Summary
Vi introduserer tre metoder for direkte kultur, direkte eksponeringskultur og eksponeringskultur for evaluering av in vitro cytokompatibilitet av biologisk nedbrytbare implantatmaterialer. Disse in vitro-metodene etterligner forskjellige in vivo celleimplantatinteraksjoner og kan brukes til å studere ulike biologisk nedbrytbare materialer.
Abstract
I løpet av de siste tiårene har biologisk nedbrytbare materialer blitt grundig utforsket for biomedisinske applikasjoner som ortopediske, tann- og kraniomaxillofaciale implantater. For å screene biologisk nedbrytbare materialer for biomedisinske applikasjoner, er det nødvendig å evaluere disse materialene når det gjelder in vitro-celleresponser , cytokompatibilitet og cytotoksisitet. International Organization for Standardization (ISO) standarder har blitt mye brukt i evalueringen av biomaterialer. Imidlertid ble de fleste ISO-standarder opprinnelig etablert for å vurdere cytotoksisiteten til ikke-nedbrytbare materialer, og ga dermed begrenset verdi for screening av biologisk nedbrytbare materialer.
Denne artikkelen introduserer og diskuterer tre forskjellige kulturmetoder, nemlig direkte kulturmetode, direkte eksponeringskulturmetode og eksponeringskulturmetode for evaluering av in vitro cytokompatibilitet av biologisk nedbrytbare implantatmaterialer, inkludert biologisk nedbrytbare polymerer, keramikk, metaller og deres kompositter, med forskjellige celletyper. Forskning har vist at kulturmetoder påvirker celleresponsen på biologisk nedbrytbare materialer fordi deres dynamiske nedbrytning induserer romlige forskjeller i grensesnittet og i nærmiljøet. Spesielt avslører den direkte kulturmetoden responsen til celler frø direkte på implantatene; den direkte eksponeringskulturmetoden belyser svarene til etablerte vertsceller som kommer i kontakt med implantatene; og eksponeringskulturmetoden evaluerer de etablerte vertscellene som ikke er i direkte kontakt med implantatene, men påvirkes av endringene i lokalmiljøet på grunn av implantatforringelse.
Denne artikkelen gir eksempler på disse tre kulturmetodene for å studere in vitro cytokompatibilitet av biologisk nedbrytbare implantatmaterialer og deres interaksjoner med benmargsavledede mesenchymale stamceller (BMSCer). Den beskriver også hvordan du høster, passerer, kultur, frø, fikser, flekker, karakteriserer cellene og analyserer postkulturmedier og materialer. In vitro-metodene beskrevet i denne artikkelen etterligner forskjellige scenarier av in vivo-miljøet , og utvider anvendbarheten og relevansen av in vitro cytokompatibilitetstesting av forskjellige biomaterialer for ulike biomedisinske applikasjoner.
Introduction
I flere tiår har biologisk nedbrytbare materialer blitt grundig studert og brukt i biomedisinske applikasjoner som ortopedisk1,2, dental3,4 og craniomaxillofacial5 applikasjoner. I motsetning til permanente implantater og materialer, biologisk nedbrytbare metaller, keramikk, polymerer og deres kompositter gradvis nedbrytes i kroppen over tid via ulike kjemiske reaksjoner i det fysiologiske miljøet. For eksempel er biologisk nedbrytbare metaller som magnesium (Mg) legeringer1,6,7 og sink (Zn) legeringer8,9 lovende materialer for beinfikseringsenheter. Deres biologisk nedbrytbarhet kan eliminere nødvendigheten av sekundære operasjoner for å fjerne implantatene etter beinheling. Biologisk nedbrytbar keramikk som kalsiumfosfatsementer (CPCer) har vist spennende potensial for behandling av osteoporotiske vertebrale kompresjonsbrudd i perkutan kyfoplastikk10. CPC-ene gir mekanisk støtte for den oppsprukne vertebrale kroppen og gradvis nedbrytes etter at bruddet har grodd.
Biologisk nedbrytbare polymerer, som enkelte polysakkarider og polyestere, har også blitt mye utforsket for biomedisinske anvendelser. For eksempel har chitosan hydrogel som biologisk nedbrytbar polysakkarid vist sine evner for å forhindre infeksjon og regenerere hudvev11. Poly-L-melkesyre (PLLA), poly (glykolsyre) (PGA) og poly (melkesyre-med-glykolsyre) (PLGA) er mye studert polyester for fremstilling av 2D eller 3D porøse stillaser for vevsteknikk applikasjoner12,13,14. Videre integrerer komposittmaterialer to eller flere faser av metaller, keramikk og polymerer for å gi avanserte funksjoner for et bredt spekter av biomedisinske applikasjoner15,16,17. For eksempel kan PLGA og kalsiumfosfatkompositter brukes til å fremstille biologisk nedbrytbare stillaser for applikasjoner som reparasjon av skallebenfeil18. Disse biologisk nedbrytbare stillasene og implantatene kan støtte og fremme veksten av celler og vev og deretter gradvis forringes i kroppen over tid.
Som vist i supplerende tabell 1, kan ulike biologisk nedbrytbare materialer ha varierte nedbrytningsmekanismer, produkter og priser. For eksempel magnesiumlegeringer, for eksempel Mg-2 wt % Zn-0,5 wt % Ca (ZC21)1, Mg-4 wt% Zn-1 wt% sr (ZSr41)19, og Mg-9 wt% Al-1 wt% sink (AZ91)20, nedbrytning ved å reagere med vann, og deres nedbrytningsprodukter inkluderer hovedsakelig Mg2 + ioner, OH- ioner, H2 gass og mineralavsetninger. Nedbrytningshastigheten for biologisk nedbrytbare metaller varierer avhengig av deres forskjellige sammensetninger, geometrier og nedbrytningsmiljøer. For eksempel rapporterte Cipriano et al.19 at ZSr41-ledninger (Ø1,1 × 15 mm) mistet 85% masse mens rene Mg-ledninger med samme geometri mistet 40% masse etter å ha blitt implantert i rottetibiae i 47 dager. Biologisk nedbrytbare keramiske materialer som hydroksyapatitt (HA) og β-trikalsiumfosfat (β-TCP) kan forringes via løsningsdrevet ekstracellulær væskeoppløsning eller bryte ned i små partikler og deretter forringes via både ekstracellulær væskeoppløsning og cellemedierte resorpsjonsprosesser. Nedbrytningsproduktene til disse kalsiumfosfatbaserte keramikk kan omfatte Ca2+ ioner, (PO4)3-ioner, OH-ioner og mineralavsetninger21. Nedbrytningshastigheten for kalsiumfosfatkeramikk påvirkes betydelig av krystallstrukturene. For eksempel rapporterte Van Blierswijk et al.22 at HA med 40 vol.% mikropores ikke mistet noen masse mens β-TCP med 40 vol.% mikropores mistet 30 ± 4% masse etter å ha blitt implantert i tibiae av kaniner i 3 måneder. Polymerer som PLGA14,23 kan forringes på grunn av hydrolyse av esterkoblingene i nærvær av vann, og nedbrytningsproduktene inkluderer hovedsakelig melkesyre og glykolsyrer. Det kan ta en måned for PLGA 50/50 og flere måneder for PLGA 95/5 å oppnå fullstendig nedbrytning24.
Cellerespons og cytokompatibilitetstesting er avgjørende for å evaluere og screene disse biologisk nedbrytbare implantatmaterialene for biomedisinske anvendelser. Imidlertid ble nåværende standarder fra International Organization for Standardization (ISO), for eksempel ISO 10993-5:2009 "Biologisk evaluering av medisinsk utstyr-Del 5 Tester for in vitro cytotoksisitet", opprinnelig designet for å vurdere cytotoksisiteten til ikke-nedbrytbare biomaterialer som Ti-legeringer og Cr-Co-legeringer in vitro25. Spesielt dekker ISO 10993-5:2009 bare in vitro cytotoksisitetstester av ekstraktet, direkte kontakt og indirekte kontakttester. I ekstrakttesten fremstilles ekstraktet ved å nedsenke prøver i ekstraksjonsvæsker som kulturmedier med serum og fysiologiske saltvannsløsninger under en av standard tids- og temperaturforholdene. Det innsamlede ekstraktet eller fortynning legges deretter inn i cellekulturen for å studere cytotoksisitet. For den direkte kontakttesten oppnås direkte kontakt mellom prøve og celler ved å plassere testprøven på det etablerte (tilholdte) cellelaget. I den indirekte kontakttesten pipetteres kulturmediene som inneholder serum og smeltet agar for å dekke de etablerte cellene. Prøven plasseres deretter på det størkne agarlaget med eller uten filter.
