ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
Miniscope in vivo calcium imaging is een krachtige techniek om neuronale dynamica en microcircuits te bestuderen in vrij gedragende muizen. Dit protocol beschrijft het uitvoeren van hersenoperaties om goede in vivo calciumbeeldvorming te bereiken met behulp van een miniscoop.
Abstract
Een miniatuur fluorescentiemicroscoop (miniscoop) is een krachtig hulpmiddel voor in vivo calciumbeeldvorming van vrij gedragende dieren. Het biedt verschillende voordelen ten opzichte van conventionele multi-foton calcium beeldvormingssystemen: (1) compact; (2) licht van gewicht; (3) betaalbaar; en (4) maakt het mogelijk om vrij gedragende dieren op te nemen. Dit protocol beschrijft hersenoperaties voor diepe hersenen in vivo calcium beeldvorming met behulp van een op maat ontwikkeld miniscoop opnamesysteem. De voorbereidingsprocedure bestaat uit drie stappen, waaronder (1) stereotaxisch injecteren van het virus in het gewenste hersengebied van een muizenbrein om een specifieke subgroep van neuronen te labelen met genetisch gecodeerde calciumsensor; (2) implantatie van gradiënt-index (GRIN) lens die calciumbeeld van diep hersengebied naar het miniscoopsysteem kan doorgeven; en (3) het bevestigen van de miniscopehouder over de muizenschedel waar de miniscope later kan worden bevestigd. Om in vivo calciumbeeldvorming uit te voeren, wordt de miniscoop op de houder bevestigd en worden neuronale calciumbeelden verzameld samen met gelijktijdige gedragsregistraties. Het huidige operatieprotocol is compatibel met alle commerciële of op maat gemaakte beeldvormingssystemen voor één foton en twee fotonen voor diepe hersenen in vivo calciumbeeldvorming.
Introduction
Intracellulaire Ca2+ signalering is een essentiële regulator van celgroei, proliferatie, differentiatie, migratie, gentranscriptie, secretie en apoptose1. In neuronen wordt Ca2+ signalering nauwkeurig gecontroleerd, omdat het spatio-temporele patroon gerelateerd is aan cruciale functies zoals membraan prikkelbaarheid, neurotransmitterafgifte en synaptische plasticiteit2.
In vivo calciumbeeldvorming is een krachtige techniek die kan worden gebruikt om neurale circuitrepresentatie te decoderen die elementair is voor normaal dierlijk gedrag, afwijkende neuronale activiteiten in diermodellen van hersenaandoeningen te identificeren en potentiële therapeutische doelen te ontrafelen die deze veranderde circuits kunnen normaliseren. De twee meest voorkomende in vivo calciumbeeldvormingssystemen zijn twee-foton laser scanning fluorescentie microscopie 3,4,5,6 en op het hoofd gemonteerde geminiaturiseerde micro-dosisscopie (miniscoop)7,8,9,10,11,12,13 . De conventionele microscopie met twee fotonen biedt indrukwekkende voordelen, zoals een betere resolutie, minder ruis en minder fotobleaching; de proefdieren moeten echter met het hoofd worden gefixeerd, waardoor de gedragsstudies die kunnen worden uitgevoerd 3,4,5,6 worden beperkt. Daarentegen is het op het hoofd gemonteerde miniscoopsysteem klein en draagbaar, waardoor het mogelijk is om een breed scala aan gedragstests te bestuderen met behulp van vrij gedragende dieren 7,8,9,10,11,12,13.
Er zijn twee leidende Ca2+ indicatoren, chemische indicatoren 5,14 en genetisch gecodeerde calciumindicatoren (GECI's)15,16. Ca2+ beeldvorming is vergemakkelijkt door gebruik te maken van zeer gevoelige GECI's die worden geleverd met virale vectoren die specifieke labeling van neuronen in het beoogde circuit mogelijk maken. De voortdurende inspanning om de gevoeligheid, levensduur en het vermogen om zelfs de subcellulaire compartimenten te labelen te verbeteren, maakt GECI's ideaal voor verschillende in vivo calciumbeeldvormingsstudies 17,18,19.
De verstrooiing van licht in hersenweefsel tijdens beeldvorming beperkt de optische penetratie in de diepte, zelfs met de twee-fotonenmicroscopie. De Gradient Index (GRIN) -lens overwint dit probleem echter omdat de GRIN-lens rechtstreeks in de biologische weefsels kan worden ingebed en beelden van het diepe hersengebied naar het microscoopobjectief kan overbrengen. In tegenstelling tot conventionele lenzen gemaakt van optisch homogeen materiaal en een gecompliceerd gevormd oppervlak vereisen om scherp te stellen en beelden te creëren, zijn de prestaties van de GRIN-lens gebaseerd op een geleidelijke brekingsindexverandering in het lensmateriaal die focus bereikt met een vlak oppervlak20. GRIN-lens kan worden vervaardigd tot een diameter van 0,2 mm. Daarom kan een geminiaturiseerde GRIN-lens in de diepe hersenen worden geïmplanteerd zonder al te veel schade aan te richten.
In dit artikel wordt een compleet operatieprotocol gepresenteerd voor de diepe hersenen in vivo calciumbeeldvorming. Voor het demonstratiedoel beschrijven we hersenoperaties die specifiek gericht zijn op de mediale prefrontale cortex (mPFC) van de muizenhersenen en in vivo calciumbeeldvormingsregistratie via een op maat gemaakt miniscoopsysteem dat is ontwikkeld door de groep van Dr. Lin aan het National Institute on Drug Abuse (NIDA / IRP) 7,12. De experimentele procedure omvat twee grote hersenoperaties. De eerste operatie is het stereotaxisch injecteren van een virale vector die GCaMP6f (een GECI) tot expressie brengt in de mPFC. De tweede operatie is om de GRIN-lens in hetzelfde hersengebied te implanteren. Na herstel van deze hersenoperaties is de volgende procedure om de miniscoophouder (basis) op de schedel van de muis aan te brengen met behulp van tandcement. In vivo Ca2+ beeldvorming kan op elk moment worden uitgevoerd na montage van de miniscoop op de basis. Het operatieprotocol voor virale injectie en GRIN-lensimplantatie is compatibel met alle commerciële of op maat gemaakte beeldvormingssystemen met één foton en twee fotonen voor de diepe hersenen in vivo calciumbeeldvorming.
Protocol
Het experimentele protocol volgt de richtlijnen voor dierverzorging van de Universiteit van Wyoming. De muis die in deze studie wordt gebruikt, is 6 maanden oud mannelijk C57BL / 6J. De procedure kan worden gebruikt om zich te richten op diepe hersengebieden voor in vivo calciumbeeldvorming. Hier, ter demonstratie, is het beoogde hersengebied de muis mPFC (voorste en achterste (A / P): 1,94 mm, mediaal en lateraal (M / L): 0,5 mm, dorsaal en ventraal (D / V): 1,8 mm). Dit protocol is aangepast op basis van het eerder gepubliceerde protocol21.
1. Stereotaxische injectie van virus in de mPFC (figuur 1)
- Voorbereiding op de operatie
- Steriliseer alle chirurgische instrumenten met behulp van een autoclaaf en plaats ze over een steriel oppervlak.
- Bereid een spuit van 10 μL door deze te primen met zoutoplossing en voor te vullen met 5 μL zoutoplossing. Bevestig de spuit aan een micropomp (zie Materiaaltabel).
- Zet het verwarmingskussen aan en houd de temperatuur op 35 °C.
- Plaats de muis in de inductiekamer (5" x 10" x 4", lengte x breedte x hoogte) met 5% isofluraan en 1 l/min zuurstofdebiet. Let goed op en tel de ademhalingsfrequentie van de muis. Haal de muis eruit zodra de ademhalingsfrequentie afneemt tot 1 ademhaling(en).
