Summary
Dit protocol beschrijft een methode voor morfometrische analyse van neuromusculaire juncties door gecombineerde confocale en STED-microscopie die wordt gebruikt om pathologische veranderingen in muismodellen van SMA- en ColQ-gerelateerd CMS te kwantificeren.
Abstract
Neuromusculaire juncties (NMJ's) zijn zeer gespecialiseerde synapsen tussen lagere motorneuronen en skeletspiervezels die een essentiële rol spelen bij de overdracht van moleculen van het zenuwstelsel naar vrijwillige spieren, wat leidt tot contractie. Ze worden beïnvloed bij veel menselijke ziekten, waaronder erfelijke neuromusculaire aandoeningen zoals Duchenne spierdystrofie (DMD), congenitale myasthenische syndromen (CMS), spinale musculaire atrofie (SMA) en amyotrofische laterale sclerose (ALS). Daarom is het monitoren van de morfologie van neuromusculaire juncties en hun veranderingen in ziektemuismodellen een waardevol hulpmiddel voor pathologische studies en preklinische beoordeling van therapeutische benaderingen. Hier worden methoden beschreven voor het labelen en analyseren van de driedimensionale (3D) morfologie van de pre- en postsynaptische delen van motorische endplates van muizen geplaagde spiervezels. De procedures voor het voorbereiden van monsters en het meten van NMJ-volume, oppervlakte, tortuositeit en axon terminale morfologie / bezetting door confocale beeldvorming, en de afstand tussen postsynaptische junctionele plooien en acetylcholine receptor (AChR) streepbreedte door superresolutie gestimuleerde emissiedepletie (STED) microscopie zijn gedetailleerd. Veranderingen in deze NMJ-parameters worden geïllustreerd bij mutante muizen die worden beïnvloed door SMA en CMS.
Introduction
De neuromusculaire junctie (NMJ) is een complexe structuur die bestaat uit een motorische axonterminal, een perisynaptische Schwann-cel en een skeletmyofibergedeelte dat betrokken is bij de overdracht van chemische informatie en de koppeling van lagere motorneuronactiviteit aan spiercontractie. Bij zoogdieren verandert de morfologie van de neuromusculaire overgang tijdens de ontwikkeling, waarbij een typische krakelingachtige vorm na rijping wordt aangenomen, met verschillen in vorm en complexiteit tussen soorten, en vertoont een zekere mate van plasticiteit als reactie op fysiologische processen zoals lichaamsbeweging of veroudering 1,2,3,4 . De postsynaptische motor endplate vormt membraaninfestaties die junctionele plooien worden genoemd, waarbij het bovenste deel met acetylcholinereceptoren (AChR) in nauw contact staat met de presynaptische terminale axontak5.
Morfologische en functionele veranderingen in neuromusculaire juncties dragen bij aan de pathofysiologie van verschillende neurodegeneratieve aandoeningen zoals spinale musculaire atrofie (SMA) en amyotrofische laterale sclerose (ALS), myopathieën zoals Duchenne spierdystrofie (DMD), congenitale myasthenische syndromen (CMS), myasthenia gravis (MG) en centronucleaire myopathieën (CNM), en verouderingsgerelateerde sarcopenie 3,6,7,8,9, 10,11,12. Bij deze ziekten worden structurele NMJ-veranderingen waargenomen, zoals fragmentatie van de endplate, verminderde postsynaptische junctionele vouwgrootte en/of denervatie. De pathologie van NMJ's kan een primaire of vroege gebeurtenis zijn tijdens ziekteprogressie of meer recentelijk verschijnen als een secundaire gebeurtenis die bijdraagt aan de klinische manifestaties. In ieder geval is het monitoren van de morfologie van NMJ's in diermodellen van deze ziekten een waardevolle parameter om pathologische veranderingen te bestuderen en de werkzaamheid van potentiële behandelingen te beoordelen.
De morfologie van neuromusculaire juncties wordt meestal geanalyseerd door technieken met behulp van confocale microscopie 2,13,14,15 of elektronenmicroscopie 5,16, met hun inherente beperkingen zoals respectievelijk resolutie of technische problemen. Meer recent werd superresolutiemicroscopie ook gebruikt om bepaalde gebieden van de NMJ te visualiseren, zoals presynaptische actieve zones of AChR-verdeling op het postsynaptische membraan 16,17,18, als een alternatieve of complementaire benadering van ultrastructurele analyse door elektronenmicroscopie.
Dit protocol heeft tot doel een gedetailleerde en reproduceerbare methode te bieden om NMJ morfologische parameters te beoordelen door fluorescentie confocale en gestimuleerde emissiedepletie (STED) microscopie te combineren. Belangrijke kenmerken van de presynaptische en postsynaptische endplates, zoals volume, oppervlakte, relatieve tortuositeit, AChR-streepbreedte en axon terminale distributie in geïnnerveerde geplaagde spiervezels van muis gastrocnemius en tibialis anterior werden gekwantificeerd in de context van normale en zieke omstandigheden. Nmj-defecten werden met name geïllustreerd in het Smn2B/- muismodel van spinale musculaire atrofie, een neuromusculaire ziekte met motorneurondegeneratie veroorzaakt door mutaties in het SMN1-gen 11,19, en in een collageenachtige staartsubeenheid van asymmetrische acetylcholinesterase knock-out (ColQDex2/Dex2 of ColQ-KO) muizen, als model van het aangeboren myasthenische syndroom20, 21,22.
Protocol
Verzorging en manipulatie van muizen werden uitgevoerd volgens de nationale en Europese wetgeving inzake dierproeven en goedgekeurd door de institutionele ethische commissie. Mannetjes en vrouwtjes van Smn2B/- (C57Bl/6J achtergrond) en ColQDex2/Dex2 (B6D2F1/J achtergrond) muizen op een leeftijd van respectievelijk 3 en 6 weken werden gebruikt in de studie.
1. Euthanasie van muizen en dissectie van spieren: tibialis anterior en gastrocnemius
- Ga over tot muizenanesthesie door intraperitoneale injectie van een ketamine (87,5 mg / kg) / xylazine (12,5 mg / kg) gemengde oplossing (0,1 ml / 20 g lichaamsgewicht) voorafgaand aan euthanasie door cervicale dislocatie.
OPMERKING: Aangezien SMA en ColQ-CMS individuen onafhankelijk van hun geslacht beïnvloeden, werden mannelijke en vrouwelijke muizen gebruikt in het huidige protocol. - Verwijder het haar van de achterpoten met een klein elektrisch scheerapparaat en spoel de benen af met 70% ethanol.
OPMERKING: De dissectieprocedure zal voor elke spier verschillen. Volg voor dissectie van tibialis anterior (TA) de stappen 1.2.1-1.2.3 en voor gastrocnemius (GA) (mediale en laterale delen) de stappen 1.2.4-1.2.6. Behandel de spieren voorzichtig om weefselbeschadiging te voorkomen en ze tijdens de dissectie te verpletteren of uit te rekken.- Plaats de muis in rugligging.
- Maak een huidincisie van 5 mm met een scherp-stompe schaar langs het antero-externe deel van de distale achtervel, parallel aan het scheenbeen, om de spier bloot te leggen. Gebruik een extra dunne schaar om de fascia te verwijderen.
- Knip eerst de distale pees (dicht bij de poot) en vervolgens de proximale pees (dicht bij de knie) met een extra dunne schaar en een gebogen dunne tang. Behandel de spier zorgvuldig om schade aan myofiberen en zenuwen te voorkomen.
OPMERKING: De proximale pees moet zo dicht mogelijk bij het bot worden doorsneden om de hele spier te oogsten. - Plaats de muis in buikligging, gebruik een scherp-stompe schaar om een huidincisie te maken van het bovenste deel van het distale achterste achterste compartiment tot aan de poot en verwijder de huid.
- Pak de achillespees vast met een medium gekartelde tang, knip hem met een extra dunne schaar en scheid de GA voorzichtig van het omliggende weefsel terug naar de proximale inbrenging.
- Breng aan de proximale kant de medium gekartelde tang in de zak gevormd tussen de biceps femoris (BF) en de GA. Scheid de twee spieren om de GA-pees zo dicht mogelijk bij de botinbrenging te snijden met een extra dunne schaar.
- Plaats voor weefselfixatie elke spier in een microcentrifugebuis van 2 ml met 1 ml paraformaldehydeoplossing (PFA) verdund in fosfaatbufferzoutoplossing (PBS zonder Ca2+Mg 2+) en houd gedurende 18-24 uur op 4 °C.
