Summary
Qui, presentiamo un protocollo per valutare le attività neuroprotettive dei composti di prova in Caenorhabditis elegans, tra cui l'aggregazione di poliglutammine, la morte neuronale e il comportamento di chemioavoidance, nonché un'integrazione esemplare di più fenotipi.
Abstract
Il misfolding legato all'età e l'aggregazione di proteine patogene sono responsabili di diverse malattie neurodegenerative. Ad esempio, la malattia di Huntington (HD) è principalmente guidata da una ripetizione nucleotidica CAG che codifica per un tratto di glutammina espanso nella proteina huntingtina. Pertanto, l'inibizione dell'aggregazione di poliglutammina (polyQ) e, in particolare, la neurotossicità associata all'aggregazione è una strategia utile per la prevenzione della MH e di altre condizioni associate alla poliQ. Questo documento introduce protocolli sperimentali generalizzati per valutare la capacità neuroprotettiva dei composti di prova contro la MH utilizzando modelli di Caenorhabditis elegans transgenici polyQ stabiliti. Il ceppo AM141 viene scelto per il test di aggregazione polyQ in quanto un fenotipo associato all'età di aggregati fluorescenti discreti può essere facilmente osservato nella sua parete corporea allo stadio adulto a causa dell'espressione muscolo-specifica delle proteine di fusione polyQ::YFP. Al contrario, il modello HA759 con una forte espressione di tratti espansi polyQ nei neuroni ASH viene utilizzato per esaminare la morte neuronale e il comportamento di chemioavoidance. Per valutare in modo completo la capacità neuroprotettiva dei composti bersaglio, i risultati dei test di cui sopra sono in definitiva presentati come un grafico radar con profilazione di più fenotipi in un modo di confronto diretto e visione diretta.
Introduction
La neurodegenerazione progressiva nella MH coinvolge huntingtina mutante patogena con un tratto anomalo di poliQ codificato da ripetizioni trinucleotidiche CAG 1,2,3. Le proteine huntingtine mutanti con più di 37 ripetizioni di glutammina sono inclini ad aggregarsi e accumularsi nel cervello dei pazienti MH e dei modelli animali 4,5, il che alla fine porta alla neurodegenerazione6. Nonostante la mancanza di chiarezza sui ruoli degli aggregati polyQ nella patologia della malattia5, l'inibizione dell'aggregazione polyQ e la sua tossicità associata è un'utile strategia terapeutica per la MH e altre malattie polyQ 4,7,8.
A causa della conservazione nelle vie di segnalazione neuronale e nei modelli di malattia transgenica facili da costruire, Caenorhabditis elegans è stato ampiamente utilizzato come organismo modello principale per lo studio dei disturbi neurologici 9,10,11,12. Ad esempio, i modelli transgenici di C. elegans che esprimono espansioni polyQ inclini all'aggregazione possono oggettivamente imitare caratteristiche simili alla MH come la perdita selettiva di cellule neuronali, la formazione di aggregati citoplasmatici e i difetti comportamentali13. Lo studio dei potenziali effetti dei campioni di prova per invertire questi fenotipi in modelli di nematodi polyQ stabiliti ha portato all'identificazione di una varietà di candidati terapeutici promettenti, ad esempio polisaccaridi 7,14,15, oligosaccaridi16, piccole molecole naturali17,18 ed estratti e formule di erbe19,20.
Qui sono descritti due principali modelli di polyQ C. elegans e protocolli rilevanti per potenziali applicazioni, come esemplificato dallo studio su astragalan, un polisaccaride isolato da Astragalus membranaceus7. Per il test di aggregazione polyQ in C. elegans, il modello utilizzato è il ceppo transgenico AM141, che mostra il puncta fluorescente disperso nel muscolo della parete corporea quando raggiunge l'età adulta a causa dell'espressione della proteina di fusione Q40::YFP, un tratto polyQ di 40 residui (polyQ40) fusi con la proteina fluorescente gialla (YFP)21,22 . Il ceppo HA759 è stato utilizzato per esaminare la sopravvivenza neuronale e il comportamento di chemioavoidance in quanto esprime sia la proteina fluorescente verde (GFP) che Htn-Q150 (un tratto polyQ derivato dall'huntingtina umana di 150 residui) fortemente nei neuroni ASH ma debolmente in altri neuroni, con conseguente neurodegenerazione progressiva e morte cellulare ASH 7,13. Una sintesi completa del potenziale neuroprotettivo dei candidati terapeutici è fornita integrando i risultati di diversi saggi.
