Summary
本プロトコルは、文献と比較して時間的増加を伴う途方もない細胞収量をもたらすADSC単離のための改良された方法論を記載する。この研究はまた、長期凍結保存後に比較的多数の生細胞を得るための簡単な方法を提供します。
Abstract
脂肪組織由来のヒト間葉系幹細胞は、適切な特徴を示し、再生臨床応用のためのアクセス可能な供給源であるため、ますます魅力的になっています。脂肪由来幹細胞を得るために、異なるプロトコルが使用されている。この記事では、より大量のADSCを得るために改良された時間節約プロトコルのさまざまなステップについて説明し、ADSCを凍結保存および解凍して培養増殖用の生細胞を取得する方法を示します。その後待機的腹部形成術を受けた9人の患者の腹部から、26cmの3穴および3mm口径のシリンジ脂肪吸引を使用して、100ミリリットルの脂肪吸引液を採取した。幹細胞の単離は、カルシウムを添加したダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)溶液およびコラゲナーゼの使用による一連の洗浄で行った。間質血管画分(SVF)細胞を凍結保存し、その生存率をイムノフェノタイピングによって確認しました。SVF細胞収量は15.7 x 105 細胞/ mLであり、6.1〜26.2細胞/ mLの範囲でした。接着性SVF細胞は平均7.5(±4.5)日後にコンフルエントに達し、平均細胞収量は12.3(± 5.7)x 105 細胞/mLでした。8ヶ月、1年、2年後の解凍SVFの生存率は23.06%〜72.34%の範囲で、平均47.7%(±24.64)であり、2年間の凍結の場合と相関する生存率は最も低かった。カルシウムとバッグの休止時間を補ったDPBS溶液を使用して脂肪を沈殿させ、コラゲナーゼ消化時間を短縮すると、幹細胞の最終細胞収量が増加しました。生幹細胞を高収率で得るための詳細な手順は、以前の研究の技術よりも時間と細胞収率に関してより効率的でした。長期間の凍結保存後でも、SVFに生菌ADSC細胞が見出された。
Introduction
ヒト間葉系幹細胞は、基礎研究と応用研究の両方で有利です。この成体細胞型の使用は、胚や他の細胞の使用と比較して倫理的問題を克服し、腫瘍領域、変性疾患の治療、再建手術領域2,3,4の治療など、自家組織再生工学および細胞治療における最も有望な研究分野の1つです。5.脂肪組織の間質血管細胞画分には間葉系多能性および多能性幹細胞の豊富な供給源があることが以前に報告されている6,7。これらのADSCは、最小限の侵襲的手順から、ex vivoでの強力な増殖能力を有するかなりの数の細胞を高収率で容易に得ることができるため、細胞療法および移植/注入に使用するための優れた候補と考えられている5,8。
また、脂肪組織は、他の2つの供給源(骨髄および臍帯組織)よりも間葉系幹細胞を提供する能力が高いことも実証されました9。ADSCは、免疫原性が低く、宿主組織に統合し、周囲の組織と相互作用する能力が高いことに加えて4,10、細胞株への分化の多能性能力を有し、適切な培養条件下での軟骨形成、骨形成、および筋原性分化の報告があります11,12,13、および膵臓、肝細胞などの細胞への分化、 神経原性細胞14,15,16。
科学界は、間葉系幹細胞の免疫調節効果が、その分化特性よりも細胞療法にとってより関連性のある作用機序であることに同意しています17,18,19。ADSC使用の最も重要なメリットの1つは、自家注入または移植の可能性であり、いくつかの疾患の代替治療になります。再生医療では、肝障害、心筋の再建、神経組織の再生、骨格筋機能の改善、骨の再生、がん治療、糖尿病治療などにADSCがすでに使用されています20,21。
現在までに、ADSCの可能性を評価するための263の登録臨床試験があり、米国国立衛生研究所のウェブサイトに記載されています22。脂肪組織を採取するためのさまざまなプロトコルが確立されていますが、臨床使用のためにADSCを分離するための標準化された方法についての文献にはコンセンサスがありません23,24。手術中および手術後の脂肪吸引処理方法は、細胞生存率、最終的な細胞収量25、およびADSC集団の質20に直接影響する可能性があります。外科的前処理に関しては、どの外科的前処理技術が単離後により多くの有意な数の生細胞を生成するか、または脂肪組織に注入された麻酔薬溶液が細胞収量およびその機能に影響を与えるかどうかは十分に確立されていない26。同様に、脂肪細胞を得るための技術間の違いは、生存可能なADSC20の数の70%もの減少をもたらし得る。文献によれば、超音波を含む高い生存率を有する細胞集団を得るための機械的処置は、脂肪組織を分解する可能性があるため、避けるべきである20。ただし、注射器を使用した手動脂肪吸引法は害が少なく、細胞破壊が少なく、腫脹性脂肪吸引により、最高品質のかなりの数の細胞が得られます26。