OPMERKING: De ademhalingssnelheid van de muis kan gemakkelijk worden gecontroleerd door tijdens elke inademing naar beneden en naar boven van de rugspierbeweging te kijken. - Laat de muis zich nestelen op een benchtop die gescheiden is van het operatiegebied. Scheer met een scheerknipper het haar af van de muizenkop tot aan de eerste halswervels.
- Plaats de muis op het stereotaxische podium (zie Materiaaltabel) en zet de positie vast met oorstaven en neusklem. Handhaaf de isofluraanstroom naar het stereotaxische stadium op 1,5% isofluraan en 0,5 l/min zuurstofdebiet.
- Breng de smerende oogzalf op beide ogen aan met een schoon wattenstaafje om uitdroging van de ogen tijdens de operatie te voorkomen. Beoordeel pedaalreflexen op de muis om te bevestigen dat de muis volledig is verdoofd voordat de operatie wordt gestart.
- Desinfecteer het haarloze gebied met 7,5% povidon-jodiumoplossing (zie Tabel met materialen) en 70% ethanol driemaal elk met behulp van steriele wattenstaafjes.
- Injecteer een klein volume (50 μL) van 2% lidocaïne onder de huid van het haarloze gebied.
- Maak een incisie van 2 cm door de huid langs de middellijn met behulp van een scalpel om de lambda en bregma van de schedel bloot te leggen.
- Verwijder de fascia van de schedel met behulp van droge wattenstaafjes en puntige tang.
- Nadat de bregma en lambda zichtbaar zijn, gebruikt u de punt van een boorboor (0,5 mm in diameter) om de Z-coördinaten van bregma en lambda te meten (zie Tabel met materialen). Pas de hoogte van de neushouder aan totdat de bregma en lambda op dezelfde Z-positie liggen.
- Plaats de 0,5 mm tandboorbraam in een positie van A/P: 1,94 mm, M/L: 0,5 mm van de bregma. Boor door de schedel.
OPMERKING: Hier, voor demonstratie, is het beoogde hersengebied de muis mPFC. Dit protocol kan worden gebruikt om elk ander diep hersengebied te targeten. Als het beoogde hersengebied bijvoorbeeld de Nucleus Accumbens (NAc) is, moet de overeenkomstige positie A / P zijn: 0,9 mm, M / L: 1, 2 mm. - Verwijder de dura met een naaldpunt van 30 G en reinig alle stukjes botresten met een scherpe tang van 45°.
OPMERKING: Bloedingen komen vaak voor omdat kleine bloedvaten kunnen worden gescheurd tijdens de reinigingsstap. Gebruik steriele wattenstaafjes om het bloeden te stoppen en breng zoutoplossing aan om het gebied te wassen. Breng zoutoplossing aan op het blootgestelde schedelgebied om het vochtig te houden. - Plaats het virus in de microliterspuit met behulp van het bedieningspaneel van de micropomp. Trek 500 nL luchtbel op, gevolgd door 800 nL van het virus bij een stroomsnelheid van 50 nL/s.
OPMERKING: Voor het demonstratiedoel wordt hier een adeno-geassocieerd virus serotype 1 (AAV1) dat GCaMP6f (een GECI), AAV1-CamKII-GCamp6f, tot expressie brengt, geïnjecteerd in de mPFC (zie Tabel met materialen). De titer van het virus is 2,8 x 1013 GC/ml. Het is 1:2 verdund in zoutoplossing vóór injectie. - Plaats de punt van de naald op de bovenkant van de bregma om de bregma aan te raken en noteer de Z-coördinaat van bregma. Beweeg de naald boven het geboorde gat en injecteer 100 nL van het virus om ervoor te zorgen dat de naald niet verstopt is.
- Beweeg de naald langzaam naar beneden in het hersenweefsel naar de beoogde Z-coördinaat van D/V: 1,75 mm en beweeg deze vervolgens licht omhoog naar de Z-coördinaat van D/V: 1,65 mm.
OPMERKING: Dit is om een kleine zak te maken voor de virale oplossing die moet worden toegediend. Als het beoogde hersengebied de NAc is, moet de overeenkomstige gerichte Z-coördinaat van D / V 4,2 mm zijn en vervolgens licht bewegen tot 4,1 mm. - Gebruik het bedieningspaneel om de micropomp in te stellen op het injecteren van 500 nL van het virus met een stroomsnelheid van 50 nL/min. Druk op de KNOP RUN op het bedieningspaneel om het virus te injecteren.
OPMERKING: Injectie duurt ongeveer 10 minuten. Nadat de injectie voorbij is, wacht u nog eens 5-10 minuten voordat u de naald uit de hersenen haalt. Breng regelmatig zoutoplossing aan om het blootgestelde schedelgebied vochtig te houden tijdens de injectieperiode. - Beweeg de naald omhoog en uit de hersenen. Injecteer tweemaal 500 nL volume bij een debiet van 50 nL/s.
OPMERKING: Deze stap bevestigt dat een goed volume van het virus in de hersenen is toegediend. Tijdens de eerste 500 nL-injecties komt het virus vrij, gevolgd door luchtbellen. Tijdens de tweede injectie van 500 nL verschijnen eerst luchtbellen, gevolgd door zoutoplossing. De spuit is nu klaar om het virus te laden voor de volgende muis. Zodra de operatie is voltooid, worden de microliterspuit en naald grondig gereinigd met aceton gevolgd door zoutoplossing. - Lijn de huidranden uit en sluit de incisie voorzichtig af met een hechting (maat 4.0). Breng antibiotische zalf aan op het gestikte gebied om infectie te voorkomen.
- Verwijder de muis uit het stereotaxische podium en breng hem terug naar zijn thuiskooi. Plaats de thuiskooi in een couveuse van 33 °C totdat de muis ambulant is.
OPMERKING: Het duurt meestal 10-15 minuten voordat een muis wakker wordt uit isofluraan-anesthesie voordat deze begint te bewegen. - Nadat de muis begint te bewegen, dient u niet-steroïde anti-inflammatoire geneesmiddelen toe gedurende 3 postoperatieve dagen (zie Tabel met materialen). Laat de muis 14 dagen herstellen van de operatie voordat u grin-lensimplantatie uitvoert.
2. GRIJNSlensimplantatie in de mPFC (figuur 1)
- Voorbereiding op de operatie
- Bereid het kunstmatige hersenvocht (ACSF) voor dat 124 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 1,2 mM MgCl2, 25 mM glucose, 26 mM NaHCO3 en 2,4 mM CaCl2 bevat.
- Steriliseer alle chirurgische instrumenten met behulp van een autoclaaf en plaats ze over een steriel oppervlak.
- Zet het verwarmingskussen aan en houd de temperatuur op 35 °C.
- Smelt 1% Agarose en bewaar het in een waterbad bij 42 °C tot gebruik.
OPMERKING: De gesmolten agarose kan een paar uur in het waterbad worden bewaard. - Desinfecteer een GRIN-lens (1 mm diameter, 4,38 mm lang, figuur 2A) gedurende 15 minuten in 70% ethanol, breng deze over in een buis gevuld met zoutoplossing om deze goed te spoelen voordat deze wordt geïmplanteerd.
OPMERKING: GRIN-lenzen (zie Materiaaltabel) worden geproduceerd via zilver- en lithium-ionuitwisseling in speciale glazen, waardoor ze niet-toxisch en neuronvriendelijkzijn 6,7. Veel in de handel verkrijgbare GRIN-lenzen kunnen echter toxische residuen uitlogen, waardoor neurodegeneratie ontstaat, waardoor ze ongeschikt zijn voor implantatie in de levende hersenen voor langdurige in vivo beeldvormingsstudies. Deze GRIN-lenzen moeten mogelijk worden gecoat met biocompatibele middelen zoals paryleen-C om toxische bijwerkingen op naburige neuronen te voorkomen22.