Protocol
NOTA: vedere la Tabella 1 per le ricette delle soluzioni utilizzate in questo protocollo.
1. Preparazione dei materiali per il test Caenorhabditis elegans
- Mantenimento dei ceppi di C. elegans
- Ottenere i ceppi di C. elegans (AM141 e HA759) ed Escherichia coli (OP50 e NA22) (vedere la tabella dei materiali).
- Mantenere i nematodi sulla piastra del mezzo di crescita dei nematodi (NGM) seminata con E. coli OP50 a 20 °C per AM14121 o 15 °C per HA75923.
- Preparazione della coltura batterica di E. coli OP50
- Prelevare una singola colonia di E. coli OP50 da una piastra striata di Luria-Bertani (LB) e inocularla in 50 ml di coltura LB liquida.
- Incubare i batteri OP50 in uno shaker a 37 °C e 200 rpm fino a una densità ottica di ~0,5 a 570 nm (OD570).
- Conservare la coltura batterica OP50 a 4 °C e utilizzarla entro due settimane.
- Preparazione di piastre NGM con batteri OP50
- Aggiungere 20 g di agar, 2,5 g di peptone, 3,0 g di NaCl e 975 ml di acqua deionizzata in una bottiglia autoclavabile da 1 L. Autoclave a 121 °C per 30 min.
- Posizionare il flacone di agar NGM liquido sul banco per raffreddare a ~60 °C, quindi aggiungere le seguenti soluzioni madre sterili: 1 mL di 1 M CaCl2, 1 mL di 1 M MgSO4, 1 mL di 5 mg/mL di colesterolo e 25 mL di 1 M di fosfato di potassio (pH 6,0).
- Versare 20 ml di NGM in una capsula di Petri sterile da 90 mm e lasciare raffreddare e solidificare le piastre sul banco. Tenere le piastre capovolte e lasciarle asciugare sul banco a temperatura ambiente per 2 giorni.
- Erogare 200 μL della coltura batterica OP50 su ciascuna piastra NGM e distribuire uniformemente con un'asta di rivestimento in vetro sterile. Chiudere i coperchi e incubare le piastre durante la notte a 37 °C.
- Conservare le piastre NGM seminate con OP50 in una scatola di plastica con coperchio a temperatura ambiente e utilizzare entro due settimane.
- Preparazione della popolazione di C. elegans sincronizzata con l'età
- Raccogliere i nematodi adulti gravidi in un tubo microcentrifuga sterile da 1,5 ml e centrifugare a 1000 × g per 1 minuto. Lavare tre volte e risospesciare i nematodi nel tampone M9.
- Aggiungere un volume uguale di soluzione di candeggina e agitare delicatamente per 3-5 minuti. Monitorare lo sbiancamento ogni 15 s al microscopio sezionante.
NOTA: La soluzione di candeggina deve essere preparata appena prima dell'uso mescolando volumi uguali di NaOCl al 10% e 1 M NaOH (Tabella 1)20. - Una volta che la maggior parte dei nematodi sono rotti, interrompere la digestione diluendo con il tampone M9. Centrifugare rapidamente per rimuovere il surnatante e risospesare il pellet nel tampone M9 per ripetere il lavaggio tre volte.
- Risospesso il pellet in S medio. Lasciare che i residui di nematodi si depositino per gravità per 2-3 minuti mentre le uova rimangono nel surnatante.
- Aspirare il surnatante in un nuovo tubo microcentrifuga sterile. Raccogliere le uova per centrifugazione a 1000 × g per 1 min.
