Summary
यहां, हम पॉलीग्लूटामाइन एकत्रीकरण, न्यूरोनल मृत्यु और केमोएवॉयडेंस व्यवहार के साथ-साथ कई फेनोटाइप्स के अनुकरणीय एकीकरण सहित कैनोरहाब्डिटिस एलिगेंस में परीक्षण यौगिकों की न्यूरोप्रोटेक्टिव गतिविधियों का आकलन करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।
Abstract
रोगजनक प्रोटीन की उम्र से संबंधित मिसफोल्डिंग और एकत्रीकरण कई न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों के लिए जिम्मेदार हैं। उदाहरण के लिए, हंटिंगटन रोग (एचडी) मुख्य रूप से एक सीएजी न्यूक्लियोटाइड रिपीट द्वारा संचालित होता है जो हंटिंगटिन प्रोटीन में एक विस्तारित ग्लूटामाइन पथ को एन्कोड करता है। इस प्रकार, पॉलीग्लूटामाइन (पॉलीक्यू) एकत्रीकरण का निषेध और, विशेष रूप से, एकत्रीकरण से जुड़े न्यूरोटॉक्सिसिटी एचडी और अन्य पॉलीक्यू से जुड़ी स्थितियों की रोकथाम के लिए एक उपयोगी रणनीति है। यह पेपर स्थापित पॉलीक्यू ट्रांसजेनिक कैनोरहाब्डाइटिस एलिगेंस मॉडल का उपयोग करके एचडी के खिलाफ परीक्षण यौगिकों की न्यूरोप्रोटेक्टिव क्षमता का आकलन करने के लिए सामान्यीकृत प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल का परिचय देता है। एएम 141 तनाव को पॉलीक्यू एकत्रीकरण परख के लिए चुना जाता है क्योंकि असतत फ्लोरोसेंट समुच्चय के आयु से जुड़े फेनोटाइप को पॉलीक्यू की मांसपेशियों की विशिष्ट अभिव्यक्ति के कारण वयस्क चरण में अपने शरीर की दीवार में आसानी से देखा जा सकता है:: वाईएफपी संलयन प्रोटीन। इसके विपरीत, एएसएच न्यूरॉन्स में पॉलीक्यू-विस्तारित ट्रैक्ट्स की मजबूत अभिव्यक्ति के साथ एचए 759 मॉडल का उपयोग न्यूरोनल मृत्यु और केमोएवॉइडेंस व्यवहार की जांच करने के लिए किया जाता है। लक्ष्य यौगिकों की न्यूरोप्रोटेक्टिव क्षमता का व्यापक रूप से मूल्यांकन करने के लिए, उपरोक्त परीक्षण परिणाम अंततः प्रत्यक्ष तुलना और प्रत्यक्ष देखने के तरीके से कई फेनोटाइप की प्रोफाइलिंग के साथ एक रडार चार्ट के रूप में प्रस्तुत किए जाते हैं।
Introduction
एचडी में प्रगतिशील न्यूरोडीजेनेरेशन में सीएजी ट्राइन्यूक्लियोटाइड द्वारा एन्कोडेड पॉलीक्यू के असामान्य खिंचाव के साथ रोगजनक उत्परिवर्ती हंटिंगटिन शामिल है। 37 से अधिक ग्लूटामाइन दोहराव वाले उत्परिवर्ती हंटिंगटिन प्रोटीन एचडी रोगियों और पशु मॉडल 4,5 के दिमाग में एकत्रित और जमा होने के लिए प्रवण होते हैं, जो अंततः न्यूरोडीजेनेरेशन6 की ओर जाता है। रोग विकृति 5 में पॉलीक्यू समुच्चय की भूमिकाओं पर स्पष्टता की कमी के बावजूद, पॉलीक्यू एकत्रीकरण औरइससे संबंधित विषाक्तता का निषेध एचडी और अन्य पॉलीक्यू रोगों 4,7,8 के लिए एक उपयोगी चिकित्सीय रणनीति है।
न्यूरोनल सिग्नलिंग मार्गों और आसानी से निर्माण करने वाले ट्रांसजेनिक रोग मॉडल में संरक्षण के कारण, केनोरहाब्डाइटिस एलिगेंस का व्यापक रूप से न्यूरोलॉजिकल विकारों 9,10,11,12 की जांच के लिए एक प्रमुख मॉडल जीव के रूप में उपयोग किया गया है। उदाहरण के लिए, एकत्रीकरण-प्रवण पॉलीक्यू विस्तार व्यक्त करने वाले ट्रांसजेनिक सी एलिगेंस मॉडल निष्पक्ष रूप से एचडी जैसी विशेषताओं की नकल कर सकते हैं जैसे चयनात्मक न्यूरोनल सेल हानि, साइटोप्लाज्मिक कुल गठन और व्यवहार दोष13. स्थापित पॉलीक्यू नेमाटोड मॉडल में इन फेनोटाइप्स को उलटने के लिए परीक्षण नमूनों के संभावित प्रभावों की जांच ने विभिन्न प्रकार के होनहार चिकित्सीय उम्मीदवारों की पहचान की है, उदाहरण के लिए, पॉलीसेकेराइड 7,14,15, ओलिगोसेकेराइड16, प्राकृतिक छोटे अणु17,18, और हर्बल अर्क और सूत्र19,20।