- Weeg de muis en verdoof deze door een intraperitoneale injectie van ketamine / xylazinemengsel (zie tabel met materialen) (Ketamine: 100 mg / kg; Xylazine: 15 mg/kg).
OPMERKING: Een muis met een gewicht van 30 g vereist 300 μL Ketamine/Xylazine mengsel (Ketamine 100 mg/ml en Xylazine 1,5 mg/ml) voor de aanvangsdosis en 150 μL Ketamine (10 mg/ml) voor extra doses tijdens de operatie. Om de muis tijdens het hele chirurgische proces verdoofd te houden, moeten extra doses Ketamine (50 mg / kg) ten minste eenmaal per uur worden toegediend. Het anesthesiestadium van de muis moet regelmatig worden gecontroleerd door pedaalreflexen te beoordelen. - Scheer het haar van het operatiegebied met een scheerapparaat en reinig het haar met een natte papieren handdoek.
- Plaats de muis in het stereotaxische stadium en zet de positie vast door de neusklem en oorstaven aan te spannen. Breng smerende oogzalf aan op beide ogen met een steriel wattenstaafje. Controleer of de muis volledig is verdoofd door pedaalreflexen te beoordelen.
- Desinfecteer het haarloze gebied met 7,5% povidon-jodiumoplossing en 70% ethanol drie keer elk met behulp van steriele wattenstaafjes. Dien 2 mg/kg Dexamethason intramusculair toe in de dij om het risico op operatiegerelateerde zwelling en ontsteking te verlagen.
- Injecteer 50 μL 2% lidocaïne onder de huid van het operatiegebied.
- Gebruik een fijne schaar om een driehoekig huidgebied van 1,5 cm (hoogte) x 1,0 cm (basis) af te snijden, van de voorste kant tussen de ogen tot de achterste kant achter de lambda.
- Verwijder het botvliesweefsel uit de schedel met behulp van een fijne tang, micromes en wattenstaafjes.
OPMERKING: De schedel moet grondig worden gereinigd en gedroogd voordat u de volgende stap zet. - Breng cyanoacrylaat (zie Materiaaltabel) aan op de randen van de huid en bevestig de huid aan de schedel. Wacht 5 minuten tot het cyanoacrylaat droogt.
- Met behulp van een boorpunt van 0,5 mm lijnt u de bregma en lambda in hetzelfde horizontale vlak uit door de hoogte van de neusklem aan te passen.
- Lokaliseer een boorboor (1,2 mm in diameter) op een positie van A/P: 1,94 mm, M/L: 0,8 mm van de bregma. Boor door de schedel. Verwijder de dura met een naaldpunt van 30 G en reinig alle stukjes botresten met een scherpe tang van 45°.
OPMERKING: Dit botresten kunnen de volgende aspiratiestap blokkeren als ze niet volledig worden verwijderd. - Bevestig een handmatig gepolijste naald met een stomp uiteinde van 27 G (figuur 2B) aan de naaldhouder die is gekoppeld aan een robotarm die onder een hoek van 10° is gekanteld (figuur 2C). Sluit het andere uiteinde van de naaldhouder aan op het huisstofzuigersysteem.
OPMERKING: De robotarm (zie Tabel met materialen) is ontwikkeld door de groep van Dr. Lin bij de NIDA/IRP en wordt bestuurd door een op maat ontwikkelde, momenteel open-access software, AutoStereota (https://github.com/liang-bo/AutoStereota)23 - Lokaliseer de punt van de naald om de bregma aan te raken. Stel de Z-coördinaat van bregma in op 0 door op de bregmaknop op AutoStereota te klikken.
- Stel de Input X-waarde in op 0,8, de Input Y-waarde op 1,94, de Input Z-waarde op 1,0 en klik vervolgens op de knop Zoeken om de naald naar de bovenkant van het geboorde gat op de schedel te verplaatsen.
- Pas de positie van de naald aan het midden van het blootgestelde hersenweefselgebied aan via AutoStereota.
OPMERKING: Om de naald in laterale of mediale richtingen te bewegen, voert u de stapwaarde in en klikt u op de laterale of mediale knoppen op AutoStereota. Evenzo, om de naald in voorste of achterste en dorsale of ventrale richtingen te bewegen, klikt u respectievelijk op Rostral of Caudal en Dorsal of Ventrale knoppen. - Schakel het vacuüm in en begin met het spoelen van het blootgestelde hersengebied met ACSF via een zwaartekrachtgestuurd buizensysteem (zie Materiaaltabel) dat is verbonden met een naald van 30 G met een gebogen punt. ACSF wordt continu gebbeld met een gasmengsel van 95% O2 en 5% CO2 en gefilterd door een filter van 0,2 μm.
OPMERKING: Het ACSF-debiet is ~ 1,5 ml / min. De uitgangsdruk van het gasmengsel wordt op ~3 psi gehouden. - Zuig hersenweefsel laag voor laag op met behulp van AutoStereota-software (Figuur 3).
OPMERKING: Aspiratie van hersenweefsel wordt in 4 ronden voltooid, zodat een kolomzak (1,8 mm diep en 1 mm in diameter) wordt gegenereerd.- Klik in de "zStep" -sessie op en controleer de eerste en tweede rij. Stel de waarden voor de eerste rij in op 0,2 en 1. Stel de waarden voor de tweede rij in op 0,15 en 4 (figuur 3A).
- Stel in de sessie "Mode" naaldgrootte 27 Gauge en 1.2 in, stel Dims 0.9 in. Alle andere waarden gebruiken standaardwaarden (figuur 3A).
- Klik achtereenvolgens op de knoppen Instellen, Nul behouden en Starten om de aspiratie te starten.
OPMERKING: Dit is de1e ronde van aspiratie. Invoerwaarden geven aan dat de aspiratiediepte 0,2 mm is (van de Z-coördinaat van 0) tijdens de eerste stap met 1 laag; tijdens de tweede stap is de aspiratiediepte 0, 15 mm, continu herhaald gedurende 4 lagen. De aspiratieresolutie is 1,2 en de diameter is 0,9 mm. Tijdens het aspirateren kan de directe locatie van de naaldpunt worden bewaakt via het track graph-paneel. Na het voltooien van deze aspiratieronde wordt een kolomvak met 0,8 mm diepte en 1 mm diameter gegenereerd. De naaldpunt komt terug naar het midden met de Z-coördinaat van 0. - Klik in de "zStep" -sessie op en controleer de eerste en tweede rij. Stel de waarden voor de eerste rij in op 1 en 1. Stel de waarden voor de tweede rij in op 0,15 en 4 (figuur 3B).
- Houd in de sessie "Modus" alle waarden hetzelfde als de vorige ronde (figuur 3B).
- Klik achtereenvolgens op de knoppen Instellen, Nul behouden en Starten om de aspiratie te starten.
OPMERKING: Dit is de2e ronde van aspiratie. Invoerwaarden geven aan dat de aspiratiediepte 1 mm is (van de Z-coördinaat van 0) tijdens de eerste stap met 1 laag; tijdens de tweede stap is de aspiratiediepte 0, 15 mm, continu herhaald gedurende 4 lagen. Na het voltooien van deze aspiratieronde wordt het kolomvak met 1,6 mm diepte en 1 mm diameter gegenereerd. - Klik in de "zStep" -sessie en controleer alleen de eerste rij. Stel de waarden voor de eerste rij in op 1,8 en 1 (figuur 3C).
- Stel in de sessie "Modus" naaldgrootte 27 Gauge en 2.2 in. Alle andere waarden blijven gelijk aan die van de vorige ronde (figuur 3C).
- Klik achtereenvolgens op de knoppen Instellen, Nul behouden en Starten om de aspiratie te starten.
OPMERKING: Dit is de3e ronde van aspiratie. Ingangswaarden geven aan dat de aspiratiediepte 1,8 mm is (vanaf de Z-coördinaat van 0) met 1 laag. De aspiratieresolutie is 2.2. Na het voltooien van deze aspiratieronde wordt het kolomvak met 1,8 mm diepte en 1 mm diameter gegenereerd. - Klik in de "zStep" -sessie en controleer alleen de eerste rij. Stel de waarden voor de eerste rij in op 1,6 en 1 (afbeelding 3D).