- Scartare circa l'80% del surnatante e trasferire le uova in un matraccio sterile contenente 20 ml di S medio. Mettere il pallone in uno shaker e incubare le uova durante la notte senza cibo a 120 giri / min per ottenere nematodi L1 sincronizzati.
2. Saggio di aggregazione PolyQ
- Preparazione dei nematodi per il saggio di aggregazione polyQ
- Trasferire 300-500 larve L1 sincronizzate di AM141 in ciascun pozzetto di una piastra a 48 pozzetti con 500 μL di terreno S contenente OP50 (OD570 di 0,7-0,8) e 5 mg/ mL di astragalan, in genere un pozzetto per trattamento per un punto temporale.
- Sigillare la piastra con parafilm e incubare a 20 °C e 120 giri/min per 24, 48, 72 e 96 ore.
- Raccogliere i nematodi in un tubo microcentrifuga sterile da 1,5 mL e lavare con tampone M9 >3 volte mediante centrifugazione (1000 × g per 1 min) per rimuovere l'OP50 rimanente. Risuscindi i nematodi AM141 nel buffer M9 e tienili pronti per l'acquisizione delle immagini.
- Acquisizione di immagini fluorescenti e analisi dei dati
NOTA: i dati vengono analizzati automaticamente con questo sistema di imaging ad alto contenuto. Se non è disponibile un dispositivo di imaging automatizzato, è possibile utilizzare un metodo convenzionale per preparare un tampone di agarosio per l'acquisizione di immagini per ottenere prestazioni simili utilizzando un microscopio fluorescente comune 7,15,17 (vedere i passaggi 3.2 e 3.3).- Trasferire 10-15 nematodi in ciascun pozzetto in una piastra da 384 pozzetti (volume finale 80 μL per pozzetto). Impostare 10 pozzetti di replica per ogni trattamento.
- Aggiungere 10 μL di 200 mM di azide di sodio a ciascun pozzetto per paralizzare i nematodi e consentire loro di depositarsi sul fondo (5-10 min).
- Posizionare la lastra in un sistema di imaging ad alto contenuto per acquisire immagini fluorescenti (vedere la Tabella dei materiali per informazioni su dispositivi e software).
- Aprire il software di acquisizione delle immagini e impostare i seguenti parametri.
- Aprite la finestra Impostazione acquisizione piastre e create un nuovo set di esperimenti e un nuovo nome.
- Selezionare Ingrandimento come 2x, Raccoglitore fotocamera come 1 e Tipo di piastra come piastra a 384 pozzetti.
- Impostare i pozzi e i siti (sito singolo) da visitare.
- Selezionare il filtro fitcante isotiocianato di fluoresceina e abilitare le opzioni di messa a fuoco basate su immagini.
- Impostare l'esposizione su 300 ms.
NOTA: le impostazioni di cui sopra possono essere testate e regolate per ottimizzare i parametri di imaging. - Salva le impostazioni di acquisizione delle immagini e fai clic sul pulsante Acquisisci piastra per eseguire.
- Analizzare i dati dell'immagine utilizzando il software di analisi delle immagini.
- Aprire la finestra Revisione dati piastra e selezionare la piastra di prova per l'analisi delle immagini.
- Fare doppio clic su un pozzo di prova per visualizzarne l'immagine.
- Selezionare Count Nuclei come metodo di analisi e fare clic sul pulsante Configura impostazioni per visualizzare una finestra per le seguenti impostazioni.
- Definite l'immagine sorgente dal canale FITC e selezionate l'algoritmo standard.
- Impostare i parametri di analisi dell'immagine come segue: larghezza minima approssimativa = 10 μm (= 2 pixel); larghezza massima approssimativa = 50 μm (= 12 pixel); intensità sopra lo sfondo locale = 1.000-2.000 livelli di grigio.
- Testare le impostazioni correnti per ottimizzare il metodo di analisi.
- Salvare le impostazioni ed eseguire l'analisi su tutti i pozzi.