ISO-standardene har vist noen begrensninger når de brukes til å evaluere biologisk nedbrytbare materialer in vitro. I motsetning til nedbrytbare materialer er nedbrytningsatferden til biologisk nedbrytbare materialer dynamisk og kan endres på et annet tidspunkt eller under varierte miljøforhold (f.eks. temperatur, fuktighet, mediesammensetning og celletype). Ekstrakttesten evaluerer bare cytotoksisiteten til materialets nedbrytningsprodukter og gjenspeiler ikke den dynamiske prosessen med prøveforringelse. Både direkte og indirekte kontakttester av ISO-standarden karakteriserer bare interaksjonene mellom de etablerte cellene og prøvene. Videre, i den indirekte kontakttesten, er materialene og cellene i forskjellige mikromiljøer som ikke reflekterer in vivo-miljøet og ikke fanger den dynamiske nedbrytningen av biologisk nedbrytbare materialer.
Målet med denne artikkelen er å introdusere og diskutere cytokompatibilitetstestingsmetodene for ulike biologisk nedbrytbare implantatmaterialer for å adressere de ovennevnte begrensningene i metodene beskrevet i gjeldende ISO-standarder. Metodene som presenteres i denne artikkelen vurderer den dynamiske nedbrytningsatferden til implantatmaterialer og de forskjellige omstendighetene ved cellematerialeinteraksjoner in vivo. Spesielt gir denne artikkelen tre cytokompatibilitetstestingsmetoder, nemlig direkte kultur, direkte eksponeringskultur og eksponeringskultur for ulike biologisk nedbrytbare materialer, inkludert biologisk nedbrytbare polymerer, keramikk, metaller og deres kompositter for medisinske implantatapplikasjoner.
I den direkte kulturmetoden blir celler suspendert i kulturmediene direkte sådd på prøvene, og evaluerer dermed interaksjonene mellom nylig frøceller og implantatene. I den direkte eksponeringskulturen plasseres prøvene direkte på det etablerte cellelaget for å etterligne samspillet mellom implantater med etablerte vertsceller i kroppen. I eksponeringskulturen plasseres prøvene i sine respektive brønninnlegg og introduseres deretter til kulturbrønnene med etablerte celler, noe som karakteriserer responsen fra etablerte celler til endringene i det lokale miljøet forårsaket av implantatforringelse når de ikke har direkte kontakt med implantater. De direkte kultur- og direkte eksponeringskulturmetodene evaluerer cellene direkte eller indirekte i kontakt med implantatmaterialene i samme kulturbrønn. Eksponeringskulturen karakteriserer cellene indirekte i kontakt med implantatmaterialene innenfor en foreskrevet avstand i samme kulturbrønn.
Denne artikkelen presenterer en detaljert beskrivelse av cytokompatibilitetstesting for forskjellige biologisk nedbrytbare materialer og deres interaksjoner med modellceller, det vil si benmargsavledede mesenchymale stamceller (BMSCer). Protokollene inkluderer høsting, modning, såing, fiksering, farging og avbildning av cellene, sammen med analyser av postkulturmaterialer og medier, som gjelder for en rekke biologisk nedbrytbare implantatmaterialer og et bredt spekter av celletyper. Disse metodene er nyttige for screening av biologisk nedbrytbare materialer for ulike biomedisinske anvendelser når det gjelder celleresponser og cytokompatibilitet in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokollen ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of California ved Riverside (UCR) for celle- og vevshøsting. En 12 uker gammel kvinnelig Sprague-Dawley (SD) rotte vises som et eksempel i videoen. Yngre kvinnelige og mannlige rotter foretrekkes.
1. Forberedelse av cellekultur
MERK: De tre kulturmetodene som er beskrevet i denne artikkelen, gjelder vanligvis for forskjellige celletyper som følges. Her vil BMSC-er høstet fra rotte-avvenning bli introdusert som et eksempel for cellekulturforberedelse. Avhengig av relevansen for spesifikke medisinske applikasjoner, kan forskjellige celletyper brukes, inkludert primærceller høstet fra dyr eller menneskelige donorer og cellelinjer fra en celle / vevsbank.
- Høsting av BMSC-er fra rotte-avvenninger
MERK: Det skjematiske diagrammet i figur 1 viser trinnene for å høste BMSC-er fra rotte-avvenninger.- Euthanize Sprague Dawley (SD) rotte ved CO2 innånding.
- Fjern hud og muskel og bindevev for å dissekere lårbenet ut av den euthanized rotten. Legg lårbenene i et 15 ml konisk rør (polypropylen) som inneholder cellekulturmedium. Plasser de koniske rørene på isen til tiden for å utføre celleutvinning.
MERK: Tibia kan også brukes til å høste BMSCer. Cellekulturmediet er Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) supplert med 10% foster bovint serum (FBS) og 1% penicillin/streptomycin (P/S). - Overfør beinene til en Petri-tallerken i det biologiske sikkerhetsskapet. Klipp endene av beinet ved hjelp av et kirurgisk blad og skyll benmargen i et 50 ml konisk rør (polypropylen) ved å vaske benmargshulen med cellekulturmedier ved hjelp av en sprøyte med en 251/2 G nål.
MERK: Sett en sprøyte med en 18 G nål inn i mediet med benmarg. Ta sakte og forsiktig opp og dispenser mediene for å bryte fra hverandre den store delen av margen til det ikke finnes synlige celle-/vevsagglomerater. - Filtrer cellefjæringen ved hjelp av et 70 μm filter, etterfulgt av sentrifugering ved 126 × g (1000 rpm) i 5 minutter for å få cellepellets.
- Aspirer de overnaturlige mediene og fyll på med 10 ml ferske medier. Pipette forsiktig opp og ned for å resuspendere cellene ved hjelp av en 10 ml serologisk pipette.
- Pipette suspensjonen direkte på innsiden av en T-75 kolbe og legg til medier for å bringe volumet opp til 25 ml. Kultur cellene i en inkubator i et standard sterilt cellekulturmiljø (dvs. 37 °C, fuktet atmosfære med 5 % CO2 og 95 % luft).
- Etter 3-7 dager, skyll bort de ikke-sammenhengende cellene ved å aspirere det gamle mediet og fylle på med friskt medium. Fortsett å dyrke og mate cellene med friskt medium til de er klare for cellepassasje, frysing eller bruk i et eksperiment.
- Vedlikehold av celler
- Endre cellekulturmediet regelmessig for å fjerne cellulære avfallsprodukter og fylle opp næringsstoffene omtrent annenhver dag til cellene er 90% -100% sammenfallende. Ved 90% samløp, passasje, fryse eller bruke cellene i et eksperiment.
- Sende celler
MERK: Passivisering, også kalt subkulturering, er et begrep som gjelder når celler overføres fra en kultur til en annen. Nyhøstede celler er i passasjestadium 0 (P0). Mengdene trypsin-etylendiamintetraacetisk syreoppløsning (trypsin-EDTA) og medier beskrevet i denne artikkelen er for en T-75 kolbe.- Kontroller cellene under et optisk mikroskop for å bekrefte at cellene er 90% konfluensa.
- Aspirer mediet fra celleflasken.
- Dispenser 10 ml fosfatbufret saltvann (PBS) i kolben ved hjelp av en serologisk pipette. Rock forsiktig kolben for å skylle cellene med PBS; aspirerer all PBS.
MERK: Dette trinnet fungerer som en ekstra skylling for å sikre at ingen døde celler eller cellulært avfall overføres under passivring. - Dispenser 3 ml trypsin-EDTA i celleflasken direkte på overflaten av cellene. Gyng forsiktig kolben for å sikre at hele overflaten med cellene er dekket av trypsin-EDTA.
- Plasser celleflasken med trypsin-EDTA i inkubatoren i 5 minutter for å la cellene løsne.
- Etter 5 min i inkubatoren, kontroller cellene under et optisk mikroskop for å bekrefte at cellene er løsnet. Hvis noen celler ikke har løsnet, trykker du forsiktig på siden av celleflasken og kontrollerer kolben igjen.
- Tilsett 9 ml friskt medium i celleflasken for å fortynne trypsin-EDTA. Dette gir mer tilgjengelige proteiner for trypsin-EDTA å binde seg til i stedet for å lyse cellene.
- Pipette ut cellene i media og trypsin-EDTA og dispensere dem i et 15 ml konisk rør. Sentrifuger cellene ved 126 × g (1000 rpm) i 5 min.
- Uten å forstyrre cellepellet, aspirerer du mediet med trypsin-EDTA.
- Tilsett 5-10 ml ferske medier til sentrifugerøret og resuspender cellene forsiktig i mediet ved hjelp av en 10 ml serologisk pipette.
- Pipette cellene suspendert i medium ut av sentrifugerøret og del volumet i 2-3 friske kulturflasker. Legg til nok medium til å bringe det totale middels volumet til 25 ml for hver kolbe.
