Summary
Detta protokoll beskriver en metod för morfometrisk analys av neuromuskulära korsningar genom kombinerad konfokal och STED-mikroskopi som används för att kvantifiera patologiska förändringar i musmodeller av SMA och ColQ-relaterat CMS.
Abstract
Neuromuskulära korsningar (NMJs) är högspecialiserade synapser mellan lägre motorneuroner och skelettmuskelfibrer som spelar en viktig roll vid överföring av molekyler från nervsystemet till frivilliga muskler, vilket leder till sammandragning. De påverkas av många mänskliga sjukdomar, inklusive ärftliga neuromuskulära störningar som Duchennes muskeldystrofi (DMD), medfödda myastheniska syndrom (CMS), spinal muskelatrofi (SMA) och amyotrofisk lateralskleros (ALS). Därför utgör övervakning av morfologin hos neuromuskulära korsningar och deras förändringar i sjukdomsmusmodeller ett värdefullt verktyg för patologiska studier och preklinisk bedömning av terapeutiska tillvägagångssätt. Här beskrivs metoder för märkning och analys av den tredimensionella (3D) morfologin hos de pre- och postsynaptiska delarna av motoriska ändplattor från murina retade muskelfibrer. Procedurerna för att förbereda prover och mäta NMJ-volym, area, tortuositet och axonterminal morfologi / beläggning genom konfokal avbildning och avståndet mellan postsynaptiska korsningsveck och acetylkolinreceptor (AChR) randbredd genom superupplösningsstimulerad emissionsutarmning (STED) mikroskopi är detaljerade. Förändringar i dessa NMJ-parametrar illustreras hos mutanta möss som påverkas av SMA och CMS.
Introduction
Den neuromuskulära korsningen (NMJ) är en komplex struktur som består av en motoraxonterminal, en perisynaptisk Schwann-cell och en skelettmyofiberdel som är involverad i överföringen av kemisk information och koppling av lägre motorneuronaktivitet till muskelkontraktion. Hos däggdjur förändras morfologin hos den neuromuskulära korsningen under utvecklingen och antar en typisk kringlaliknande form efter mognad, med skillnader i form och komplexitet mellan arter, och visar en viss grad av plasticitet som svar på fysiologiska processer som träning eller åldrande 1,2,3,4 . Den postsynaptiska motorändplattan bildar membraninvaginationer som kallas korsningsveck, där den övre delen innehållande acetylkolinreceptorer (AChR) är i nära kontakt med den presynaptiska terminala axongrenen5.
Morfologiska och funktionella förändringar i neuromuskulära korsningar bidrar till patofysiologin hos flera neurodegenerativa störningar såsom spinal muskelatrofi (SMA) och amyotrofisk lateralskleros (ALS), myopatier som Duchennes muskeldystrofi (DMD), medfödda myastheniska syndrom (CMS), myasthenia gravis (MG) och centronukleära myopatier (CNM) och åldrande-associerad sarkopeni 3,6,7,8,9, 10,11,12. Vid dessa sjukdomar observeras NMJ-strukturella förändringar såsom fragmentering av ändplattan, minskad postsynaptisk korsningsveckstorlek och / eller denervation. Patologin hos NMJ kan vara en primär eller tidig händelse under sjukdomsprogression eller visas mer nyligen som en sekundär händelse som bidrar till de kliniska manifestationerna. I vilket fall som helst representerar övervakning av NMJs morfologi i djurmodeller av dessa sjukdomar en värdefull parameter för att studera patologiska förändringar och bedöma effekten av potentiella behandlingar.
Morfologin hos neuromuskulära korsningar analyseras vanligtvis med tekniker som använder konfokalmikroskopi 2,13,14,15 eller elektronmikroskopi 5,16, med deras inneboende begränsningar såsom upplösning respektive tekniska svårigheter. På senare tid användes superupplösningsmikroskopi också för att visualisera vissa regioner i NMJ, såsom presynaptiska aktiva zoner eller AChR-fördelning på det postsynaptiska membranet16,17,18, som ett alternativt eller kompletterande tillvägagångssätt för ultrastrukturell analys med elektronmikroskopi.
Detta protokoll syftar till att tillhandahålla en detaljerad och reproducerbar metod för att bedöma NMJ-morfologiska parametrar genom att kombinera fluorescenskonfokal och stimulerad emissionsutarmning (STED) mikroskopi. Viktiga egenskaper hos de presynaptiska och postsynaptiska ändplattorna, såsom volym, area, relativ tortuositet, AChR-randbredd och axonterminalfördelning i innerverade retade muskelfibrer hos mus gastrocnemius och tibialis främre kvantifierades i samband med normala och sjuka tillstånd. I synnerhet exemplifierades NMJ-defekter i Smn2B/- musmodellen av spinal muskelatrofi, en neuromuskulär sjukdom med motorneurondegenerering orsakad av mutationer i SMN1-genen11,19, och i en kollagenliknande svansunderenhet av asymmetrisk acetylkolinesteras knockout (ColQ Dex2/Dex2 eller ColQ-KO) möss, som en modell av det medfödda myastheniska syndromet20, 21,22.
Protocol
Skötsel och manipulering av möss utfördes i enlighet med nationell och europeisk lagstiftning om djurförsök och godkändes av den institutionella etiska kommittén. Män och kvinnor av Smn2B/- (C57Bl/6J bakgrund) och ColQ Dex2/Dex2 (B6D2F1/J bakgrund) möss vid 3- respektive 6 veckors ålder användes i studien.
1. Eutanasi av möss och dissektion av muskler: tibialis anterior och gastrocnemius
- Fortsätt till mustanestesi genom intraperitoneal injektion av en ketamin (87,5 mg/kg)/xylazin (12,5 mg/kg) blandad lösning (0,1 ml/20 g kroppsvikt) före eutanasi genom cervikal dislokation.
OBS: Eftersom SMA och ColQ-CMS påverkar individer oberoende av deras kön, användes manliga och kvinnliga möss i detta protokoll. - Ta bort bakbenen hår med en liten elektrisk rakapparat och skölj benen med 70% etanol.
OBS: Dissektionsproceduren kommer att skilja sig åt för varje muskel. För dissektion av tibialis anterior (TA), följ steg 1.2.1-1.2.3 och för gastrocnemius (GA) (mediala och laterala delar), följ steg 1.2.4-1.2.6. Hantera musklerna försiktigt för att förhindra vävnadsskador och krossa eller sträcka dem under dissektion.- Placera musen i ryggläge.
- Gör ett snitt på huden på 5 mm med skarp-trubbig sax längs den antero-yttre delen av den distala bakbenet, parallellt med skenbenet, för att exponera muskeln. Använd extra tunn sax för att ta bort fascian.
- Skär den distala senan först (nära tassen) och sedan den proximala senan (nära knäet) med extra tunn sax och en krökt tunn pincett. Hantera muskeln försiktigt för att undvika skador på myofibrer och nerver.
OBS: Den proximala senan måste delas så nära benet som möjligt för att skörda hela muskeln. - Placera musen i benäget läge, använd skarp-trubbig sax för att göra ett hudsnitt från den övre delen av det distala bakbenets bakre fack ner till tassen och ta bort huden.
- Ta tag i hälsenan med medelstora tandade pincett, skär den med en extra tunn sax och separera försiktigt GA från den omgivande vävnaden tillbaka till dess proximala insättning.
- På den proximala sidan sätter du in de medium tandade tångarna i fickan som bildas mellan biceps femoris (BF) och GA. Separera de två musklerna för att skära GA-senan så nära beninsättningen som möjligt med en extra tunn sax.
- För vävnadsfixering, placera varje muskel i ett 2 ml mikrocentrifugrör innehållande 1 ml 4% w / v paraformaldehyd (PFA) lösning utspädd i fosfatbuffertsaltlösning (PBS utan Ca2 + Mg 2+) och håll vid 4 ° C i18-24 timmar.