この技術は、脂肪吸引領域に注入されるリドカインとエピネフリンを含む生理食塩水を使用します。注入された溶液の容量3 mLごとに、1 mLが吸引されます。この研究では、1 mLのアドレナリンと生理食塩水を注入するごとに、0.2 mLの脂肪組織を吸引する湿式脂肪吸引技術を実施しました。消化酵素、特にコラゲナーゼの使用は、ADSCを単離するプロセスに一般的です。
実験室での最初の単離ステップの後、最終的なペレットは間質血管画分(SVF)と呼ばれます。これには、内皮前駆細胞、内皮細胞、マクロファージ、平滑筋細胞、リンパ球、周皮細胞、前脂肪細胞、および接着が可能なADSCを含む、さまざまな細胞タイプ27が含まれています。 in vitro 培養からの最終的な単離が完了すると、プラスチックに接着しなかった細胞は培地交換で排除されます。8週間の増殖、培地交換、および継代の後、ADSCはフラスコ20内の細胞集団の大部分を表す。将来の治療の可能性のために単離された脂肪由来幹細胞を使用することの最も重要な利点の1つは、凍結保存の可能性です。凍結保存された脂肪吸引液は、6週間の凍結後でもSVF細胞の潜在的な供給源であり28、2年間の凍結保存後でも生物学的活性があり29、培養で増殖および分化する完全な能力があることが実証されました30。しかしながら、融解プロセス中に、かなりの割合の細胞が通常失われる31。したがって、脂肪吸引除去プロセスおよび以下の細胞単離方法は、最高の細胞収率を確保しなければならない。
この研究では、ADSCを収集して分離するためのより迅速な方法論について説明し、細胞治療の効率を向上させるための高い細胞収量と生存率を実証します。さらに、SVF凍結保存後のこの改良技術の効果を評価した。
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Protocol
本研究は、UNIFESPの倫理委員会(プロトコル番号:0029/2015 CAAE:40846215.0.0000.5505)によって承認され、 ヘルシンキ宣言(2004)に従って患者から書面によるインフォームドコンセントを取得した後に実施されます。本研究のサンプルは、33〜50歳(平均年齢41.5歳)および平均初期ボディマス指数(BMI)24.54(22.32〜26.77の範囲)(表1)の9人の女性患者で構成されています 妊娠後の皮膚の過剰のために審美的腹部形成術を受けた人、 サンパウロ連邦大学(UNIFESP)の形成外科部門で、 ブラジル。バイアスを減らすために、患者は性別、年齢、およびBMIを考慮して同種グループとして選択されました。この研究中に使用および/または分析されたデータセットは、合理的な要求に応じて対応する著者から入手できます。
1.脂肪吸引液の採取
注:この手順は手術センターで実行する必要があります。
- 皮膚の準備と無菌のために4%グルコン酸クロルヘキシジン( 材料の表を参照)を使用してください。
- 2 mmの皮下皮膚切開(真皮下と腱膜の間)を行います。口径26 mm 3 Gの3穴と3 mm口径のクラインカニューレとシリンジを挿入して、生理食塩水(1:1,000,000)で希釈したアドレナリン溶液(1 mg / mL)( 材料の表を参照)の総量500 mLを臍帯下に注入します。
- 60 mLシリンジを26 mm 3 Gの3穴および3 mm口径の脂肪吸引カニューレに接続し、皮膚切開部から挿入し、プランジャーをロックして真空を作ります。
- 真空が作られた状態で脂肪吸引液が60 mLシリンジに残るように、押したり引いたりする動きをします。
- バルブ付きの滅菌コネクタを使用して、採取した脂肪吸引液100 mLを150 mLポリ塩化ビニル移送バッグに移します( 材料表を参照)。
- トランスファーバッグをポリスチレンボックスに室温(~25°C)で詰め、すぐに実験室に持ち込んでください。組織処理を開始するのに30分以上かからないでください。
2.脂肪吸引液の処理
注意: このステップは実験室で実行されます。