MERK: Delingsforholdet under subkulturen kan variere avhengig av celletyper og spesifikke vekstegenskaper. - Kontroller cellene under et optisk mikroskop og legg dem tilbake i inkubatoren.
- Fryse celler
- Kontroller cellene under et optisk mikroskop for å bekrefte at cellene er 90% konfluensa.
- Gjenta trinn 1.2.2.2 til 1.2.2.9.
- Tilsett 900 μL friskt medium til sentrifugerøret med en mikropipette på 100-1000 μL. Langsomt og forsiktig resuspend celler i medium ved hjelp av samme mikropipette.
- Overfør 900 μL celle suspensjon til en kryolegeme. Tilsett 100 μL dimetylsulfoksid (DMSO).
- Så snart som mulig, plasser kryoogen i en sylindrisk skumbeholder designet for å regulere temperaturreduksjonen (se materialtabellen). Plasser skumbeholderen i -80 °C fryseren.
- Tine celler
- Tine de frosne cellene i vannbadet. Ta et sterilt 15 ml konisk rør fylt med 5 ml friskt medium, plasser cellene i det koniske røret og sentrifuger ved 126 × g (1000 rpm) i 5 minutter.
- Aspirer mediet som inneholder DMSO.
- Tilsett 5-10 ml friskt medium til det koniske røret på 15 ml. Pipette sakte og forsiktig opp og ned for å resuspendere cellene.
- Pipette cellene suspendert i medium ut av det 15 ml koniske røret og dispenser inn i en ny T-75 kolbe. Når du dispenserer celler, bruk en feiende bevegelse for å fordele cellene så jevnt som mulig på bunnen av celleflasken.
- Tilsett nok friskt medium til å bringe det totale middels volumet til 25 ml for hver T-75-kolbe.
- Kontroller cellene under et optisk mikroskop og plasser celleflasken tilbake i inkubatoren.
2. Prøvepreparering og sterilisering
- Prøvepreparering
- Bruk vevskulturbehandlede plater som 6, 12, 24, 48 eller 96-brønns plater for cellekultureksperimenter beskrevet i denne artikkelen. Velg type vevskulturplater og medievolumet i hver brønn basert på forskjellige eksperimentelle design som prøvedimensjon.
- Steriliser eller desinfiser alle biologisk nedbrytbare prøver før cellekulturen.
MERK: Desinfeksjon er akseptabelt for in vitro studier når prøvene er utsatt for kjemiske og/eller overflateforandringer under noen steriliseringsforhold som involverer høy varme, oksidasjonsmiddel og/eller radikaler. Steriliserings- eller desinfeksjonsmetoder for forskjellige prøvetyper varierer avhengig av de forskjellige egenskapene til materialene, for eksempel polymerer, metaller og keramikk. Prosessen for sterilisering eller desinfeksjon kan innebære varme, gass, stråling, kjemikalier, høyt trykk eller en kombinasjon av disse.- Biologisk nedbrytbare metaller
- Generelt, bruk ultrafiolett (UV) stråling for å desinfisere biologisk nedbrytbare metaller for in vitro-studier .
MERK: For eksempel rapporterte Zhang et al. at rene magnesiumprøver (Mg) og ZC21 Mg legeringsprøver ble desinfisert under UV-stråling i 4 timer før de ble brukt i cellestudiene1. For in vivo-studier er prøvene generelt pålagt å steriliseres. For mange biologisk nedbrytbare metaller som magnesium- eller magnesiumlegeringer, bør autoklavering ved hjelp av damp unngås fordi disse prøvene kan oksideres eller korroderes i vann6. En kvartsfat anbefales for UV-desinfeksjon fordi den gir bedre UV-gjennomsiktighet enn de fleste briller og plast. - Steriliser Mg legeringsprøver under tørr varme i en ovn eller autoklav ved temperaturområdet 100-200 °C.
MERK: Ettersom noen metalllegeringer fortsatt kan oksideres på overflaten ved høye temperaturer i luften, kan høyintensitetsstråling i noen tilfeller brukes som et alternativ. Imidlertid bør høyintensitetsstråling som alfa- eller gammastråling unngås ved sterilisering av tynne metalliske folier. Det kan forårsake atomforskyvning i materialene, endre mikrostrukturen til materialer. - Bruk etylenoksid (EtO) gasssterilisering som en alternativ metode for biologisk nedbrytbare metaller som er følsomme for varme og stråling26.
- Generelt, bruk ultrafiolett (UV) stråling for å desinfisere biologisk nedbrytbare metaller for in vitro-studier .
- Biologisk nedbrytbar keramikk
- Desinfiser generelt biologisk nedbrytbar keramikk ved hjelp av UV-stråling eller 70% etanoloppløsning før in vitro-studier .
MERK: For eksempel rapporterte Liu et al. at kalsiumfosfatprøvene ble desinfisert via nedsenking i 70% etanol i 1 time og eksponering for UV-lys i 12 timer på hver side før de ble brukt i in vitro cytokompatibilitetstester27. - Bruk autoklaver til å sterilisere biologisk nedbrytbar keramikk hvis høy temperatur og vanndamp ikke skader kompostioner og mikrostrukturer.
MERK: Noen keramikk kan påvirkes av autoklavering. For eksempel ble faseendring og overflatere roughening funnet da yttria-stabilisert zirkonia keramikk ble autoklavert ved 121 °C i 15 minutter. I tillegg kan ikke CPCer steriliseres via autoklavering med damp fordi prøvene vil reagere med vann. - Bruk alternative steriliseringsmetoder som Kobolt-60-stråling for ovennevnte yttria-stabilisert zirkonia keramikk og CPC-prøver28.
- Desinfiser generelt biologisk nedbrytbar keramikk ved hjelp av UV-stråling eller 70% etanoloppløsning før in vitro-studier .
- Biologisk nedbrytbare polymerer
- Desinfiser generelt biologisk nedbrytbare polymerer ved hjelp av UV-stråling eller 70% etanol før du bruker dem i cellestudier in vitro.
MERK: Noen polymerer kan gjennomgå kjemiske endringer under UV-stråling. For sterilisering kan gammastrålebehandling som Kobolt-60-stråling brukes. For eksempel ble stivelsespulver sterilisert under Kobolt-60-stråling før de ble brukt i in vitro-cellestudier29. - Autoklavpolymermaterialer som tåler høy temperatur og fuktighet.
MERK: For eksempel kan polymerer som polypropylen autoklaveres, da de tåler autoklaveringstemperaturer (dvs. 121-134 °C). Noen polymerer som polycaprolactone (PCL) kan ikke autoklaveres på grunn av deres relativt lave smeltepunkter (dvs. rundt 60 °C)30. - Bruk EtO-gass til å sterilisere polymere materialer som er følsomme for varme- eller strålingsterilisering.
- Desinfiser generelt biologisk nedbrytbare polymerer ved hjelp av UV-stråling eller 70% etanol før du bruker dem i cellestudier in vitro.
- Biologisk nedbrytbare metaller
3. Cellekultur metoder
- Direkte kulturmetoder
MERK: Det skjematiske diagrammet i figur 2A viser trinnene i den direkte kulturmetoden. I denne artikkelen ble BMSC dyrket på en Mg-avledet plate plassert inne i brønnene til en 12-brønns vevskulturbehandlet plate som et eksempel for å illustrere kulturmetoden.- Følg trinnene som er beskrevet i trinn 1.2.2.1-1.2.2.10 for å få cellesuspensjonen.
- Bruk en 90% konfluent kolbe for å bestemme cellekonsentrasjonen i celleopphenget ved hjelp av et hemocytometer. Fortynn cellefjæringen ved hjelp av friskt medium til en foreskrevet cellekonsentrasjon som trengs for cellestudiens in vitro.
MERK: Frøtettheten til cellene bestemmes av den eksperimentelle designen. For eksempel har celletettheter på 2000-40 000 celler/cm2 blitt brukt i forskjellige cellestudier med biologisk nedbrytbare materialer. - Plasser prøvene (Mg plate) i midten av de 12-godt behandlede vevskulturplatene. Skyll kulturplatene sekvensielt med 2 ml PBS og 2 ml DMEM for å kalibrere det osmotiske trykket under sterile forhold. Tilsett 3 ml av den fortynnede cellefjæringen i hver brønn på prøvene av interesse.
- Kultur cellene i en inkubator under standard cellekulturforhold i 24 timer.
MERK: Kulturtiden kan være lengre eller kortere enn 24 timer, avhengig av eksperimentell design.
- Direkte eksponeringskulturer
MERK: Det skjematiske diagrammet i figur 2B viser trinnene i den direkte eksponeringskulturen.- Som beskrevet i trinn 3.1.1 og 3.1.2, forberede cellesuspensjonen med de nødvendige konsentrasjonene av celler basert på eksperimentell design for forskjellige celletyper og tiltenkte applikasjoner.