VARNING: Paraformaldehyd och formaldehyd är giftiga och måste hanteras i en kemisk dragskåp med lämplig skyddsutrustning. - Nästa dag, tvätta de fasta musklerna 3x i 5 min med PBS i 12-brunnsplattor genom att skaka försiktigt vid rumstemperatur (RT) inuti en kemisk dragskåp.
OBS: Protokollet kan stoppas vid detta steg och fortsätta inom en månad. Tillsätt i så fall PBS kompletterat med 0,01 % natriumazid för att lagra proverna vid 4 °C. - Reta varje muskel i små fiberbuntar på cirka 1 mm breda med två fina tandade pincett.
OBS: Det är viktigt att manipulera musklerna mycket försiktigt med pincett, utan överdriven kraft, för att förhindra vävnadsskador under retning.- Dissociera TA-muskeln i 3 eller 4 buntar beroende på dess storlek.
- För GA, separera de mediala och laterala delarna av muskeln och dissociera sedan varje del i 4-5 buntar beroende på deras storlek.
2. Immunfärgning
- Fortsätt med muskelfiberpermeabilisering: Överför muskelbuntar till 24-brunnsplattor som innehåller 1% (v / v) Triton X-100 i PBS och håll dem under mild omrörning (50 rpm) i 1 h vid RT eller 5 h vid 4 ° C.
OBS: Dela muskelbuntarna mellan två plattor för att fortsätta med separata immunfärgningar och för att minimera risken för antikroppsförvirring. Dela dem inte i mer än två brunnar (1 brunn / platta); annars kan antalet (N) NMJ som är representativa för deras allmänna status i den analyserade muskeln vara otillräckligt. - Tvätta proverna 3x i 5 min med PBS vid RT och inkubera dem med en blockerande lösning bestående av 4% bovint serumalbumin (BSA) i PBS/Triton X-100 1% i 4 timmar vid 4 °C, under försiktig omrörning (50 rpm).
OBS: Använd inte en aspirationspump under tvättstegen, utan aspirera lösningen manuellt med en pipett på 200 μL och små spetsar (referensen anges i materialförteckningen). - Inkubera proverna över natten (O/N) vid 4 °C under försiktig omrörning (50 rpm) med den blockerande lösning som anges i steg 2.2 och som innehåller primära monoklonala antikroppar mot antingen neurofilament M (NF-M, 2H3, utspädning 1/200) eller synaptiskt vesikelglykoprotein 2 (SV2, utspädning 1/200) för att märka presynaptiska axonterminaler respektive aktiva zoner.
- Nästa dag, tvätta muskelbuntarna 3x i 5 min i PBS under omrörning (50 rpm).
- För konfokal avbildning: Inkubera muskelbuntarna med sekundära antimusantikroppar konjugerade med en rödemitterande fluorofor (F594) (utspädning 1/500) och α-bungarotoxin konjugerat med en grönemitterande fluorofor (α-BTX-F488) (utspädning 1/1000) i PBS i 2 timmar vid RT under omrörning (50 rpm).
- För STED-avbildning: Inkubera muskelbuntarna med sekundära antimusantikroppar konjugerade med en grönemitterande fluorofor (F488) (utspädning 1/500) och α-bungarotoxin konjugerat med en långt rödemitterande fluorofor som kännetecknas av hög fotostabilitet (α-BTX-F633) (utspädning 1/1000) i PBS i 2 timmar vid RT under omrörning (50 rpm).
OBS: Utsätt inte proverna för ljus under inkubation för att undvika fotoblekning.
- Tvätta de märkta muskelbuntarna 3x i 5 min med PBS under omrörning (50 rpm) och placera dem på en bild med ett monteringsmedium.
OBS: Placera högst 4 till 5 muskelbuntar per bild för att möjliggöra tätning. - Lägg till en klass #1.5 (eller # 1.5H) glasöverdrag (0.17 mm tjocklek) på toppen och placera cylindriska magneter på båda sidor av bilden för att applicera tryck och platta ut musklerna.
- Håll rutschkanorna skyddade från ljus O/N vid 4 °C. Försegla bilderna permanent med nagellack.
3. Bildförvärv
- Förvärv med konfokalmikroskop
OBS: Bilder samlades in med ett inverterat laserscanningskonfokalmikroskop med hjälp av ett 63x oljefördjupningsmål (HCX Plan Apo CS, 1,4 numerisk bländare (NA)).- För blindad analys, låt en person som inte är involverad i analysen koda varje bild med ett givet nummer. Förbli blindad för experimentgrupperna tills kvantifieringen av NMJ-parametrar är klar för alla prover.
- Starta mikroskopprogramvaran i konfigurationsläge > machine.xlhw (kompletterande bild 1).
- Placera bilden på mikroskopsteget och hitta observationsplanet i provet genom att titta under DAPI-fluorescensbelysning med DAPI-filteruppsättningen.
- Klicka på Öppna projekt > nya projekt och skapa en mapp för att lagra bildförvärv (kompletterande bild 1).
Skapa ett nytt projekt för varje NMJ för att begränsa mappstorleken och förhindra problem med datorminnet. - För att hantera förvärvsparametrar, klicka på flikfönstret Förvärv och ställ in konfokalhålet till 1.0 Airy-enhet och lasereffekt för att optimera förstärknings- och förskjutningsnivåerna för den gröna / F488 (α-BTX) fluorescensen med en 488 nm laser vid ändplattan som måste avbildas (Live-läge PÅ).
- Optimera sedan den röda / F594 (NF-M eller SV2) fluorescensförvärvet med hjälp av en laser anpassad för F594-observation. I denna studie användes en 552 nm laser (Live mode ON). Ställ in spektrumet för färgämnesemission med följande intervall för varje laser: laser 405 (DAPI) från 414 till 483 nm, laser 488 (F488-α-BTX) från 506-531 nm och laser 552 (NF-M / SV2) från 622-650 nm.
- Samla bildstaplar av neuromuskulära korsningar i varje experimentgrupp med samma inställningar: bildstorlek 1024 x 1024 pixlar (73,7 x 73,7 μm) vid 400 Hz samplingsfrekvens, dubbelriktad X ON, zoomfaktor 2,5, Z-stegstorlek 0,5 μm i Z-Wide-läge.
OBS: För varje NMJ är antalet segment inställt på att förvärva hela korsningen. Förvärvsinställningarna som beskrivs ovan uppfyller Nyquist-Shanons provtagningssats. Användaren kan dock klicka på knappen Optimera format , som finns på alla senaste konfokala operativsystem, för att säkerställa att pixelstorlek och Z-steg uppfyller den perfekta Nyquist-samplingsfrekvensen. Denna åtgärd kommer att undvika över- eller undersamplade bilder, vilket kommer att orsaka förlust av noggrannhet i volymmätningar. - Spara originalfilen (.lif) eller Z-stack-bilderna (.tif) i en mapp med ett namn som innehåller kodnamnet på bilden, färgningstypen och slutplåtsnumret.
OBS: Samla sekventiellt (inte samtidigt) skanningarna med 488 nm och 552 nm lasrar (F488 och F594) för att undvika överhörning av F488-fluorescensen till F594-kanalen och vice versa (genomblödning). OBS: strålbanan kan konfigureras med färgassistenten i mikroskopprogramvaran. - Byt till nästa kodade bild och upprepa steg 3.1.3-3.1.8 för varje NMJ.
- I slutet av sessionen klickar du på Öppna i 3D Viewer och väljer en NMJ-representant för en experimentell grupp för att visualisera 3D-märkningen.
Det här visningsläget hjälper dig att verifiera att förvärvsparametrarna var korrekta. - Stäng mikroskopprogramvaran, rengör målen med linsvävnader och stäng sedan av systemet.