एलिगेंस मॉडल और संभावित अनुप्रयोगों के लिए प्रासंगिक प्रोटोकॉल हैं, जैसा कि एस्ट्रागलन पर अध्ययन द्वारा उदाहरण दिया गया है, एस्ट्रागलस मेम्ब्रानेसियस7 से पृथक एक पॉलीसेकेराइड। सी एलिगेंस में पॉलीक्यू एकत्रीकरण परख के लिए, इस्तेमाल किया गया मॉडल ट्रांसजेनिक तनाव एएम 141 है, जो क्यू 40 की अभिव्यक्ति के कारण वयस्कता तक पहुंचने पर अपने शरीर की दीवार की मांसपेशियों में फ्लोरोसेंट पंक्टा को दिखाता है: : वाईएफपी संलयन प्रोटीन, 40 अवशेषों का एक पॉलीक्यू पथ (पॉलीक्यू 40) पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (वाईएफपी) 21,22 से जुड़ा हुआ है . तनाव एचए 75 9 का उपयोग न्यूरोनल अस्तित्व और कीमोएवॉइडेंस व्यवहार की जांच करने के लिए किया गया था क्योंकि यह एएसएच न्यूरॉन्स में दृढ़ता से हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) और एचटीएन-क्यू 150 (150 अवशेषों का एक मानव हंटिंगटिन-व्युत्पन्न पॉलीक्यू ट्रैक्ट) दोनों को व्यक्त करता है, जिसके परिणामस्वरूप प्रगतिशील न्यूरोडीजेनेरेशन और एएसएच कोशिका मृत्यु 7,13 होती है। चिकित्सीय उम्मीदवारों की न्यूरोप्रोटेक्टिव क्षमता का एक व्यापक सारांश विभिन्न परखों से परिणामों को एकीकृत करके प्रदान किया जाता है।
Protocol
नोट: इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले समाधानों के व्यंजनों के लिए तालिका 1 देखें।
1. कैनोरहाब्डाइटिस एलिगेंस परख के लिए सामग्री की तैयारी
- सी एलिगेंस उपभेदों का रखरखाव
- एलिगेंस (एएम 141 और एचए 75 9) और एस्चेरिचिया कोलाई (ओपी 50 और एनए 22) उपभेदों (सामग्री की तालिका देखें) प्राप्त करें।
- नेमाटोड ग्रोथ मीडिया (एनजीएम) प्लेट पर नेमाटोड को बनाए रखें ई कोलाई ओपी 50 एएम 141 21 के लिए 20 डिग्री सेल्सियस या एचए 75923 के लिए 15 डिग्री सेल्सियस पर।
- ई कोलाई ओपी 50 जीवाणु संस्कृति की तैयारी
- लूरिया-बर्तानी (एलबी) लकीर प्लेट से ई कोलाई ओपी 50 की एक एकल कॉलोनी चुनें और इसे तरल एलबी संस्कृति के 50 मिलीलीटर में टीका लगाएं।
- 570 एनएम (आयुध डिपो 570) पर ~ 0.5 के ऑप्टिकल घनत्व तक 37 डिग्री सेल्सियस और 200 आरपीएम पर एक प्रकार के बरतन में ओपी50 बैक्टीरिया सेते हैं।
- ओपी 50 जीवाणु संस्कृति को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें और दो सप्ताह के भीतर इसका उपयोग करें।
- ओपी 50 बैक्टीरिया के साथ एनजीएम प्लेटों की तैयारी
- 1 एल आटोक्लेवेबल बोतल में 20 ग्राम अगर, 2.5 ग्राम पेप्टोन, 3.0 ग्राम एनएसीएल और 975 मिलीलीटर विआयनीकृत पानी जोड़ें। 30 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर आटोक्लेव।
- ~ 60 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करने के लिए बेंच पर तरल एनजीएम अगर की बोतल रखें, और फिर निम्नलिखित बाँझ स्टॉक समाधान जोड़ें: 1 एम सीएसीएल2 का 1 एमएल, 1 एमजीएसओ4 का 1 एमएल, 5 मिलीग्राम / एमएल कोलेस्ट्रॉल का 1 एमएल, और 1 एम पोटेशियम फॉस्फेट (पीएच 6.0) का 25 एमएल।
- एक बाँझ 90 मिमी पेट्री डिश में एनजीएम के 20 मिलीलीटर डालो, और प्लेटों को ठंडा और जमने के लिए बेंच पर छोड़ दें। प्लेटों को उल्टा रखें और उन्हें 2 दिनों के लिए कमरे के तापमान पर बेंच पर सूखने दें।
- प्रत्येक एनजीएम प्लेट पर ओपी 50 जीवाणु संस्कृति के 200 μL वितरित करें और एक बाँझ ग्लास कोटिंग रॉड के साथ समान रूप से फैलाएं। ढक्कन बंद करें और 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर प्लेटों सेते हैं।
- कमरे के तापमान पर एक कवर के साथ एक प्लास्टिक बॉक्स में ओपी 50 के साथ वरीयता प्राप्त एनजीएम प्लेटों को स्टोर करें और दो सप्ताह के भीतर उपयोग करें।
- आयु-सिंक्रनाइज़ सी एलिगेंस आबादी की तैयारी
- 1 मिनट के लिए 1000 × ग्राम पर एक बाँझ 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब और अपकेंद्रित्र में ग्रेविड वयस्क नेमाटोड ले लीजिए। तीन बार धोएं और एम 9 बफर में नेमाटोड को फिर से निलंबित करें।
- ब्लीच समाधान की एक समान मात्रा जोड़ें और 3-5 मिनट के लिए धीरे आंदोलन। एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत हर 15 एस विरंजन की निगरानी करें।