- Skyll kulturplatene med 2 ml PBS og 2 ml DMEM sekvensielt for å kalibrere det osmotiske trykket under sterile forhold. Tilsett 3 ml av den fortynnede cellefjæringen i hver brønn. Kultur cellene i den fuktede inkubatoren under standard cellekulturforhold i 24 timer eller til cellene når 50-80% samløp.
MERK: Cellesamløpsnivået kan variere for forskjellige celletyper og eksperimentell design. - Etter 24 timer skyll cellene i brønnplaten med PBS ved hjelp av en pipette for å fjerne flytende døde celler.
- Plasser de desinfiserte eller steriliserte prøvene direkte på de festede cellene. Tilsett 3 ml friskt medium i hver brønn.
- Kultur cellene under standard cellekultur forhold for en annen 24 h.
MERK: Kulturtiden kan være lengre eller kortere enn 24 timer, avhengig av eksperimentell design.
- Eksponeringskulturer
MERK: Det skjematiske diagrammet i figur 2C viser trinnene i eksponeringskulturmetoden.- De første trinnene for celleforberedelsen er de samme som eksponeringskulturen. Som beskrevet i trinn 3.1.1 og 3.1.2, klargjør celleopphenget med de ønskede cellene. I likhet med trinn 3.2.1 og 3.2.2, frø cellene i brønnplaten ved ønsket tetthet og kultur dem i en inkubator under standard cellekulturforhold i 24 timer.
- Etter 24 timer, skyll tilhengercellene med PBS for å fjerne flytende døde celler, etterfulgt av tilsetning av 3 ml friskt medium i hver brønn.
- Deretter plasserer du prøvene i brønninnleggene med en membranporstørrelse på 0,4 μm og plasserer brønninnleggene med prøvene i hver brønn med cellene.
- Kultur cellene under standard cellekultur forhold for en annen 24 h.
MERK: Kulturtiden kan være lengre eller kortere enn 24 timer, avhengig av eksperimentell design.
4. Postkultur karakterisering av celler
MERK: For direkte kultur og direkte eksponeringskultur, fest, flekk, bilde og analyser cellene som følges på både brønnplater og prøver. For eksponeringskultur, analyser cellene som er festet til brønnplatene.
- Cellefiksering
- Samle postkulturmediet fra hver brønn i et tilsvarende 15 ml konisk rør for videre analyse. Samle alle prøvene etter kultur for videre analyse.
- Skyll cellene på begge prøvene og brønnplatene 3 ganger ved hjelp av PBS.
- Tilsett 1 ml 4 % paraformaldehyd (PFA, 10 % nøytral bufret formalin) i hver brønnplate. Sett lokket tilbake på brønnplaten og la PFA reagere i 20 minutter.
- Etter 20 min aspirerer du PFA og dispenserer den i en avfallsflaske. Skyll brønnplaten 3 ganger med PBS for å fjerne PFA, og overfør avfallet til avfallsflasken.
- Cellefarging
- Forbered arbeidslagrene til fargestoffene i følge produsentens instruksjoner.
MERK: For eksempel brukes Alexa Fluor 488 Phalloidin til å flekke F-aktin, og 4′, 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) brukes til å flekke cellekjerner. Fargingstiden kan reduseres hvis prøvene forringes raskt i fargingsløsningene. - Tilsett 200-400 μL fortynnet Alexa Fluor 488 Phalloidin fargestoff til hver brønn for å dekke cellene på brønnplaten og prøven. Pakk brønnplaten i aluminiumsfolie for å forhindre lyseksponering, og la Alexa Fluor 488 Phalloidin reagere i 20 minutter ved romtemperatur.
- Samle Alexa Fluor 488 Phalloidin fargingsmiddel og dispenser det inn i den tilsvarende avfallsflasken. Skyll brønnplaten 3 ganger ved hjelp av PBS for å fjerne overflødig Alexa Fluor 488 Phalloidin, og dispenser den brukte PBS-en i den tilsvarende avfallsflasken.
- Tilsett 200-400 μL fortynnet DAPI til hver brønn for å dekke cellene i brønnen og på prøven. Pakk brønnplaten inn i aluminiumsfolie og la DAPI reagere i 5 minutter ved romtemperatur.
- Samle DAPI og dispenser den i den tilsvarende avfallsflasken. Skyll brønnplaten 3 ganger med PBS for å fjerne DAPI, og dispenser den brukte PBS-en i den tilsvarende avfallsflasken.
- Forbered arbeidslagrene til fargestoffene i følge produsentens instruksjoner.
- Celleavbildning
- Etter farging, bilde cellene ved hjelp av et fluorescensmikroskop. Når det er mulig, ta fasekontrastbilder av celler i tillegg til fluorescensbilder. Bilde cellene på de biologisk nedbrytbare prøvene så snart som mulig eller umiddelbart etter farging for å unngå eller redusere mulige endringer forårsaket av kontinuerlig nedbrytning av prøver. Oppbevar cellene i brønnplatene i en bufferløsning ved 2-8 °C etter fiksering, og bilde cellene så snart som mulig etter farging for å unngå tap av fluorescenssignaler.
- For direkte kultur og direkte eksponeringskultur, bilde og evaluer to typer celler: (1) cellene på prøvene (i direkte kontakt med prøvene) og (2) cellene som følges på brønnplaten rundt prøvene (indirekte kontakt med prøvene), som vist i figur 3A.
- For eksponeringskultur, som vist i figur 3B, bruker du en bildeveiledning når du tar fluorescensbildene av celler for å finne ut om celleresponsen vil være forskjellig som svar på den dynamiske nedbrytningsgradienten til prøvene. Bilde og analyser cellene i området i den indre ringen (3,5 mm fra midten) og den ytre ringen (7 mm fra midten) separat.
MERK: Bildeguiden brukes til å definere avstanden mellom cellene og prøvene. - For hver prøve og godt i kulturplatene, ta tilfeldig minst fem bilder fra hvert interesseområde der cellene enten er i direkte kontakt eller indirekte kontakt med prøvene på forhåndsdefinert avstand.
- Bildeanalyse
- For alle cellebildene som er hentet fra trinn 4.3, kvantifiserer du cellemorfologien ved å måle cellespredningsområdet og størrelsesforholdet ved hjelp av programvare som ImageJ for bildeanalyse.
- Tell antall celler i hvert bildeområde. Beregn celleadhesjonstettheten under direkte og indirekte kontaktforhold som antall celler per enhetsområde.
5. Postkulturanalyser av medier og prøver
- Mål pH for postkulturmedium.
MERK: Noen prøver endrer pH-verdien til mediet under nedbrytningen. For eksempel øker biologisk nedbrytbare metaller som magnesiumlegeringer vanligvis pH-verdien til mediet på grunn av nedbrytning31. I motsetning til dette reduserer biologisk nedbrytbare polymerer som PLGA ofte pH-verdien til mediet når de forringes32. Måling av pH-verdien til postkulturmediet kan indikere nedbrytning av disse prøvene in vitro.- Før cellefiksering samler du postkulturmediet som i trinn 4.1.1.
- Mål pH-verdiene til postkulturmediet i hver brønn umiddelbart etter oppsamling, ved hjelp av en forhåndskalibrert pH-måler.
MERK: Medienes pH kan drive over tid på grunn av miljøforhold som CO2-nivå og temperatur, som bør tas i betraktning.
- Analyser mediumsammensetningene for nedbrytningsatferden til biologisk nedbrytbare prøver. For noen prøver som forårsaker en fargeendring av mediet, måler du O.D.-verdien (Optical Den optiske tettheten) for postkulturmediet ved hjelp av et spektrofotometer eller en mikroplateleser for å fastslå nedbrytningsvirkemåten. Alternativt kan du bruke ultrafiolett synlig spektroskopi (UV-VIS) og Fouriertransformer infrarød spektroskopi-svekket total refleks (FTIR-ATR) for å analysere nedbrytningsproduktene i postkulturmediet.
MERK: Måling av nedbrytningsproduktene i postkulturmediet er verdifullt for å forstå nedbrytningsatferden til prøvene. En av de vanligste tilnærmingene er å måle ionene av interesse for postkulturmediet ved hjelp av et induktivt koblet plasmaoptisk utslippsspektrometer (ICP-OES). ICP-OES kan brukes til å måle sammensetningene av postkulturmediet av metaller og keramikk, men er kanskje ikke egnet for polymerer. Polymerer består vanligvis av karbon, hydrogen og oksygen, og nøyaktig kvantifisering av disse elementene er vanskelig for ICP-OES.- Etter trinn 5.1.2 for pH-måling, samle og fortynn mediet ved hjelp av en ønskelig fortynningsfaktor for optimale målinger av ionkonsentrasjoner.