- Förvärv genom STED-mikroskopi
OBS: Bilder samlades in med ett inverterat laserscanningskonfokalmikroskop utrustat med Gated STED vid 775 nm med ett 100x oljefördjupningsmål (HC PL APO CS2 1.4 NA).- För blindad analys, låt en person som inte är involverad i analysen koda varje bild med ett givet nummer. Förbli blindad för experimentgrupperna tills kvantifieringen av NMJ-parametrar är klar för alla prover.
- Starta mikroskopprogramvaran i konfigurationsläge > machine.xlhw och STED ON (kompletterande bild 2).
- Klicka på Öppna projekt > Nya projekt för att skapa en mapp för att lagra bildförvärv.
Generera en ny mapp för varje bild för att begränsa mappstorleken och förhindra problem med datorminnet. - Placera bilden på mikroskopsteget och visa den under bredfältsfluorescensbelysning med 488 nm-lasern för att hitta observationsplanet i provet.
- Sök efter en NMJ märkt med neurofilament M (NF-M) eller SV2 färgningar med 488 nm laser med en spektral detektion från 506-531 nm.
- När en NMJ har identifierats klickar du på Aktivera STED och börjar skaffa bilder i ett område som innehåller flera korsningsveck (kompletterande figur 3) med 635 nm-lasern med en spektraldetektering från 640-750 nm.
OBS: Var försiktig med mättnadsuppslagstabellen under bildförvärvet och klicka på Quick LUT-knappen för att undvika överexponering (grå värden >255; för 8 bitar). - Samla in bilderna från varje experimentgrupp med samma inställningar: bildstorlek 2048 x 2048 pixlar (38,75 x 38,75 μm) med en samplingsfrekvens på 400 Hz.
OBS: Utarmningslaserns (STED) effekt är inställd på 65%. - Spara bilderna med ett filnamn som innehåller koden för bilden.
OBS: Det är möjligt att klicka på Optimerat XY-format: Ställ in format för att få den bästa förvärvsinställningen med STED-avbildning. - Byt till nästa kodade bild och upprepa steg 3.2.3-3.2.8. Upprepa den här proceduren för alla bilder.
- I slutet av STED-mikroskopisessionen överför du bildfilerna till en annan dator och sparar originalfilerna (. lif) på en extern enhet eller server.
- Stäng av mikroskopprogramvaran, rengör målen med linsvävnader och stäng sedan av systemet.
4. Bildanalys - konfokalmikroskopi
OBS: Alla bilder bearbetades med datorer som använder Microsoft Windows 10 professionellt operativsystem.
- Starta ImageJ och anpassat makro för att beräkna postsynaptisk NMJ-ändplattvolym, MIP-område (Maximum Intensity Projection) och relativ tortuositet.
- Bearbeta NMJ-bildstaplar med NIH ImageJ freeware23, iGeodesic-plugin och det anpassade makrot för att få NMJ-parametermätningar. Starta ImageJ-programvaran.
OBS: Den senaste versionen av ImageJ är fritt tillgänglig och kan laddas ner24. För att öppna proprietära filformat måste Bio-Formats Package25 plugin laddas ner26 . Detta steg är inte nödvändigt om operatören använder Fiji eftersom plugin-programmet redan är installerat i programvaran. Den iGeodesic plugin27 för att beräkna tortuositet är också tillgänglig online28; verifiera tillgängligheten för detta plugin i den ImageJ/Fiji-version som ska användas. De skräddarsydda makrona finns också tillgängliga online29. - Dra och släpp Macro_NMJ_VOL_Marinelloetal.ijm (skräddarsydd, kompletterande kodningsfil 1) till ImageJ-fönstret; Makrot öppnas i ett andra fönster. I det här nya fönstret klickar du på Makron > Kör makro.
Makrot kan bearbeta både proprietära filer och TIFF-filer. Filer måste uppfylla följande kriterier: för proprietära filformat, spara endast en korsning (dvs. bildstapeln) per fil, beställd i en mapp; För TIFF-bilder måste filer sparas i en mapp som innehåller undermappar, var och en med namnet JunctionX (X motsvarar ett NMJ-nummer) med bildstaplarna för en given korsning (RGB TIFF) (kompletterande figur 4). - Välj den inbyggda mappen som innehåller Junction-undermapparna som måste analyseras och klicka på Välj.
- I den nya popup-menyn som heter Spara mapp väljer du lagringsmappen och klickar på Välj.
- I den nya popup-menyn Bildtyp väljer du formatet för Z-stack-förvärven.
- Välj den RGB-kanal som motsvarar färgningen av intresse och ange XY-pixelstorlek och Z-steg (z). Makrot utför automatiskt analysen.
Om proprietära filformat väljs läser makrot direkt pixelstorlek och Z-steg (z). Användaren måste dock fortfarande ange kanalen av intresse (C1, C2 eller C3). Makrot tillhandahåller ett datablad (.csv) för varje kopplingsparameter (endplate-volym, MIP-område och tortuositet) i sparmappen. Makrot genererar också tre . TIF-filer , som motsvarar omkretsen av α-BTX-färgning Drawing_MaxprojX.tif, DrawingJunctionX.tif och MIP MaxprojX.tif. Dessa TIFF-filer genereras för att verifiera kvaliteten på förvärven och för att säkerställa att bildbehandlingen har utförts korrekt.
Postsynaptisk NMJ-volym (V): Makrot separerar bilder från en enda NMJ och behåller den α-bungarotoxin F488-kanalen som motsvarar den postsynaptiska ändplattan. Stapeln segmenteras med Otsu-tröskelvärde30 på den mellanliggande delen av stapeln. Den resulterande binära bilden är 1-pixel dilaterad och funktionen Analysera partiklar används för att mäta ändplattans yta för varje upptäckt objekt. För att erhålla den postsynaptiska NMJ-volymen summerar makrot alla uppmätta ändplåtsarealer i stapeln och multiplicerar den med Z-stegsvärde (z) i μm.
Maximal intensitetsprojektion (MIP) ändplatta: När stacken har begränsats erhålls projektionen med maximal intensitet (MIP) med hjälp av Z-projektets ImageJ-funktion . Funktionen Analysera partiklar används sedan för att kvantifiera MIP-ändplattans yta.
NMJ MIP-tortuositet (T): NMJ-tortuositeten, som återspeglar graden av komplexitet hos den postsynaptiska motorplattan inklusive veck och perforeringar31, beräknas baserat på varje MIP med följande formel, där d Obj (AB) är avståndet mellan A och B längs objektets omkrets och dEuc (AB) är det euklidiska avståndet mellan A och B (rak linje).
- Ställ in det högsta tortuositetsvärdet i vildtypsgruppen för varje experimentellt tillstånd till 100% och normalisera alla andra värden för det experimentella tillståndet till detta värde för att erhålla den relativa NMJ-tortuositeten.
- Bearbeta NMJ-bildstaplar med NIH ImageJ freeware23, iGeodesic-plugin och det anpassade makrot för att få NMJ-parametermätningar. Starta ImageJ-programvaran.
- Starta ImageJ och anpassat makro för att kvantifiera presynaptisk neurofilamentackumulering och synaptisk vesikelglykoprotein 2-färgning.
OBS: Neurofilamentackumulering (här, NF-M) och / eller förändrad fördelning av synaptiska vesiklar (här, SV2) är markörer för onormal axonal transport och / eller nedsatt vesikelhandel och observerades tidigare i NMJ av olika SMA-musmodeller32,33,34.- Dra och släpp Macro_NMJ_ACCU_Marinelloetal.ijm (skräddarsydd, kompletterande kodningsfil 2) till ImageJ-fönstret; Makrot öppnas i ett andra fönster. I det här nya fönstret klickar du på Makron > Kör makro.
Makrot kan bearbeta både proprietära filformat och TIFF-filer. Filerna måste uppfylla de kriterier som anges i anmärkningen nedan steg 4.1.2. - Välj den inbyggda mappen som innehåller Junction-undermapparna som måste analyseras och klicka på Välj.