- まず、バッグの重量を量り、デジタル非接触赤外線体温計で温度を測定し、バッグを層流チャンバー内で5分間休ませて、脂っこい層(気泡)の沈殿と目的の細胞を含む組織分離を行います。
- 一連の組織洗浄を行います。最初の洗浄:カルシウム(1x)を含む100 mLのDPBSをトランスファーバッグに注入し、手で混ぜます。
- 5分間放置し、沈殿する基礎液の大部分を取り除きます。
- バッグアダプターに取り付けられた60 mLシリンジで基礎液を廃棄します。このプロセスは2回繰り返す必要があります。
- 100 mLの消化溶液をバッグに加え(93 mLのカルシウムフリーDPBS + 60 μLの塩化カルシウム(1 g / L)+ 7 mLの0.075%滅菌コラゲナーゼ、 材料の表を参照)、ゆっくりと攪拌しながら37°Cで30分間放置します。
- バッグの内容物をすべて50 mLの4本の円錐形チューブに移し、400 x g で22°Cで10分間遠心分離します。
- 上清を除去して廃棄し、20%FBS(ウシ胎児血清)を添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)低グルコース5 mLを細胞ペレットに加えます(図1)。
3. SVF細胞のカウント
- 10 μLのトリパンブルーの新鮮な溶液を蒸留水中の0.05%で10 μLの細胞懸濁液と5分間混合します。
- ノイバウアー細胞計数チャンバー32 内の生細胞を倒立光学顕微鏡( 材料の表を参照)を用いて20倍の倍率で計数する。
- 細胞ペレットを凍結保護培地(5 mLのFBS + 10%ジメチルスルホキシド-DMSO)に1 x 106 細胞/ mLの濃度で再懸濁します。
- このミックス1 mLをクライオバイアルに入れます。冷却速度(1°C / minから-80°C)の冷凍容器( 材料表を参照)を使用してください。
- -80°Cで1年間保管してください。
- この後、液体窒素気相(-165°C)に浸した標準カセットボックスに保管してください。
4.細胞の解凍プロセス
- バイアルを液体窒素から取り出し、直ちに37°Cの水浴に1分間入れます。
- SVF細胞を、37°Cに予熱した4 mLのDMEM(低グルコースに20%FBSを添加した)を入れた円錐管に入れます。
- 400 x g 、22°Cで5分間遠心分離します。
- 上清を取り除き、1 mLのDMEM(低グルコース)+ 10%FBSを追加します。以下の手順に従ってイムノフェノタイピングを実行します。
5. フローサイトメトリー技術(免疫表現型多重標識)
- 1 mLの細胞ペレット(濃度1,000細胞/μL)を5本のサイトメトリーチューブ(各200 μL)に入れます。
- 400 x g 、22°Cで5分間遠心分離し、上清をピペットで廃棄します。
- 300 μLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)(10x)を加え、22°Cで400 x g で遠心分離し、上清をピペットで廃棄します。
- 次のように、異なるマーカーの組み合わせ用に5本のチューブを準備します:5 μLのCD11B/5 μLのCD19/20 μLのCD45;CD73/20 μL5 μLのCD90/5 μLのCD105/20 μLのCD45;20 μL の CD34/5 μL の HLA-DR/20 μL の CD45;細胞生存率アッセイ-5 μLの蛍光反応性色素。( 材料の表を参照)および陰性対照として染色されていない細胞およびPBSを有するチューブ。ボルテックスでホモジナイズし、4°Cで30分間インキュベートします。
- 400 x g 、22°Cで5分間遠心分離し、上清をピペットで廃棄し、500 μLのPBS(10x)を加えて、細胞ソーティングを進めます。
注:フローサイトメーターの抗体セットごとに4色と5つのパラメータの5000イベントを取得し、CellQuestソフトウェアで分析します。
- 400 x g 、22°Cで5分間遠心分離し、上清をピペットで廃棄し、500 μLのPBS(10x)を加えて、細胞ソーティングを進めます。
6. 継代1(P1)の播種
- 2 x 105細胞を75cm2の培養フラスコに播種する。
- 12 mLのDMEM低グルコース+ 20%のFBS + 10%抗生物質/抗真菌薬を追加します(10,000単位のペニシリン、10 mgのストレプトマイシン、および25 μgのアムホテリシンB/mL、0.1 μm)を追加します。.