- Stel in de sessie "Modus" naaldgrootte 27 Gauge en 2.2 in, stel Dims 0.6 in (Figuur 3D).
- Klik achtereenvolgens op de knoppen Instellen, Nul behouden en Starten om de aspiratie te starten.
OPMERKING: Dit is de4e ronde van aspiratie. Het doel van deze stap is om bloed dat zich in de zak heeft opgehoopt op te ruimen. Bloedingen komen vaak voor als kleine bloedvaten worden gescheurd tijdens het aspiratieproces. Om het bloed grondig te reinigen, stopt u de irrigatie van ACSF gedurende 5 minuten en schakelt u de irrigatie vervolgens weer in. Herhaal de4e aspiratieronde meerdere keren totdat de pocket bloedvrij is. Dit protocol kan worden gebruikt om andere diepe hersengebieden te targeten. Als het beoogde hersengebied bijvoorbeeld de NAc is, moet de uiteindelijke overeenkomstige Z-coördinaat van D/V 4,4 mm zijn.
- Stop het vacuüm en de irrigatie van ACSF. Breng de naald op +2 mm Z-coördinaat en 0,5 mm vooraan naar het midden. Plaats de steriele 1mm GRIN lens in de zak.
- Houd de punt van de naald in contact met de belichte GRIN-lens om ervoor te zorgen dat de GRIN-lens in een hoek van 10° wordt geplaatst. Druk voorzichtig op het bovenoppervlak van de GRIN-lens met steriel zacht tissuepapier om ervoor te zorgen dat het onderste oppervlak van de GRIN-lens in contact komt met het hersenweefsel.
- Breng de gesmolten Agarose aan in de opening tussen de GRIN-lens en het hersenweefsel met behulp van een spatel. Nadat Agarose een gel heeft gevormd, verwijdert u overtollige Agarose met behulp van een microblad.
- Reinig de schedel grondig met zoutoplossing en wattenstaafjes. Laat de schedel drogen voordat het tandcement (zie Tabel met materialen) wordt aangebracht.
- Haal het mengputje uit -20 °C vriezer. Meng het tandcementpoeder en de katalysatorvloeistof en breng een laag zelfuithardend kleefharscement aan op de schedel; omring eerst de GRIN-lens en bedek vervolgens de hele blootgestelde schedel.
- Wacht 5 minuten en laat het volledig uitharden. Verwijder de aspiratienaald voorzichtig.
- Meng in een schone plastic put tandcementpoeder, zwarte houtskool met vloeistof en breng een dunne laag van het mengsel aan op de 1e laag tandcement. Wacht 5 minuten om het te laten uitharden.
- Bescherm de blootgestelde GRIN-lens door deze te bedekken met een aangepaste dop gemaakt van een PCR-buis (figuur 2D). Breng cyanoacrylaat aan om de dop aan het tandcement te bevestigen.
- Injecteer 1 ml voorverwarmde zoutoplossing subcutaan in de muis, gevolgd door 0,1 mg/kg buprenorfine. Plaats de muis terug in zijn thuiskooi. Plaats de thuiskooi in een incubator van 33 °C en controleer de muis totdat deze ambulant is. Het duurt meestal 20-40 minuten voordat een muis wakker wordt uit anesthesie voordat hij begint te bewegen.
- Dien niet-steroïde anti-inflammatoire geneesmiddelen toe en controleer de muis gedurende ten minste 3 postoperatieve dagen. Laat de muis 30 dagen herstellen van de operatie.
3. Aanbrengen van de miniscopehouder (basis) op de schedel van de muis (figuur 1)
- Verdoof de muis in een inductiekamer met 5% isofluraan en 1 l/min zuurstofstroomsnelheid totdat de ademhalingsfrequentie afneemt tot 1 ademhaling(en).
- Plaats de muis in het stereotaxische stadium en zet de positie vast met oorstaven en neusklemmen. Zorg voor een continue stroom van isofluraan (1,5%) en zuurstof (0,5 l/min).
- Breng oogheelkundige zalf aan op zijn ogen om ze vochtig te houden. Zet het verwarmingskussen aan en houd de temperatuur op 35 °C. Controleer of de muis volledig is verdoofd door pedaalreflexen te beoordelen.
- Verwijder de dop die de GRIN-lens bedekt voorzichtig met een puntige tang. Boor de gedroogde cyanoacrylaatresten van het tandcement volledig af met behulp van een microdrill (zie Tabel met materialen).
- Knip het haar rond het tandheelkundige cementgebied met een kleine schaar. Reinig het vuil met behulp van een persluchtstofzuiger. Gebruik een met aceton gedoopt wattenstaafje om het bovenoppervlak van de GRIN-lens schoon te maken.
- Bereid de miniscoop voor met de houder (basis).
- Plaats een zeskantmoer van #00-90 (zie Materiaaltabel) in de sleuf in de basis en breng cyanoacrylaat aan om het daar vast te zetten (figuur 2E).
- Breng een polytetrafluorethyleen (PTFE) tape strak aan rond de draad van de miniscoop en knip de extra tape af (figuur 2F).
- Bevestig de miniscoop aan de basis en gebruik de borgschroef om de miniscoop aan de basis te bevestigen (figuur 2G).
- Sluit de miniscoop aan op de kabel en schakel de op maat ontwikkelde, momenteel open-access software NeuView in (zie Materiaaltabel).
OPMERKING: NeuView-software is op maat ontwikkeld voor miniscoop in vivo calciumbeeldvorming van dr. Lin's groep op de NIDA / IRP 7,12. Het is open access (https://github.com/giovannibarbera/miniscope_v1.0). - Klik in NeuView op Hardware, vink LED1 aan en klik op de knop Streamen om de livebeelden weer te geven (afbeelding 4A). Om live streaming te stoppen, klikt u op stop knop.
- Plaats de miniscoop in een op maat gemaakte miniscoop-houder (figuur 2H) waarvan de XYZ-positie kan worden gemanipuleerd met behulp van gemotoriseerde controllers (figuur 2I).
- Plaats de miniscoop net boven de belichte GRIN-lens en maak deze evenwijdig aan het oppervlak van de lens. Breng de miniscoop langzaam naar beneden in de richting van de GRIN-lens en pas de Z-positie aan totdat het beste scherpstelvlak is gevonden.
OPMERKING: Het beste brandpuntsvlak wordt bepaald door verschillende mogelijke Z-posities te vergelijken en het brandpuntsvlak te selecteren met een duidelijke visualisatie van de meeste cellichamen. - Breng de eerste laag tandcement voorzichtig aan rond de miniscoopbasis zonder de positie van de miniscoop te wijzigen. Nadat het cement is uitgehard, verwijdert u voorzichtig de houdarm zodat de miniscoop op zichzelf op de muiskop kan staan.
OPMERKING: Het tandcement heeft de neiging om te krimpen na het uitharden en het zal de miniscoop wegslepen van het oorspronkelijke focusvlak. Meestal wordt de positie van de miniscoop Z iets boven het oorspronkelijke brandpuntsvlak getild voordat tandcement wordt aangebracht om de potentiële verandering te compenseren. - Breng een tweede laag tandcement aan rond de basis om alle gaten te vullen en ervoor te zorgen dat er geen LED-licht uit de openingen lekt. Laat het tandcement uitharden.
- Verwijder de muis uit het stereotaxische stadium. Maak de borgschroef los en maak de miniscoop los van de basis. Plaats een 3D-geprinte beschermkap in de basis om de blootgestelde GRIN-lens te beschermen en draai de borgschroef in de basis vast (figuur 2J).
- Plaats de muis terug in zijn thuiskooi.