NOTA: ci vogliono ~ 20 minuti per completare l'analisi per una piastra a 384 pozzetti. - Esportare i nuclei totali come numero totale di aggregati Q40::YFP in ciascun pozzetto.
- Conta il numero di nematodi in ogni pozzo.
- Calcola il numero medio di aggregati Q40::YFP per nematode in ciascun gruppo e applica una curva non lineare adatta ai dati da ciascun punto temporale.
- Calcola l'indice di inibizione usando eq (1) di seguito:
Indice di inibizione =
(1)
Doveil controllo N e ilcampione N sono il numero medio di aggregati Q40::YFP rispettivamente nei gruppi di controllo e di trattamento.
(1)3. Saggi di neurotossicità politossicità-mediati da PolyQ
- Trattamento di C. elegans con campioni di prova
- Per preparare i nematodi per il test di neurotossicità polyQ, trasferire 300-500 larve L1 sincronizzate di HA759 a ciascun pozzetto di una piastra a 48 pozzetti con 500 μL di terreno S contenente OP50 (OD570 di 0,7-0,8) e 5 mg / mL di astragalan, in genere tre pozzetti replicati per ciascun trattamento.
- Sigillare la piastra con parafilm e incubare a 15 °C e 120 giri/min per 3 giorni23.
- Raccogliere i nematodi per centrifugazione e lavare 3-5 volte con tampone M9. Risospese i nematodi nel tampone M9 per l'uso nei saggi di sopravvivenza ed evitamento neuronale.
- Preparazione del tampone di agarosio
- Aggiungere 2 g di agarosio a 100 mL di tampone M9 (2%, p/v) e riscaldare la soluzione di agarosio in un forno a microonde fino quasi all'ebollizione.
- Erogare 0,5 ml di agarosio fuso al centro di un vetrino al microscopio di 1 mm di spessore posto tra due pezzi di lastre di vetro spesse 2 mm. Coprire con un'altra diapositiva verticalmente. Una volta che l'agarosio si raffredda e si solidifica, rimuovere delicatamente la diapositiva superiore.
- Test di sopravvivenza neuronale ASH
- Aggiungere una goccia di 20 mM di azide di sodio sul tampone di agarosio. Trasferire 15-20 nematodi HA759 nella goccia per immobilizzarli.
- Posizionare delicatamente una coverslip sui nematodi. Tenere il vetrino sotto un microscopio a fluorescenza dotato di una fotocamera digitale. Selezionare una lente obiettivo 40x e un filtro FITC per rilevare i neuroni ASH GFP-positivi nella regione della testa dei nematodi.
- Selezionare più di 50 nematodi in ogni gruppo in modo casuale per contare il numero di nematodi con neuroni ASH bilaterali marcati GFP nella loro regione della testa7. Calcola il tasso di sopravvivenza dei neuroni ASH usando eq (2) di seguito.
Sopravvivenza neuronale (%) =
(2)
Dove Nsopravvivenza e Ntotale sono il numero di nematodi con neuroni ASH GFP-positivi e il numero totale di nematodi testati in ciascun gruppo, rispettivamente.
- Saggio di evitamento osmotico
- Dividere una piastra NGM senza alimenti (9 cm) in zone normali (N) e trappole (T) per una linea di glicerolo 8 M (~ 30 μL) nel mezzo. Distribuire una linea di azide di sodio (~ 20 μL) di 200 mM a ~ 1 cm di distanza dalla linea del glicerolo per paralizzare i nematodi che attraversano la barriera del glicerolo nella zona T.
- Trasferire ~ 200 nematodi ciascuno sulla zona N di tre piastre replicate per ciascun gruppo. Aggiungere una goccia di butanedione all'1% (~2 μL) sulla zona T (1 cm dal bordo della piastra) per attirare i nematodi. Coprire immediatamente il coperchio della capsula di Petri e incubare a 23 °C per 90 minuti.
- Segna il numero di nematodi sulle zone N e T al microscopio. Calcolare l'indice di evitamento utilizzando eq (3)20.