- Mål konsentrasjonene av ionene av interesse for postkulturmediet ved hjelp av en ICP-OES.
- Postkulturanalyse av prøver
MERK: Etter in vitro-cellestudien kan de biologisk nedbrytbare prøvene endres i dimensjon, masse, overflatemorfologi, mikrostruktur og sammensetning. Postkulturanalyse av prøver bidrar til å forstå nedbrytningsmekanismen for prøver.- Etter cellekulturen tar du bildene av prøvene for å vise mulige endringer i utvalgsdimensjon, farge, morfologi og andre synlige egenskaper.
- Tørk eller dehydrer postkulturprøvene og mål prøvemassen, dimensjonen og volumet for å kvantifisere eventuelle endringer i masse, dimensjon og volum.
- Bruk et skanningselektronmikroskop (SEM) for å karakterisere mikrostruktur og morfologi av prøvene. Bruk energidispergeringsspektroskopi (EDX) og røntgendiffraksjon (XRD) for å karakterisere sammensetningen og fasen av nedbrytningsproduktene på prøvene. Bruk FTIR-ATR til å oppdage kjemisk binding på prøveflatene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 4 viser de representative fluorescensbildene av BMSC-er under direkte og indirekte kontaktforhold ved hjelp av ulike kulturmetoder. Figur 4A,B viser BMSCene under direkte og indirekte kontaktforhold etter samme 24 timers direkte kultur med ZC21 magnesiumlegeringer1. ZC21-legeringene består av 97,5 wt% magnesium, 2 wt% sink og 0,5 wt% kalsium. Cellene som ikke har direkte kontakt med ZC21 legeringsprøvene, sprer seg bedre enn de som har direkte kontakt med prøvene. Som vist i figur 4C,D, viser cellene under direkte og indirekte kontaktforhold alle normal morfologi etter en 24 timers direkte eksponering med hyaluronsyre (HyA) hydrogeler krysset av Fe3 + ioner. Antall celler under den indirekte kontaktbetingelsen er imidlertid lavere enn det under den direkte kontaktbetingelsen33. En annen studie rapporterte effekten av nedbrytning av ZSr41 legeringer (ф = 1,1 mm) på BMSCer etter en 24 h eksponering kultur19. ZSr41-legeringene består av 95 wt% magnesium, 4 wt% sink og 1 wt% strontium. Figur 4E viser de representative fluorescensbildene av BMSC-er som holder seg til kulturbrønnen på et sted 3,5 mm fra brønnsenteret, etter en 24 timers eksponeringskultur med de biologisk nedbrytbare pinnene19.
Figur 5 viser eksempeldataene for kvantifisert celleadhesjonstetthet. Som vist i figur 5A, i 24 h direkte eksponering (24h_DE) kultur, BMSCer i direkte kontakt med ZC21 har betydelig større celle vedheft tetthet enn noen annen gruppe. I den 24 h direkte kulturen (24h_D) viser BMSCer i direkte kontakt med ZC21 betydelig høyere celleadhesjonstetthet enn Mg-gruppen, betydelig lavere enn Glass-referansegruppen, men ingen statistisk forskjell sammenlignet med Ti-legeringskontrollen (T64). Som vist i figur 5B, i den indirekte kontakttilstanden til direkte eksponeringskultur, er BMSC-adhesjonstettheten betydelig høyere for ZC21-gruppen enn Mg-gruppen. Det viser imidlertid ingen signifikant forskjell sammenlignet med kontrollgruppene T64 og bare for celler. I den indirekte kontakttilstanden til direkte kultur er BMSC-adhesjonstettheten betydelig høyere for ZC21-gruppen enn for Mg-gruppen, men viser ingen signifikant forskjell sammenlignet med T64 og kontrollgrupper kun for celler1.
Figur 6A viser pH-verdien av postkulturmediet etter direkte eksponeringskultur og direkte kultur. For den direkte eksponeringskulturen varierer pH-verdiene for middels fra 8,3 til 8,4 for alle prøver. I den direkte kulturen varierer pH-verdiene for middels fra 7,9 til 8 på tvers av gruppene. Figur 9B viser Mg2+ ionkonsentrasjonen i postkulturmediet. I både den direkte eksponeringskulturen og den direkte kulturen er Mg2+ ionkonsentrasjonene i ZC21- og Mg-gruppene betydelig høyere enn i noen andre kontrollgrupper1. Figur 7 viser XRD-mønstrene for ZSr41 og ren Mg etter en 3-dagers eksponeringskultur. I figur 7A finnes de krystallinske fasene av Mg, Ca(OH)2, ZnO, MgO∙H2O, Ca(HPO4)(H2O)2 og Ca5(PO4)3(OH) (dvs. hydroksyapatitt eller HA), Mg17Sr2 på overflaten av ZSr41. I figur 7B er de krystallinske fasene av Mg, Ca(OH)2, Mg3(PO4)2, Mg7(PO4)2(OH)8, Ca2P2O7∙5H2O på overflaten av ren Mg19. Figur 8A viser overlegget av SEM-bilder og EDX-kart over overflateelementsammensetning for MgO-belagt Mg og kontroll av Mg-substrater og glass etter 24 timers direkte kultur med BMSCer. Figur 8B viser den kvantitative overflateelementsammensetningen av prøveflatene, noe som indikerer forskjellige avsetninger dannet under cellekultur34.
Figur 1: Skjematisk diagram som viser trinnene for å høste BMSC-er fra rotteslitere. Denne figuren er endret fra 35. Forkortelse: BMSCs = benmargsavledede mesenchymale stamceller. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Skjematisk diagram som viser de tre cellekulturmetodene. (A) Direkte kultur, (B) direkte eksponeringskultur og (C) eksponeringskultur. Denne figuren er endret fra 36. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Skjematiske diagrammer som viser direkte kultur og direkte eksponeringskultur. (A) Celler under direkte kontakt og indirekte kontaktforhold i direkte kultur og direkte eksponeringskultur. (B) Bruk av en bildeguide for å ta bilder av cellene som er festet til brønnplaten på forskjellige avstander vekk fra midten av prøvene i eksponeringskulturen. Figur 3B er endret fra 37. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Representative fluorescensbilder av BMSC (A, B) Direkte og indirekte kontaktforhold etter en 24 timers direkte kultur med ZC21-legeringer. (C, D) Direkte eksponeringskultur med HyA-hydrogeler. (E) På kulturplaten etter en 24 timers eksponeringskultur med ZSr41-legeringer. Skalastenger = 100 μm. A og B reproduseres fra 1; C og D reproduseres fra 33; og E reproduseres fra 19. Forkortelser: BMSCs = benmargsavledede mesenchymale stamceller; HyA = hyaluronsyre. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Kvantitative resultater for celleadhesjonstetthet for BMSCer (A) Direkte kontakt og (B) indirekte kontaktforhold etter 24 timers direkte eksponeringskultur (24 h_DE) og direkte kultur (24 h_D). Denne figuren er gjengitt fra 1. Forkortelser: BMSCs = benmargsavledede mesenchymale stamceller; DE = direkte eksponeringskultur; D = direkte kultur. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Representative resultater for postkulturanalyser av medium etter 24 t direkte eksponeringskultur og direkte kultur. (A) pH-verdier og (B) Mg2+ ionkonsentrasjoner. Denne figuren er gjengitt fra 1. Forkortelser: DE = direkte eksponering kultur; D = direkte kultur. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Representative postkulturresultater for faseanalyser av biologisk nedbrytbare metallprøver etter 3 dagers kultur med BMSCer. (A) Røntgendiffraksjonsspekter for ZSr41. (B) XRD-spektrum for ren Mg. Denne figuren er gjengitt fra 19. Forkortelser: BMSCs = benmargsavledede mesenchymale stamceller; XRD = røntgendiffraksjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Representative postkulturresultater for overflateanalyser av prøver etter 24 timers direkte kultur med BMSCer, inkludert overflatemikrostruktur, morfologi og sammensetning. (A) Overlegg av SEM-bilder og EDX-kart over overflateelementsammensetning for MgO-belagt Mg., ikke-belagt Mg-kontroll og glassreferanse. (B) Overflateelementsammensetning (at. %) kvantifisert fra EDX-analyser. Skalastenger = 200 μm. Gjengitt fra 34. Forkortelser: BMSCs = benmargsavledede mesenchymale stamceller; SEM = skanning elektronmikroskopi; EDX = energidispergerings-røntgenspektroskopi. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende tabell 1: Nedbrytningsmekanismer, produkter og priser for ulike typer materialer, og resultatene som samles inn for postkulturprøven og mediumanalysen. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ulike cellekulturmetoder kan brukes til å evaluere in vitro cytokompatibilitet av biomaterialer av interesse for ulike aspekter av anvendelser in vivo. Denne artikkelen demonstrerer tre in vitrokulturmetoder , det vil si direkte kultur, direkte eksponeringskultur og eksponeringskultur, for å etterligne forskjellige in vivo-scenarier der biologisk nedbrytbare implantatmaterialer brukes inne i menneskekroppen. Den direkte kulturmetoden brukes hovedsakelig til å evaluere oppførselen til nylig frøceller som er direkte tilhenger av og rundt implantatmaterialene. Den direkte eksponeringskulturmetoden etterligner in vivo-scenariet der implantatmaterialene kommer i direkte kontakt med de etablerte cellene og vevene. Eksponeringskulturmetoden kan brukes til å vise hvordan nedbrytningsproduktene fra implantatmaterialene og endringene i det lokale mikromiljøet kan påvirke de etablerte cellene og vevene som ikke er direkte i kontakt med implantatmaterialene.