- I den nya popup-menyn som heter Spara mapp väljer du lagringsmappen och klickar på Välj.
- I den nya popup-menyn Bildtyp väljer du formatet för Z-stack-förvärven.
- I popup-fönstret Staining Infos anger du den presynaptiska och postsynaptiska etiketten och färgen och klickar på OK. Till exempel presynaptisk etikett: SV2 eller NF, Presynaptisk färg: R, Postsynaptisk etikett: BTX, Postsynaptisk färg: G.
OBS: För proprietära filformat måste etiketter och motsvarande kanaler (C1, C2 eller C3) anges. - I popup-fönstret Pixelstorlek anger du XY-pixelstorlek 0,072 μm och Z-steg 0,5 μm (z) och klickar på OK. Makrot utför automatiskt analysen.
OBS: Denna parameter motsvarar bildstorleken 1024 x 1024 pixlar (73,7 x 73,7 μm) som valts före konfokalmikroskopförvärv, och den är korrelerad till mål- och zoominställningarna. Om de proprietära filformaten är markerade läser makrot direkt pixelstorlek och Z-steg (z). Makrot lagrar, i sparmappen, ett DataSheet (.csv) av presynaptiska och postsynaptiska volymer, en flersidig TIFF-bild av den aktuella detekteringen för varje (pre- och postsynaptisk) märkning. Som anges ovan genereras dessa TIFF-filer för att kontrollera kvaliteten på förvärven och för att säkerställa att bildbehandlingen har utförts korrekt.
Makrot beräknar volymen av axonal neurofilament M-färgning (NF-volym) från NF-M-F594-kanalen som samlokaliseras med α-bungarotoxin-F488-märkning och volymen av NMJ-synaptisk vesikelglykoprotein 2-färgning (SV2-volym) från SV2-F594-kanalen som samlokaliseras med α-BTX-F488-märkning. NF-M-ackumuleringen kvantifieras genom att beräkna förhållandet mellan NF-volym och postsynaptisk endplate-volym (α-BTX) och NMJ-axonterminalbeläggning med förhållandet mellan SV2- och α-BTX-volymer, som visas nedan.
- Dra och släpp Macro_NMJ_ACCU_Marinelloetal.ijm (skräddarsydd, kompletterande kodningsfil 2) till ImageJ-fönstret; Makrot öppnas i ett andra fönster. I det här nya fönstret klickar du på Makron > Kör makro.
5. Bildanalys- STED-mikroskopi
OBS: Bildbehandling utfördes med offline-programvaran från STED-mikroskoptillverkaren.
- Starta mikroskopprogramvaran.
- Öppna projektet genom att klicka på knappen Öppna projekt . Välj projektfilen (.lif) och öppna den. Bilderna visas på skärmen tillsammans med deras namn.
- I processfönstret : Klicka på Brusreducering > median. Längst ned i mittenfönstret ställer du in Radie på 5.00 och Iteration på 1.00 och avmarkerar 3D-filtrering.
- Välj sedan fliken Öppna projekt längst upp till vänster i fönstret och välj en bild.
- Klicka på Apply för att validera parametrar. En ny bild som heter "nameofimage_median001" skapas.
OBS: Det är möjligt att klicka på Förhandsvisning före Apply för att övervaka effekten av medianfiltret, vilket kommer att förbättra bildkontrasten och jämna ut linjeprofilerna som används för kvantifiering. - Använd filtret på alla bilder enligt anvisningarna i steg 5.4–5.5.
- På flikarna Öppna projekt klickar du på diskettenhetsikonen för att spara alla projekt , inklusive de nyskapade filtrerade bilderna.
OBS: Nästa steg kommer att göras med den filtrerade bilden med namnet "nameofimage_median001". - Beräkna avståndet mellan AChR-ränder
OBS: Förändringar i morfologin hos postjunktionella veck observeras ofta vid neuromuskulära störningar som ett tecken på NMJ-patologi (omogenhet eller degeneration). Avståndet (d) mellan AChR-ränder, som detekteras genom α-bungarotoxinfärgning, beräknas genom att generera intensitetsprofiler och kvantifiera avståndet mellan varje maximal intensitetstopp genom att rita en linjeprofil (kompletterande figur 5).- Använd mikroskopprogramvaran och välj menyn Quantify högst upp i det centrala fönstret.
- Klicka på fliken Verktyg längst upp till vänster. Välj Intensitet i den övre vänstra panelen och klicka på ikonen Linjeprofil . Ställ in Översampling på 1 och markera Sortera kanaler.
- Klicka på flikarna Öppna projekt och välj den filtrerade bilden som ska analyseras.
OBS: Det är möjligt att zooma in på bilden genom att bläddra med datormusen. Bildens dynamiska omfång kan ändras med hjälp av fältet på vänster sida bredvid den visade bilden, vilket underlättar visualiseringen av ränderna. - Klicka sedan på ikonen Rita linje i toppmenyn i det högra fönstret och spåra en linje som korsar vinkelrätt flera ränder / korsningsveck.
OBS: Intensitetsprofilen visas i det centrala fönstret. - Klicka på toppen av den första toppen och flytta muspekaren medan du håller vänster musknapp intryckt tills nästa maximala topp har uppnåtts.
OBS: Informationen visas i intensitetsprofilen, medan avståndet mellan de två topparna visas under diagrammet med "dx" -valör. - Klicka höger på musen medan du är i bilden i det högra fönstret och välj Spara ROI. Öppna de sparade ROI: erna (regioner av intresse) genom att klicka på Ladda ROI.
- Klicka på pilikonen längst upp till vänster i det högra fönstret, klicka på ROI och ta bort den genom att klicka på bin-ikonen.
- Upprepa denna operation så många gånger som behövs från olika intensitetsprofiler för att erhålla det förutsagda antalet AChR-randavstånd som representerar det globala värdet i den analyserade muskeln.
OBS: Det optimala N-värdet kan beräknas i förväg baserat på den uppskattade skillnaden mellan grupper, α risk, effekt och en- eller tvåsidigt test. I den nuvarande experimentella designen applicerades ett ensidigt Mann-Whitney-test (α risk = 10%; effekt = 80%) och N-värdet uppskattades vara minst fem AChR-randavstånd per NMJ för att jämföra de två grupperna av djur.
- AChR rand bredd
OBS: Randbredden (w) motsvarar intensitetsprofilens halvmaximala fullbredd (FWHM), vilket är avståndet mellan de punkter där α-BTX-signalfluorescensvärdet är hälften av dess maximala intensitet (kompletterande figur 5).- Använd mikroskopprogramvaran och välj menyn Quantify i det centrala fönstret.
- Klicka på fliken Verktyg längst upp till vänster. Välj Intensitet i den övre vänstra panelen och klicka på ikonen Bestäm FWHM . Markera Sortera kanaler.
OBS: För att optimera toppdetekteringen av programvaran ställdes Set Threshold och Width in på 50 respektive 3. Anpassa dessa värden för varje experiment och be om råd från en erfaren bildforskare. - Klicka på flikarna Öppna projekt och välj den filtrerade bilden som ska analyseras.
OBS: Det är möjligt att zooma in på den visade bilden i det högra fönstret genom att bläddra med datormusen. Som anges ovan (OBS efter steg 5.8.3) kan bildens dynamiska omfång ändras för optimal randvisualisering. - Klicka sedan på ikonen Rita rektangel i toppmenyn i det högra fönstret. Välj en rand som är antingen horisontell eller vertikal och rita en rektangel vinkelrätt mot randen. En profil visas i det centrala fönstret.
- Klicka på antingen Vertikal eller Horisontell på menyn Genomsnittlig projektion i den vänstra panelen, beroende på om randorienteringen är vertikal eller horisontell.