LET OP: Paraformaldehyde en formaldehyde zijn giftig en moeten worden behandeld in een chemische zuurkast met voldoende beschermingsmiddelen. - Was de volgende dag de vaste spieren 3x gedurende 5 minuten met PBS in 12-well platen door zachtjes te schudden bij kamertemperatuur (RT) in een chemische zuurkast.
OPMERKING: Het protocol kan bij deze stap worden gestopt en binnen een maand worden voortgezet. Voeg in dit geval PBS aangevuld met 0,01% natriumazide toe om monsters bij 4 °C te bewaren. - Plaag elke spier in kleine vezelbundels van ongeveer 1 mm breed met behulp van twee fijne gekartelde tangen.
OPMERKING: Het is cruciaal om spieren heel voorzichtig te manipuleren met de tang, zonder overmatige kracht, om weefselschade tijdens het plagen te voorkomen.- Dissociëer de TA-spier in 3 of 4 bundels, afhankelijk van de grootte.
- Voor GA scheidt u de mediale en laterale delen van de spier en dissociëert u vervolgens elk deel in 4-5 bundels, afhankelijk van hun grootte.
2. Immunostaining
- Ga verder met spiervezelpermeabilisatie: breng spierbundels over in 24-well platen met 1% (v / v) Triton X-100 in PBS en houd ze onder zachte agitatie (50 rpm) gedurende 1 uur bij RT of 5 uur bij 4 ° C.
OPMERKING: Verdeel de spierbundels over twee platen om door te gaan met afzonderlijke immunostainings en om het risico op antilichaamverwarring te minimaliseren. Splits ze niet in meer dan twee putten (1 put / plaat); anders kan het aantal (N) NMJ's dat representatief is voor hun algemene status in de geanalyseerde spier onvoldoende zijn. - Was de monsters 3x gedurende 5 minuten met PBS op RT en incubeer ze met een blokkerende oplossing bestaande uit 4% runderserumalbumine (BSA) in PBS/Triton X-100 1% gedurende 4 uur bij 4 °C, onder voorzichtig roeren (50 rpm).
OPMERKING: Gebruik geen aspiratiepomp tijdens de wasstappen, maar zuig de oplossing handmatig aan met een pipet van 200 μL en kleine uiteinden (de referentie wordt aangegeven in de materiaaltabel). - Incubeer de monsters 's nachts (O/N) bij 4 °C onder voorzichtig roeren (50 rpm) met de in stap 2.2 aangegeven blokkerende oplossing die primaire monoklonale antilichamen bevat tegen neurofilament M (NF-M, 2H3, verdunning 1/200) of synaptisch blaasjeglycoproteïne 2 (SV2, verdunning 1/200) om respectievelijk presynaptische axonterminals of actieve zones te labelen.
- Was de volgende dag de spierbundels 3x gedurende 5 min in PBS onder agitatie (50 rpm).
- Voor confocale beeldvorming: Incubeer de spierbundels met secundaire antimuisantistoffen geconjugeerd met een rooduitstotende fluorofoor (F594) (verdunning 1/500) en α-bungarotoxine geconjugeerd met een groen-emitterende fluorofoor (α-BTX-F488) (verdunning 1/1000) in PBS gedurende 2 uur bij RT onder agitatie (50 rpm).
- Voor SOA-beeldvorming: Incubeer de spierbundels met secundaire antimuisantistoffen geconjugeerd met een groen-emitterende fluorofoor (F488) (verdunning 1/500) en α-bungarotoxine geconjugeerd met een verrood uitstotende fluorofoor gekenmerkt door hoge fotostabiliteit (α-BTX-F633) (verdunning 1/1000) in PBS gedurende 2 uur bij RT onder agitatie (50 rpm).
OPMERKING: Stel de monsters niet bloot aan licht tijdens de incubatie om fotobleaching te voorkomen.
- Was de gelabelde spierbundels 3x gedurende 5 min met PBS onder roeren (50 rpm) en plaats ze op een schuif met een montagemedium.
LET OP: Plaats maximaal 4 tot 5 spierbundels per glijbaan om afdichting mogelijk te maken. - Voeg een grade #1.5 (of #1.5H) glazen coverslip (0,17 mm dikte) toe aan de bovenkant en plaats cilindrische magneten aan beide zijden van de glijbaan om druk uit te oefenen en de spieren plat te maken.
- Houd de dia's beschermd tegen licht O/N bij 4°C. Sluit de dia's permanent af met nagellak.
3. Beeldacquisitie
- Overnames door een confocale microscoop
OPMERKING: Beelden werden verzameld met een omgekeerde laserscanconfiscale microscoop met behulp van een olie-onderdompelingsobjectief van 63x magnitude (HCX Plan Apo CS, 1,4 numeriek diafragma (NA)).- Voor geblindeerde analyse laat een persoon die niet betrokken is bij de analysecode elke dia met een bepaald nummer. Blijf blind voor de experimentele groepen totdat de kwantificering van NMJ-parameters voor alle monsters is voltooid.
- Start de microscoopsoftware in de configuratiemodus > machine.xlhw (aanvullende figuur 1).
- Plaats de dia op het microscoopstadium en zoek het observatievlak in het monster door te kijken onder DAPI wide-field fluorescentieverlichting met de DAPI-filterset.
- Klik op Project openen > Nieuwe projecten en maak een map om beeldaankopen op te slaan (aanvullende afbeelding 1).
OPMERKING: Maak een nieuw project voor elke NMJ om de mapgrootte te beperken en problemen met het computergeheugen te voorkomen. - Om acquisitieparameters te beheren, klikt u op het tabblad Acquisitie en stelt u het confocale gaatje in op 1.0 Luchtige eenheid en laservermogen om de versterkings- en offsetniveaus voor de groene / F488 (α-BTX) fluorescentie te optimaliseren met behulp van een 488 nm-laser op de eindplaat die moet worden afgebeeld (Live-modus AAN).
- Optimaliseer vervolgens de rode/F594 (NF-M of SV2) fluorescentieacquisitie met behulp van een laser die is aangepast aan F594-observatie. In dit onderzoek werd een 552 nm laser gebruikt (Live mode ON). Stel het spectrum van kleurstofemissie in met de volgende bereiken voor elke laser: laser 405 (DAPI) van 414 tot 483 nm, laser 488 (F488-α-BTX) van 506-531 nm en laser 552 (NF-M/SV2) van 622-650 nm.
- Verzamel beeldstapels van neuromusculaire juncties in elke experimentele groep met dezelfde instellingen: beeldgrootte 1024 x 1024 pixels (73,7 x 73,7 μm) bij 400 Hz bemonsteringsfrequentie, Bidirectioneel X AAN, Zoomfactor 2,5, Z-stapgrootte 0,5 μm in Z-Wide-modus.
OPMERKING: Voor elke NMJ wordt het aantal segmenten ingesteld om de hele kruising te verkrijgen. De hierboven beschreven acquisitie-instellingen voldoen aan de bemonsteringsstelling van Nyquist-Shanon. De gebruiker kan echter op de knop Format optimaliseren klikken, aanwezig op alle recente confocale besturingssoftware, om ervoor te zorgen dat pixelgrootte en Z-stap voldoen aan de ideale Nyquist-bemonsteringsfrequentie. Deze actie voorkomt over- of ondermonsterde afbeeldingen, wat een verlies van nauwkeurigheid in volumemetingen veroorzaakt. - Sla de oorspronkelijke bestandsafbeeldingen (.lif) of Z-stack-afbeeldingen (.tif) op in een map met een naam die de codenaam van de dia, het kleuringstype en het endplate-nummer bevat.
OPMERKING: Verzamel achtereenvolgens (niet gelijktijdig) de scans met behulp van de 488 nm- en 552 nm-lasers (F488 en F594) om kruisverwijzing van de F488-fluorescentie in het F594-kanaal te voorkomen en vice versa (doorbloeding). NB: het bundelpad kan worden geconfigureerd met de Dye Assistant in de microscoopsoftware. - Ga naar de volgende gecodeerde dia en herhaal stap 3.1.3-3.1.8 voor elke NMJ.
- Klik aan het einde van de sessie op Openen in 3D Viewer en kies een NMJ-vertegenwoordiger van een experimentele groep om de 3D-labeling te visualiseren.
OPMERKING: Deze weergavemodus helpt om te controleren of de acquisitieparameters correct waren. - Sluit de microscoopsoftware, reinig de objectieven met lensweefsels en schakel het systeem uit.