I den direkte kulturen evalueres de nyseedede cellene under både direkte og indirekte kontaktforhold. I den direkte eksponeringskulturen kan etablerte celler evalueres under både direkte og indirekte kontaktforhold. I eksponeringskulturen kan bare etablerte celler under indirekte kontaktforhold evalueres. De nylig frøede cellene under direkte kontaktforhold i den direkte kulturen påvirkes av materielle egenskaper og materialinduserte endringer i medium som endringene i ionkonsentrasjon og pH-verdi.
De ovennevnte materialegenskapene kan omfatte overflatemorfologi, hydrofilisitet, overflatefri energi, stivhet og sammensetning. De nyseedede cellene under indirekte kontaktforhold i den direkte kulturmetoden og alle de etablerte cellene i den direkte eksponeringskulturen og eksponeringskulturmetodene påvirkes hovedsakelig av materialinduserte endringer i mediet. De tre forskjellige metodene som er beskrevet i denne artikkelen, er nærmere det praktiske scenariet for in vivo-miljøet enn konvensjonelle metoder som medium ekstraktmetoden. Medium ekstraktmetoden evaluerer bare cytotoksisiteten til materialets nedbrytningsprodukter og gjenspeiler ikke den dynamiske prosessen med prøveforringelse. I kulturmetodene som er beskrevet i denne artikkelen, da cellene dyrkes med implantatmaterialene, kan den dynamiske endringen av de biologisk nedbrytbare materialene og middels miljø påvirke cellene in situ.
Selv om ingen in vitro-studier helt kan erstatte in vivo-studier , er in vitro-studier komplementære og kan gi verdifulle data på en rimelig og effektiv måte. In vivo-studier inkluderer vanligvis alle flere variabler i en modell, mens in vitro-cellekultur kan studere effekten av en enkelt faktor på cellematerialeinteraksjoner. Metodene introdusert i denne artikkelen kan etterligne forskjellige scenarier av de relevante in vivo-studiene . Vi kan skape koblinger mellom ulike variabler for å gi kosttilskudd til in vivo-studier . En in vivo-modell inkluderer vanligvis bare det samme vevet i en dyretype. In vitro-studier kan imidlertid omfatte forskjellige celletyper i en kultur, som kan studere de kombinerte effektene av forskjellige variabler på cellematerialeinteraksjoner. Videre er det relativt vanskelig å studere effekten av dynamiske miljøendringer på cellematerialeinteraksjoner i in vivo-modeller . Metodene beskrevet i denne artikkelen kan undersøke effekten av dynamiske endringer som ionkonsentrasjoner i mediet på celleadferd38.
Metodene som presenteres i denne artikkelen gjelder for å forstå in vitro cytokompatibilitet av alle typer materialer, inkludert polymerer, metaller, keramikk, kompositter og nanopartikler, og bestemme deres interaksjoner med forskjellige celler, bakterier eller sopp basert på de tiltenkte applikasjonene. For eksempel evaluerte Xu et al. in vitro cytokompatibiliteten til HyA-baserte hydrogeler med BMSCer via den direkte eksponeringskulturmetoden33. Celleadhesjonstettheter og cellemorfologier ble analysert under direkte og indirekte kontaktforhold. Cytotoksisiteten til HyA-baserte hydrogelkompositter kan være relatert til konsentrasjonene av Fe3+ og H + ioner frigjort fra de krysskoblede HyA-hydrogelene under cellekultureksperimentet. Tian et al. humane urotelceller (HUCer) med fire forskjellige Mg-legeringer i 24 timer og 48 timer ved hjelp av eksponeringskulturmetoden og deres uoppløselige nedbrytningsprodukter fra MgO og Mg(OH)2 i 24 timer ved hjelp av direkte eksponeringskultur for å undersøke cytokompatibilitet og nedbrytningsatferd i Mg-legeringer som inneholder sink (Zn) og strontium (Sr) for potensiell ureteral stentapplikasjon. . I denne studien ble ZSr41_B som inneholder 4 wt% Zn og 0,5 wt% Sr funnet å ha bedre cytokompatibilitet med HUCer blant alle de andre Mg-4Zn-xSr-legeringene i både 24 timer og 48 h eksponeringskulturer. Resultatene viste også at det ikke ble funnet synlige tilhengerceller på brønnplaten da konsentrasjonene av magnesiumoksid (MgO) og magnesiumhydroksid (Mg(OH)2) oversteg 1,0 mg/ml etter 24 timer direkte eksponeringskultur. Derfor konkluderte Tian et al. med at reduksjon av nedbrytningsgraden av Mg legeringer er nødvendig for å kontrollere mulige bivirkninger mot fremtidig klinisk oversettelse. Wetteland et al. skapte en polymerbasert nanokompositt ved å spre hydroksyapatitt (nHA) og nMgO nanopartikler i en biologisk nedbrytbar PLGA polymer40. Denne nanokompositten ble studert ved å dyrke BMSC-er med forskjellige prøver ved hjelp av den direkte kulturmetoden. Resultatene viste at forbedret spredning av nanopartikler i polymeren kunne forbedre BMSC-vedheft på nHA/PLGA, men redusere celle levedyktigheten på nMgO/PLGA. Basert på resultatene fra in vitro-cellestudier rapporterte Wetteland et al. verdifull innsikt for prosjektering av optimale keramiske/polymer nanokompositter for ulike biomedisinske anvendelser.
Cellemorfologier og celletall kan observeres og kvantifiseres i fluorescensbilder ved hjelp av programvare for kvantitativ bildeanalyse som ImageJ. Vi kan undersøke effekten av ulike materialer på celleadhesjon og morfologi ved å kvantifisere celleadhesjonstetthetene, celleproporsjonene og cellespredningsområdene for forskjellige utvalgsgrupper. Morfologien til celler fra den tomme kontrollgruppen, der bare cellene dyrkes i middels, kan fungere som en referansestandard uten påvirkning fra prøvematerialer. Vi kan avgjøre om prøvematerialene vil påvirke celleadhesjon og morfologi in vitro ved å sammenligne celleadhesjonstetthetene og cellemorfologiene til eksempelgruppene med de tomme kontrollene. Cellespredningsområdet viser preferansen for celleadhesjon til prøveoverflaten, og viser hvordan cellene samhandler med prøvematerialene. I denne artikkelen reduserte vi reaksjonstiden for DAPI-farging til å være mindre enn den leverandør anbefalte optimale tiden fordi biologisk nedbrytbare prøver, for eksempel rent magnesium, forringes raskt i vandige løsninger. Morfologien til celler som følges av de biologisk nedbrytbare materialene, kan endres hvis fargingsprosessen tar for lang tid og vanneksponeringstiden er for lang for prøvene. Videre, for cellene som følges av biologisk nedbrytbare materialer, bør cellebilder tas omgående for å redusere eventuelle endringer i celleadhesjon og morfologi på grunn av prøveforringelse.
I tillegg til å samle inn resultater fra celler, er postkulturmedium og prøveanalyser viktige fordi de vil gi verdifulle data for å analysere nedbrytningsmekanismen, produktene og frekvensene til implantatmaterialene. For eksempel kan biologisk nedbrytbare polymerer som PLGA generere sure nedbrytningsbiprodukter som monomeriske eller oligomeriske hydroksylkarboksylsyrer under cellekulturen32, noe som kan påvirke cellevekst og spredning. I motsetning produserer biologisk nedbrytbare metaller, som magnesium og legeringer, hydroksydioner og hydrogengass under nedbrytningen31, noe som kan øke den lokale pH betydelig, og alvorlig alkalitet kan ha negative effekter på lokale cellefunksjoner. Ulike biologisk nedbrytbare keramikk kan også øke pH i medium41. Generelt krever celler et bestemt pH-område i kulturmedium for å fungere ordentlig, og det er kjent at økte eller reduserte pH-verdier i kroppsvæsker er skadelige for livet42. Måling av pH for postkulturmedium er verdifullt for å forstå potensiell skade som biologisk nedbrytbare prøvematerialer kan forårsake i cellekulturen. Derfor er det nødvendig å måle pH-verdien til postkulturmediet for å forstå de potensielle mekanismene for hvordan disse biologisk nedbrytbare materialene påvirker celler.