OPMERKING: Het duurt meestal 10-15 minuten voordat een muis wakker wordt uit isofluraan-anesthesie voordat deze begint te bewegen.
4. Miniscope montage en in vivo Ca2+ beeldvorming (Figuur 1)
- Monteer de miniscoop aan de basis
- Verdoof de muis kort in de inductiekamer (5% isofluraan en 1 l/min zuurstofstroomsnelheid). Plaats de muis op een schoon bankoppervlak.
- Maak de borgschroef los met een kleine schroevendraaier, verwijder de beschermkap en reinig het oppervlak van de GRIN-lens met een met aceton doordrenkt wattenstaafje.
- Wikkel een PTFE-tape strak om de miniscoopdraad en bevestig de miniscoop aan de basis op de muiskop.
- Sluit de miniscope aan op de kabel (Figuur 2K), schakel de NeuView-software in.
- Klik in NeuView op Hardware, vink LED1 aan en klik op de knop Streamen om de livebeelden weer te geven (afbeelding 4A).
- Identificeer het beste brandpuntsvlak door de positie van de miniscoop ten opzichte van de basis aan te passen, iets aan te spannen of los te maken met behulp van een stompe tang.
OPMERKING: Het beste brandpuntsvlak wordt bepaald door verschillende mogelijke locaties te vergelijken en degene te selecteren met een duidelijke visualisatie van de meeste cellichamen. - Draai de borgschroef vast en plaats de muis terug in zijn thuiskooi.
- Pas in NeuView het LED-lichtvermogen aan op het optimale niveau. Klik op Vastleggen en vervolgens op Trigger-knoppen om de opname te starten en druk op Stoppen na 150 frames.
OPMERKING: Het laagst mogelijke vermogen bepaalt het optimale niveau van het LED-vermogen voor het bereiken van een helder genoeg beeld. Het doel van het opnemen van een korte video is om het identificeren van hetzelfde brandpuntsvlak in de toekomst te vergemakkelijken voor repetitieve beeldvorming. - Koppel de kabel los van de miniscope. Laat de muis ten minste 30 minuten herstellen voordat u het experiment start.
OPMERKING: Om de miniscoop te beschermen, worden meestal de waterfles en de draadvoeding gedurende deze korte periode verwijderd. Als de muis langer in zijn thuiskooi moet blijven, wordt het aanbevolen om in de handel verkrijgbare dieetgel (zie Tabel met materialen) in de thuiskooi te leveren.
- Data-acquisitie voor in vivo calciumbeeldvorming
OPMERKING: In vivo calcium Imaging kan tegelijkertijd worden uitgevoerd samen met alle gedragstests die de onderzoeker wenst. Voor het demonstratiedoel is het voorbeeld hier in vivo Ca2+ beeldvorming tijdens een open veldtest. Om dit doel te bereiken, zijn twee computers nodig. Eén computer is uitgerust met commerciële software (zie Tabel met materialen) om een camera te bedienen om het gedrag van muizen automatisch vast te leggen. De andere computer is uitgerust met NeuView om de miniscoop te bedienen en de Ca2+ beelden op te nemen.- Schakel de gedragscamerasoftware in (zie Tabel met materialen) om de arena voor muisgedrag te bekijken via een livestreamfunctie. Pas handmatig de scherpstelling van de bovenste camera aan (figuur 2L).
- Selecteer Trigger/Strobe en vink "Enable/disable trigger" (Figuur 4B) aan. Klik op de knop Opnemen , gebruik Bladeren om de locatie te selecteren waar gedragsopnamen worden opgeslagen, selecteer de gewenste afbeeldingsindeling.
OPMERKING: De functie "Trigger Control" is ingeschakeld om de gedragsregistratie te activeren door de NeuView-software, zodat de gedragsframes en de bijbehorende calciumbeeldvormingsframes tijdelijk aan elkaar worden gekoppeld. De gedragsregistratie kan in elk gewenst formaat worden opgeslagen. Gedragsregistratie wordt over het algemeen opgeslagen in JPEG-indeling in de aangewezen map. - Breng de muis dicht bij de arena en sluit de miniscoop aan op de kabel die is gekoppeld aan het Data Acquisition System (figuur 2L) (zie Materiaaltabel). De muis wordt vervolgens in het midden van de arena geplaatst.
- Met de Livestream-functie van NeuView-software kunt u het LED-vermogen aanpassen om de helderheid van het calciumbeeld te optimaliseren.
OPMERKING: Voor calciumbeeldvorming is de opnameframesnelheid standaard 10 frames / s. - Schakel in NeuView LED1 uit, klik op Vastleggen en vervolgens op Trigger-knoppen om de opname te starten en druk op Stoppen na 100 frames.
OPMERKING: Dit is om achtergrondafbeeldingen op te nemen voor ongeveer 100 frames met LED-licht uit. - Klik in de software voor gedragscamera's op Opname starten (afbeelding 4C). Controleer in NeuView LED1, klik op Vastleggen en vervolgens op Trigger-knoppen om de opname te starten. Druk op Stoppen na 3000 frames.
OPMERKING: Dit is om calciumbeeldvorming en gedrag tegelijkertijd vast te leggen. De open-veldtest is 15 minuten lang, meestal onderverdeeld in drie opnamesessies van elk 5 minuten. Dit om te voorkomen dat de miniscoop oververhit raakt door continu gebruik. - Sla zowel de calciumbeeldvorming als gedragsregistraties op in de aangewezen mappen. Herhaal de opname nog twee sessies terwijl u de achtergrond voor elke sessie opneemt en sla alle opnamen op in de aangewezen map.
- Maak de miniscoop los van de basis.
- Nadat de opname is voltooid, koppelt u de kabel los van de miniscoop.
- Verdoof de muis kort in de inductiekamer (5% isofluraan en 1L/min zuurstofstroomsnelheid). Plaats de muis op een schoon, warm oppervlak.
- Schroef de borgschroef in de basis los en maak de miniscoop los van de basis. Plaats de beschermkap terug over de basis en draai de borgschroef vast. Zet de muis terug in zijn thuiskooi.
Representative Results
Figuur 1 toont de schematische experimentele procedure, inclusief virale injectie, GRIJN-lensimplantatie, aanbrenging van de miniscoopbasis op de schedel van de muis en in vivo calciumbeeldvorming via een miniscoop. De hele procedure duurt ~ 2 maanden. Figuur 2 toont de belangrijkste componenten beschreven in het protocol voor miniscoop in vivo calcium beeldvorming. Figuur 3 toont de interfaces van AutoStereota-software tijdens de implantatie van GRIN-lenzen. Figuur 4 toont de interfaces van NeuView en gedragsregistratiesoftware tijdens in vivo calciumbeeldvorming.
De uitkomst van in vivo calciumbeeldvorming is afhankelijk van het succes van zowel virale injectie- als GRIN-lensimplantatieoperaties. Figuur 5 toont een reeks uitkomsten (d.w.z. onsuccesvol, suboptimaal en goed) van in vivo calciumbeeldvormingsopnamen. In onsuccesvolle gevallen kan het calciumbeeld donker of helder lijken, maar onthult het meestal geen of zeer weinig actieve neuronen. We streven meestal geen in vivo calciumregistratie-experimenten na als er minder dan vijf actieve neuronen zijn. Een goede in vivo calciumbeeldvorming onthult meestal enkele honderden actieve neuronen. Als een opname minder dan honderd actieve neuronen bevat, beschouwen we het als een suboptimale opname.
In zowel suboptimale als goede opnames werden in vivo calciumbeeldvormingsexperimenten uitgevoerd en werd de daaropvolgende data-analyse uitgevoerd. Film 1 toont een representatieve in vivo calciumbeeldvormingsopname van de mPFC van de muis. Gedragsvideo's en calciumbeeldvormingsgegevens worden meestal afzonderlijk verwerkt. Video's over muisgedrag kunnen handmatig worden gescoord. Calciumbeeldvormingsbestanden worden verwerkt met behulp van de CaImAn calcium image processing toolbox24. Figuur 6 toont een representatieve celkaart en enkele calciumsporen uit een goede in vivo calciumbeeldvormingsregistratie.