Indice di evitamento =
(3)
Dove N e T sono il numero di nematodi nelle zone N e T, rispettivamente. I dati sono presentati come mezzi ± deviazione standard (SD) di tre repliche, rappresentative di esperimenti indipendenti >3. - Eseguire un t-test a due code spaiato per confrontare i dati dei gruppi astragalan e di controllo.
(2)
(3)4. Creazione di un grafico radar
- Aprire il software di creazione di grafici e importare i dati da diversi test in un nuovo foglio. Immettere la colonna A(X) come titoli degli assi radiali, la colonna A(Y) come dati del gruppo di controllo e la colonna B(Y) come dati del gruppo di trattamento.
- Selezionare i dati richiesti e fare clic su Plot | Specializzato: pulsante Radar nel menu della barra degli strumenti per generare un grafico radar.
- Fate doppio clic sull'asse radiale e regolate le etichette Scala, Spunta e Spunta di ciascun asse in base alle esigenze.
- Fare clic su File nel menu e selezionare Esporta grafici per salvare l'immagine come *.tiff.
NOTA: i siti Web del software nella Tabella dei materiali forniscono documenti di aiuto dettagliati e esercitazioni video sulla creazione di grafici radar.
Representative Results
Il ceppo transgenico polyQ AM141 esprime fortemente le proteine di fusione Q40::YFP nelle cellulemuscolari della parete corporea 7,21. Come mostrato nella Figura 1A, il fenotipo aggregato discreto di questo ceppo può essere identificato dal protocollo automatizzato di imaging e analisi descritto in questo articolo. La quantità di aggregati Q40::YFP nei nematodi AM141 è aumentata significativamente dopo 48 ore dallo stadio L1. Tuttavia, questa tendenza all'aumento è stata inibita dal trattamento con astragalan (Figura 1B), dimostrando il potenziale protettivo di astragalan contro l'aggregazione di polyQ. In genere 72 h o 96 h possono essere comodamente utilizzati come punti temporali per contare gli aggregati Q40::YFP per valutare l'effetto antiaggregante dei campioni di prova. In questo protocollo, gli aggregati fluorescenti del nematode AM141 sono stati catturati da un sistema di imaging automatizzato, sebbene i microscopi a fluorescenza possano essere utilizzati anche per questo scopo7.
Il ceppo C. elegans HA759 esprime sia il marcatore GFP che Htn-Q150 nei suoi neuroni ASH sensoriali, portando alla progressiva perdita e disfunzione di questi neuroni11,13. I nematodi sono stati montati su cuscinetti di agarosio al 2% per determinare la vitalità neuronale ASH (Figura 2A) e visualizzati microscopicamente per rilevare i neuroni ASH. Una perdita di fluorescenza GFP nei neuroni ASH bilaterali nelle regioni della testa dei nematodi indica la morte neuronale ASH (Figura 2B). Il tasso di sopravvivenza dei neuroni ASH nei nematodi HA759 è <40% nel gruppo di controllo dopo incubazione a 15 °C per 3 giorni 7,20, indicando neurotossicità poliQ-mediata. Quindi, questo test di sopravvivenza neuronale ASH può essere utilizzato per valutare visivamente gli effetti dei composti di prova sui neuroni C. elegans, ad esempio l'effetto neuroprotettivo di astragalan ma non poria glycan (Figura 2C).
Poiché la disfunzione comportamentale è un sintomo clinico importante nelle malattie polyQ, il test di evitamento chemiosensoriale (Figura 3A) che utilizza un gran numero di nematodi HA759 è progettato come un test semplificato per esaminare l'effetto dei campioni di prova sulla perdita funzionale dei neuroni ASH mediata dall'aggregazione polyQ. Come mostrato nella Figura 3B, l'indice di evitamento dei nematodi HA759 nel gruppo di controllo non trattato era ~ 0,5, simile a quello riportato in precedenza14. È interessante notare che l'indice di evitamento è aumentato a >0,6 nei nematodi trattati con astragalan a 15 °C per 3 giorni (Figura 3B), dimostrando un effetto neuroprotettivo del polisaccaride contro le menomazioni comportamentali.