- 細胞が80%〜90%のコンフルエントに達したら、接着細胞のトリプシン処理を2 mLの0.25%EDTA-トリプシンで3分間行います。
- セルをもう一度カウントします(手順3で説明したように)。
- イムノフェノタイピングを再度実行します(ステップ5で述べたように)。
7.統計分析
- スピアマンのRho計算機33 を使用して、以下に示すように、 P <0.05で次の変数間の関連性の強さを測定します。
- SVF細胞収量を選択し、SVFが最初の継代(P1)で80%〜90%コンフルエントになるまで培養にとどまる日数(P1までの日数)を選択します。
- P1に行く前後のSVF細胞収量を選択します。
- P1に行く前に、P1までの日数と細胞収量を考慮してください。
- 確認されたADSCの平均パーセンテージでSVF細胞収量を選択します。
- P1に行く前に、確認されたADSCの割合と細胞収量を計算します。
- BMIおよびSVF細胞収量を決定します。
8. 分化アッセイ
- 鑑別キットプロトコルに従って鑑別アッセイを実行します( 材料の表を参照)。 図 4 に、ケース 1 の結果を示します。
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Representative Results
年齢、体重、身長、BMIなど、調査した9人の個人の特徴を 表1に示します。
最初に提示した細胞収量に従って、培養液に接種される細胞量は、75cm2 培養フラスコの容量にできるだけ近いと計算した。それぞれの場合において播種したサンプル量を 表2に記載する。次に、初期細胞収量に従って、各サンプルの可変容量の細胞を決定しました:細胞収量が高いサンプルの場合は1 mL、中間の細胞収量を持つサンプルの場合は1.1 mL、細胞収量が低いサンプルの場合は2 mLで、ケース間でより類似した細胞播種を実行します。培養が約80%〜90%のコンフルエント(図2A)に達した時点で(約7.5±4.5日目)、接着細胞のトリプシン処理を行った(表2 および 図2B)。
継代1前の細胞収率は、トリプシン処理前に同じコンフルエントが観察された場合でも大きく変動した(表2)。これは、細胞が層状に成長した可能性があるという事実によって説明することができます。 表2に示すように、患者のADSCからの異なるパラメータも異なる期間で評価された。
一部のサンプル(ケース1、ケース2、ケース7)は、細菌汚染と凍結保存SVFイムノフェノタイピングを実行するために利用可能な細胞の不足により、確認されたADSCの割合と培養中の推定ADSC数に関して評価できませんでした。スピアマンのRho計算機33によると、SVF細胞収量とP1までの日数(r = 0.37816、p = 0.31561)、P1に行く前後 のSVF細胞収量(r = -0.33333、p = 0.38071)、P1までの日数とP1に行く前の細胞収量(r = -0.53783、p = 0.13529)。さらに、SVF細胞収量を確定ADSCの平均割合(r = -0.02857、p = 0.95716)と相関させ、確認ADSCの平均割合とP1に行く前の細胞収量(r = 0.42857、p = 0.3965)との間に有意差は認められ なかった。また、BMIとSVF細胞収量との相関は統計的に有意とは見なされなかった(r = -0.46667、p = 0.20539)。表3は、凍結保存されたSVF細胞について実施したフローサイトメトリーデータを示す。初期のSVF細胞には、造血マーカー(CD45、CD11b、CD19、HLA-DR)の陽性細胞のサブセットが含まれていました34。初期のSVF細胞集団から、特定のサブグループがCD11b34およびCD1934間質細胞関連マーカーを発現した。CD73 34、CD90 34、およびCD10534のレベルは、これらの値の中間であった。最初のSVFには、幹細胞関連マーカーに陽性の細胞の亜集団が含まれていました(図3)。SVFの平均79%がHSC関連マーカーCD3434を発現した。
合計で、3回の洗浄に21分、コラゲナーゼ消化に30分、遠心分離に10分、細胞カウントとプレーティングに5分が必要でした。
図1:プロトコル脂肪由来幹細胞単離からのステップ 。 (A)閉鎖系での脂肪吸引輸送用バッグ。(b)洗浄後に袋を3回繰り返す工程。(C)DPBSで3回洗浄した後の脂肪吸引。(d)コラゲナーゼ消化後の脂肪吸引液。(E)消化後の脂肪吸引液を50mLチューブに分配する。(F)遠心分離後に消化された脂肪吸引液。(g)間質血管画分(SVF)を用いたペレットによる最終プロセスの単離。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ADSCの形態と生存率 。 (A)光学顕微鏡で単離した後の最初の継代における可塑性接着性間葉系脂肪由来幹細胞。細胞は、プラスチックおよび線維芽細胞様形態への接着を示す。(B)光学顕微鏡を用いてノイバウアーチャンバー内で計数した生細胞を示すトリパンブルーアッセイ。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:8ヶ月凍結保存後のケース9のSVFにおける幹細胞関連マーカー陽性細胞の亜集団。 R1:FSC(前方散乱)x SSC(側方散乱)(サイズx複雑さ)で分析された全細胞領域。R2:CD45陰性領域、その集団CD73、CD90、およびCD105がこの領域で陽性である。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:分化アッセイ 。 (A)軟骨細胞におけるADSC分化。(B)骨細胞におけるADSC分化。(C)脂肪細胞におけるADSC分化。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 患者 | 収集時の年齢(年) | 重量(キログラム) | 高さ(メートル) | BMI* |