- Acquisities door STED-microscopie
OPMERKING: Beelden werden verzameld met een omgekeerde laserscanconfiscale microscoop uitgerust met Gated STED bij 775 nm met behulp van een 100x olie-onderdompelingsobjectief (HC PL APO CS2 1.4 NA).- Voor geblindeerde analyse laat een persoon die niet betrokken is bij de analysecode elke dia met een bepaald nummer. Blijf blind voor de experimentele groepen totdat de kwantificering van NMJ-parameters voor alle monsters is voltooid.
- Start de microscoopsoftware in de configuratiemodus > machine.xlhw en STED ON (aanvullende figuur 2).
- Klik op Project openen > Nieuwe projecten om een map te maken om beeldacquisities op te slaan.
OPMERKING: Genereer een nieuwe map voor elke dia om de mapgrootte te beperken en problemen met het computergeheugen te voorkomen. - Plaats de dia op het microscoopstadium en bekijk deze onder breedveldfluorescentieverlichting met behulp van de 488 nm-laser om het observatievlak in het monster te vinden.
- Zoek naar een NMJ gelabeld met neurofilament M (NF-M) of SV2-kleuringen met behulp van de 488 nm-laser met een spectrale detectie van 506-531 nm.
- Wanneer een NMJ is geïdentificeerd, klikt u op STED activeren en begint u met het verkrijgen van beelden in een gebied dat verschillende junctionele plooien bevat (aanvullende figuur 3) met behulp van de 635 nm-laser met een spectrale detectie van 640-750 nm.
OPMERKING: Let op de tabel voor het opzoeken van verzadiging tijdens het verkrijgen van afbeeldingen en klik op de knop Snelle LUT om overbelichting te voorkomen (grijze waarden >255; voor 8 bit). - Verzamel de afbeeldingen van elke experimentele groep met dezelfde instellingen: beeldgrootte 2048 x 2048 pixels (38,75 x 38,75 μm) bij een bemonsteringsfrequentie van 400 Hz.
OPMERKING: Het vermogen van de depletion laser (STED) is ingesteld op 65%. - Sla de afbeeldingen op met een bestandsnaam die de code van de dia bevat.
OPMERKING: Het is mogelijk om op Geoptimaliseerd XY-formaat te klikken: Stel Formaat in om de beste acquisitie-instelling met STED-beeldvorming te verkrijgen. - Ga naar de volgende gecodeerde dia en herhaal stap 3.2.3-3.2.8. Herhaal deze procedure voor alle dia's.
- Breng aan het einde van de STED-microscopiesessie de afbeeldingsbestanden over naar een andere computer en sla de originele bestanden op (. lif) in een externe schijf of server.
- Schakel de microscoopsoftware uit, reinig de objectieven met lensweefsels en schakel het systeem uit.
4. Beeldanalyse- confocale microscopie
OPMERKING: Alle afbeeldingen zijn verwerkt met computers met het professionele besturingssysteem Microsoft Windows 10.
- Start ImageJ en aangepaste macro om postsynaptisch NMJ-endplatevolume, MIP-gebied (Maximum Intensity Projection) en relatieve tortuositeit te berekenen.
- Verwerk NMJ-afbeeldingsstapels met behulp van NIH ImageJ freeware23, de iGeodesic-plug-in en de aangepaste macro om NMJ-parametermetingen te verkrijgen. Start imagej-software.
OPMERKING: De nieuwste versie van ImageJ is gratis beschikbaar en kan worden gedownload24. Om eigen bestandsformaten te openen, moet de Bio-Formats Package25-plug-in worden gedownload26 . Deze stap is niet nodig als de operator Fiji gebruikt omdat de plug-in al in de software is geïnstalleerd. De iGeodesic plugin27 om tortuositeit te berekenen is ook online beschikbaar28; controleer de beschikbaarheid van deze plug-in in de ImageJ /Fiji-versie die zal worden gebruikt. De op maat gemaakte Macro's zijn ook online beschikbaar29. - Sleep de Macro_NMJ_VOL_Marinelloetal.ijm (op maat gemaakt, aanvullend coderingsbestand 1) naar het ImageJ-venster; de macro wordt geopend in een tweede venster. Klik in dit nieuwe venster op Macro's > Macro uitvoeren.
OPMERKING: De macro kan zowel propriëtaire als TIFF-bestanden verwerken. Bestanden moeten aan de volgende criteria voldoen: voor eigen bestandsindelingen slaat u slechts één knooppunt (d.w.z. de stapel afbeeldingen) per bestand op, geordend in een map; voor TIFF-afbeeldingen moeten bestanden worden opgeslagen in een map met submappen, elk met de naam JunctionX (X komt overeen met een NMJ-nummer) met de afbeeldingsstapels van een bepaald knooppunt (RGB TIFF) (aanvullende afbeelding 4). - Selecteer de native map met de Junction-submappen die moeten worden geanalyseerd en klik op Selecteren.
- Selecteer in het nieuwe pop-upmenu genaamd Map opslaan de opslagmap en klik op Selecteren.
- Selecteer in het nieuwe pop-upmenu Met de naam Afbeeldingstype de indeling van de Z-stack-acquisities.
- Selecteer het RGB-kanaal dat overeenkomt met de kleuring van belang en geef XY pixelgrootte en Z-stap (z) aan. De macro voert de analyse automatisch uit.
OPMERKING: Als eigen bestandsindelingen zijn geselecteerd, leest de macro direct de pixelgrootte en Z-stap (z). De gebruiker moet echter nog steeds het kanaal van interesse aangeven (C1, C2 of C3). De macro biedt een DataSheet (.csv) voor elke junctieparameter (endplatevolume, MIP-gebied en tortuositeit) in de opslagmap. De macro genereert ook drie . TIF-bestanden , die overeenkomen met de omtrek van α-BTX-kleuring Drawing_MaxprojX.tif, DrawingJunctionX.tif en MIP MaxprojX.tif. Deze TIFF-bestanden worden gegenereerd om de kwaliteit van de acquisities te verifiëren en om ervoor te zorgen dat de beeldverwerking correct is uitgevoerd.
Postsynaptisch NMJ-volume (V): De macro scheidt afbeeldingen van een enkele NMJ en houdt het α-bungarotoxine F488-kanaal dat overeenkomt met de postsynaptische endplate. De stapel wordt gesegmenteerd met Otsu-drempel30 op het tussenliggende segment van de stapel. De resulterende binaire afbeelding is 1-pixel verwijd en de functie Deeltjes analyseren wordt gebruikt om het endplate-gebied van elk gedetecteerd object te meten. Om het postsynaptische NMJ-volume te verkrijgen, somt de macro alle gemeten eindplaatgebieden van de stapel op en vermenigvuldigt deze met de Z-stapwaarde (z) in μm.
Mip-eindplaatoppervlak (Maximum Intensity Projection): Nadat de stack is gedrempeld, wordt de mip (maximum intensity projection) verkregen met behulp van de Z-project ImageJ-functie . De functie Deeltjes analyseren wordt vervolgens gebruikt om het MIP-eindplaatgebied te kwantificeren.
NMJ MIP tortuosity (T): De NMJ tortuosity, die de mate van complexiteit van de postsynaptische motor endplate weergeeft inclusief plooien en perforaties31, wordt berekend op basis van elke MIP met behulp van de volgende formule, waarbij dObj (AB) de afstand is tussen A en B langs de omtrek van het object, en dEuc (AB) de Euclides-afstand tussen A en B (rechte lijn).
- Stel de hoogste tortuositeitswaarde in de wildtypegroep van elke experimentele toestand in op 100% en normaliseer alle andere waarden van de experimentele toestand naar deze waarde om de relatieve NMJ-tortuositeit te verkrijgen.
- Verwerk NMJ-afbeeldingsstapels met behulp van NIH ImageJ freeware23, de iGeodesic-plug-in en de aangepaste macro om NMJ-parametermetingen te verkrijgen. Start imagej-software.
- Start ImageJ en aangepaste macro om presynaptische neurofilamentaccumulatie en synaptische blaasjesglycoproteïne 2-kleuring te kwantificeren.
OPMERKING: Neurofilamentaccumulatie (hier NF-M) en/of veranderde verdeling van synaptische blaasjes (hier SV2) zijn markers van abnormaal axonaal transport en/of verminderde vesikelhandel en werden eerder waargenomen in NMJ's van verschillende SMA-muismodellen 32,33,34.- Sleep de Macro_NMJ_ACCU_Marinelloetal.ijm (op maat gemaakt, aanvullend coderingsbestand 2) naar het ImageJ-venster; de macro wordt in een tweede venster geopend. Klik in dit nieuwe venster op Macro's > Macro uitvoeren.