Na het voltooien van in vivo calciumbeeldvorming is de laatste stap om te bevestigen of de virale injectie en GRIN-lensimplantatie heeft plaatsgevonden in het gewenste hersengebied. Voor dit doel werd de muis doordrenkt met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) gevolgd door 4% paraformaldehyde (PFA). Het muizenbrein werd geoogst, gedurende 12 uur in 4% PFA gefixeerd en bij 4 °C in PBS bewaard. Het muizenbrein werd vervolgens in 50 μm dikke plakken gesneden met een vibratome. De hersenplakken werden gekleurd met DAPI en waargenomen onder de microscoop (niet beschreven in het protocol)12. Figuur 7 is een hersenschijf van de muis ~ 1,94 mm voor bregma van een experimentele muis, die het spoor toont waar de GRIN-lens werd geïmplanteerd. Het groene fluorescentiegebied onder en rond de GRIN-lenstrack geeft de expressie van GCaMP6f in het mPFC-gebied aan.
Figuur 1: Schematisch overzicht van de experimentele procedure. (A) Stereotaxische injectie van virus in de mPFC. (B) GRIJNSlensimplantatie in de mPFC. (C) Het aanbrengen van miniscoopbasis op de schedel van de muis. (D) Miniscope-montage en in vivo calciumbeeldvorming. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Belangrijkste componenten die nodig zijn voor in vivo calciumbeeldvorming. (A) Een GRIJNSlens met een diameter van 1 mm en een lengte van 4,38 mm. (B) Een handmatig gepolijste naald van 27 G met stomp uiteinde die wordt gebruikt voor hersenweefselaspiratie. (C) De robotarm gekoppeld aan de naaldhouder. (D) Een op maat gemaakte dop van een PCR-buis om de blootgestelde GRIN-lens te beschermen tot de bevestiging van de miniscoopbasis op de schedel van de muis. (E) De miniscopehouder (basis) met een zeskantmoer. (F) Een miniscoop waarvan het draadgedeelte is omwikkeld met de PTFE-tape. (G) Een miniscoop die met een borgschroef aan de basis is bevestigd. (H) De miniscope die de arm vasthoudt. (I) Een op maat gemaakte 3D gemotoriseerde controller die wordt gebruikt om de beweging van de miniscoop in XYZ-posities te vergemakkelijken. (J) Een beschermkap die op de basis is bevestigd om de blootgestelde GRIN-lens te beschermen terwijl de muis geen in vivo calciumbeeldvorming uitvoert. (K) De miniscope die op de kabel is aangesloten. (L) Het data-acquisitiesysteem voor in vivo Ca2+- beeldvorming. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Interfaces van AutoStereota-software tijdens laag-voor-laag hersenweefselaspiratie. (A) De interface die overeenkomt met de stappen 2.17.1 tot en met 2.17.3. (B) De interface die overeenkomt met de stappen 2.17.4 tot en met 2.17.6. (C) De interface die overeenkomt met de stappen 2.17.7 tot en met 2.17.9. (D) De interface die overeenkomt met de stappen 2.17.10 tot en met 2.17.12. Rode vakken markeren de invoerwaarden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Interfaces van NeuView-software en de gedragsregistratiesoftware tijdens in vivo calciumbeeldvorming. (A) De interface van NeuView. (B,C) De interfaces van de gedragsregistratiesoftware. Rode vakken markeren knoppen waarop moet worden geklikt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Maximale projectie fluorescentiecelkaarten om het bereik van mogelijke uitkomsten weer te geven. (A,B) Mislukte in vivo calciumbeeldvorming die niet aanvaardbaar is voor latere gegevensanalyse. (A) is donker en bevat minder dan 5 actieve neuronen. (B) is helder maar heeft geen actieve neuronen. (C) De celkaart van een suboptimale in vivo calciumbeeldvorming die enkele actieve neuronen bevat. (D) De celkaart van een goede in vivo calciumbeeldvorming die enkele honderden actieve neuronen bevat. Schaalbalk: 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Representatieve celkaart en calciumtransiënten van een succesvolle in vivo calciumbeeldvorming. Het linkerpaneel is de maximale fluorescentiecelkaart van een in vivo calciumbeeldvormingsopname in de mPFC tijdens een open veldtest. De opname duurt 5 min. Het rechterpaneel toont calciumtransiënten uit 15 interessegebieden (kleurgematcht). Schaalbalk: 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Postmortale beoordeling van een experimentele muis. De postmortale beoordeling voor GCaMP6f-expressie en GRIN-lensimplantatie in de mPFC van een experimentele muis. Het rechthoekige gebied geeft het pad aan voor GRIJN-lensimplantatie. Het groene gebied onder het geïmplanteerde gebied van de GRIN-lens bevestigt dat GCaMP6f tot expressie is gebracht en dat de GRIN-lens precies in het gewenste hersengebied is geïmplanteerd. Cg, cingulate cortex; PrL, prelimbische cortex; IL, infralimbische cortex. Schaalbalk: 400 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: Vergelijkingen van het op maat gemaakte miniscoopsysteem bij de NIDA met andere miniscoopsystemen 7,8,9,10,11,13,25,26. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Film 1: Een in vivo calciumbeeldvormingsopname van de mPFC van de muis tijdens een open veldtest. Voor demonstratiedoeleinden toont deze video slechts 1 minuut opname. De oorspronkelijke opnameframesnelheid is 10 frames / s. De video is 6 keer sneller dan de originele opname. Klik hier om deze film te downloaden.
Discussion
Een centrale vraag in de neurowetenschappen is begrijpen hoe neurale dynamica en circuits informatie coderen en opslaan, en hoe ze worden veranderd in hersenziekten. Met behulp van een miniscoop in vivo Ca2+ beeldvormingssysteem kan individuele neurale activiteit van enkele honderden neuronen binnen een lokaal microcircuit tegelijkertijd worden gevolgd door een vrij gedragend dier. Hier wordt een gedetailleerd operatieprotocol voor virale injectie en GRIN-lensimplantatie beschreven om knaagdieren voor te bereiden op een diepe hersenen in vivo Ca2 + -beeldvorming via een op maat ontwikkeld miniscoopregistratiesysteem. Tabel 1 toont de vergelijkingen van ons miniscoopsysteem met andere in de handel verkrijgbare en op maat gemaakte miniscoopsystemen 7,8,9,10,11,13,25,26. Het is vermeldenswaard dat GRIN-lensimplantatie met behulp van het huidige chirurgische protocol compatibel is met commerciële of op maat gemaakte beeldvormingssystemen met één foton en twee fotonen voor een diepe hersenen in vivo calciumbeeldvorming.
Van virale injectie tot gegevensverzameling van miniscope in vivo calciumbeeldvorming, de hele experimentele procedure duurt ten minste 2 maanden om te voltooien. Het is een ingewikkeld en arbeidsintensief proces. Het uiteindelijke succes van het experiment hangt af van meerdere factoren, waaronder de juiste keuze van GECI's, injectie van het virus nauwkeurig in het beoogde hersengebied, voldoende virale expressie in de gewenste neurale populatie, implantatie van de GRIN-lens precies op de gewenste locatie, voldoende herstel van operaties, evenals, of ernstige ontsteking optreedt na de operatie, en of het gedrag van het dier ernstig wordt beïnvloed door operaties, enzovoort.