| ケース1 | 35 | 68 | 1.64 | 25.28 |
| ケース2 | 33 | 65 | 1.65 | 23.88 |
| ケース3 | 35 | 70 | 1.68 | 24.8 |
| ケース4 | 34 | 72 | 1.64 | 26.77 |
| ケース5 | 36 | 72 | 1.69 | 25.21 |
| ケース6 | 36 | 67 | 1.64 | 24.91 |
| ケース7 | 38 | 62 | 1.53 | 26.49 |
| ケース8 | 50 | 63 | 1.68 | 22.32 |
| ケース9 | 37 | 65 | 1.58 | 26.04 |
表1:調査した個人のサンプルからのデータ。 *BMI:ボディマス指数。
| 患者 | 回収量(mL) | SVF細胞収量 (細胞/mL) (x 105) | 培養液量(mL) | 確認されたADSCの平均割合(%) | 初期培養の細胞数 (x 105) | 培養中の推定ADSC数 (x 105) | P1までの日数 | P1に行く前の細胞収量 (x 105) |
| ケース1 | 96 | 9.2 | 2 | ナ | 18.4 | ナ | 10 | 18 |
| ケース2 | 100 | 25.2 | 1 | 38 | 25.2 | 9.6 | 12 | 10.8 |
| ケース3 | 100 | 26.2 | 1 | ナ | 26.2 | ナ | 12 | 6.6 |
| ケース4 | 105 | 21.1 | 1 | 55.9 | 21.1 | 11.8 | 3 | 13.1 |
| ケース5 | 110 | 23.7 | 1 | 61.4 | 23.7 | 14.5 | 4 | 16.1 |
| ケース6 | 100 | 13.3 | 1.1 | 78.9 | 14.6 | 11.5 | 10 | 13.5 |
| ケース7 | 98 | 6.8 | 2 | ナ | 13.6 | ナ | 8 | 10.5 |
| ケース8 | 100 | 9.7 | 1.1 | 44.2 | 10.7 | 4.7 | 11 | 6.9 |
| ケース9 | 100 | 6.1 | 2 | 43.8 | 12.2 | 5.3 | 6 | 15.9 |
| ティッカー | 3.89 | 7.81 | 0.46 | 13.75 | 5.55 | 3.53 | 3.2 | 3.79 |
表2:分析した9人の患者からの手順のさまざまなステップからのデータ。 SVF:間質血管画分;ADSC:脂肪由来幹細胞;P1:パッセージ1;NA: データは使用できません。
| 見本 | モノクローナル抗体によって決定されたADCの割合 | モノクローナル抗体によって測定された造血細胞の割合 | 細胞生存率アッセイとSVF凍結保存時間 | |||||||||
| CD45-(*) | CD73+/CD90+ | CD73+/CD105+ | CD105+/CD90+ | 意味する | CD34+ | HLA-DR+ | CD11b+ | CD19+ | ライブ/デッド+ | |||
| ケース2 | 52.34% | 31.97% | 25.36% | 56.52% | 37.95% | 63.16% | 12.87% | 2.41% | 0.21% | 39.54% (2 年) | ||
| ケース4 | 48.02% | 61.62% | 40.93% | 65.25% | 55.93% | 82.94% | 26.62% | 0.00% | 0.16% | 38.30% (2 年) | ||
| ケース5 | 27.74% | 54.02% | 49.72% | 80.42% | 61.38% | 73.33% | 51.31% | 0.05% | 0.00% | 23.06% (2 年) | ||
| ケース6 | 55.52% | 79.52% | 67.70% | 89.52% | 78.91% | 86.86% | 8.83% | 0.18% | 1.06% | 56.76% (2 年) | ||
| ケース8 | 57.28% | 46.84% | 30.88% | 57.65% | 45.12% | 78.47% | 26.97% | 0.03% | 0.00% | 55.56% (1 年) | ||
| ケース9 | 56.14% | 47.52% | 36.30% | 47.69% | 43.83% | 88.10% | 26.94% | 0.05% | 0.24% | 72.34%(8ヶ月) | ||
表3:6人の患者からのフローサイトメトリーデータ。 (*)これらのCD45−細胞から、幹細胞マーカーの異なる組み合わせを有するADSCの%が決定された。ADSC:脂肪由来幹細胞;SVF:間質血管画分;(*)これらのCD45−細胞から、幹細胞マーカーの異なる組み合わせを有するADSCの%が決定された。