OPMERKING: De macro kan zowel eigen bestandsindelingen als TIFF-bestanden verwerken. Bestanden moeten voldoen aan de criteria die zijn aangegeven in de OPMERKING onder stap 4.1.2. - Selecteer de native map met de Junction-submappen die moeten worden geanalyseerd en klik op Selecteren.
- Selecteer in het nieuwe pop-upmenu genaamd Map opslaan de opslagmap en klik op Selecteren.
- Selecteer in het nieuwe pop-upmenu Met de naam Afbeeldingstype de indeling van de Z-stack-acquisities.
- Geef in de pop-up Kleuring Infos het presynaptische en postsynaptische label en de kleur aan en klik op OK. Bijvoorbeeld, Presynaptic label: SV2 of NF, Presynaptic kleur: R, Postsynaptic label: BTX, Postsynaptic kleur: G.
OPMERKING: Voor eigen bestandsindelingen moeten labels en bijbehorende kanalen (C1, C2 of C3) worden aangegeven. - Geef in het pop-upvenster Pixelgrootte XY-pixelgrootte 0,072 μm en Z stap 0,5 μm (z) aan en klik op OK. De macro voert de analyse automatisch uit.
OPMERKING: Deze parameter komt overeen met de beeldgrootte van 1024 x 1024 pixels (73,7 x 73,7 μm) die is geselecteerd vóór confocale microscoopaankopen en is gecorreleerd met de doel- en zoominstellingen. Als de eigen bestandsindelingen zijn geselecteerd, leest de macro direct pixelgrootte en Z-stap (z). De macro slaat in de opslagmap een DataSheet (.csv) van presynaptische en postsynaptische volumes op, een TIFF-afbeelding met meerdere pagina's van de huidige detectie voor elke (pre- en postsynaptische) labeling. Zoals hierboven aangegeven, worden deze TIFF-bestanden gegenereerd om de kwaliteit van de acquisities te controleren en om ervoor te zorgen dat de beeldverwerking correct is uitgevoerd.
De macro berekent het volume van axonale neurofilament M-kleuring (NF-volume) van het NF-M-F594-kanaal dat colocaliseert met α-bungarotoxine-F488-labeling en het volume NMJ synaptische blaasjesglycolproteïne 2-kleuring (SV2-volume) van het SV2-F594-kanaal dat colocaliseert met α-BTX-F488-labeling. De NF-M accumulatie wordt gekwantificeerd door de verhouding tussen NF volume en postsynaptic endplate (α-BTX) volume en NMJ axon terminal bezetting te berekenen door de verhouding van SV2 en α-BTX volumes, zoals hieronder weergegeven.
- Sleep de Macro_NMJ_ACCU_Marinelloetal.ijm (op maat gemaakt, aanvullend coderingsbestand 2) naar het ImageJ-venster; de macro wordt in een tweede venster geopend. Klik in dit nieuwe venster op Macro's > Macro uitvoeren.
5. Beeldanalyse - STED-microscopie
OPMERKING: Beeldverwerking werd uitgevoerd met de offline software van de STED-microscoopfabrikant.
- Start de microscoopsoftware.
- Open het project door op de knop Project openen te klikken. Selecteer het projectbestand (.lif) en open het. De afbeeldingen worden samen met hun namen op het scherm weergegeven.
- In het procesvenster : Klik op Ruisonderdrukking > Mediaan. Stel onder aan het middelste venster Radius in op 5,00 en Iteratie op 1,00 en schakel 3D-filtering uit.
- Selecteer vervolgens het tabblad Projecten openen linksboven in het venster en kies een afbeelding.
- Klik op Toepassen om parameters te valideren. Er wordt een nieuwe afbeelding met de naam "nameofimage_median001" gemaakt.
OPMERKING: Het is mogelijk om voorafgaand aan Toepassen op Voorbeeld te klikken om het effect van het mediane filter te controleren, waardoor het beeldcontrast wordt verbeterd en de lijnprofielen die voor kwantificering worden gebruikt, vloeiend worden gemaakt. - Pas het filter toe op alle afbeeldingen zoals aangegeven in stap 5.4-5.5.
- Klik op de tabbladen Projecten openen op het pictogram van het diskettestation om alle projecten op te slaan, inclusief de nieuw gemaakte gefilterde afbeeldingen.
OPMERKING: De volgende stap wordt uitgevoerd met behulp van de gefilterde afbeelding met de naam "nameofimage_median001". - Bereken de afstand tussen AChR-strepen
OPMERKING: Veranderingen in de morfologie van postjunctionale plooien worden vaak waargenomen bij neuromusculaire aandoeningen als een teken van NMJ-pathologie (onvolwassenheid of degeneratie). De afstand (d) tussen AChR-strepen, die worden gedetecteerd door α-bungarotoxinekleuring, wordt berekend door intensiteitsprofielen te genereren en de afstand tussen elke maximale intensiteitspiek te kwantificeren door een lijnprofiel te tekenen (aanvullende figuur 5).- Selecteer met behulp van de microscoopsoftware het menu Quantify boven in het centrale venster.
- Klik op het tabblad Extra in de linkerbovenhoek. Selecteer Intensiteit in het linkerbovenhoekpaneel en klik op het pictogram Lijnprofiel . Stel Oversampling in op 1 en vink Sorteerkanalen aan.
- Klik op de tabbladen Projecten openen en selecteer de gefilterde afbeelding die moet worden geanalyseerd.
OPMERKING: Het is mogelijk om in te zoomen op de afbeelding door te scrollen met de computermuis. Het dynamische bereik van de afbeelding kan worden gewijzigd met behulp van de balk aan de linkerkant naast de weergegeven afbeelding, wat de visualisatie van de strepen vergemakkelijkt. - Klik vervolgens op het pictogram Lijn tekenen in het bovenste menu van het rechtervenster en traceer een lijn die loodrecht verschillende strepen / junctionele vouwen kruist.
OPMERKING: Het intensiteitsprofiel wordt weergegeven in het centrale venster. - Klik op de bovenkant van de eerste piek en beweeg de muisaanwijzer terwijl u de linkermuisknop ingedrukt houdt totdat de volgende maximale piek is bereikt.
OPMERKING: De informatie wordt weergegeven in het intensiteitsprofiel, terwijl de afstand tussen de twee pieken wordt weergegeven onder de grafiek met de benaming "dx". - Klik met de rechtermuisknop terwijl u zich in de afbeelding van het rechtervenster bevindt en selecteer ROIs opslaan. Open de opgeslagen ROIs (Regions of Interest) door op Load ROIs te klikken.
- Klik op het pijlpictogram in de linkerbovenhoek van het rechtervenster, klik op de ROI en verwijder deze door op het prullenbakpictogram te klikken.
- Herhaal deze bewerking zo vaak als nodig is van verschillende intensiteitsprofielen om het voorspelde aantal AChR-streepafstanden te verkrijgen die de globale waarde in de geanalyseerde spier vertegenwoordigen.
OPMERKING: De optimale N-waarde kan van tevoren worden berekend op basis van het geschatte verschil tussen groepen, α risico, vermogen en een- of tweezijdige test. In het huidige experimentele ontwerp werd een eenzijdige Mann-Whitney-test (α risico = 10%; vermogen = 80%) toegepast en de N-waarde werd geschat op ten minste vijf AChR-streepafstanden per NMJ om de twee groepen dieren te vergelijken.
- AChR streep breedte
OPMERKING: De streepbreedte (w) komt overeen met de volledige breedte half-maximum (FWHM) van het intensiteitsprofiel, dat is de afstand tussen de punten waar de α-BTX signaalfluorescentiewaarde de helft van de maximale intensiteit is (aanvullende figuur 5).- Selecteer met behulp van de microscoopsoftware het menu Quantify in het centrale venster.
- Klik op het tabblad Extra linksboven. Selecteer Intensiteit in het linkerbovenhoekpaneel en klik op het pictogram FWHM bepalen . Vink Sorteerkanalen aan.
OPMERKING: Om de piekdetectie door de software te optimaliseren, zijn Drempel en Breedte instellen ingesteld op respectievelijk 50 en 3. Pas deze waarden aan voor elk experiment en vraag advies aan een ervaren beeldvormingswetenschapper. - Klik op de tabbladen Projecten openen en selecteer de gefilterde afbeelding die u wilt analyseren.