नोट: ब्लीच समाधान 10% एनएओसीएल और 1 एम एनएओएच (तालिका 1) 20 के बराबर मात्रा में मिश्रण करके उपयोग करने से पहले हौसले से तैयार किया जाना चाहिए। - एक बार जब अधिकांश नेमाटोड टूट जाते हैं, तो एम 9 बफर के साथ पतला करके पाचन को रोक दें। सतह पर तैरनेवाला को हटाने के लिए जल्दी से अपकेंद्रित्र और तीन बार धोने को दोहराने के लिए एम 9 बफर में गोली को फिर से निलंबित करें।
- एस माध्यम में गोली को फिर से निलंबित करें। नेमाटोड अवशेषों को 2-3 मिनट के लिए गुरुत्वाकर्षण द्वारा व्यवस्थित होने दें, जबकि अंडे सतह पर तैरनेवाला में रहते हैं।
- सतह पर तैरनेवाला को एक नए बाँझ माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में एस्पिरेट करें। 1 मिनट के लिए 1000 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा अंडे ले लीजिए।
- सतह पर तैरनेवाला के ~ 80% त्यागें और अंडे को एस माध्यम के 20 मिलीलीटर युक्त बाँझ फ्लास्क में स्थानांतरित करें। एक प्रकार के बरतन में फ्लास्क रखें और सिंक्रनाइज़ एल 1 नेमाटोड प्राप्त करने के लिए 120 आरपीएम पर भोजन के बिना रात भर अंडे सेते हैं।
2. पॉलीक्यू एकत्रीकरण परख
- पॉलीक्यू एकत्रीकरण परख के लिए नेमाटोड की तैयारी
- एएम 141 के 300-500 सिंक्रनाइज़ एल 1 लार्वा को 48-अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं में स्थानांतरित करें, जिसमें ओपी 50 (0.7-0.8 का ओडी 570) और 5 मिलीग्राम /
- पैराफिल्म के साथ प्लेट सील करें और 24, 48, 72 और 96 घंटे के लिए 20 डिग्री सेल्सियस और 120 आरपीएम पर सेते हैं।
- एक बाँझ 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में नेमाटोड की कटाई करें और शेष ओपी 50 को हटाने के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन (1 मिनट के लिए 1000 × ग्राम ) द्वारा एम 9 बफर >3 बार धो लें। एम 9 बफर में एएम 141 नेमाटोड को फिर से निलंबित करें, और उन्हें छवि अधिग्रहण के लिए तैयार रखें।
- फ्लोरोसेंट छवियों और डेटा विश्लेषण का अधिग्रहण
नोट: डेटा स्वचालित रूप से इस उच्च सामग्री इमेजिंग प्रणाली के साथ विश्लेषण कर रहे हैं। यदि एक स्वचालित इमेजिंग डिवाइस उपलब्ध नहीं है, तो छवि अधिग्रहण के लिए एक एगरोज़ पैड तैयार करने के लिए एक पारंपरिक विधि का उपयोग एक सामान्य फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप 7,15,17 का उपयोग करके समान प्रदर्शन प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है (चरण 3.2 और 3.3 देखें)।- एक 384 अच्छी तरह से प्लेट (अंतिम मात्रा 80 μL प्रति अच्छी तरह से) में प्रत्येक अच्छी तरह से में 10-15 सूत्रकृमि स्थानांतरण। प्रत्येक उपचार के लिए 10 प्रतिकृति कुओं को सेट करें।
- नेमाटोड को पंगु बनाने के लिए प्रत्येक कुएं में 200 एमएम सोडियम एजाइड के 10 μL जोड़ें और उन्हें नीचे (5-10 मिनट) तक बसने की अनुमति दें।
- फ्लोरोसेंट छवियों को प्राप्त करने के लिए प्लेट को उच्च सामग्री इमेजिंग सिस्टम में रखें (डिवाइस और सॉफ़्टवेयर जानकारी के लिए सामग्री की तालिका देखें)।
- छवि अधिग्रहण सॉफ़्टवेयर खोलें और निम्न पैरामीटर सेट करें।
- प्लेट अधिग्रहण सेटअप विंडो खोलें और एक नया प्रयोग सेट और नाम बनाएँ।
- 2x के रूप में आवर्धन का चयन करें, 1 के रूप में कैमरा बिनिंग, और 384-अच्छी तरह से प्लेट के रूप में प्लेट प्रकार।
- कुओं और साइटों (एकल साइट) का दौरा करने के लिए सेट करें।
- फ्लोरोसिन आइसोथियोसाइनेट (एफआईटीसी) फिल्टर का चयन करें और छवि-आधारित फोकसिंग विकल्प सक्षम करें।
- एक्सपोजर को 300 एमएस के रूप में सेट करें।
नोट: उपरोक्त सेटिंग्स का परीक्षण किया जा सकता है और इमेजिंग मापदंडों को अनुकूलित करने के लिए समायोजित किया जा सकता है। - छवि अधिग्रहण सेटिंग्स सहेजें और चलाने के लिए प्लेट प्राप्त करें बटन पर क्लिक करें।
- छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके छवि डेटा का विश्लेषण करें।
- समीक्षा प्लेट डेटा विंडो खोलें और छवि विश्लेषण के लिए टेस्ट प्लेट का चयन करें।
- अपनी छवि प्रदर्शित करने के लिए एक परीक्षण पर डबल-क्लिक करें।