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Discussion
単離収率
細胞療法で頻繁に必要とされる凍結保存プロセスは、時には50%を超える重大な細胞損失をもたらすことは十分に確立されています29,30,35。したがって、単離して高い初期細胞収量を得るための技術的改善が基本である。脂肪吸引液の採取方法と細胞の単離方法は、細胞の長期培養と操作を考慮しながら、より多くの細胞を保存し、高い生存率を維持し、初期材料から最大数の細胞を抽出することに焦点を当てる必要があります。したがって、細胞療法は患者にとって効果的で安全である可能性が高いため、細胞をアポトーシス、老化、または遺伝的不安定性から遠ざけるために、まっすぐな培養維持が必要です。
私たちの知る限り、脂肪吸引に由来する間葉系幹細胞の単離にこの一連の手順を使用した以前の記事はなく、その結果、時間の節約と費用便益の技術が得られます。この研究では、各方法論的ステップは、細胞単離において最も高い最終細胞収量を示した文献に従って推論されました。この研究で実施された技術の目新しさは、一連の脂肪吸引洗浄に関連する手動吸引の使用であり、その後のバッグは安静にした。脂肪吸引物の輸送と処理に使用される収集バッグは、未消化の組織片がコラゲナーゼ消化に関与しないようにしました。最も重要なステップは、コラゲナーゼの作用を増強するため、新鮮な消化液に塩化カルシウムを加えることです。長い凍結保存時間の後でも生細胞を可能にする細胞融解法による時間増加は文献にはまだ報告されていない。本研究で得られたSVF細胞収量は、6.15〜26.2 x 10 5細胞/mLと大きく異なり、平均15.7 x 105細胞/mLであった。これは、吸引されたより有意な量のアドレナリン溶液の存在に起因する可能性があり、外科的処置の段階およびSVFに一般的に見られる他の既知の細胞型の数に応じて、より高いまたは低い可能性があります。いくつかの研究では、BMIとADSC収量の間に負の相関関係が見られましたが36,37、この研究では、他の2つの研究38,39のように有意な相関は見られず、それがこの研究で見つかった信じられないほど多様なSVF細胞収量の原因である可能性を減らしました。これらのデータは、得られた最低SVF細胞収量が6.15 x 105細胞/mLであったことを示しています。いくつかの研究では、脂肪吸引を得るための外科的技術に従ってADSC単離の効率をすでに測定していました。ある研究では、アドレナリン溶液(この研究で使用)を使用した脂肪吸引技術のために新たに分離されたSVFで0.087 x 10 5細胞/ mL、それなしで0.143 x 105細胞/ mLが得られました26。この研究は、大多数の外科医が臨床診療を行うことを選択するように、術中の出血と打撲傷を減少させる血管収縮効果によるアドレナリン溶液注射の重要性を強調しました。別の研究では、単離された生きたADSCは、0〜0.59 x 10 5細胞/ gの脂肪吸引液を採取し、平均0.295(±0.25)x 105細胞/ g組織の範囲であることが示されました31。いくつかの研究では、より高いADSC収率を達成するためのさまざまな方法をテストしています。これらの研究のうちの1つは、コラゲナーゼ消化緩衝液およびオービタルシェーカー40の使用中に様々な成分を提示する方法について約350×105を達成した。別の研究では、腹部41からのSVF細胞の総数として29.7(±0.2)x 105細胞/ mLが示されました。この研究で選択された腹部領域は、脂肪吸引液42の最高の可用性とアクセス可能性のための参照領域です。脂肪吸引採取のための身体領域は、ドナーの年齢および選択された採取方法などの他の要因の中でも、ADSC収量の質の強力な決定要因である。
微生物の汚染により細胞が実験を継続できなくなる可能性が、この研究の完了を制限する唯一の実行上の問題でした。抗生物質と適正製造基準の要件を使用しても、脂肪の吸引を実行するための完全な無菌環境がないために汚染が発生する可能性があります。
SVFイムノフェノタイピング
国際細胞療法学会の間葉系および組織幹細胞委員会34によると、ヒト間葉系幹細胞を定義する3つの最小基準の1つは、細胞がCD105 34、CD73 34、およびCD90 34を発現しなければならず、CD45 34、CD34、CD14 34、またはCD11b 34、CD79a 34またはCD19 34を発現してはならないということです。 HLA-DR34表面膜分子。ミッチェル43は、イムノフェノタイピングによって新鮮なSVF細胞をテストし、ADSC表面マーカーを有する細胞の最大54%を発見しました。この研究では、イムノフェノタイピングにより、長期凍結保存後のSVFで確認されたADSC(非造血細胞)の割合が最大78.91%であることが明らかになりました(37.95%〜78.91%の範囲、平均53.68%)。証拠は、まだコミットされていない幹細胞集団の前駆体がCD34マーカー34、44、45を発現しないことを示している。分化の段階に応じて、CD3434陰性幹細胞は造血前駆細胞だけでなく、破骨細胞、軟骨細胞、筋細胞、脂肪細胞などのより特異的な間葉系前駆体も生成できます。いくつかの研究は、間質細胞機能と造血および間葉系前駆細胞を有する細胞で構成される原始幹細胞集団の顕著な可塑性を示した45。文献によれば、SVF細胞における組織形成における完全なCD3434の機能的役割は未だ不明である46。ミッチェル43は、CD3434マーカーを発現するSVFの60%細胞の平均を示したが、この研究では、平均は78.81%であった。CD3434表面マーカーの発現は継代とともに減少することが知られている。