OPMERKING: Het is mogelijk om in te zoomen op de weergegeven afbeelding in het rechtervenster door te scrollen met de computermuis. Zoals hierboven aangegeven (OPMERKING na stap 5.8.3), kan het dynamische bereik van de afbeelding worden gewijzigd voor optimale streepvisualisatie. - Klik vervolgens op het pictogram Rechthoek tekenen in het bovenste menu van het rechtervenster. Selecteer een horizontale of verticale streep en teken een rechthoek loodrecht op de streep. Er verschijnt een profiel in het centrale venster.
- Klik op Verticaal of Horizontaal van het menu Gemiddelde projectie in het linkerdeelvenster, afhankelijk van of de streepstand verticaal of horizontaal is.
- Klik op Statistieken in het centrale venster en lees de FWHM-waarde.
- Klik met de rechtermuisknop op de afbeelding in het rechtervenster en selecteer UI's opslaan.
OPMERKING: Open de opgeslagen ROIs door op ROIs laden te klikken. - Klik op het pijlpictogram in de linkerbovenhoek van het rechtervenster, klik op de ROI en verwijder deze door op het prullenbakpictogram te klikken.
- Herhaal deze bewerking zo vaak als nodig is vanaf verschillende rechthoekige ROI's totdat het voorspelde aantal AChR-streepbreedtes is verkregen, die representatief zijn voor de globale waarde in de geanalyseerde spier.
6. Experimenteel ontwerp en statistische tests
- Voer statistische analyses uit met behulp van specifieke software.
OPMERKING: Gegevens werden verzameld van N ≥ 3 biologische replicaties en ten minste 20 NMJ's per genotype voor confocale microscoopbeeldvorming, en N ≥ 5 biologische replicaties en N = 5 NMJ's per genotype voor STED-beeldvorming, in elke experimentele groep. Significantie werd beoordeeld door ongepaarde Mann-Whitney-test (nietparametrisch) en p-waarden worden aangegeven in de overeenkomstige figuurlegendes.
Representative Results
Om de morfologische analyse van neuromusculaire juncties op pre- en postsynaptisch niveau op een reproduceerbare manier te vergemakkelijken, werd een workflow ontwikkeld van spieroogst tot beeldvorming en kwantificering met behulp van de microscoopsoftware en ImageJ aangepaste macro's (figuur 1). Om het nut van dit protocol te illustreren, werd de morfologie van NMJ's in twee muismodellen van genetische aandoeningen, Smn2B / - en ColQDex2 / Dex2-muizen die werden beïnvloed door spinale musculaire atrofie (SMA) en een aangeboren myasthenisch syndroom (CMS) -vorm, geëvalueerd en werden gegevens vergeleken met leeftijdsgematchte controlebrobsters.
De NMJ-structuur werd beoordeeld aan de hand van tibialis anterieure en gastrocnemiusspieren van respectievelijk 3- en 6 weken oude Smn2B/- (C57Bl/6-achtergrond) en ColQDex2/Dex2 (B6D2F1/J-achtergrond) muizen, wanneer er al tekenen van de ziekte bij deze dieren aanwezig zijn. Op de leeftijd van 3 weken vertonen Smn2B/- muizen tekenen van vertraagde skeletspierontwikkeling en denervatie, zoals NMJ-atrofie en verlies35,36. CMS-muizen hebben een primaire pathologie bij NMJ's en manifesteren een vermindering van het lichaamsgewicht vanaf de eerste levensweek en duidelijke spierzwakte20 (gegevens niet getoond). Zoals te zien is in figuur 2A, leek de postsynaptische motoreindplaat gelabeld met fluorescerende α-bungarotoxine kleiner en/of gefragmenteerd in mutanten van de twee muislijnen door confocale microscopie. Kwantificering van NMJ Z-stacks met behulp van deze aangepaste ImageJ-macro's onthulde duidelijke afnames in endplatevolume, maximale intensiteitsprojectie (MIP) en relatieve tortuositeit in zowel SMA- als CMS-muizen in vergelijking met controles, als tekenen van NMJ-rijpingsdefecten32 (figuur 2B-D). Postsynaptisch endplatevolume en MIP waren afgenomen bij zieke dieren (vouwverandering van respectievelijk 2,7 en 2,0 voor volume en 2,5 en 2,0 voor MIP, bij Smn2B/- en ColQDex2/Dex2 muizen). De relatieve tortuositeit was ook kleiner in SMN- en ColQ-deficiënte spieren dan WT (16,97% ± 1,33% in SMA versus 48,84% ± 5,90% WT-muizen en 13,29% ± 2,79% in CMS versus 30,20% ± 4,44% controlemuizen). Bovendien onthulde de kwantificering van de verdeling van presynaptische axonterminaltakken met behulp van de ImageJ aangepaste macro een veranderd patroon in neurofilament M-distributie in de twee diermodellen, met verhoogde immunolabelling (84,65% ± 0,32% versus 16,57% ± 2,03% en 23,64% ± 2,78% versus 18,77% ± 1,73% in Smn2B / - en ColQDex2 / Dex2-muizen in vergelijking met controles) (Figuur 3A-D ). Door SV2-kleuring werd ook een vermindering van 43% van de bezettingsgraad, d.w.z. procent van de AChR-bevattende regio's met aangrenzende zenuwterminale actieve zones, waargenomen bij Smn2B / - muizen (49,36% ± 3,76% in SMA versus 85,69% ± 2,34% WT-muizen) (figuur 3E, F). Deze NMJ-parameter werd ook berekend in GA van ColQDex2/Dex2-mutanten, maar er werd geen statistisch significant verschil gevonden in vergelijking met controlebrobzingenoten (gegevens niet getoond).
We analyseerden verder postsynaptische membraankenmerken door de afstand tussen junctionele plooien en de breedte van AChR-strepen, die zich op de top van deze plooien bevinden, in ColQ-deficiënte spieren te kwantificeren met behulp van superresolutie gestimuleerde emissiedepletie (STED) microscopie. Zoals te zien is in figuur 4, kan het aspect van deze structuren duidelijk worden gevisualiseerd door fluorescerende α-bungarotoxine-etikettering en intensiteitsprofielanalyse. We evalueerden deze NMJ-parameters en vonden een toename van de junctionele vouwafstand (d) en breedte (w) van AChR-strepen in de gastrocnemiusspier van mutanten (358,3 nm ± 11,97 nm en 320,8 nm ± 10,90 nm voor de afstand, en 216,9 nm ± 10,51 nm en 186,3 nm ± 7,015 nm voor de breedte, in ColQDex2 / Dex2 in vergelijking met wildtype muizen, respectievelijk p < 0,05) (figuur 4C,D).