- विश्लेषण विधि के रूप में गिनती नाभिक का चयन करें और निम्नलिखित सेटिंग्स के लिए एक विंडो लाने के लिए सेटिंग्स कॉन्फ़िगर करें बटन पर क्लिक करें।
- एफआईटीसी चैनल से स्रोत छवि को परिभाषित करें और मानक एल्गोरिथ्म का चयन करें।
- छवि विश्लेषण पैरामीटर निम्नानुसार सेट करें: अनुमानित न्यूनतम चौड़ाई = 10 μm (= 2 पिक्सेल); अनुमानित अधिकतम चौड़ाई = 50 μm (= 12 पिक्सेल); स्थानीय पृष्ठभूमि के ऊपर तीव्रता = 1,000-2,000 ग्रेलेवल।
- विश्लेषण की विधि को अनुकूलित करने के लिए वर्तमान सेटिंग्स का परीक्षण करें।
- सेटिंग्स सहेजें और सभी कुओं पर विश्लेषण चलाएं।
नोट: एक 384-अच्छी तरह से प्लेट के लिए विश्लेषण समाप्त करने के लिए ~ 20 मिनट लगते हैं। - प्रत्येक कुएं में क्यू 40:: वाईएफपी समुच्चय की कुल संख्या के रूप में कुल नाभिक निर्यात करें।
- प्रत्येक कुएं में नेमाटोड की संख्या की गणना करें।
- प्रत्येक समूह में प्रति सूत्रकृमि क्यू 40:: वाईएफपी समुच्चय की औसत संख्या की गणना करें, और प्रत्येक समय बिंदु से डेटा के लिए एक नॉनलाइनियर वक्र फिट लागू करें।
- नीचे समीकरण (1) का उपयोग करके निषेध सूचकांक की गणना करें:
निषेध सूचकांक =
(1)
जहां एननियंत्रण और एननमूना क्रमशः नियंत्रण और उपचार समूहों में क्यू 40:: वाईएफपी समुच्चय की औसत संख्या है।
(1)3. पॉलीक्यू-मध्यस्थता न्यूरोटॉक्सिसिटी परख
- परीक्षण नमूनों के साथ सी एलिगेंस का उपचार
- पॉलीक्यू न्यूरोटॉक्सिसिटी परख के लिए नेमाटोड तैयार करने के लिए, एचए 759 के 300-500 सिंक्रनाइज़ एल 1 लार्वा को 48-अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं में स्थानांतरित करें, जिसमें ओपी50 (0.7-0.8 का ओडी 570) और एस्ट्रागलन के 5 मिलीग्राम /
- पैराफिल्म के साथ प्लेट सील करें और 3 दिनों के लिए 15 डिग्री सेल्सियस और 120 आरपीएम पर सेतेहैं।
- सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा नेमाटोड इकट्ठा करें और एम 9 बफर के साथ 3-5 बार धो लें। न्यूरोनल अस्तित्व और परिहार परख में उपयोग के लिए एम 9 बफर में नेमाटोड को फिर से निलंबित करें।
- एगरोज़ पैड की तैयारी
- एम 9 बफर (2%, डब्ल्यू / वी) के 100 एमएल में 2 ग्राम एगरोज़ जोड़ें और माइक्रोवेव में एगरोज़ समाधान को निकट-उबलते में गर्म करें।
- 2 मिमी मोटी ग्लास प्लेटों के दो टुकड़ों के बीच रखे गए 1 मिमी मोटी माइक्रोस्कोपी ग्लास स्लाइड के केंद्र पर पिघला हुआ एगरोज़ के 0.5 मिलीलीटर वितरित करें। लंबवत रूप से किसी अन्य स्लाइड के साथ कवर करें। एक बार जब एगरोज़ ठंडा हो जाता है और जम जाता है, तो धीरे-धीरे शीर्ष स्लाइड को हटा दें।
- एएसएच न्यूरोनल उत्तरजीविता परख
- एगरोज़ पैड पर 20 एमएम सोडियम एजाइड की एक बूंद जोड़ें। उन्हें स्थिर करने के लिए ड्रॉप में 15-20 एचए 759 नेमाटोड स्थानांतरित करें।
- नेमाटोड के ऊपर धीरे-धीरे एक कवरस्लिप रखें। एक डिजिटल कैमरे के साथ फिट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत स्लाइड रखें। नेमाटोड के सिर क्षेत्र में जीएफपी पॉजिटिव एएसएच न्यूरॉन्स का पता लगाने के लिए 40x उद्देश्य लेंस और एफआईटीसी फ़िल्टर का चयन करें।
- प्रत्येक समूह में 50 से अधिक नेमाटोड बेतरतीब ढंग से अपने सिर क्षेत्र में जीएफपी-लेबल द्विपक्षीय एएसएच न्यूरॉन्स के साथ नेमाटोड की संख्या की गणना करने के लिए चुनें। नीचे दिए गए ईक्यू (2) का उपयोग करके एएसएच न्यूरॉन्स की जीवित रहने की दर की गणना करें।
न्यूरोनल अस्तित्व (%) =
(2)
जहां एनउत्तरजीविता और एनकुल क्रमशः जीएफपी पॉजिटिव एएसएच न्यूरॉन्स के साथ नेमाटोड की संख्या और प्रत्येक समूह में परीक्षण किए गए नेमाटोड की कुल संख्या है।
- आसमाटिक परिहार परख
- बीच में 8 एम ग्लिसरॉल (~ 30 μL) लाइन द्वारा एक खाद्य मुक्त एनजीएम प्लेट (9 सेमी) को सामान्य (एन) और ट्रैप (टी) क्षेत्रों में विभाजित करें। ज़ोन टी में ग्लिसरॉल बाधा के माध्यम से पार करने वाले नेमाटोड को पंगु बनाने के लिए ग्लिसरॉल लाइन से ~ 1 सेमी दूर 200 एमएम सोडियम एजाइड (~ 20 μL) लाइन फैलाएं।