Per valutare la capacità neuroprotettiva complessiva dei composti di prova, i dati dei singoli saggi di cui sopra possono essere integrati e presentati come un grafico radar per più fenotipi, rendendolo una caratteristica unificante dei fenotipi polyQ adatti per il confronto diretto e la visione diretta. Come mostrato nella Figura 4, l'area del triangolo nel gruppo di trattamento astragalan è maggiore di quella del gruppo di controllo, indicando gli effetti anti-poliQ del polisaccaride.
Figura 1: Effetto di astragalan sull'aggregazione di poliQ40. (A) Immagini rappresentative di nematodi AM141 dopo trattamento con o senza astragalan per 96 ore a 20 °C. Le immagini fluorescenti (pannelli di sinistra) sono state acquisite da lastre a 384 pozzetti utilizzando un sistema di imaging e analisi ad alto contenuto e gli aggregati Q40::YFP (pannelli di destra) sono stati automaticamente identificati dal sistema. Gli inserti sono le viste ingrandite delle immagini di nematodi che mostrano gli aggregati polyQ. Barre di scala = 500 μm. (B) Quantificazione degli aggregati Q40::YFP. Il numero di aggregati Q40::YFP nei nematodi AM141 è stato monitorato utilizzando il sistema di imaging ad alto contenuto ogni 24 ore per 4 giorni dopo il trattamento con o senza astragalan a 20 °C. Circa 100-150 nematodi in ciascun gruppo sono stati valutati per aggregati in ogni punto temporale. I risultati sono mostrati come curve adattate in base al numero medio di aggregati per nematode. Abbreviazioni: polyQ = poliglutammina; YFP = proteina fluorescente gialla; FITC = isotiocianato di fluoresceina. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Effetto di astragalan sulla morte neuronale ASH mediata da Htn-Q150. (A) Diagramma schematico della preparazione del vetrino di agarosio. (B) Micrografie rappresentative di nematodi HA759 con sopravvivenza neuronale ASH e morte mediante ingrandimento 400x. Barre di scala = 20 μm. I nematodi HA759 sono stati fotografati utilizzando un microscopio a fluorescenza dopo il trattamento con o senza astragalan a 15 °C per 3 giorni da L1. (C) Effetto protettivo di astragalan contro la morte neuronale ASH poliQ-mediata. Poria glycan, un polisaccaride di Poria cocos, è stato usato come controllo. I dati sono presentati come mezzi ± SD di tre repliche, rappresentative di più di tre esperimenti indipendenti. L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando un t-test a due code spaiato per confrontare i dati del gruppo di controllo con quelli dei gruppi glicano astragalan e Poria . *p < 0,05; ns = non significativo. Abbreviazione: GFP = proteina fluorescente verde. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Effetto di astragalan sulla disfunzione comportamentale mediata da Htn-Q150. (A) Diagramma schematico della piastra di saggio di evitamento. (B) Risultati rappresentativi del test di evitamento. L'indice di evitamento è stato definito come il rapporto tra nematodi nella zona N e il numero totale di nematodi sulla piastra. I risultati sono presentati come mezzi ± SD di tre repliche, rappresentative di tre esperimenti indipendenti. L'analisi statistica dell'indice di evitamento è stata eseguita utilizzando un t-test a due code spaiato. **p < 0,01. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Capacità neuroprotettiva complessiva di astragalan. I dati di tre diversi saggi vengono importati nel software OriginPro per creare un grafico radar, che viene presentato per profilare l'effetto generale di astragalan su più fenotipi mediati da polyQ. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tabella 1. Fare clic qui per scaricare questa tabella.