Figuur 1: Stroomdiagram van het videoprotocol voor 3D multiscale NMJ-karakterisering door confocale en STED-microscopie. Tibialis anterieure (TA) en gastrocnemius (GA) spieren werden verzameld van muizen, en spiervezels werden geplaagd voordat ze werden geëtiketteerd met α-bungarotoxine-F488 of α-bungarotoxine-F633, DAPI, primaire antilichamen gericht tegen neurofilament M (NF-M) en synaptisch vesikelglycoproteïne 2 (SV2) en fluorofoor (F488 of F594) -geconjugeerde secundaire antilichamen. Beeldstapels werden verkregen door confocale microscopie en verwerkt om postsynaptisch NMJ-volume, presynaptische NF-M-accumulatie, NMJ axon terminale bezetting, postsynaptische maximale intensiteitsprojectie (MIP) endplate-oppervlakte en tortuositeit (dObj (AB) is de afstand tussen A en B langs de omtrek van het object (rode lijn), terwijl dEuc (AB) is de Euclides-afstand tussen A en B (groene lijn)). Voor STED-microscopieanalyse werden de breedte van acetylcholinereceptor (AChR) strepen en de afstand tussen junctionele plooien gekwantificeerd uit intensiteitsprofielen van α-BTX-F633-kleuring. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Multi-parameter postsynaptische NMJ-karakterisering in muismodellen van spinale musculaire atrofie (SMA) en ColQ-gerelateerd congenitaal myasthenisch syndroom (CMS). (A) Representatieve afbeeldingen van postsynaptische motorische endplates van TA- en GA-spieren gelabeld met α-bungarotoxine-F488 (α-BTX). (B) Kwantificering van NMJ postsynaptisch endplate volume, (C) maximale intensiteit projectie (MIP) gebied en (D) relatieve tortuositeit in TA van respectievelijk 3 weken oude wild-type (WT) en Smn2B/- muizen (linker grafieken, N = 3 dieren per genotype, n = 37 en n = 56 NMJ's) en 6 weken oude WT en ColQDex2/Dex2 muizen (rechter grafieken, N = 5 muizen per genotype, n = 89 en n = 97 NMJ's, respectievelijk). Gegevens worden uitgedrukt als het gemiddelde per muis (punt) ± SEM. Verschillen tussen groepen werden geanalyseerd door Mann-Whitney-test (* p < 0,05). Schaalbalk is 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Morfometrische analyse van presynaptische axon terminale distributie in spieren van WT en mutante muizen. NMJ innervatiepatroon in tibialis anterieure (TA) en gastrocnemius (GA) spieren van wild-type, SMA en ColQ-gerelateerde CMS muizen. (A, B) Representatieve neuromusculaire juncties van TA van WT en Smn2B/- muizen op een leeftijd van 21 dagen gelabeld met antilichamen tegen neurofilament M (NF-M, rood) en α-bungarotoxine-F488 (α-BTX, groen) (A), en resultaten van kwantitatieve analyse van neurofilamentaccumulatie (B); (C, D) Representatieve neuromusculaire juncties van GA van 6 weken oude WT- en ColQDex2/Dex2-muizen gelabeld met antilichamen tegen neurofilament M (NF-M, rood) en α-bungarotoxine-F488 (α-BTX, groen), met gefragmenteerde en onrijpe postsynaptische endplates (C) en resultaten van neurofilamentaccumulatie in de twee groepen dieren (D). N= 4 (n = 34 NMJ's) (B) en N = 3 (n = 54 NMJ's) (D) WT-dieren, en N=3 (n = 36 NMJ's) Smn2B/- en N = 3 (n = 55 NMJ's) ColQDex2/Dex2-muizen werden geanalyseerd in de experimenten (B, D). (E, F) Representatieve beelden van axon terminale bezetting in NMJ's van TA van 3 weken oude WT en Smn2B/- muizen gelabeld met antilichamen tegen synaptische blaasjesglycoproteïne 2 (SV2, rood) en α-bungarotoxine-F488 (α-BTX, groen) (E), en resultaten van NMJ-bezetting (SV2/AChR-volumeverhouding) (F). Spieren van N = 3 (n = 50 NMJ's) wild-type en N = 4 (n = 62 NMJ's) Smn2B/- muizen werden geanalyseerd. Gegevens worden uitgedrukt als de gemiddelde waarde per muis (punt) ± SEM. Verschillen tussen groepen werden geanalyseerd door Mann-Whitney-test (* p < 0,05). Schaalbalken zijn 20 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: STED-beeldvorming van NMJ postsynaptische endplates. (A) Representatieve SOA-afbeelding van een NMJ gelabeld met α-bungarotoxine-F633 (α-BTX) van gastrocnemius van een 6 weken oude wild-type muis met postjunctionale AChR-strepen (schaalbalk is 5 μm). (B) Hogere vergroting van een gebied met AChR-strepen (onderste paneel) dat werd gebruikt om het intensiteitsprofiel te genereren. De breedte (w) van AChR-strepen en de afstand tussen twee aangrenzende strepen (d) van dit gebied werden gekwantificeerd en weergegeven in het staafdiagram. Schematische weergave van de postsynaptische eindplaat om de breedte van de AChR-streep (w) en de afstand (d) te illustreren. Deze parameters, (C) AChR-streepafstand en (D) breedte, werden gemeten bij ColQDex2/Dex2-muizen en controlebroedgenoten op de leeftijd van 6 weken. NMJ's van 5 WT (totaal n = 29 NMJ's) en 6 ColQDex2/Dex2 (totaal n = 43 NMJ's) dieren werden blind geanalyseerd. Gegevens worden uitgedrukt als het gemiddelde per muis (punt) ± SEM. Statistische verschillen tussen groepen werden geanalyseerd met behulp van de Mann-Whitney-test (* p < 0,05). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur 1: Lancering van LAS X-software en parameters voor confocale overnames. De verschillende stappen om confocale beelden te verkrijgen worden beschreven in de paragrafen 3.1.2 tot en met 3.1.7 van het protocol. Voor elke NMJ stack acquisitie wordt een project geopend (stap 3.1.4) en worden de parameters van beeldgrootte, acquisitiesnelheid, X, Y en Z assen geselecteerd (stap 3.1.7), waarbij elke sequentiële scan wordt aangegeven (Seq.1, laser 405 voor DAPI; Seq.2, laser 488 voor α-BTX-F488; en Seq.3, laser 552 voor F594 geconjugeerde secundaire antilichamen). Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 2: Lancering van LAS X-software en parameters voor STED-acquisities. De stappen voor het verkrijgen van STED-beelden worden beschreven in de punten 3.2.2 tot en met 3.2.8 van het protocol. De microscoop wordt gestart in configuratiemodus STED ON (stap 3.2.2) en een project wordt geopend (stap 3.2.3). De parameters voor beeldacquisitie (stap 3.2.7) (beeldgrootte, acquisitiesnelheid, zoomfactor, X-as), bij elke sequentiële scan worden aangegeven (Seq.1 voor α-BTX-F633; Seq.2 voor F488 geconjugeerde secundaire antilichamen). Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 3: Afbeeldingen van α-BTX-gekleurde junctionele plooien verkregen door STED-microscopie. Afbeeldingsvoorbeelden van een postsynaptische endplate gelabeld met α-BTX-F633 van een 6 weken oude wild-type muis die werden verkregen met een juiste (links) of onjuiste focus (rechts). Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende afbeelding 4: Windows-pop-ups om de invoer- en uitvoergegevens te beschrijven die zijn verkregen door de aangepaste ImageJ-macro's. Voorbeelden van invoergegevens (.tif- en .lif-bestanden) van NMJ-afbeeldingen worden weergegeven in de linkerkolom. De uitvoergegevens van de macro's (rechterkolom) worden opgeslagen in mappen (Save_Volume, Save_Accu) die afbeeldingen van het knooppunt (.tif) en gegevensbladen met de resultaten (.csv bestanden) bevatten. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 5: AChR-streepafstands- en breedteanalyse van een STED-acquisitie met behulp van de LAS X-software. De stappen om NMJ STED-beelden te analyseren worden beschreven in sectie 5 van het protocol. A) Afbeelding van een gelabeld postsynaptisch endplate-gebied met AChR-strepen. Het gebied dat van belang is voor streepanalyse wordt geselecteerd door een loodrechte lijn (groene lijn, voor streepafstand) of een loodrechte rechthoek (paarse rechthoek, voor streepbreedte) te tekenen. (B, C) Intensiteitsprofielen van de geselecteerde gebieden en metingen om de afstand tussen AChR-strepen (B) en de AChR-streepbreedte (C) te berekenen, worden weergegeven. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende coderingsbestand 1: Macro_NMJ_VOL_Marinelloetal. Aangepaste macro imageJ om NMJ-parametermetingen te extraheren (NMJ-volume, MIP-eindplaatoppervlak en NMJ-tortuositeit). Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend coderingsbestand 2: Macro_NMJ_ACCU_Marinelloetal. ImageJ aangepaste macro om NF-M accumulatie en SV2-kleuring te extraheren. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussion
Het beschreven videoprotocol biedt een gedetailleerde methode om de 3D-structuur van neuromusculaire juncties te kwantificeren door confocale en STED-microscopie te combineren die kan worden gebruikt om pathologische veranderingen op pre- en postsynaptisch niveau te karakteriseren. De hoge resolutie van STED-microscopie maakt visualisatie en morfometrische analyse mogelijk van nanostructuren die niet identificeerbaar zijn door conventionele confocale beeldvorming. Deze procedure stelde ons in staat om structurele veranderingen van NMJ's te meten in twee appendiculaire spieren, tibialis anterior en gastrocnemius, van SMA- en ColQ-gerelateerde CMS-muizen.