Det er viktig å måle de avgjørende ionkonsentrasjonene i postkulturmediet for biologisk nedbrytbare materialer. For eksempel målte Cortez Alcaraz et al. Konsentrasjonene mg2+ og ca2+ ion i postkulturmediet da de studerte nanopartikkelbelagte magnesiumprøver av magnesiumoksid ved hjelp av direkte kultur med BMSCs34. Konsentrasjonene av magnesiumioner indikerer nedbrytningsegenskapene til forskjellige prøver in vitro under cellekulturen, og konsentrasjonene av kalsiumioner kan gi informasjon om kalsiumavsetning under celleproliferasjon. Xu et al. målte Fe3+ ionkonsentrasjoner av postkulturmediet da de studerte HyA-hydrogeler ved hjelp av direkte eksponeringskultur med BMSCer. De brukte Fe3+ ioner for å justere krysskoblingstetthetene til HyA33. Fe3+ ioner kan redusere pH-verdien til kulturmediet, og høye konsentrasjoner av Fe3+ ioner kan være giftige for cellene. Derfor er det viktig å måle konsentrasjonene av ionene av interesse for å forbedre cytokompatibiliteten til biologisk nedbrytbare materialer og deres tilhørende nedbrytningsprodukter.
Vi kan samle inn forskjellige data for å analysere cellematerialeinteraksjonene for forskjellige materialer. Som vist i tilleggstabell 1 forringes for eksempel Mg-legeringer ved å reagere med vann, og nedbrytningsproduktene kan omfatte Mg2+ og OH-ioner, H2-gass og noen andre uoppløselige nedbrytningsprodukter som Mg(OH)2. XRD, SEM og EDX, som kan brukes til å bestemme mineralavsetningen som dannes på materialet. Vi kan studere effekten av konsentrasjon av Mg2+ ioner og pH-verdier i medium på celleatferden. Videre kan vi bruke disse resultatene til å studere gassutviklingen under metallforringelse. In vitro-studier har rapportert at det kritiske toleransenivået for H2-gass er <0,01 ml/cm2/dag, og dette har blitt mye brukt til å screene magnesiumlegeringer for midlertidige implantatapplikasjoner. I hovedsak er mengden gassutvikling avhengig av nedbrytningshastigheten til magnesiumlegeringer. I et annet eksempel forringes PLGA på grunn av hydrolysen av esterforbindelsene i nærvær av vann. Nedbrytningsproduktene av melkesyre og glykolsyre, samt pH-verdiene i mediet, kan studeres for å analysere cellematerialeinteraksjoner. Metodene beskrevet i denne artikkelen inkluderer måling av frigjorte ioner og pH-verdiene i cellekulturmediet og masseendringen av materialene, som kan brukes til å estimere materialenes nedbrytningshastighet.
Ulike materialer oppfører seg vanligvis annerledes in vitro og in vivo, og metodene for cytokompatibilitetsstudier bør velges basert på applikasjonsmiljø og materialtype. For ortopediske anvendelser er det ønskelig å evaluere samspillet mellom de relevante beincellene og implantatene når de er i direkte kontakt med hverandre. Den direkte kulturmetoden kan brukes til å undersøke samspillet mellom de nylig frøcellene og implantatet. I kardiovaskulære applikasjoner, da de etablerte cellene direkte eller indirekte vil komme i kontakt med de implanterte stentmaterialene, kan direkte eksponeringskultur og eksponeringskulturmetoder brukes til å evaluere cytokompatibiliteten til biologisk nedbrytbare metaller for kardiovaskulære applikasjoner. Vi mener at in vitro-metodene beskrevet i denne artikkelen er mulige for å gi innledende bevis for cytokompatibilitet av biologisk nedbrytbare implantatmaterialer. Kulturmetodene må modifiseres for ulike materialer med varierte nedbrytningsmekanismer, produkter og priser. For eksempel kan dyrkingstiden for forskjellige materialer endres basert på varierte nedbrytningshastigheter av forskjellige materialtyper. Ulike resultater kan samles inn basert på forskjellige nedbrytningsmekanismer og produkter av materialene.
Oppsummert er det viktig å analysere cellene, mediet og prøvematerialene kvalitativt og kvantitativt, før og etter in vitro-cellekultur , for å forstå effekten av biologisk nedbrytbare implantatmaterialer og deres nedbrytningsprodukter på cytokompatibilitet. De tre kulturmetodene som presenteres i denne artikkelen kan brukes til å studere et bredt spekter av biologisk nedbrytbare materialer, inkludert biologisk nedbrytbare polymerer, keramikk og metaller for medisinske implantat- og vevsteknikkapplikasjoner. Disse in vitro-cellestudiene er verdifulle for screening av biologisk nedbrytbare materialer, optimalisering av utformingen av implanterbare enheter og stillaser i det tidlige stadiet av produktutviklingen, og reduserer potensiell toksisitet for celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Forfatterne setter pris på den økonomiske støtten fra U.S. National Science Foundation (NSF CBET award 1512764 og NSF PIRE 1545852), National Institutes of Health (NIH NIDCR 1R03DE028631), University of California (UC) Regents Faculty Development Fellowship, og Committee on Research Seed Grant (Huinan Liu) og UC-Riverside Dissertation Research Grant (Jiajia Lin). Forfatterne setter pris på Central Facility for Advanced Microscopy and Microanalysis (CFAMM) ved UC-Riverside for bruk av SEM/EDS og Dr. Perry Cheung for bruk av XRD-instrumenter. Forfatterne setter også pris på Thanh Vy Nguyen og Queenie Xu for delvis redigering. Forfatterne vil også takke Cindy Lee for å ha spilt inn fortellingen for videoen. Eventuelle meninger, funn og konklusjoner, eller anbefalinger uttrykt i denne artikkelen, er forfatternes og gjenspeiler ikke nødvendigvis synspunktene til National Science Foundation eller National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL serological pipette | VWR | 490019-704 | |
| 12-well tissue-culture-treated plates | Thermo Fisher Scientific | 353043 | |
| 15 mL conical tube (Polypropylene) | VWR | 89039-666 | |
| 18 G needle | BD | 305196 | |
| 25½ G needle | BD | 305122 | |
| 4′,6-diamidino-2- phenylindole dilactate (DAPI) | Invitrogen | D3571 | |
| 50 mL conical tube (Polypropylene) | VWR | 89039-658 | |
| 70 μm nylon strainer | Fisher Scientific | 50-105-0135 | |
| Alexa Flour 488-phalloidin | Life technologies | A12379 | |
| Biological safety cabinet | LABCONCO | Class II, Type A2 | |
| Centrifuge | Eppendorf | Rotor F-35-6-30, Centrifuge5430 | |
| Clear Fused Quartz Round Dish | AdValue Technology | FQ-4085 | |
| CO2 incubator | SANYO | MCO-19AIC | |
| CoolCell Freezer Container | Corning | 432000 | foam container designed to regulate temperature decrease |
| Cryovial | Thermo Fisher Scientific | 5000-1020 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| EDX analysis software | Oxford Instruments | AztecSynergy | |
| Energy dispersive X-ray spectroscopy (EDX) | FEI | 50mm2 X-Max50 SDD | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific Inc. | SH30910 | |
| Fluorescence microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Formaldehyde | VWR | 100496-496 | |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 3520 | |
| ImageJ software | National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation (LOCI, University of Wisconsin) | ||
| Inductively coupled plasma optical emission spectrometry (ICP-OES) |
PerkinElmer | Optima 8000 | |
| Optical microscope | VWR | VistaVision | |
| Penicillin/streptomycin (P/S) | Thermo Fisher Scientific, Inc., | 15070063 | |
| pH meter | VWR | model SB70P | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | VWR | 97062-730 | |
| Scanning electronic microscope (SEM) | FEI | Nova NanoSEM 450 | |
| surgical blade | VWR | 76353-728 | |
| Tissue Culture Flasks | VWR | T-75, MSPP-90076 | |
| Transwell inserts | Corning | 3460 | |
| Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid solution (Trypsin-EDTA) | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| X-ray diffraction instrument (XRD) | PANalytical | Empyrean Series 2 |
References
- Zhang, C., et al. Antimicrobial bioresorbable Mg-Zn-Ca alloy for bone repair in a comparison study with Mg-Zn-Sr Alloy and pure Mg. ACS Biomaterials Science & Engineering. 6 (1), 517-538 (2019).
- Xu, C., et al. A green biocompatible fabrication of highly porous functional ceramics with high strength and controllable pore structures. Journal of Materials Science & Technology. 32 (8), 729-732 (2016).