- प्रत्येक समूह के लिए तीन प्रतिकृति प्लेटों के ज़ोन एन पर ~ 200 नेमाटोड स्थानांतरित करें। नेमाटोड को आकर्षित करने के लिए ज़ोन टी (प्लेट किनारे से 1 सेमी) पर 1% ब्यूटेनडियोन (~ 2 μL) की एक बूंद जोड़ें। पेट्री डिश के ढक्कन को तुरंत कवर करें, और 90 मिनट के लिए 23 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
- एक माइक्रोस्कोप के तहत एन और टी क्षेत्रों पर नेमाटोड की संख्या स्कोर करें। समीकरण (3)20 का उपयोग करके परिहार सूचकांक की गणना कीजिए।
परिहार सूचकांक =
(3)
जहां एन और टी क्रमशः एन और टी क्षेत्रों में नेमाटोड की संख्या हैं। डेटा को तीन प्रतिकृतियों के मानक विचलन (एसडी) ± साधन के रूप में प्रस्तुत किया जाता है, >3 स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि। - एस्ट्रैगलन और नियंत्रण समूहों से डेटा की तुलना करने के लिए एक अप्रकाशित, दो-पूंछ वाला टी-टेस्ट करें।
(2)
(3)4. एक रडार चार्ट बनाना
- ग्राफिंग सॉफ़्टवेयर खोलें और विभिन्न परखों से डेटा को एक नई शीट में आयात करें। रेडियल अक्षों के शीर्षक के रूप में ए (एक्स) कॉलम, नियंत्रण समूह से डेटा के रूप में ए (वाई) कॉलम और उपचार समूह से डेटा के रूप में बी (वाई) कॉलम इनपुट करें।
- आवश्यक डेटा का चयन करें और प्लॉट | पर क्लिक करें विशेष: रडार चार्ट उत्पन्न करने के लिए टूलबार मेनू में रडार बटन।
- रेडियल अक्ष पर डबल-क्लिक करें और आवश्यकतानुसार प्रत्येक अक्ष के स्केल, टिक और टिक लेबल को समायोजित करें।
- मेनू में फ़ाइल पर क्लिक करें और छवि को * .tiff के रूप में सहेजने के लिए निर्यात रेखांकन का चयन करें।
नोट: सामग्री की तालिका में सॉफ्टवेयर वेबसाइटें रडार चार्ट बनाने पर विस्तृत सहायता दस्तावेज और वीडियो ट्यूटोरियल प्रदान करती हैं।
Representative Results
ट्रांसजेनिक पॉलीक्यू तनाव एएम 141 दृढ़ता से क्यू 40:: वाईएफपी संलयन प्रोटीन को अपने शरीर की दीवार की मांसपेशियों की कोशिकाओं 7,21 में व्यक्त करता है। जैसा कि चित्रा 1 ए में दिखाया गया है, इस तनाव के असतत कुल फेनोटाइप को इस लेख में वर्णित स्वचालित इमेजिंग और विश्लेषण प्रोटोकॉल द्वारा पहचाना जा सकता है। क्यू 40:: वाईएफपी समुच्चय की मात्रा एएम 141 नेमाटोड एल 1 चरण से 48 घंटे के बाद काफी बढ़ गई। हालांकि, वृद्धि की इस प्रवृत्ति को एस्ट्रैगलन उपचार (चित्रा 1 बी) द्वारा बाधित किया गया था, जो पॉलीक्यू एकत्रीकरण के खिलाफ एस्ट्रागलन की सुरक्षात्मक क्षमता का प्रदर्शन करता है। आमतौर पर या तो 72 घंटे या 96 घंटे को आसानी से परीक्षण नमूनों के विरोधी एकत्रीकरण प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए क्यू 40:: वाईएफपी समुच्चय की गिनती करने के लिए समय बिंदुओं के रूप में उपयोग किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में, AM141 सूत्रकृमि के फ्लोरोसेंट समुच्चय एक स्वचालित इमेजिंग प्रणाली द्वारा कब्जा कर लिया गया था, हालांकि प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी भी इस उद्देश्य के लिए इस्तेमाल किया जा सकताहै 7.
एलिगेंस तनाव एचए 75 9 अपने संवेदी एएसएच न्यूरॉन्स में जीएफपी मार्कर और एचटीएन-क्यू 150 दोनों को व्यक्त करता है, जिससे इन न्यूरॉन्स11,13 की प्रगतिशील हानि और शिथिलता होती है। नेमाटोड को एएसएच न्यूरोनल व्यवहार्यता (चित्रा 2 ए) निर्धारित करने के लिए 2% एगरोज़ पैड पर रखा गया था और एएसएच न्यूरॉन्स का पता लगाने के लिए सूक्ष्म रूप से कल्पना की गई थी। नेमाटोड के सिर क्षेत्रों में द्विपक्षीय एएसएच न्यूरॉन्स में जीएफपी प्रतिदीप्ति का नुकसान एएसएच न्यूरोनल मृत्यु (चित्रा 2 बी) को इंगित करता है। एचए 759 नेमाटोड में एएसएच न्यूरॉन्स की जीवित रहने की दर 3 दिनों 7,20 के लिए 15 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन के बाद नियंत्रण समूह में <40% है, जो पॉलीक्यू-मध्यस्थता न्यूरोटॉक्सिसिटी का संकेत देती है। इसलिए, इस एएसएच न्यूरोनल उत्तरजीविता परख का उपयोग सी एलिगेंस न्यूरॉन्स पर परीक्षण यौगिकों के प्रभावों का नेत्रहीन मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, एस्ट्रैगलन का न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभाव लेकिन पोरिया ग्लाइकन (चित्रा 2 सी) नहीं।