Twee cruciale stappen omvatten stereotaxische injectie van virus en GRIN lensimplantatie. Voor het demonstratiedoel werd de stereotaxische micro-injectie uitgevoerd in de muismPFC, met adeno-geassocieerd virus (AAV1) dat codeert voor GCaMP6f onder controle van CaMKII-promotor die selectief piramidale neuronen in de mPFC labelt. GCaMP6f werd gekozen omdat het een van de snelste en meest gevoelige calciumindicatoren is met een halfvervaltijd van 71 ms15. Bovendien is de AAV-virale expressie van GCaMP6f langdurig (d.w.z. enkele maanden), waardoor het ideaal is voor het uitvoeren van repetitieve in vivo Ca2+ beeldvorming gedurende een lange periode voor longitudinale studies in muismodellen van neurodegeneratieve ziekten27. Het huidige operatieprotocol kan worden aangepast voor het richten op verschillende celpopulaties in elk ander hersengebied. Verschillende beschikbare virale hulpmiddelen maken selectieve labeling van specifieke neurale populaties in het gewenste hersengebied op de gewenste leeftijd mogelijk. Bovendien kunnen onderzoekers profiteren van het Cre-LoxP-recombinatiesysteem en verschillende beschikbare transgene muismodellen om genetische modificaties uit te voeren en de gedrags- en neurale circuituitkomst te bestuderen28,29.
Een uniek kenmerk van het gepresenteerde protocol is dat de geautomatiseerde laag-voor-laag hersenweefselaspiratie werd uitgevoerd vóór de implantatie van de GRIN-lens (1 mm in diameter). Dit wordt bereikt door een naald van 27 G die is aangesloten op een vacuümsysteem, bestuurd door een op maat gemaakte robotarm en software23. Op basis van onze ervaring genereert deze methode een uniform oppervlak voor de GRIN-lens om contact te maken en veroorzaakt minder schade aan het naburige weefsel dan handmatige weefselaspiratie23. Om deze reden biedt deze procedure een duidelijk voordeel voor GRIN-lenzen met een relatief grotere diameter (bijvoorbeeld 1 mm). Weefselaspiratie is echter mogelijk niet nodig voor het implanteren van een GRIJNS-lens met een kleinere diameter (0,5 mm of 0,25 mm). In plaats daarvan kan het direct langs de leidende baan worden geplant, gemaakt met een naald21 van 30 G.
Naast de twee kritieke stappen die hierboven zijn besproken, moeten veel andere factoren zorgvuldig worden overwogen voor een succesvolle operatie. (1) Alle instrumenten die contact maken met de hersenen moeten worden gesteriliseerd om infectie te voorkomen. (2) Alle chirurgische stappen moeten worden uitgevoerd om schade aan de hersenen te minimaliseren om verdere ontsteking en overmatige littekenweefselvorming te voorkomen. (3) De anesthesiedoses die aanvankelijk worden gegeven en tijdens de operatie worden gehandhaafd, met name die welke intraperitoneaal worden toegediend, moeten zorgvuldig worden overwogen. De anesthesiedoses kunnen worden aangepast aan verschillende muizenstammen, omdat sommige gevoeliger kunnen zijn. (4) De toestand van de muis moet tijdens de operatie voortdurend worden gecontroleerd. Ten slotte (5) moeten de muizen na de operatie regelmatig worden gecontroleerd, omdat er na de operatie veel complicaties kunnen optreden.
Hoewel een stuk hersenweefsel eenzijdig wordt verwijderd tijdens de GRIJNS-lensimplantatiestap, hebben we geen duidelijke gedragstekortenwaargenomen 7,12. Het gewicht van de miniscoop is ongeveer 2 gram en de kabel is speciaal ontworpen om hem licht te maken en ervoor te zorgen dat de muis hem gemakkelijk kan dragen. De miniscoop en kabel worden alleen aan het dier bevestigd voorafgaand aan in vivo beeldvorming en losgemaakt na beeldvorming. Het hele beeldvormingsproces duurt meestal niet langer dan 30 minuten. Daarom voorkomen deze instrumentaties niet dat de muis zich vrij kan gedragen. De miniscope-installatie- en demontagestappen vereisen een korte anesthesie (minder dan 2 minuten) met isofluraan met het oog op het beperken van dieren. We laten de muis meestal gedurende 30 minuten herstellen van de korte blootstelling aan isofluraan voordat we in vivo beeldvorming uitvoeren. We hebben gedurende een paar weken één keer per week miniscoop in vivo calciumbeeldvorming uitgevoerd zonder enige impact op de gezondheid van muizen en het sociale gedrag van muizen op temerken 12.
Een belangrijke beperking van het huidige miniscope-opnamesysteem is de noodzaak om de microscoop aan te sluiten op een kabel voor gegevensverzameling. De aanwezigheid van de kabel beperkt soms de prestaties van de muistaak en beperkt de opname van één dier tegelijk. Onlangs is er een draadloze miniscoop ontwikkeld 25,26. Dit zal de taakprestaties verbreden en gelijktijdige in vivo beeldvorming van meerdere dieren in een groep mogelijk maken. Bovendien zal het ontwikkelen van meer gevoelige GECI's met spectraal scheidbare golflengten in combinatie met een tweekleurige miniscoop meer opwindende mogelijkheden bieden voor neurowetenschappelijk onderzoek.
Disclosures
De auteurs melden geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Dit werk wordt ondersteund door subsidies van het National Institute of Health (NIH) 5P20GM121310, R61NS115161 en UG3NS115608.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.6mm and 1.2mm drill burrs | KF technology | 8000037800 | For craniotomy |
| 27-G and 30-G needle | BD PrecisionGlide Needle | REF 305109 and REF305106 | For both surgeries |
| 45 angled forceps | Fine Science tools | 11251-35 | For surgeries |
| 7.5% povidone-iodine solution (Betadine) | Purdue Products L.P. | NDC 67618-151-17 | Surface disinfectant |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124-1L | GRIN lens cleaner |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539-25G | For GRIN lens implantation |
| Antibiotic ointment | HeliDerm Technology | 81073087 | For virus injection |
| Anti-inflamatory drug (Ibuprofen) | Johnson & Johnson Consumer Inc | 30043308 | Acts as pain killer after surgeries |
| AutoStereota | NIDA/IRP | github.com/liang-bo/autostereota | For GRIN lens implantation |
| Behavior Recoding Software (Point Grey FlyCap2) | Point Grey | Point Grey Research Blackfly BFLY-PGE-12A2C | For recording behavior |
| Brass hex nut | McMASTER-CARR | 92736A112 | For GRIN lens implantation |
| Buprenorphine | Par Pharmaceuticals | NDC 4202317905 | For GRIN lens implantation |
| Calcium chloride | Sigma | 10043-52-4 | For preparing aCSF |
| Commutator | NIDA/IRP | Custom-designed | Component of image acquisition system |
| Compressed Oxygen and Caxbondioxide tank | Rocky Mountain Air Solutions | BI-OX-CD5C-K | For GRIN lens implantation |
| Compressed Oxygen tank | Rocky Mountain Air Solutions | OX-M-K | For virus injection |
| Cordless Microdrill | KF technology | 8000037800 | For craniotomy |
| Cyanoacrylate | Henkel Coorporation | # 1811182 | For GRIN lens implantation |
| Data acquisition controller | NIDA/IRP | Custom-designed | Component of image acquisition system |
| Data transmission cable | NIDA/IRP | Custom-designed | Component of image acquisition system |
| Dental cement set | C&B Metabond and Catalyst | A00253revA306 and A00168revB306 | For GRIN lens implantation |
| Dental cement set | Duralay | 2249D | For GRIN lens implantation |
| Dexamethasone | VETone | NDC 1398503702 | For GRIN lens implantation |
| Dextrose | Sigma | 50-99-7 | For preparing aCSF |
| Diet gel | Clear H20 | 72-06-5022 | Diet Supplement for mouse |
| GRIN lens | GRINTECH | NEM-100-25-10-860-S | For GRIN lens implantation |
| Heating Pad | Physitemp Instruments LLC. | #10023 | To keep the mouse body warm during surgeries |
| Isoflurane | VETone | V1 502017 | Anesthesia |
| Ketamine | VETone | V1 501072 | For GRIN lens implantation |