- Klicka på Statistik i det centrala fönstret och läs FWHM-värdet.
- Högerklicka med datormusen på bilden som visas i det högra fönstret och välj Spara ROI.
OBS: Öppna de sparade ROI: erna genom att klicka på Ladda ROI. - Klicka på pilikonen längst upp till vänster i det högra fönstret, klicka på ROI och ta bort den genom att klicka på bin-ikonen.
- Upprepa denna operation så många gånger som behövs från olika rektangel-ROI tills du får det förutsagda antalet AChR-randbredder, vilket kommer att vara representativt för det globala värdet i den analyserade muskeln.
6. Experimentell design och statistiska tester
- Utföra statistiska analyser med hjälp av specifik programvara.
OBS: Data samlades in från N ≥ 3 biologiska replikat och minst 20 NMJ per genotyp för konfokalmikroskopavbildning, och N ≥ 5 biologiska replikat och N = 5 NMJ per genotyp för STED-avbildning, i varje experimentgrupp. Signifikansen bedömdes genom oparat Mann-Whitney-test (icke-parametriska), och p-värden anges i motsvarande figurlegender.
Representative Results
För att underlätta den morfologiska analysen av neuromuskulära korsningar på pre- och postsynaptisk nivå på ett reproducerbart sätt utvecklades ett arbetsflöde från muskelskörd till avbildning och kvantifiering med hjälp av mikroskopprogramvaran och ImageJ-anpassade makron (figur 1). För att exemplifiera nyttan av detta protokoll utvärderades morfologin hos NMJ i två musmodeller av genetiska störningar, Smn2B/- och ColQ Dex2/Dex2-möss som drabbats av spinal muskelatrofi (SMA) respektive en medfödd myasthenisk syndrom (CMS) och data jämfördes med åldersmatchade kontrollkullkamrater.
NMJ-strukturen bedömdes från tibialis främre och gastrocnemius muskler hos 3- och 6-veckors gamla Smn2B/- (C57Bl/6 bakgrund) respektive ColQ Dex2/Dex2 (B6D2F1/J bakgrund) möss, när tecken på sjukdomen redan finns hos dessa djur. Vid 3 veckors ålder visar Smn2B/- möss tecken på fördröjd skelettmuskelutveckling och denervation, såsom NMJ-atrofi och förlust35,36. CMS-möss har en primär patologi i NMJ och uppvisar en minskning av kroppsvikt från den första veckan i livet och markerad muskelsvaghet20 (data visas inte). Som visas i figur 2A verkade den postsynaptiska motorplattan märkt med fluorescerande α-bungarotoxin mindre och / eller fragmenterad i mutanter av de två muslinjerna genom konfokalmikroskopi. Kvantifiering av NMJ Z-stackar med hjälp av dessa anpassade ImageJ-makron avslöjade markanta minskningar i ändplattans volym, maximal intensitetsprojektion (MIP) och relativ tortuositet hos både SMA- och CMS-möss jämfört med kontroller, som tecken på NMJ-mognadsdefekter32 (Figur 2B-D). Postsynaptisk endplate-volym och MIP minskade hos sjuka djur (vikförändring på 2,7 och 2,0 för volym och 2,5 och 2,0 för MIP, hos Smn2B/- respektive ColQ Dex2/Dex2-möss). Den relativa tortuositeten var också mindre i SMN- och ColQ-bristfälliga muskler än WT (16,97% ± 1,33% i SMA jämfört med 48,84% ± 5,90% WT-möss och 13,29% ± 2,79% i CMS jämfört med 30,20% ± 4,44% kontrollmöss). Dessutom avslöjade kvantifieringen av fördelningen av presynaptiska axonterminalgrenar med hjälp av ImageJ-anpassade makrot ett förändrat mönster i neurofilament M-distribution i de två djurmodellerna, med ökad immunmärkning (84,65% ± 0,32% mot 16,57% ± 2,03% och 23,64% ± 2,78% mot 18,77% ± 1,73% i Smn2B /- respektive ColQ Dex2 / Dex2-möss jämfört med kontroller) (Figur 3A-D ). Vid SV2-färgning observerades också en 43% minskning av beläggningsgraden, dvs procent av AChR-innehållande regioner med intilliggande nervterminala aktiva zoner, hos Smn2B /- möss (49,36% ± 3,76% i SMA jämfört med 85,69% ± 2,34% WT-möss) (Figur 3E, F). Denna NMJ-parameter beräknades också i GA för ColQ Dex2/Dex2-mutanter, men ingen statistiskt signifikant skillnad hittades jämfört med kontrollkullkamrater (data visas inte).
Vi analyserade vidare postsynaptiska membranegenskaper genom att kvantifiera avståndet mellan korsningsveck och bredden på AChR-ränder, som ligger vid toppen av dessa veck, i ColQ-bristfällig muskel med hjälp av superupplösningsstimulerad emissionsutarmning (STED) mikroskopi. Som visas i figur 4 kan aspekten av dessa strukturer tydligt visualiseras genom fluorescerande α-bungarotoxinmärkning och intensitetsprofilanalys. Vi utvärderade dessa NMJ-parametrar och fann en ökning av korsningsavståndet (d) och bredden (w) för AChR-ränder i gastrocnemiusmuskeln hos mutanter (358,3 nm ± 11,97 nm och 320,8 nm ± 10,90 nm för avståndet och 216,9 nm ± 10,51 nm och 186,3 nm ± 7,015 nm för bredden, i ColQ Dex2 / Dex2 jämfört med vildtypsmöss, respektive p < 0,05) (figur 4C,D).