चूंकि व्यवहार की शिथिलता पॉलीक्यू रोगों में एक प्रमुख नैदानिक लक्षण है, बड़ी संख्या में एचए 759 नेमाटोड का उपयोग करके कीमोसेंसरी परिहार परख (चित्रा 3 ए) को पॉलीक्यू एकत्रीकरण द्वारा मध्यस्थता वाले एएसएच न्यूरॉन्स के कार्यात्मक नुकसान पर परीक्षण नमूनों के प्रभाव की जांच करने के लिए एक सरलीकृत परीक्षण के रूप में डिज़ाइन किया गया है। जैसा कि चित्रा 3 बी में दिखाया गया है, अनुपचारित नियंत्रण समूह में एचए 75 9 नेमाटोड का परिहार सूचकांक ~ 0.5 था, जो पहले14 की सूचना दी गई थी। दिलचस्प बात यह है कि परिहार सूचकांक 3 दिनों (चित्रा 3 बी) के लिए 15 डिग्री सेल्सियस पर एस्ट्रागलन के साथ इलाज किए गए नेमाटोड में >0.6 तक बढ़ गया, जो व्यवहार हानि के खिलाफ पॉलीसेकेराइड के न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभाव का प्रदर्शन करता है।
परीक्षण यौगिकों की समग्र न्यूरोप्रोटेक्टिव क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए, उपरोक्त व्यक्तिगत परखों के डेटा को एकीकृत किया जा सकता है और कई फेनोटाइप के लिए रडार चार्ट के रूप में प्रस्तुत किया जा सकता है, जिससे यह प्रत्यक्ष तुलना और प्रत्यक्ष देखने के लिए उपयुक्त पॉलीक्यू फेनोटाइप की एक एकीकृत विशेषता बन जाती है। जैसा कि चित्रा 4 में दिखाया गया है, एस्ट्रैगलन उपचार समूह में त्रिकोण का क्षेत्र नियंत्रण समूह की तुलना में अधिक है, जो पॉलीसेकेराइड के एंटी-पॉलीक्यू प्रभावों को दर्शाता है।
चित्रा 1: पॉलीक्यू 40 एकत्रीकरण पर एस्ट्रागलन का प्रभाव (ए) 20 डिग्री सेल्सियस पर 96 घंटे के लिए एस्ट्रागलन के साथ या बिना उपचार के बाद एएम 141 नेमाटोड की प्रतिनिधि छवियां। फ्लोरोसेंट छवियों (बाएं पैनल) को उच्च सामग्री इमेजिंग और विश्लेषण प्रणाली का उपयोग करके 384-अच्छी तरह से प्लेटों से अधिग्रहित किया गया था, और क्यू 40:: वाईएफपी समुच्चय (दाएं पैनल) सिस्टम द्वारा स्वचालित रूप से पहचाने गए थे। इनसेट पॉलीक्यू समुच्चय दिखाने वाले सूत्रकृमि छवियों के आवर्धित दृश्य हैं। स्केल बार = 500 μm. (B) Q40:: YFP समुच्चय का परिमाणीकरण। क्यू 40 की संख्या:: एएम 141 नेमाटोड में वाईएफपी समुच्चय की निगरानी 20 डिग्री सेल्सियस पर एस्ट्रैगलन के साथ या उसके बिना उपचार के बाद 4 दिनों के लिए हर 24 घंटे में उच्च सामग्री इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके की गई थी। प्रत्येक समूह में लगभग 100-150 सूत्रकृमि प्रत्येक समय बिंदु पर समुच्चय के लिए स्कोर किए गए थे। परिणाम प्रति सूत्रकृमि समुच्चय की औसत संख्या के आधार पर फिट घटता के रूप में दिखाए जाते हैं। संक्षिप्त नाम: पॉलीक्यू = पॉलीग्लूटामाइन; वाईएफपी = पीला फ्लोरोसेंट प्रोटीन; एफआईटीसी = फ्लोरोसिन आइसोथियोसाइनेट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: एचटीएन-क्यू 150-मध्यस्थता एएसएच न्यूरोनल मौत पर एस्ट्रागलन का प्रभाव। (ए) एगरोज़ स्लाइड तैयारी का योजनाबद्ध आरेख। (बी) 400x आवर्धन का उपयोग करके एएसएच न्यूरोनल अस्तित्व और मृत्यु के साथ एचए 759 नेमाटोड के प्रतिनिधि माइक्रोग्राफ। स्केल सलाखों = 20 μm. एचए 759 नेमाटोड को एल 1 से 3 दिनों के लिए 15 डिग्री सेल्सियस पर एस्ट्रैगलन के साथ या बिना उपचार के बाद प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करके फोटो खिंचवाया गया था। (सी) पॉलीक्यू-मध्यस्थता एएसएच न्यूरोनल मौत के खिलाफ एस्ट्रागलन का सुरक्षात्मक प्रभाव। पोरिया ग्लाइकन, पोरिया कोकोस