Om betrouwbare resultaten met deze techniek te verkrijgen, is het van cruciaal belang om spieren goed te ontleden en te plagen, met bijzondere aandacht voor de fascia rond de spier en de toegepaste kracht om spierbundels te scheiden; anders zou het innervatiepatroon kunnen worden verstoord, waardoor een goede presynaptische NMJ-beoordeling wordt belemmerd. Hoewel gedetailleerde informatie wordt verstrekt om NMJ's van TA en GA te analyseren, kan dit protocol in principe worden aangepast aan andere spieren, waaronder platte spieren, zoals het diafragma of transversale abdominis37, waarvoor de plagerige stap niet nodig is. Weefselfixatie is ook cruciaal om een goede kwaliteit kleuring te garanderen; daarom wordt aanbevolen om PFA van hoge kwaliteit te gebruiken op een geschikt volume (15-20 keer dat van de spier). Bovendien is de blootstellingstijd aan het fixatief een belangrijke stap omdat artefacten, zoals krimp en klontering, kunnen verschijnen als gevolg van overfixatie en NMJ-kenmerken kunnen beïnvloeden. Gezien de grootte van de monsters en de penetratiegraad van de paraformaldehyde-oplossing in weefsels38, wordt een fixatietijd van 18-24 uur aanbevolen voor dit type spier. In het geval dat de kleuringsstap meer dan een week na het oogsten van weefsel wordt gepland, wordt voorgesteld om PFA-gefixeerde spieren in PBS aangevuld met natriumazide bij 4 ° C te houden om bacteriële proliferatie te voorkomen.
Dit protocol presenteert een aanpak met behulp van α-BTX-F488 voor confocale en α-BTX-F633 voor STED-beeldvorming. Deze fluoroforen zijn gekozen om te passen bij het beschreven experimentele ontwerp, maar kunnen worden aangepast aan de beschikbare apparatuur en materialen. Zo kan α-BTX F488-etikettering worden geselecteerd bij gebruik van een STED CW 592 nm-laser voor beeldacquisitie en kwantificering. Het lijkt er echter op dat de configuratie die in de huidige studie werd toegepast (pulsed excitation gated STED, 775 nm depletion) hogere prestaties en betere resolutie vertoont dan andere benaderingen, zoals continue golf STED39, waardoor het meer geschikt is voor de huidige toepassing. Het is ook belangrijk om de instellingen voor het laservermogen zorgvuldig te selecteren, vooral voor STED (zowel excitatie als uitputting), omdat de kenmerken van een intensiteitsprofiel niet kunnen worden gemeten in geval van verzadiging, en daarom kan elk verzadigd signaal in een NMJ-beeld de hele analyse in gevaar brengen.
Deze gedetailleerde workflow, inclusief beeldacquisitie en -analyse met behulp van microscoopsoftware en ImageJ-macro's, is ontwikkeld om autonome NMJ-morfometrische analyse door confocale en STED-microscopie van een enkele spier mogelijk te maken. Eerder beschreven workflows voor NMJ confocale analyse, zoals NMJ-morph2 of NMJ-Analyser14, maakten de weg vrij voor het ontwerp van semi-automatische methoden die morfologische analyse van NMJ's en vergelijkende studies vergemakkelijken. NMJ-morph (en de bijgewerkte versie aNMJ-morph15) is een gratis ImageJ-gebaseerd platform dat de maximale intensiteitsprojectie gebruikt om 21 morfologische kenmerken te meten, en NMJ-Analyser gebruikt een script ontwikkeld in Python dat 29 relevante parameters genereert uit de gehele 3D NMJ-structuur. Handmatige drempels zijn de enige stap tijdens de beeldverwerking in deze twee methoden die gebruikersanalyse vereisen. Dit geïntegreerde protocol beschrijft stappen voor weefselvoorbereiding, 3D confocale beeldacquisitie en ImageJ-gebaseerde verwerking van NMJ's van volledige skeletspieren en biedt een vereenvoudigd overzicht van vijf belangrijke parameters van de postsynaptische (volume, maximaal projectiegebied en tortuositeit) en presynaptische (axon terminale bezetting en neurofilamentaccumulatie) endplates. Een extra parameter van biologische relevantie, het AChR-organisatiepatroon van de postsynaptische junctionele plooien, werd opgenomen voor morfometrische analyse op nanoschaalniveau door superresolutie STED-microscopie (resolutie 20-30 nm)40. Interessant is dat weefselvoorbereiding voor SOA-beeldvorming eenvoudiger is dan andere methoden die worden gebruikt voor NMJ-ultrastructurele studies, zoals conventionele transmissie-elektronenmicroscopie (TEM)9, een vrij complexe en tijdrovende procedure die een bekwame manipulator vereist om ultradunne secties van het juiste spiergebied te verkrijgen. Bovendien kunnen kwantitatieve gegevens uit meerdere junctionele plooien automatisch worden verkregen met behulp van de STED-bijbehorende software.
Dit protocol werd toegepast om eerder bekende NMJ-defecten in SMN- en ColQ-deficiënte spieren te illustreren 20,36,41,42. Gemeenschappelijke veranderingen werden gevonden in de twee muismodellen door confocale microscopie, zoals een verminderd postsynaptisch endplatevolume, MIP-gebied en relatieve tortuositeit, en verhoogde neurofilamentaccumulatie, terwijl sommige meer specifieke bevindingen (verminderde NMJ-bezetting), alleen werden waargenomen bij SMA-muizen, als een indicator van verminderde blaasjeshandel36. Ten slotte werd een toename van de AChR-streepafstand en -breedte gedetecteerd in ColQ-KO door STED-analyse, die tekenen zijn van ultrastructurele defecten in de postsynaptische junctionele plooien, zoals eerder waargenomen door TEM20. Belangrijk is dat dit protocol kan helpen bij een meer diepgaande morfologische karakterisering van neuromusculaire juncties tijdens ontwikkeling, onderhoud en onder verschillende pathologische omstandigheden.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten met betrekking tot dit werk.
Acknowledgments
We danken Genethon's "Imaging and Cytometry Core Facility", evenals de histologiedienst, die gedeeltelijk worden ondersteund door apparatuurfondsen van de regio Ile-de-France, de Conseil General de l'Essonne, de Genopole Recherche van Evry, de Universiteit van Evry Val d'Essonne en de INSERM, Frankrijk. We zijn ook Dr. Rashmi Kothary dankbaar voor het leveren van de Smn2B/2B muislijn (Universiteit van Ottawa, Canada) en Dr. Eric Krejci voor de ColQDex2/+ muislijn (ongepubliceerd, Universiteit van Parijs, Frankrijk). Wij danken Guillaume Corre voor zijn steun bij de statistische analyse. De 2H3 (ontwikkeld door Jessel, T.M. en Dodd, J.) en SV2 (ontwikkeld door Buckley, K.M.) monoklonale antilichamen werden verkregen uit de Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB), gemaakt door de NICHD van de NIH en onderhouden aan de Universiteit van Iowa, Department of Biology, Iowa City, IA 52242. Dit werk werd ondersteund door de Association Française contre les Myopathies (AFM-Telethon), het INSERM en de Universiteit van Evry Val d'Essonne.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Buffers and Reagents | |||
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (F488) | Life Technologies, Thermofisher | A-11001 | |
| Alexa Fluor 488 α-bungarotoxin (F488-a-BTX) | Life Technologies, Thermofisher | B13422 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG (F594) | Life Technologies, Thermofisher | A-11032 | |
| ATTO-633 α-bungarotoxin (F633-a-BTX) | Alomone Labs | B-100-FR | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
| DAPI Fluoromount-G | Southern Biotech | 00-4959-52 | |
| DPBS | Gibco, Invitrogen | 14190-169 | |
| Ethanol Absolute | VWR | 20821.296 | |
| Immersion Oil, n = 1.518 | THORLABS | MOIL-10LF | Low autofluorescence |
| Neurofilament (NF-M) antibody | DSHB | AB_531793 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | MERCK | 1.04005 | |
| Synaptic vesicle glycoprotein 2 (SV2) antibody | DSHB | AB_2315387 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Materials | |||
| Alnico Button cylindrical magnets | Farnell France | E822 | diameter of 19.1 mm with maximal pull of 1.9 Kg |
| 63x 1.4 NA magnitude oil immersion HCX Plan Apo CS objective | Leica Microsystems | ||
| 100x 1.4 NA HC PL APPO CS2 Objective | Zeiss | ||
| Curved thin forceps-Moria iris forceps | Fine Science Tools | 11370-31 | |
| Extra thin scissors - Vannas-Tübingen Spring Scissors | Fine Science Tools | 15-003-08 | |
| Fine serrated forceps | Euronexia | P-95-AA | |
| Gel loading tip round 1-200 µL | COSTAR | 4853 | |
| Leica laser-scanning confocal microscope TCS SP8 | Leica Microsystems | ||
| Leica Laser-scanning confocal microscope TCS SP8 Gated STED 775 nm | Leica Microsystems | ||
| Lens Cleaning Tissue | Whatman (GE Healthcare) | 2105-841 | |
| Medium serrated forceps | Euronexia | P-95-AB | |
| Microscope cover glasses 24x50 nm No 1.5H 170±5 µm | Marienfield | 107222 | High precision |
| Nunclon delta surface (12-well plates) | Thermo Scientific | 150628 | |
| Nunclon delta surface (24-well plates) | Thermo Scientific | 142475 | |
| Safeshield scalpel | Feather | 02.001.40.023 | |
| Sharp-blunt scissors - fine Scissors - Martensitic Stainless Steel | Fine Science Tools | 14094-11 | |
| Superfrost plus slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Software | |||
| GraphPad | Prism, San Diego (US) | Release N°6.07 | Statistical software |
| ImageJ software | National Institutes of Health | Release N° 1.53f | |
| Leica Application Suite X software | Leica Microsystems | Release N°3.7.2.2283 | Free microscope software available at https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/downloads/ |
References
- Slater, C. R. Postnatal maturation of nerve-muscle junctions in hindlimb muscles of the mouse. Developmental Biology. 94 (1), 11-22 (1982).