Figur 1: Flödesschema för videoprotokollet för 3D-multiskala NMJ-karakterisering med konfokal- och STED-mikroskopi. Tibialis främre (TA) och gastrocnemius (GA) muskler samlades in från möss, och muskelfibrer retades före märkning med α-bungarotoxin-F488 eller α-bungarotoxin-F633, DAPI, primära antikroppar riktade mot neurofilament M (NF-M) och synaptiskt vesikelglykoprotein 2 (SV2) och fluorofor (F488 eller F594) -konjugerade sekundära antikroppar. Bildstackar förvärvades genom konfokalmikroskopi och bearbetades för att mäta postsynaptisk NMJ-volym, presynaptisk NF-M-ackumulering, NMJ-axonterminalbeläggning, postsynaptisk maximal intensitetsprojektion (MIP) ändplattaarea och tortuositet (d Obj (AB) är avståndet mellan A och B längs objektets omkrets (röd linje), medan dEuc (AB) är det euklidiska avståndet mellan A och B (grön linje)). För STED-mikroskopianalys kvantifierades bredden på acetylkolinreceptor (AChR) ränder och avståndet mellan korsningsveck från intensitetsprofiler av α-BTX-F633-färgning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Postsynaptisk NMJ-karakterisering med flera parametrar i musmodeller av spinal muskelatrofi (SMA) och ColQ-relaterat medfött myastheniskt syndrom (CMS). (A) Representativa bilder av postsynaptiska motoriska ändplattor från TA- och GA-muskler märkta med α-bungarotoxin-F488 (α-BTX). (B) Kvantifiering av NMJ postsynaptisk endplatevolym, (C) maximal intensitetsprojektion (MIP) -område och (D) relativ tortuositet i TA av 3 veckor gammal vildtyp (WT) och Smn2B /- möss (vänster grafer, N = 3 djur per genotyp, n = 37 respektive n = 56 NMJ) och 6 veckor gamla WT och ColQ Dex2 / Dex2 möss (höger grafer, N = 5 möss per genotyp, n = 89 respektive n = 97 NMJ). Data uttrycks som medelvärdet per mus (punkt) ± SEM. Skillnader mellan grupper analyserades med Mann-Whitney-test (* p < 0,05). Skalfältet är 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Morfometrisk analys av presynaptisk axonterminalfördelning i muskler hos WT och mutanta möss. NMJ innervationsmönster i tibialis främre (TA) och gastrocnemius (GA) muskler av vild typ, SMA och ColQ-relaterade CMS-möss. (A, B) Representativa neuromuskulära korsningar från TA av WT- och Smn2B/- möss vid 21 dagars ålder märkta med antikroppar mot neurofilament M (NF-M, röd) och α-bungarotoxin-F488 (α-BTX, grön) (A), och resultat från kvantitativ analys av neurofilamentackumulering (B); (C, D) Representativa neuromuskulära korsningar från GA av 6 veckor gamla WT- och ColQ Dex2 / Dex2-möss märkta med antikroppar mot neurofilament M (NF-M, röd) och α-bungarotoxin-F488 (α-BTX, grön), som visar fragmenterade och omogna postsynaptiska ändplattor (C) och resultat av neurofilamentackumulering i de två grupperna av djur (D). N= 4 (n = 34 NMJ) (B) och N = 3 (n = 54 NMJ) (D) WT-djur och N=3 (n = 36 NMJs) Smn2B/- och N = 3 (n = 55 NMJs) ColQ Dex2/Dex2-möss analyserades i experimenten (B, D). (E, F) Representativa bilder av axonterminalbeläggning i NMJ från TA av 3 veckor gamla WT- och Smn2B/- möss märkta med antikroppar mot synaptiskt vesikelglykoprotein 2 (SV2, rött) och α-bungarotoxin-F488 (α-BTX, grönt) (E) och resultat av NMJ-beläggning (SV2 / AChR-volymförhållande) (F). Muskler från N = 3 (n = 50 NMJ) vildtyp och N = 4 (n = 62 NMJs) Smn2B/- möss analyserades. Data uttrycks som medelvärdet per mus (punkt) ± SEM. Skillnader mellan grupper analyserades med Mann-Whitney-test (* p < 0,05). Skalstrecken är 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: STED-avbildning av NMJ postsynaptiska ändplattor. (A) Representativ STED-bild av en NMJ märkt med α-bungarotoxin-F633 (α-BTX) från gastrocnemius av en 6 veckor gammal vild mus som visar postjunctional AChR-ränder (skalstången är 5 μm). (B) Högre förstoring av ett område med AChR-ränder (bottenpanelen) som användes för att generera intensitetsprofilen. Bredden (w) på AChR-ränder och avståndet mellan två intilliggande ränder (d) i denna region kvantifierades och presenterades i stapeldiagrammet. Schematisk representation av den postsynaptiska ändplattan för att illustrera AChR-randbredd (w) och avstånd (d). Dessa parametrar, (C) AChR-randavstånd och (D) bredd, mättes hos ColQ Dex2/Dex2-möss och kontrollkullkamrater vid 6 veckors ålder. NMJs från 5 WT (totalt n = 29 NMJs) och 6 ColQ Dex2/Dex2 (totalt n = 43 NMJs) djur analyserades blint. Data uttrycks som medelvärdet per mus (punkt) ± SEM. Statistiska skillnader mellan grupper analyserades med hjälp av Mann-Whitney-testet (* p < 0,05). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 1: Lansering av LAS X-programvara och parametrar för konfokala förvärv. De olika stegen för att skaffa konfokala bilder beskrivs i avsnitten 3.1.2 till 3.1.7 i protokollet. För varje NMJ-stackförvärv öppnas ett projekt (steg 3.1.4) och parametrarna för bildstorlek, förvärvshastighet, X-, Y- och Z-axlar väljs (steg 3.1.7), med varje sekventiell skanning indikerad (Seq.1, laser 405 för DAPI; Seq.2, laser 488 för α-BTX-F488; och Seq.3, laser 552 för F594 konjugerade sekundära antikroppar). Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 2: Lansering av LAS X-programvara och parametrar för STED-förvärv. Stegen för att skaffa STED-bilder beskrivs i avsnitten 3.2.2 till 3.2.8 i protokollet. Mikroskopet startas i konfigurationsläge STED ON (steg 3.2.2) och ett projekt öppnas (steg 3.2.3). Parametrarna för bildförvärv (steg 3.2.7) (bildstorlek, förvärvshastighet, zoomfaktor, X-axel), med varje sekventiell skanning anges (Seq.1 för α-BTX-F633; Seq.2 för F488-konjugerade sekundära antikroppar). Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 3: Bilder av α-BTX-färgade korsningsveck erhållna genom STED-mikroskopi. Bildexempel på en postsynaptisk ändplatta märkt med α-BTX-F633 från en 6 veckor gammal vild mus som förvärvades med antingen ett korrekt (vänster) eller felaktigt fokus (höger). Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande bild 4: Windows popup-fönster för att beskriva indata och utdata som hämtas av de anpassade ImageJ-makrona. Exempel på indata (.tif- och .lif-filer) av NMJ-bilder visas i den vänstra kolumnen. Utdata från makrona (höger kolumn) sparas i mappar (Save_Volume, Save_Accu) som innehåller bilder av korsningen (.tif) och datablad som innehåller resultaten (.csv filer). Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 5: AChR-randavstånds- och breddanalys från ett STED-förvärv med LAS X-programvaran. Stegen för att analysera NMJ STED-bilder beskrivs i avsnitt 5 i protokollet. A) Bild av en märkt postsynaptisk ändplatta som innehåller AChR-ränder. Området av intresse för randanalys väljs genom att rita en vinkelrät linje (grön linje, för randavstånd) eller en vinkelrät rektangel (lila rektangel, för randbredd). (B, C) Intensitetsprofiler för de valda regionerna och mätningar för att beräkna avståndet mellan AChR-ränder (B) och AChR-randbredden (C) visas. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande kodningsfil 1: Macro_NMJ_VOL_Marinelloetal. ImageJ anpassat makro för att extrahera NMJ-parametermätningar (NMJ-volym, MIP-ändplattereal och NMJ-tortuositet). Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande kodningsfil 2: Macro_NMJ_ACCU_Marinelloetal. ImageJ anpassat makro för att extrahera NF-M-ackumulering och SV2-färgning. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
Det beskrivna videoprotokollet ger en detaljerad metod för att kvantifiera 3D-strukturen hos neuromuskulära korsningar genom att kombinera konfokal och STED-mikroskopi som kan användas för att karakterisera patologiska förändringar på pre- och postsynaptiska nivåer. Den höga upplösningen av STED-mikroskopi möjliggör visualisering och morfometrisk analys av nanostrukturer som inte kan identifieras genom konventionell konfokal avbildning. Denna procedur gjorde det möjligt för oss att mäta strukturella förändringar av NMJ i två appendikulära muskler, tibialis anterior och gastrocnemius, av SMA- och ColQ-relaterade CMS-möss.
För att få tillförlitliga resultat med denna teknik är det viktigt att dissekera och reta musklerna ordentligt, med särskild uppmärksamhet på fascian som omger muskeln och den applicerade styrkan för att separera muskelbuntar; annars kan innervationsmönstret störas och hindra korrekt presynaptisk NMJ-bedömning. Även om detaljerad information tillhandahålls för att analysera NMJ från TA och GA, kan detta protokoll i princip anpassas till andra muskler, inklusive platta muskler, såsom membran eller tvärgående abdominis37, som inte kräver retningssteget. Vävnadsfixering är också avgörande för att säkerställa färgning av god kvalitet; Därför rekommenderas att använda högkvalitativ PFA vid lämplig volym (15-20 gånger muskelns). Dessutom är exponeringstiden för fixativet ett viktigt steg eftersom artefakter, såsom krympning och klumpning, kan uppstå på grund av överfixering och påverka NMJ-funktioner. Med tanke på provernas storlek och penetrationshastigheten för paraformaldehydlösningen i vävnader38 rekommenderas en fixeringstid på 18-24 h för denna typ av muskel. Om färgningssteget planeras mer än en vecka efter vävnadsskörd, föreslås att PFA-fixerade muskler i PBS kompletteras med natriumazid vid 4 ° C för att förhindra bakteriell spridning.