| Lidocaine | WEST-WARD | NDC 0143-9575-01 | Local anesthesia |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma | 7791-18-6 | For preparing aCSF |
| Microliter syringe (Hamilton) | Hamilton | 7653-01 | For virus injection |
| MicroSyringe Pump Controller | World Precision Instrument | #178647 | For virus injection |
| Miniscope | NIDA/IRP | Custom-designed | For imaging |
| Miniscope base | Protolabs | Custom-designed | For mounting the base |
| Miniscope holding arm | NIDA/IRP | Custom-designed | For mounting the base |
| Miniscope protection cap | Protolabs | Custom-designed | For protecting the miniscope |
| Motorized controller | Thorlabs | KMTS50E | For mounting the base |
| NeuView | NIDA/IRP | https://github.com/giovannibarbera/miniscope_v1.0 | For in vivo imaging |
| Ophthalmic ointment | Puralube Vet Ointment | NDC 17033-211-38 | Ophthalmic |
| PCR tube | Thermo Scientific | AB-0622 | For GRIN lens implantation |
| Pinch Clamp | World Precision Instrument | 14040 | For clamping the tubing |
| Polytetrafluoroethylene (PTFE) tape | TegaSeal PTFE Tape | A-A-58092 | For fastening miniScope to the base |
| Potassium chloride | Sigma | 7447-40-7 | For preparing aCSF |
| Robotic arm | NIDA/IRP | Custom-designed | For GRIN lens implantation |
| Saline | Hospira | RL 7302 | For both surgeries |
| Set screw | DECORAH LLC. | 3BT-P9005-00-0025 | For screwing the brass hex nut in miniscope base |
| Silicone Rubber tubing, 0.062”ID, 1/8”OD | McMaster | 2124T3 | For irrigation of aCSF |
| Sodium bicarbonate | Sigma | 144-55-8 | For preparing aCSF |
| Sodium chloride | Sigma | 7647-14-5 | For preparing aCSF |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | 7558-80-7 | For preparing aCSF |
| Stereotaxic stage | KOPF | Model 962 Dual Ultra Precise Small Animal Stereotaxic | For both surgeries |
| Sterile cotton swab | Puritan | REF 806-WC | For both surgeries |
| Surgical tools | Fine Science tools | 11251-35 | For surgeries |
| Suture | Sofsilk | REF SS683 | For virus injection |
| Syringe filter (0.22 µm) | Millex | SLGVR33RS | For filtering aCSF during GRIN lens implantation |
| Viral suspension (AAV1-CamKII-GCamp6f) | Addgene | 100834-AAV1 | For virus injection |
| Titre: 2.8 X 10^13 GC/ml | |||
| Xylazine | VETone | V1 510650 | For GRIN lens implantation |
References
- Clapham, D. E.
- Brini, M., Cali, T., Ottolini, D., Carafoli, E. Neuronal calcium signaling: function and dysfunction. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (15), 2787-2814 (2014).
- Chen, T. W., Li, N., Daie, K., Svoboda, K. A Map of Anticipatory Activity in Mouse Motor Cortex. Neuron. 94 (4), 866-879 (2017).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Komiyama, T., et al. Learning-related fine-scale specificity imaged in motor cortex circuits of behaving mice. Nature. 464 (7292), 1182-1186 (2010).
- Peters, A. J., Lee, J., Hedrick, N. G., O'Neil, K., Komiyama, T. Reorganization of corticospinal output during motor learning. Nature Neuroscience. 20 (8), 1133-1141 (2017).
- Barbera, G., et al. Spatially compact neural clusters in the dorsal striatum encode locomotion relevant information. Neuron. 92 (1), 202-213 (2016).
- Cai, D. J., et al. A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time. Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).
- de Groot, A., et al. NINscope, a versatile miniscope for multi-region circuit investigations. Elife. 9, 49987 (2020).
- Ghosh, K. K., et al. Miniaturized integration of a fluorescence microscope. Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).
- Jacob, A. D., et al. A compact head-mounted endoscope for in vivo calcium imaging in freely behaving mice. Current Protocols in Neuroscience. 84 (1), 51 (2018).
- Liang, B., et al. Distinct and Dynamic ON and OFF neural ensembles in the prefrontal cortex code social exploration. Neuron. 100 (3), 700-714 (2018).
- Liberti, W. A., et al. Unstable neurons underlie a stable learned behavior. Nature Neuroscience. 19 (12), 1665-1671 (2016).
- Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7319-7324 (2003).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Miyawaki, A., et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388 (6645), 882-887 (1997).
- Bassett, J. J., Monteith, G. R. Genetically encoded calcium indicators as probes to assess the role of calcium channels in disease and for high-throughput drug discovery. Advances in Pharmacology. 79, 141-171 (2017).
- Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. Genetically encoded indicators of neuronal activity. Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).
- Tian, L., Akerboom, J., Schreiter, E. R., Looger, L. L. Neural activity imaging with genetically encoded calcium indicators. Progress in Brain Research. 196, 79-94 (2012).
- Moore, D. T.
- Zhang, L., et al. Miniscope GRIN Lens System for Calcium Imaging of Neuronal Activity from Deep Brain Structures in Behaving Animals. Current Protocols in Neuroscience. 86 (1), 56 (2019).
- Yang, Y., et al. A two-step GRIN lens coating for in vivo brain imaging. Neuroscience Bulletin. 35 (3), 419-424 (2019).
- Liang, B., Zhang, L., Moffitt, C., Li, Y., Lin, D. T. An open-source automated surgical instrument for microendoscope implantation. Journal of Neuroscience Methods. 311, 83-88 (2019).
- Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. Elife. 8, 38173 (2019).
- Barbera, G., Liang, B., Zhang, L., Li, Y., Lin, D. T. A wireless miniScope for deep brain imaging in freely moving mice. Journal of Neuroscience Methods. 323, 56-60 (2019).
- Shuman, T., et al. Breakdown of spatial coding and interneuron synchronization in epileptic mice. Nature Neuroscience. 23 (2), 229-238 (2020).
- Werner, C. T., Williams, C. J., Fermelia, M. R., Lin, D. T., Li, Y. Circuit mechanisms of neurodegenerative diseases: A new frontier with miniature fluorescence microscopy. Frontiers in Neuroscience. 13, 1174 (2019).
- Brault, V., Besson, V., Magnol, L., Duchon, A., Herault, Y. Cre/loxP-mediated chromosome engineering of the mouse genome. Handbook of Experimental Pharmacology. (178), 29-48 (2007).
- McLellan, M. A., Rosenthal, N. A., Pinto, A. R. Cre-loxP-mediated recombination: General principles and experimental considerations. Current Protocols in Mouse Biology. 7 (1), 1-12 (2017).
Tags
Neurowetenschappen Nummer 176 Miniscope in vivo calcium beeldvorming mPFC muis hersenchirurgieErratum
Formal Correction: Erratum: Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging
Posted by JoVE Editors on 05/05/2022.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging. The Discussion was updated.
The following paragraph was added to the end of the Discussion:
Although a chunk of brain tissue is removed unilaterally during the GRIN lens implantation step, we did not observe any obvious behavior deficits7,12. The weight of the miniscope is around 2 grams and the cable is custom-designed to make it light and to ensure that the mouse can easily carry it. The miniscope and cable are only attached to the animal prior to in vivo imaging and detached after imaging. The entire imaging process usually takes no longer than 30 minutes. Therefore, these instrumentations do not prevent the mouse from freely behaving. The miniscope installation and deinstallation steps need a brief anesthesia (less than 2 minutes) with isoflurane for the purpose of animal restraining. We typically let the mouse recover from the brief exposure of isoflurane for 30 minutes before performing in vivo imaging. We have performed miniscope in vivo calcium imaging once per week for a few weeks without noticing any impact on mouse health and mouse social behavior12.