से एक पॉलीसेकेराइड, एक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। डेटा को तीन प्रतिकृतियों के एसडी ± साधन के रूप में प्रस्तुत किया जाता है, जो तीन से अधिक स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं। सांख्यिकीय विश्लेषण एस्ट्रैगलन और पोरिया ग्लाइकन समूहों के साथ नियंत्रण समूह के डेटा की तुलना करने के लिए एक अप्रकाशित, दो-पूंछ वाले टी-टेस्ट का उपयोग करके किया गया था। * पी < 0.05; एनएस = कोई महत्वपूर्ण नहीं है। संक्षिप्त नाम: जीएफपी = ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: एचटीएन-क्यू 150-मध्यस्थता व्यवहार शिथिलता पर एस्ट्रागलन का प्रभाव। (ए) परिहार परख प्लेट का योजनाबद्ध आरेख। (बी) परिहार परख के प्रतिनिधि परिणाम। परिहार सूचकांक को प्लेट पर नेमाटोड की कुल संख्या के लिए एन क्षेत्र में नेमाटोड के अनुपात के रूप में परिभाषित किया गया था। परिणाम तीन प्रतिकृतियों के एसडी ± साधन के रूप में प्रस्तुत किए जाते हैं, तीन स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि। परिहार सूचकांक का सांख्यिकीय विश्लेषण एक अप्रकाशित, दो-पूंछ वाले टी-टेस्ट का उपयोग करके किया गया था। ** पी < 0.01। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4: एस्ट्रागलन की समग्र न्यूरोप्रोटेक्टिव क्षमता। तीन अलग-अलग परखों से डेटा को ओरिजिनप्रो सॉफ्टवेयर में एक क्रिएट रडार चार्ट में आयात किया जाता है, जिसे पॉलीक्यू द्वारा मध्यस्थता वाले कई फेनोटाइप पर एस्ट्रैगलन के सामान्य प्रभाव को प्रोफाइल करने के लिए प्रस्तुत किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
चूंकि पॉलीक्यू एकत्रीकरण और प्रोटियोटॉक्सिसिटी पॉलीक्यू विकारों की महत्वपूर्ण विशेषताएं हैं, जैसे हंटिंगटन रोग13, हम परीक्षण यौगिकों की न्यूरोप्रोटेक्टिव क्षमता का व्यापक मूल्यांकन करने के लिए कई मॉडलों और विधियों के उपयोग की सलाह देते हैं, जिसमें एएम 141 तनाव में पॉलीक्यू एकत्रीकरण परख, एचए 75 9 तनाव में एएसएच न्यूरोनल उत्तरजीविता परख, और एचए 75 9 तनाव में कीमोसेंसरी परिहार परख शामिल है। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उपयोग पॉलीक्यू विषाक्तता के खिलाफ परीक्षण नमूनों की न्यूरोप्रोटेक्टिव क्षमताओं का मूल्यांकन करने के लिए किया गया है, जिसमें पॉलीक्यू एकत्रीकरण और संबंधित न्यूरोटॉक्सिसिटी 7,14,15,16,17,19,20 दोनों पर निरोधात्मक प्रभाव शामिल हैं, जो एचडी और अन्य पॉलीक्यू रोगों के लिए दवा की खोज में उनकी क्षमता का प्रदर्शन करते हैं।
पॉलीक्यू एकत्रीकरण परख में पॉलीक्यू समुच्चय का पता लगाने और गिनती के लिए एक स्वचालित इमेजिंग और विश्लेषण प्रणाली पेश की जाती है। इस पद्धति में उच्च-थ्रूपुट और समय-कुशल होने के फायदे हैं और इसके परिणामस्वरूप श्रमसाध्य गिनती प्रक्रिया में व्यक्तिपरक त्रुटियां काफी कम हो जाती हैं। एक पूरे 384-अच्छी तरह से प्लेट के लिए, छवि अधिग्रहण और विश्लेषण को पूरा करने में केवल <1 घंटे लगते हैं। हालांकि, पारंपरिक सूक्ष्म इमेजिंग विधि ने स्वचालित इमेजिंग डिवाइस7 का उपयोग किए बिना इस प्रयोगशाला में समान प्रदर्शन भी दिखाया है।
उपचार प्रति कुल 100-150 नेमाटोड प्रत्येक समय बिंदु के लिए एक विशिष्ट क्यू 40:: वाईएफपी एकत्रीकरण परख में अनुशंसित हैं, जो प्रत्येक 10-15 नेमाटोड युक्त प्रतिकृति कुओं में किया जा सकता है। हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि एल 1 लार्वा कुछ उपचारों या उच्च सांद्रता के प्रति अधिक संवेदनशील हो सकता है। इसलिए, परीक्षण यौगिकों की उच्च खुराक उनके विकास को बाधित कर सकती है, जिससे धीमी वृद्धि के कारण झूठे-सकारात्मक परिणाम हो सकते हैं और इस प्रकार, पॉलीक्यू एकत्रीकरण में देरी हो सकती है। आमतौर पर, इस चिंता को दूर करने और परीक्षण यौगिकों की उचित एकाग्रता सीमा सुनिश्चित करने के लिए एक खाद्य निकासी परख किया जा सकताहै 23.