Detta protokoll presenterar en metod som använder α-BTX-F488 för konfokal och α-BTX-F633 för STED-avbildning. Dessa fluoroforer valdes för att passa med den beskrivna experimentella designen men kan modifieras enligt tillgänglig utrustning och material. Till exempel kan α-BTX F488-märkning väljas när du använder en STED CW 592 nm laser för bildförvärv och kvantifiering. Det verkar dock som om konfigurationen som tillämpades i den här studien (pulserad excitation gated STED, 775 nm utarmning) uppvisar högre prestanda och bättre upplösning än andra tillvägagångssätt, såsom kontinuerlig våg STED39, vilket gör den mer lämplig för den aktuella applikationen. Det är också viktigt att noggrant välja lasereffektinställningarna, särskilt för STED (både excitation och utarmning), eftersom egenskaperna hos en intensitetsprofil inte kan mätas vid mättnad, och därför kan någon mättad signal i en NMJ-bild äventyra hela analysen.
Detta detaljerade arbetsflöde, inklusive bildförvärv och analys med hjälp av mikroskopprogramvara och ImageJ-makron, utvecklades för att underlätta autonom NMJ-morfometrisk analys genom konfokal- och STED-mikroskopi från en enda muskel. Tidigare beskrivna arbetsflöden för NMJ konfokal analys, såsom NMJ-morph2 eller NMJ-Analyser14, banade väg för design av halvautomatiska metoder som underlättar morfologisk analys av NMJ och jämförande studier. NMJ-morph (och dess uppdaterade version aNMJ-morph15) är en gratis ImageJ-baserad plattform som använder maximal intensitetsprojektion för att mäta 21 morfologiska funktioner, och NMJ-Analyser använder ett skript utvecklat i Python som genererar 29 relevanta parametrar från hela 3D NMJ-strukturen. Manuell tröskel är det enda steget under bildbehandling i dessa två metoder som kräver användaranalys. Detta integrerade protokoll beskriver steg för vävnadsberedning, 3D-konfokala bildförvärv och ImageJ-baserad bearbetning av NMJ från hela skelettmusklerna och ger en förenklad översikt över fem viktiga parametrar för postsynaptiska (volym, maximal projektionsarea och tortuositet) och presynaptiska (axonterminalbeläggning och neurofilamentackumulering) ändplattor. En ytterligare parameter av biologisk relevans, AChR-organisationsmönstret för de postsynaptiska korsningsvecken, införlivades för morfometrisk analys på nanonivånivå genom superupplöst STED-mikroskopi (upplösning 20-30 nm)40. Intressant nog är vävnadsförberedelse för STED-avbildning enklare än andra metoder som används för NMJ-ultrastrukturella studier, såsom konventionell transmissionselektronmikroskopi (TEM)9, vilket är ett ganska komplext och tidskrävande förfarande som kräver en skicklig manipulator för att erhålla ultratunna delar av lämplig muskelregion. Dessutom kan kvantitativa data från flera korsningsveck erhållas automatiskt med hjälp av den STED-associerade programvaran.
Detta protokoll tillämpades för att illustrera tidigare kända NMJs-defekter i SMN- och ColQ-bristfälliga muskler 20,36,41,42. Vanliga förändringar hittades i de två musmodellerna genom konfokalmikroskopi, såsom minskad postsynaptisk ändplåtvolym, MIP-område och relativ tortuositet och ökad neurofilamentackumulering, medan vissa mer specifika fynd (minskad NMJ-beläggning) endast observerades hos SMA-möss, som en indikator på nedsatt vesikelhandel36. Slutligen detekterades en ökning av AChR-randavståndet och bredden i ColQ-KO genom STED-analys, vilket är tecken på ultrastrukturella defekter i de postsynaptiska korsningsvecken, som tidigare observerats av TEM20. Det är viktigt att detta protokoll kan hjälpa till med en mer djupgående morfologisk karakterisering av neuromuskulära korsningar under utveckling, underhåll och under olika patologiska tillstånd.
Disclosures
Författarna förklarar inga intressekonflikter relaterade till detta arbete.
Acknowledgments
Vi tackar Genethons "Imaging and Cytometry Core Facility", liksom histologitjänsten, som delvis stöds av utrustningsmedel från regionen Ile-de-France, Conseil General de l'Essonne, Genopole Recherche of Evry, University of Evry Val d'Essonne och INSERM, Frankrike. Vi är också tacksamma mot Dr. Rashmi Kothary för att ha tillhandahållit Smn 2B / 2B muslinjen (University of Ottawa, Kanada) och Dr. Eric Krejci för ColQDex2 / + muslinjen (opublicerad, University of Paris, Frankrike). Vi tackar Guillaume Corre för hans stöd i statistisk analys. De monoklonala antikropparna 2H3 (utvecklade av Jessel, T.M. och Dodd, J.) och SV2 (utvecklade av Buckley, K.M.) erhölls från Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB), skapade av NICHD från NIH och underhålls vid University of Iowa, Department of Biology, Iowa City, IA 52242. Detta arbete stöddes av Association Française contre les Myopathies (AFM-Telethon), INSERM och University of Evry Val d'Essonne.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Buffers and Reagents | |||
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (F488) | Life Technologies, Thermofisher | A-11001 | |
| Alexa Fluor 488 α-bungarotoxin (F488-a-BTX) | Life Technologies, Thermofisher | B13422 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG (F594) | Life Technologies, Thermofisher | A-11032 | |
| ATTO-633 α-bungarotoxin (F633-a-BTX) | Alomone Labs | B-100-FR | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
| DAPI Fluoromount-G | Southern Biotech | 00-4959-52 | |
| DPBS | Gibco, Invitrogen | 14190-169 | |
| Ethanol Absolute | VWR | 20821.296 | |
| Immersion Oil, n = 1.518 | THORLABS | MOIL-10LF | Low autofluorescence |
| Neurofilament (NF-M) antibody | DSHB | AB_531793 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | MERCK | 1.04005 | |
| Synaptic vesicle glycoprotein 2 (SV2) antibody | DSHB | AB_2315387 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Materials | |||
| Alnico Button cylindrical magnets | Farnell France | E822 | diameter of 19.1 mm with maximal pull of 1.9 Kg |
| 63x 1.4 NA magnitude oil immersion HCX Plan Apo CS objective | Leica Microsystems | ||
| 100x 1.4 NA HC PL APPO CS2 Objective | Zeiss | ||
| Curved thin forceps-Moria iris forceps | Fine Science Tools | 11370-31 | |
| Extra thin scissors - Vannas-Tübingen Spring Scissors | Fine Science Tools | 15-003-08 | |
| Fine serrated forceps | Euronexia | P-95-AA | |
| Gel loading tip round 1-200 µL | COSTAR | 4853 | |
| Leica laser-scanning confocal microscope TCS SP8 | Leica Microsystems | ||
| Leica Laser-scanning confocal microscope TCS SP8 Gated STED 775 nm | Leica Microsystems | ||
| Lens Cleaning Tissue | Whatman (GE Healthcare) | 2105-841 | |
| Medium serrated forceps | Euronexia | P-95-AB | |
| Microscope cover glasses 24x50 nm No 1.5H 170±5 µm | Marienfield | 107222 | High precision |
| Nunclon delta surface (12-well plates) | Thermo Scientific | 150628 | |
| Nunclon delta surface (24-well plates) | Thermo Scientific | 142475 | |
| Safeshield scalpel | Feather | 02.001.40.023 | |
| Sharp-blunt scissors - fine Scissors - Martensitic Stainless Steel | Fine Science Tools | 14094-11 | |
| Superfrost plus slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Software | |||
| GraphPad | Prism, San Diego (US) | Release N°6.07 | Statistical software |
| ImageJ software | National Institutes of Health | Release N° 1.53f | |
| Leica Application Suite X software | Leica Microsystems | Release N°3.7.2.2283 | Free microscope software available at https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/downloads/ |
References
- Slater, C. R. Postnatal maturation of nerve-muscle junctions in hindlimb muscles of the mouse. Developmental Biology. 94 (1), 11-22 (1982).