Discussion
Poiché l'aggregazione e la proteotossicità del polyQ sono caratteristiche importanti dei disturbi polyQ, come la malattia di Huntington13, raccomandiamo l'uso di più modelli e metodi per valutare in modo completo la capacità neuroprotettiva dei composti in esame, tra cui il test di aggregazione polyQ nel ceppo AM141, il test di sopravvivenza neuronale ASH nel ceppo HA759 e il test di evitamento chemiosensoriale nel ceppo HA759. I protocolli qui presentati sono stati utilizzati per valutare le capacità neuroprotettive dei campioni di prova contro la tossicità del polyQ, compresi gli effetti inibitori sia sull'aggregazione del polyQ che sulla neurotossicità associata 7,14,15,16,17,19,20, dimostrando il loro potenziale nella scoperta di farmaci per la MH e altre malattie poliQ.
Viene introdotto un sistema automatizzato di imaging e analisi per il rilevamento e il conteggio degli aggregati polyQ nel test di aggregazione polyQ. Questo metodo ha il vantaggio di essere ad alta produttività ed efficienza in termini di tempo e si traduce in errori soggettivi significativamente ridotti nel laborioso processo di conteggio. Per un'intera piastra a 384 pozzetti, bastano <1 ora per completare l'acquisizione e l'analisi delle immagini. Tuttavia, il metodo di imaging microscopico convenzionale ha anche mostrato prestazioni simili in questo laboratorio senza utilizzare il dispositivo di imaging automatizzato7.
Un totale di 100-150 nematodi per trattamento sono raccomandati in un tipico test di aggregazione Q40::YFP per ogni punto temporale, che può essere eseguito in pozzetti replicati contenenti 10-15 nematodi ciascuno. Tuttavia, va notato che le larve L1 possono essere più sensibili ad alcuni trattamenti o concentrazioni più elevate. Pertanto, dosi più elevate di composti di prova potrebbero inibire la loro crescita, portando a risultati falsi positivi a causa della crescita lenta e, quindi, dell'aggregazione ritardata del poliQ. Di solito, è possibile eseguire un test di clearance alimentare per affrontare questa preoccupazione e garantire l'intervallo di concentrazione appropriato dei composti in esame23.
I nematodi transgenici HA759 utilizzati nei saggi di neurotossicità polyQ coesprimono OSM-10::GFP e Htn-Q150, rendendo possibile l'identificazione inequivocabile dei neuroni sensoriali ASH bilaterali. Quindi, la sopravvivenza del neurone ASH è valutata dalla presenza o dall'assenza di espressione di GFP; di solito, ~ 40-75% dei neuroni ASH nei nematodi di controllo sono morti 23,24. È interessante notare che il background mutante genetico pqe-1 (polyglutamine enhancer-1) nel ceppo HA759 (pqe-1; Htn-Q150) accelera la tossicità poliQ-mediata, portando alla morte della maggior parte dei neuroni ASH entro tre giorni, anche a 15 °C, e quindi questo ceppo viene coltivato a 15 °C per il test di sopravvivenza neuronale, come precedentemente riportato23,24.
La perdita funzionale dei neuroni ASH nei nematodi HA759 può verificarsi prima del rilevamento della morte cellulare e degli aggregati proteici13; pertanto, il test del comportamento di evitamento osmotico è essenziale per la valutazione della tossicità poliQ-mediata. Per ridurre al minimo il potenziale impatto dei nematodi HA759 meno attivi a bassa temperatura sugli esperimenti comportamentali, le piastre di saggio di evitamento vengono incubate in un incubatore umidificato a 23 °C piuttosto che a 15 °C come nel saggio di sopravvivenza neuronale utilizzando questo ceppo. Inoltre, è stato riportato che i nematodi transgenici Htn-Q150/OSM-10::GFP sono altamente sensibili al tocco del naso; quindi, un rilevamento alternativo della funzione neuronale ASH è il test del tocco del naso13.
Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Ringraziamo gli ex membri dello Huang Lab che hanno contribuito a sviluppare e migliorare i protocolli utilizzati in questo documento, in particolare Hanrui Zhang, Lingyun Xiao e Yanxia Xiang. Questo lavoro è stato sostenuto dal Progetto 111 (numero di sovvenzione B17018) e dalla Fondazione di Scienze Naturali della Provincia di Hebei (numero di sovvenzione H2020207002).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C. elegans strains | |||
| AM141 rmIs133 [unc-54p::Q40::YFP] |
Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/strain/AM141 | |
| HA759 rtIs11 [osm-10p::GFP + osm-10p::HtnQ150 + dpy-20(+)] |
Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/strain/HA759 | |
| E. coli strains | |||
| NA22 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/strain/NA22 | |
| OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/strain/OP50 | |
| Reagent | |||
| Agar | Shanghai EKEAR Bio-Technology Co., Ltd. | EQ1001-500G | https://www.ekear.com |
| Agarose | Biowest | 111860 | |
| Butanedione | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 80042427 | https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/d027c00e64c9404d9aa41391fbb59 5d0 |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | https://www.sigmaaldrich.cn/CN/zh/product/sigma/c8667?context=product |
| Glycerol | Aladdin Co., Ltd. | G116203 | https://www.aladdin-e.com/zh_cn/g116203.html |
| Peptone | Guangdong HuanKai Microbial Science and Technology Co., Ltd. | 050170B | https://www.huankai.com/show/21074.html |
| Sodium azide | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 80115560 | https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/5e981aa807664e26af 551e96ff5f07cd |
| Sodium hydroxide | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10019718 | https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/450dfdb1132a4d8a817 d3d8c68ec25e6 |
| Sodium hypochlorite solution | Guangzhou Chemical Reagent Factory | 7681-52-9 | http://www.chemicalreagent.com/product/DetailProduct.aspx?id=125 |
| Tryptone | Oxoid Ltd. | LP0042B | https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/LP0042B#/LP0042B |
| Yeast extract | Oxoid Ltd. | LP0021B | https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/LP0021B#/LP0021B |
| Equipment | |||
| 384-well cell culture plate | Nest Biotechnology Co., Ltd. | 761001 | https://www.cell-nest.com/page94?_l=en&product_id=85 |
| 48-well cell culture plate | Nest Biotechnology Co., Ltd. | 748001 | https://www.cell-nest.com/page94?_l=en&product_id=85 |
| 90 mm Petri dish | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | F611003 | https://www.sangon.com/productDetail?productInfo.code=F611003 |
| Autoclave | Panasonic | MLS-3781L-PC | |
| Dissecting microscope | ChongQing Optical Co., Ltd. | ZSA0745 | http://www.coicuop.com/plus/view.php?aid=64 |
| Fluorescence microscope | Guangzhou Micro-shot Optical Technology Co., Ltd. | Mshot MF31-LED | https://www.mshot.com/article/442.html |
| High-content imaging system | Molecular Devices | ImageXpress | https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems#High-Content-Imaging |
| Microcentrifuge | GeneCompany | GENESPEED X1 | https://www.genecompany.com/index.php/Home/Goods/goodsdetails/gid/189.html |
| Microscope digital camera | Guangzhou Micro-shot Optical Technology Co., Ltd. | MS60 | https://www.mshot.com/article/677.html |
| Microwave | Midea Corp. | M1-211A | https://www.midea.cn/10000/10000000001 00511264425.html |
| Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | https://www.sigmaaldrich.cn/CN/en/product/sigma/p7793?context=product |
| Shaker | Zhicheng Inc. | ZWY-2102C | http://www.zhicheng.net/Product/0865291356.html |
| Software | |||
| Image acquisition and analysis software | Molecular Devices | MetaXpress | https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/acquisition-and-analysis-software/metaxpress |
| OriginPro | OriginLab Corp. | Version 9.8.5.204 | 1. Software introduction: https://www.originlab.com/index.aspx?go=Products/Origin 2. Instruction for creating a radar chart: https://www.originlab.com/doc/Origin-Help/RadarChart-Graph 3. Video tutorial for creating a radar chart: https://www.originlab.com/videos/details.aspx?pid=1813 |
References
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