接着細胞および分化アッセイ
単離後に得られた細胞数に応じて、第1培養で播種した細胞数は変化した。75cm2フラスコ中で80%〜90%のコンフルエントに達するための最初の培養時間は、平均8.4日および6.6〜16.1 x 10 5細胞/mLの範囲の7.5(±4.5)日の標準偏差を要した。細胞収量が低い場合でも、最初の培養時間は、おそらく収集および単離プロセス全体を通して維持される生細胞の最高の可用性のために、文献と比較して高い細胞収量指数をもたらしたことに注意する必要があります。ある研究では、4.1(±0.7)日の培養期間47以内に、脂肪吸引液1mLあたり3.75(±1.42)x 105 ADSCの細胞収量が得られました。別の研究では、有核SVF細胞の収量は1ミリメートルあたり3.08(±1.40)x 105で、最初の培養期間の平均は6.0(±2.4)日であることが示されました43。本研究では、培養中に播種したADSCの数を推定することにより、同じ容量の100mLの脂肪吸引液の採取からSVFで観察された細胞数の関数として変化し、P1に到達するまでの日数が細胞体積と関係がないことを検証しました。例えば、12.2 x 105細胞をインキュベートしたケース9では、80%〜90%のコンフルエントに達するまでに6日が必要でした。14.6 x 105細胞を培養中に播種した症例6では、同じレベルのコンフルエントに達するまでにさらに長い期間(10日)が必要でした。おそらく、最初の接着期間には最小ADSC数で十分です。併存疾患、年齢、一般的な健康状態など、個人間の大きな変動がある可能性があります。文献のいくつかの研究は、SVF細胞収量に対する患者の個人間変動を考慮することの重要性に疑問を呈しています48,49。
国際細胞療法学会の間葉系および組織幹細胞委員会34によると、間葉系細胞は、 図4で実証されているように、骨形成、脂肪原性、軟骨形成の系統として3つの異なる細胞型に分化する能力を持っている必要があります。
細胞生存率、凍結保存、および遺伝的不安定性
生存率損失を決定するために異なる方法が使用されており、原形質膜完全性損傷50と定義される。しかし、培養物は初期のアポトーシス細胞を提示することもありますが、これらのアプローチは無傷の原形質膜を維持するため無視できますが、生存不可能です。ここで報告された結果は、生存率マーカーの広い範囲を示しており、23.06%〜72.34%であり、長期凍結保存後の平均は47.6%です。凍結保存は細胞治療の重要なステップであることを考えると、融解後の最大生存幹細胞数および機能性幹細胞の回収は、細胞治療の成功のための優先課題の1つです。文献は、細胞生存率の少なくとも50%が凍結保存後1〜4ヶ月で失われることを示した43。特に、この研究で提示された最も低い指標は、最も古い凍結保存されたサンプル(約2年)であるケース5、ケース4、およびケース2からのものです。それらは最も低い生存率指数を示しましたが、新鮮なSVFでのトリパンブルー色素排除アッセイで高い細胞収量を示しました。文献は生存率喪失の原因を支持しているが、これらの率は予想よりも低い。技術的な理由による細胞貯蔵の温度変動は、ストレスの増加と蓄積を引き起こし、水性部分の蓄積を助長し、長期凍結保存中に形質膜を損傷する結晶を生成する可能性があります51。文献は、同じまたはより長い凍結時間を有するサンプルに対して70%以上の生存率を示している。しかしながら、生存率チェックは、この研究52で実施されたものとは異なる技術で実施された。別の研究では、より長い凍結保存が細胞の生存率に悪影響を与えることが示されました31、これは-80°Cの冷凍庫の温度変化によって説明できます。したがって、細胞はしばしば培養中に長時間留まる必要があり、細胞周期のストレスを増加させ、遺伝的不安定のリスクをもたらし、その結果、細胞療法を損なう。いくつかのストレス因子と、それらが細胞治療に必要な長期の幹細胞培養を維持するために不可欠な細胞遺伝学的安定性にどのように影響するかを示す文献のコンセンサスもあります35,53。
方法論の利点
今日まで、文献は臨床応用を目指してADSCを分離するための標準化されたプロトコルを示していません。ほとんどの研究は、複雑で時間のかかるプロトコルを示しています24。この研究では、この方法の効率と初期細胞収量を完了するために必要な時間(約1.5時間)を強調する必要があります。文献によれば、脂肪由来幹細胞の単離は、約3時間〜8時間54,55かかり得る。したがって、高い細胞収入に関連する時間の獲得は、再生医療治療の進歩にとって重要です。この方法を改善するために、この作業で実施されたものと並行して、より多くの細胞生存率評価を実施する必要があります。これらの結果に副署するには、この方法論を用いたより広範なサンプルを組み込んださらなるランダム化比較試験が必要である。
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Disclosures
著者は、競合する金銭的利益を宣言していません。
Acknowledgments