पॉलीक्यू न्यूरोटॉक्सिसिटी परख में उपयोग किए जाने वाले एचए 75 9 ट्रांसजेनिक नेमाटोड ओएसएम -10 :: जीएफपी और एचटीएन-क्यू 150 को कोएक्सप्रेस करते हैं, जिससे द्विपक्षीय एएसएच संवेदी न्यूरॉन्स की स्पष्ट रूप से पहचान करना संभव हो जाता है। इसलिए, एएसएच न्यूरॉन अस्तित्व का मूल्यांकन जीएफपी अभिव्यक्ति की उपस्थिति या अनुपस्थिति से किया जाता है; आमतौर पर, नियंत्रण सूत्रकृमि में एएसएच न्यूरॉन्स का ~ 40-75%23,24 मृत हो जाता है। दिलचस्प बात यह है कि एचए 759 तनाव (पीक्यूई -1) में पीक्यूई -1 (पॉलीग्लूटामाइन एन्हांसर -1) आनुवंशिक उत्परिवर्ती पृष्ठभूमि; एचटीएन-क्यू 150) पॉलीक्यू-मध्यस्थता विषाक्तता को तेज करता है, जिससे तीन दिनों के भीतर अधिकांश एएसएच न्यूरॉन्स की मृत्यु हो जाती है, यहां तक कि 15 डिग्री सेल्सियस पर भी, और इसलिए यह तनाव न्यूरोनल उत्तरजीविता परख के लिए 15 डिग्री सेल्सियस पर उगाया जाता है, जैसा कि पहले23,24 की सूचना दी गई थी।
एचए 759 नेमाटोड में एएसएच न्यूरॉन्स का कार्यात्मक नुकसान कोशिका मृत्यु और प्रोटीन समुच्चय13 का पता लगाने से पहले हो सकता है; इसलिए, आसमाटिक परिहार व्यवहार परख पॉलीक्यू-मध्यस्थता विषाक्तता के मूल्यांकन के लिए आवश्यक है। व्यवहार प्रयोगों पर कम तापमान पर कम सक्रिय एचए 759 नेमाटोड के संभावित प्रभाव को कम करने के लिए, परिहार परख प्लेटों को इस तनाव का उपयोग करके न्यूरोनल उत्तरजीविता परख के रूप में 15 डिग्री सेल्सियस के बजाय आर्द्र 23 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में ऊष्मायन किया जाता है। इसके अलावा, यह बताया गया है कि एचटीएन-क्यू 150 / ओएसएम -10:: जीएफपी ट्रांसजेनिक नेमाटोड नाक स्पर्श के प्रति अत्यधिक संवेदनशील हैं; इसलिए, एएसएच न्यूरॉन फ़ंक्शन का एक वैकल्पिक पता लगाना नाक स्पर्श परख13 है।
Disclosures
लेखकों ने घोषणा की है कि उनके पास कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं हैं।
Acknowledgments
हम हुआंग लैब के पूर्व सदस्यों को धन्यवाद देते हैं जिन्होंने इस पत्र में उपयोग किए जाने वाले प्रोटोकॉल को विकसित करने और सुधारने में मदद की है, विशेष रूप से, हनरुई झांग, लिंगयुन जिओ और यांक्सिया जियांग। इस काम को 111 परियोजना (अनुदान संख्या बी 17018) और हेबेई प्रांत के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान संख्या एच 2020207002) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C. elegans strains | |||
| AM141 rmIs133 [unc-54p::Q40::YFP] |
Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/strain/AM141 | |
| HA759 rtIs11 [osm-10p::GFP + osm-10p::HtnQ150 + dpy-20(+)] |
Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/strain/HA759 | |
| E. coli strains | |||
| NA22 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/strain/NA22 | |
| OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/strain/OP50 | |
| Reagent | |||
| Agar | Shanghai EKEAR Bio-Technology Co., Ltd. | EQ1001-500G | https://www.ekear.com |
| Agarose | Biowest | 111860 | |
| Butanedione | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 80042427 | https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/d027c00e64c9404d9aa41391fbb59 5d0 |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | https://www.sigmaaldrich.cn/CN/zh/product/sigma/c8667?context=product |
| Glycerol | Aladdin Co., Ltd. | G116203 | https://www.aladdin-e.com/zh_cn/g116203.html |
| Peptone | Guangdong HuanKai Microbial Science and Technology Co., Ltd. | 050170B | https://www.huankai.com/show/21074.html |
| Sodium azide | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 80115560 | https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/5e981aa807664e26af 551e96ff5f07cd |
| Sodium hydroxide | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10019718 | https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/450dfdb1132a4d8a817 d3d8c68ec25e6 |
| Sodium hypochlorite solution | Guangzhou Chemical Reagent Factory | 7681-52-9 | http://www.chemicalreagent.com/product/DetailProduct.aspx?id=125 |
| Tryptone | Oxoid Ltd. | LP0042B | https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/LP0042B#/LP0042B |
| Yeast extract | Oxoid Ltd. | LP0021B | https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/LP0021B#/LP0021B |
| Equipment | |||
| 384-well cell culture plate | Nest Biotechnology Co., Ltd. | 761001 | https://www.cell-nest.com/page94?_l=en&product_id=85 |
| 48-well cell culture plate | Nest Biotechnology Co., Ltd. | 748001 | https://www.cell-nest.com/page94?_l=en&product_id=85 |
| 90 mm Petri dish | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | F611003 | https://www.sangon.com/productDetail?productInfo.code=F611003 |
| Autoclave | Panasonic | MLS-3781L-PC | |
| Dissecting microscope | ChongQing Optical Co., Ltd. | ZSA0745 | http://www.coicuop.com/plus/view.php?aid=64 |
| Fluorescence microscope | Guangzhou Micro-shot Optical Technology Co., Ltd. | Mshot MF31-LED | https://www.mshot.com/article/442.html |
| High-content imaging system | Molecular Devices | ImageXpress | https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems#High-Content-Imaging |
| Microcentrifuge | GeneCompany | GENESPEED X1 | https://www.genecompany.com/index.php/Home/Goods/goodsdetails/gid/189.html |
| Microscope digital camera | Guangzhou Micro-shot Optical Technology Co., Ltd. | MS60 | https://www.mshot.com/article/677.html |
| Microwave | Midea Corp. | M1-211A | https://www.midea.cn/10000/10000000001 00511264425.html |
| Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | https://www.sigmaaldrich.cn/CN/en/product/sigma/p7793?context=product |
| Shaker | Zhicheng Inc. | ZWY-2102C | http://www.zhicheng.net/Product/0865291356.html |
| Software | |||
| Image acquisition and analysis software | Molecular Devices | MetaXpress | https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/acquisition-and-analysis-software/metaxpress |
| OriginPro | OriginLab Corp. | Version 9.8.5.204 | 1. Software introduction: https://www.originlab.com/index.aspx?go=Products/Origin 2. Instruction for creating a radar chart: https://www.originlab.com/doc/Origin-Help/RadarChart-Graph 3. Video tutorial for creating a radar chart: https://www.originlab.com/videos/details.aspx?pid=1813 |
References
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