- Asgari, M., et al. Biodegradable metallic wires in dental and orthopedic applications: a review. Metals. 8 (4), 212 (2018).
- Shi, Y., Liu, J., Yu, L., Zhong, L. Z., Jiang, H. B. β-TCP scaffold coated with PCL as biodegradable materials for dental applications. Ceramics International. 44 (13), 15086-15091 (2018).
- Wu, C. -C., et al. A self-reinforcing biodegradable implant made of poly (ɛ-caprolactone)/calcium phosphate ceramic composite for craniomaxillofacial fracture fixation. Journal of Cranio-Maxillofacial Surgery. 44 (9), 1333-1341 (2016).
- Jiang, W., et al. In vitro evaluation of MgSr and MgCaSr alloys via direct culture with bone marrow derived mesenchymal stem cells. Acta Biomaterialia. 72, 407-423 (2018).
- Zhang, C., et al. Magnesium-based biodegradable microelectrodes for neural recording. Materials Science and Engineering: C. 110, 110614 (2020).
- Jia, B., et al. In vitro and in vivo studies of Zn-Mn biodegradable metals designed for orthopedic applications. Acta Biomaterialia. 108, 358-372 (2020).
- Yang, H., et al. Alloying design of biodegradable zinc as promising bone implants for load-bearing applications. Nature Communications. 11 (1), 1-16 (2020).
- Liu, H., et al. Injectable, biomechanically robust, biodegradable and osseointegrative bone cement for percutaneous kyphoplasty and vertebroplasty. International Orthopaedics. 42 (1), 125-132 (2018).
- Anjum, S., Arora, A., Alam, M., Gupta, B. Development of antimicrobial and scar preventive chitosan hydrogel wound dressings. International Journal of Pharmaceutics. 508 (1-2), 92-101 (2016).
- Barroca, N., et al. Electrically polarized PLLA nanofibers as neural tissue engineering scaffolds with improved neuritogenesis. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 167, 93-103 (2018).
- Liu, Y., et al. Polydopamine-modified poly (l-lactic acid) nanofiber scaffolds immobilized with an osteogenic growth peptide for bone tissue regeneration. RSC Advances. 9 (21), 11722-11736 (2019).
- Liu, H., Webster, T. J. Enhanced biological and mechanical properties of well-dispersed nanophase ceramics in polymer composites: from 2D to 3D printed structures. Materials Science and Engineering: C. 31 (2), 77-89 (2011).
- Xu, C., et al. Bioinspired mechano-sensitive macroporous ceramic sponge for logical drug and cell delivery. Advanced Science. 4 (6), 1600410 (2017).
- Xu, C., Bai, Y., Yang, H., Yang, L. Mechanically modulated, ultra-high precision logic delivery of molecules by bio-inspired macroporous ceramic sponge. MRS Advances. 2 (19-20), 1125-1130 (2017).
- Zhang, N., Xu, C., Azer, A., Liu, H. Dispersibility and characterization of polyvinyl alcohol-coated magnetic nanoparticles in poly (glycerol sebacate) for biomedical applications. Journal of Nanoparticle Research. 21 (12), 1-11 (2019).
- Kim, S. S., et al. A poly (lactide-co-glycolide)/hydroxyapatite composite scaffold with enhanced osteoconductivity. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 80 (1), 206-215 (2007).
- Cipriano, A. F., et al. Degradation of bioresorbable Mg-4Zn-1Sr intramedullary pins and associated biological responses in vitro and in vivo. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (51), 44332-44355 (2017).
- Surmeneva, M. A., et al. Bone marrow derived mesenchymal stem cell response to the RF magnetron sputter deposited hydroxyapatite coating on AZ91 magnesium alloy. Materials Chemistry and Physics. 221, 89-98 (2019).
- Sheikh, Z., et al. Mechanisms of in vivo degradation and resorption of calcium phosphate based biomaterials. Materials. 8 (11), 7913-7925 (2015).
- Klein, C., Driessen, A., De Groot, K., Van den Hooff, A. Biodegradation behavior of various calcium phosphate materials in bone tissue. Journal of Biomedical Materials Research. 17 (5), 769-784 (1983).
- Lanao, R. P. F., Leeuwenburgh, S. C., Wolke, J. G., Jansen, J. A. Bone response to fast-degrading, injectable calcium phosphate cements containing PLGA microparticles. Biomaterials. 32 (34), 8839-8847 (2011).
- Vey, E., et al. Degradation kinetics of poly (lactic-co-glycolic) acid block copolymer cast films in phosphate buffer solution as revealed by infrared and Raman spectroscopies. Polymer Degradation and Stability. 96 (10), 1882-1889 (2011).
- Standard, I. Biological evaluation of medical devices-Part 5: Tests for in vitro cytotoxicity. Geneve, Switzerland: International Organization for Standardization. , (2009).
- Liu, X., Zhou, W., Wu, Y., Cheng, Y., Zheng, Y. Effect of sterilization process on surface characteristics and biocompatibility of pure Mg and MgCa alloys. Materials Science and Engineering: C. 33 (7), 4144-4154 (2013).
- Liu, H., Yazici, H., Ergun, C., Webster, T. J., Bermek, H. An in vitro evaluation of the Ca/P ratio for the cytocompatibility of nano-to-micron particulate calcium phosphates for bone regeneration. Acta Biomaterialia. 4 (5), 1472-1479 (2008).
- Liu, H., et al. Enhancing effects of radiopaque agent BaSO4 on mechanical and biocompatibility properties of injectable calcium phosphate composite cement. Materials Science and Engineering: C. 116, 110904 (2020).
- Xu, C., et al. A versatile three-dimensional foam fabrication strategy for soft and hard tissue engineering. Biomedical Materials. 13 (2), 025018 (2018).
- Speranza, V., Sorrentino, A., De Santis, F., Pantani, R. Characterization of the polycaprolactone melt crystallization: complementary optical microscopy, DSC, and AFM studies. The Scientific World Journal. , 720157 (2014).
- Cipriano, A. F., et al. Anodization of magnesium for biomedical applications-Processing, characterization, degradation and cytocompatibility. Acta Biomaterialia. 62, 397-417 (2017).
- Li, H., Chang, J. pH-compensation effect of bioactive inorganic fillers on the degradation of PLGA. Composites science and technology. 65 (14), 2226-2232 (2005).
- Xu, C., Hung, C., Cao, Y., Liu, H. H. Tunable crosslinking, reversible phase transition, and 3D printing of hyaluronic acid hydrogels via dynamic coordination of innate carboxyl groups and metallic ions. ACS Applied Bio Materials. 4 (3), 2408-2428 (2021).
- Cortez Alcaraz, M. C., et al. Electrophoretic deposition of magnesium oxide nanoparticles on magnesium: processing parameters, microstructures, degradation, and cytocompatibility. ACS Applied Bio Materials. 2 (12), 5634-5652 (2019).
- Rutherford, D., et al. Synthesis, characterization, and cytocompatibility of yttria stabilized zirconia nanopowders for creating a window to the brain. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 108 (3), 925-938 (2020).
- Tian, Q., Deo, M., Rivera-Castaneda, L., Liu, H. Cytocompatibility of magnesium alloys with human urothelial cells: a comparison of three culture methodologies. ACS Biomaterials Science & Engineering. 2 (9), 1559-1571 (2016).
- Nguyen, T., Cipriano, A., Guan, R. G., Zhao, Z. Y., Liu, H. In vitro interactions of blood, platelet, and fibroblast with biodegradable magnesium-zinc-strontium alloys. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (9), 2974-2986 (2015).
- Jiang, W., Lin, J., Chen, A. H., Pan, J., Liu, H. A portable device for studying the effects of fluid flow on degradation properties of biomaterials inside cell incubators. Regenerative Biomaterials. 6 (1), 39-48 (2019).
- Tian, Q., et al. Responses of human urothelial cells to magnesium-zinc-strontium alloys and associated insoluble degradation products for urological stent applications. Materials Science and Engineering: C. 96, 248-262 (2019).
- Wetteland, C. L., Liu, H. Optical and biological properties of polymer-based nanocomposites with improved dispersion of ceramic nanoparticles. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 106 (10), 2692-2707 (2018).
- Wetteland, C. L., Nguyen, N. -Y. T., Liu, H. Concentration-dependent behaviors of bone marrow derived mesenchymal stem cells and infectious bacteria toward magnesium oxide nanoparticles. Acta Biomaterialia. 35, 341-356 (2016).
- Aoi, W., Marunaka, Y. The importance of regulation of body fluid pH in the development and progression of metabolic diseases. Advances in Medicine and Biology. 77, 177-189 (2014).
- Wang, H. Hydroxyapatite degradation and biocompatibility. , The Ohio State University. (2004).