ボランティアで参加してくださった患者さん、サンパウロ病院の医療・看護スタッフに感謝します。この研究は、サンパウロ州アンパロ・ペスキサ・ド・エスタード・デ・サンパウロ財団(FAPESP)およびブラジルのコンセリョ・ナシオナル・デ・デセンボルビメント・シエンティフィコ・エ・テクノロヒコ(CNPq)の支援を受けた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.8 mL cryovials | Nunc Thermo Fisher Scientific | 340711 | |
| 150 mL polyvinyl chloride transfer bag | JP FARMA | 80146150059 | |
| 2% Alizarin Red S Solution, pH 4.2 | Sigma Aldrich | A5533 | |
| Adrenaline (1 mg/mL) | Hipolabor | NA | |
| Alcian Blue solution | Sigma Aldrich | 1,01,647 | |
| Antibiotic-Antimycotic 100x | Gibco | 15240062 | |
| BD FACSCalibur Flow Cytometer using BD CellQues Pro Analysis | BD BioSciences | NA | |
| Calcium chloride 10% | Merck | 102379 | |
| Chlorhexidine gluconate 4% | VIC PHARMA | NA | |
| Collagenase, Type I, powder | Gibco | 17018029 | |
| DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) | Gibco | 11966025 | |
| DPBS no calcium, no magnesium (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems) | Gibco | A1285801 | |
| DPBS with calcium (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems) | Gibco | A1285601 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10500056 | |
| Formaldehyde 4% | Sigma Aldrich | 1,00,496 | |
| Inverted light microscope | Nikon Eclipse TS100 | NA | |
| Live and Dead Cell Assay | Thermofisher | 01-3333-41 | 01-3333-42 | |
| Monoclonal antibody: CD105 | BD BioSciences | 745927 | |
| Monoclonal antibody: CD11B | BD BioSciences | 746004 | |
| Monoclonal antibody: CD19 | BD BioSciences | 745907 | |
| Monoclonal antibody: CD34 | BD BioSciences | 747822 | |
| Monoclonal antibody: CD45 | DAKO | M0701 | |
| Monoclonal antibody: CD73 | BD BioSciences | 746000 | |
| Monoclonal antibody: CD90 | BD BioSciences | 553011 | |
| Monoclonal antibody: HLA-DR | BD BioSciences | 340827 | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
| PBS (phosphate buffered saline) 1x pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| StemPro Adipogenesis Differentiation Kit | Gibco | A1007001 | |
| StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit | Gibco | A1007101 | |
| StemPro Osteogenesis Differentiation Kit | Gibco | A1007201 | |
| Sterile connector with one spike with needle injection site | Origen Biomedical Connector, USA | NA | Code mark: IBS |
| Trypan blue solution 0.4% | Sigma Aldrich | 93595 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% 1x, phenol red | Gibco | 25200056 |
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