- Jones, R. A., et al. NMJ-morph reveals principal components of synaptic morphology influencing structure-function relationships at the neuromuscular junction. Open Biology. 6 (12), (2016).
- Willadt, S., Nash, M., Slater, C. Age-related changes in the structure and function of mammalian neuromuscular junctions. Annals of the New York Academy of Sciences. 1412, 41-53 (2018).
- Boehm, I., et al. Comparative anatomy of the mammalian neuromuscular junction. Journal of Anatomy. 237 (5), 827-836 (2020).
- Nishimune, H., Shigemoto, K. Practical anatomy of the neuromuscular junction in health and disease. Neurologic Clinics. 36 (2), 231-240 (2018).
- Moloney, E. B., de Winter, F., Verhaagen, J. ALS as a distal axonopathy: molecular mechanisms affecting neuromuscular junction stability in the presymptomatic stages of the disease. Frontiers in Neuroscience. 8, (2014).
- Lovering, R. M., Iyer, S. R., Edwards, B., Davies, K. E. Alterations of neuromuscular junctions in Duchenne muscular dystrophy. Neuroscience Letters. 737, 135304 (2020).
- Koneczny, I., Herbst, R. Myasthenia Gravis: Pathogenic effects of autoantibodies on neuromuscular architecture. Cells. 8 (7), 671 (2019).
- Dowling, J. J., et al. Myotubular myopathy and the neuromuscular junction: a novel therapeutic approach from mouse models. Disease Models & Mechanisms. 5 (6), 852-859 (2012).
- Gibbs, E. M., et al. Neuromuscular junction abnormalities in DNM2-related centronuclear myopathy. Journal of Molecular Medicine. 91 (6), 727-737 (2013).
- Swoboda, K. J., et al. Natural history of denervation in SMA: Relation to age, SMN2 copy number, and function. Annals of Neurology. 57 (5), 704-712 (2005).
- Rodríguez Cruz, P. M., Palace, J., Beeson, D. The neuromuscular junction and wide heterogeneity of congenital myasthenic syndromes. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1677 (2018).
- Tse, N., et al. The neuromuscular junction: Measuring synapse size, fragmentation and changes in synaptic protein density using confocal fluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (94), e52220 (2014).
- Mejia Maza, A., et al. NMJ-Analyser identifies subtle early changes in mouse models of neuromuscular disease. Scientific Reports. 11 (1), 12251 (2021).
- Minty, G., et al. aNMJ-morph: a simple macro for rapid analysis of neuromuscular junction morphology. Royal Society Open Science. 7 (4), 200128 (2020).
- Modla, S., Mendonca, J., Czymmek, K. J., Akins, R. E. Identification of neuromuscular junctions by correlative confocal and transmission electron microscopy. Journal of Neuroscience Methods. 191 (2), 158-165 (2010).
- Kittel, R. J., et al. Bruchpilot promotes active zone assembly, Ca2+ channel clustering, and vesicle release. Science. 312 (5776), 1051-1054 (2006).
- York, A. L., Zheng, J. Q. Super-resolution microscopy reveals a nanoscale organization of acetylcholine receptors for trans-synaptic alignment at neuromuscular synapses. eNeuro. 4 (4), (2017).
- Bowerman, M., Murray, L. M., Beauvais, A., Pinheiro, B., Kothary, R. A critical smn threshold in mice dictates onset of an intermediate spinal muscular atrophy phenotype associated with a distinct neuromuscular junction pathology. Neuromuscular Disorders. 22 (3), 263-276 (2012).
- Feng, G., Krejci, E., Molgo, J., Cunningham, J. M., Massoulié, J., Sanes, J. R. Genetic analysis of collagen Q: Roles in acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase assembly and in synaptic structure and function. Journal of Cell Biology. 144 (6), 1349-1360 (1999).
- Sigoillot, S. M., et al. Neuromuscular junction immaturity and muscle atrophy are hallmarks of the ColQ-deficient mouse, a model of congenital myasthenic syndrome with acetylcholinesterase deficiency. The FASEB Journal. 30 (6), 2382-2399 (2016).
- Vanhaesebrouck, A. E., Beeson, D. The congenital myasthenic syndromes: expanding genetic and phenotypic spectrums and refining treatment strategies. Current Opinion in Neurology. 32 (5), 696-703 (2019).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- ImageJ. , Available from: http://imagej.nih.gov/ij (2021).
- Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
- Bio-Formats. , Available from: http://www.openmicroscopy.org/bio-formats/downloads/ (2021).
- Legland, D., Beaugrand, J. Automated clustering of lignocellulosic fibres based on morphometric features and using clustering of variables. Industrial Crops and Products. 45, Supplement C 253-261 (2013).
- ImageJ documentation. , Available from: http://imagejdocu.tudor.lu/plugin/analysis/geodesic_distances/start (2021).
- GitHUb. , Available from: https://github.com/Genethon/ImCy (2021).
- Otsu, N. A Threshold selection method from gray-level histograms. IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 9 (1), 62-66 (1979).
- Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Induction, assembly, maturation and maintenance of a postsynaptic apparatus. Nature Reviews Neuroscience. 2 (11), 791-805 (2001).
- Kong, L., et al. Impaired synaptic vesicle release and immaturity of neuromuscular junctions in spinal muscular atrophy mice. The Journal of Neuroscience. 29 (3), 842-851 (2009).
- Cifuentes-Diaz, C., et al. Neurofilament accumulation at the motor endplate and lack of axonal sprouting in a spinal muscular atrophy mouse model. Human Molecular Genetics. 11 (12), 1439-1447 (2002).
- Murray, L. M., Comley, L. H., Thomson, D., Parkinson, N., Talbot, K., Gillingwater, T. H. Selective vulnerability of motor neurons and dissociation of pre- and post-synaptic pathology at the neuromuscular junction in mouse models of spinal muscular atrophy. Human Molecular Genetics. 17 (7), 949-962 (2008).
- Boyer, J. G., et al. Myogenic program dysregulation is contributory to disease pathogenesis in spinal muscular atrophy. Human Molecular Genetics. 23 (16), 4249-4259 (2014).
- Ling, K. K. Y., Gibbs, R. M., Feng, Z., Ko, C. -P. Severe neuromuscular denervation of clinically relevant muscles in a mouse model of spinal muscular atrophy. Human Molecular Genetics. 21 (1), 185-195 (2012).
- Murray, L., Gillingwater, T. H., Kothary, R. Dissection of the transversus abdominis muscle for whole-mount neuromuscular junction analysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (83), e51162 (2014).
- Baker, J. R. Principles of biological microtechnique; a study of fixation and dyeing. , Wiley. London Methuen; New York. at http://archive.org/details/principlesofbiol01bake (1958).
- Vicidomini, G., et al. STED Nanoscopy with time-gated detection: Theoretical and experimental aspects. PLoS ONE. 8 (1), 054421 (2013).
- Badawi, Y., Nishimune, H. Super-resolution microscopy for analyzing neuromuscular junctions and synapses. Neuroscience Letters. 715, 134644 (2020).
- Thomson, S. R., et al. Morphological characteristics of motor neurons do not determine their relative susceptibility to degeneration in a mouse model of severe spinal muscular atrophy. PLoS ONE. 7 (12), 052605 (2012).
- McMacken, G. M., et al. Salbutamol modifies the neuromuscular junction in a mouse model of ColQ myasthenic syndrome. Human Molecular Genetics. 28 (14), 2339-2351 (2019).