- Jones, R. A., et al. NMJ-morph reveals principal components of synaptic morphology influencing structure-function relationships at the neuromuscular junction. Open Biology. 6 (12), (2016).
- Willadt, S., Nash, M., Slater, C. Age-related changes in the structure and function of mammalian neuromuscular junctions. Annals of the New York Academy of Sciences. 1412, 41-53 (2018).
- Boehm, I., et al. Comparative anatomy of the mammalian neuromuscular junction. Journal of Anatomy. 237 (5), 827-836 (2020).
- Nishimune, H., Shigemoto, K. Practical anatomy of the neuromuscular junction in health and disease. Neurologic Clinics. 36 (2), 231-240 (2018).
- Moloney, E. B., de Winter, F., Verhaagen, J. ALS as a distal axonopathy: molecular mechanisms affecting neuromuscular junction stability in the presymptomatic stages of the disease. Frontiers in Neuroscience. 8, (2014).
- Lovering, R. M., Iyer, S. R., Edwards, B., Davies, K. E. Alterations of neuromuscular junctions in Duchenne muscular dystrophy. Neuroscience Letters. 737, 135304 (2020).
- Koneczny, I., Herbst, R. Myasthenia Gravis: Pathogenic effects of autoantibodies on neuromuscular architecture. Cells. 8 (7), 671 (2019).
- Dowling, J. J., et al. Myotubular myopathy and the neuromuscular junction: a novel therapeutic approach from mouse models. Disease Models & Mechanisms. 5 (6), 852-859 (2012).
- Gibbs, E. M., et al. Neuromuscular junction abnormalities in DNM2-related centronuclear myopathy. Journal of Molecular Medicine. 91 (6), 727-737 (2013).
- Swoboda, K. J., et al. Natural history of denervation in SMA: Relation to age, SMN2 copy number, and function. Annals of Neurology. 57 (5), 704-712 (2005).
- Rodríguez Cruz, P. M., Palace, J., Beeson, D. The neuromuscular junction and wide heterogeneity of congenital myasthenic syndromes. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1677 (2018).
- Tse, N., et al. The neuromuscular junction: Measuring synapse size, fragmentation and changes in synaptic protein density using confocal fluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (94), e52220 (2014).
- Mejia Maza, A., et al. NMJ-Analyser identifies subtle early changes in mouse models of neuromuscular disease. Scientific Reports. 11 (1), 12251 (2021).
- Minty, G., et al. aNMJ-morph: a simple macro for rapid analysis of neuromuscular junction morphology. Royal Society Open Science. 7 (4), 200128 (2020).
- Modla, S., Mendonca, J., Czymmek, K. J., Akins, R. E. Identification of neuromuscular junctions by correlative confocal and transmission electron microscopy. Journal of Neuroscience Methods. 191 (2), 158-165 (2010).
- Kittel, R. J., et al. Bruchpilot promotes active zone assembly, Ca2+ channel clustering, and vesicle release. Science. 312 (5776), 1051-1054 (2006).
- York, A. L., Zheng, J. Q. Super-resolution microscopy reveals a nanoscale organization of acetylcholine receptors for trans-synaptic alignment at neuromuscular synapses. eNeuro. 4 (4), (2017).
- Bowerman, M., Murray, L. M., Beauvais, A., Pinheiro, B., Kothary, R. A critical smn threshold in mice dictates onset of an intermediate spinal muscular atrophy phenotype associated with a distinct neuromuscular junction pathology. Neuromuscular Disorders. 22 (3), 263-276 (2012).
- Feng, G., Krejci, E., Molgo, J., Cunningham, J. M., Massoulié, J., Sanes, J. R. Genetic analysis of collagen Q: Roles in acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase assembly and in synaptic structure and function. Journal of Cell Biology. 144 (6), 1349-1360 (1999).
- Sigoillot, S. M., et al. Neuromuscular junction immaturity and muscle atrophy are hallmarks of the ColQ-deficient mouse, a model of congenital myasthenic syndrome with acetylcholinesterase deficiency. The FASEB Journal. 30 (6), 2382-2399 (2016).
- Vanhaesebrouck, A. E., Beeson, D. The congenital myasthenic syndromes: expanding genetic and phenotypic spectrums and refining treatment strategies. Current Opinion in Neurology. 32 (5), 696-703 (2019).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- ImageJ. , Available from: http://imagej.nih.gov/ij (2021).
- Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
- Bio-Formats. , Available from: http://www.openmicroscopy.org/bio-formats/downloads/ (2021).
- Legland, D., Beaugrand, J. Automated clustering of lignocellulosic fibres based on morphometric features and using clustering of variables. Industrial Crops and Products. 45, Supplement C 253-261 (2013).
- ImageJ documentation. , Available from: http://imagejdocu.tudor.lu/plugin/analysis/geodesic_distances/start (2021).
- GitHUb. , Available from: https://github.com/Genethon/ImCy (2021).
- Otsu, N. A Threshold selection method from gray-level histograms. IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 9 (1), 62-66 (1979).
- Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Induction, assembly, maturation and maintenance of a postsynaptic apparatus. Nature Reviews Neuroscience. 2 (11), 791-805 (2001).
- Kong, L., et al. Impaired synaptic vesicle release and immaturity of neuromuscular junctions in spinal muscular atrophy mice. The Journal of Neuroscience. 29 (3), 842-851 (2009).
- Cifuentes-Diaz, C., et al. Neurofilament accumulation at the motor endplate and lack of axonal sprouting in a spinal muscular atrophy mouse model. Human Molecular Genetics. 11 (12), 1439-1447 (2002).
- Murray, L. M., Comley, L. H., Thomson, D., Parkinson, N., Talbot, K., Gillingwater, T. H. Selective vulnerability of motor neurons and dissociation of pre- and post-synaptic pathology at the neuromuscular junction in mouse models of spinal muscular atrophy. Human Molecular Genetics. 17 (7), 949-962 (2008).
- Boyer, J. G., et al. Myogenic program dysregulation is contributory to disease pathogenesis in spinal muscular atrophy. Human Molecular Genetics. 23 (16), 4249-4259 (2014).
- Ling, K. K. Y., Gibbs, R. M., Feng, Z., Ko, C. -P. Severe neuromuscular denervation of clinically relevant muscles in a mouse model of spinal muscular atrophy. Human Molecular Genetics. 21 (1), 185-195 (2012).
- Murray, L., Gillingwater, T. H., Kothary, R. Dissection of the transversus abdominis muscle for whole-mount neuromuscular junction analysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (83), e51162 (2014).
- Baker, J. R. Principles of biological microtechnique; a study of fixation and dyeing. , Wiley. London Methuen; New York. at http://archive.org/details/principlesofbiol01bake (1958).
- Vicidomini, G., et al. STED Nanoscopy with time-gated detection: Theoretical and experimental aspects. PLoS ONE. 8 (1), 054421 (2013).
- Badawi, Y., Nishimune, H. Super-resolution microscopy for analyzing neuromuscular junctions and synapses. Neuroscience Letters. 715, 134644 (2020).
- Thomson, S. R., et al. Morphological characteristics of motor neurons do not determine their relative susceptibility to degeneration in a mouse model of severe spinal muscular atrophy. PLoS ONE. 7 (12), 052605 (2012).
- McMacken, G. M., et al. Salbutamol modifies the neuromuscular junction in a mouse model of ColQ myasthenic syndrome. Human Molecular Genetics. 28 (14), 2339-2351 (2019).
