemical Biology. 2 (10), 537-542 (2006).
- Bai, C., et al. Exploiting a precise design of universal synthetic modular regulatory elements to unlock the microbial natural products in Streptomyces. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (39), 12181-12186 (2015).
- Moore, S. J., et al. EcoFlex: A multifunctional MoClo kit for E. coli synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 5 (10), 1059-1069 (2016).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50762 (2013).
- Kim, D. M., Choi, C. Y. A semicontinuous prokaryotic coupled transcription/translation system using a dialysis membrane. Biotechnology Progress. 12 (5), 645-649 (1996).
- Liu, Y., Fritz, B. R., Anderson, M. J., Schoborg, J. A., Jewett, M. C. Characterizing and alleviating substrate limitations for improved in vitro ribosome construction. ACS Synthetic Biology. 4 (4), 454-462 (2015).
- Bindels, D. S., et al. mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging. Nature Methods. 14, 53-56 (2017).
- Hopword, D. A., Kieser, T., Bibb, M. J., Buttner, M. J., Chater, K.
- Hunter, D. J. B., Bhumkar, A., Giles, N., Sierecki, E., Gambin, Y. Unexpected instabilities explain batch-to-batch variability in cell-free protein expression systems. Biotechnology and Bioengineering. 115 (8), 1904-1914 (2018).
- Dopp, J. L., Jo, Y. R., Reuel, N. F. Methods to reduce variability in E. coli-based cell-free protein expression experiments. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 204-211 (2019).
- Hoff, G., Bertrand, C., Piotrowski, E., Thibessard, A., Leblond, P. Genome plasticity is governed by double strand break DNA repair in Streptomyces. Scientific Reports. 8, 5272 (2018).
- Bibb, M. J.
- Weber, T., et al. antiSMASH 3.0-a comprehensive resource for the genome mining of biosynthetic gene clusters. Nucleic Acids Research. 43 (1), 237-243 (2015).
- Navarro-Muñoz, J. C., et al. A computational framework to explore large-scale biosynthetic diversity. Nature Chemical Biology. 16, 60-68 (2020).
- Alanjary, M., et al. The Antibiotic Resistant Target Seeker (ARTS), an exploration engine for antibiotic cluster prioritization and novel drug target discovery. Nucleic Acids Research. 45 (1), 42-48 (2017).
- Medema, M. H., Fischbach, M. A. Computational approaches to natural product discovery. Nature Chemical Biology. 11 (9), 639-648 (2015).
- Whitford, C. M., Cruz-Morales, P., Keasling, J. D., Weber, T. The Design-Build-Test-Learn cycle for metabolic engineering of Streptomycetes. Essays in Biochemistry. , (2021).
