Summary
Ici, nous présentons un protocole pour évaluer les activités neuroprotectrices des composés de test chez Caenorhabditis elegans, y compris l’agrégation de polyglutamines, la mort neuronale et le comportement de chimioavoidance, ainsi qu’une intégration exemplaire de plusieurs phénotypes.
Abstract
Le mauvais repliement et l’agrégation de protéines pathogènes liés à l’âge sont responsables de plusieurs maladies neurodégénératives. Par exemple, la maladie de Huntington (MH) est principalement provoquée par une répétition de nucléotide CAG qui code pour un tractus glutamine expansé dans la protéine huntingtine. Ainsi, l’inhibition de l’agrégation des polyglutamines (polyQ) et, en particulier, de la neurotoxicité associée à l’agrégation est une stratégie utile pour la prévention de la MH et d’autres affections associées aux polyQ. Cet article présente des protocoles expérimentaux généralisés pour évaluer la capacité neuroprotectrice des composés d’essai contre la MH à l’aide de modèles transgéniques polyQ établis de Caenorhabditis elegans . La souche AM141 est choisie pour le test d’agrégation polyQ car un phénotype associé à l’âge d’agrégats fluorescents discrets peut être facilement observé dans sa paroi corporelle au stade adulte en raison de l’expression musculaire spécifique des protéines de fusion polyQ::YFP. En revanche, le modèle HA759 avec une forte expression des voies polyQ-étendues dans les neurones ASH est utilisé pour examiner la mort neuronale et le comportement de chimioavoidance. Pour évaluer de manière exhaustive la capacité neuroprotectrice des composés cibles, les résultats des tests ci-dessus sont finalement présentés sous la forme d’un graphique radar avec profilage de plusieurs phénotypes dans une manière de comparaison directe et de visualisation directe.
Introduction
La neurodégénérescence progressive dans la MH implique une huntingtine mutante pathogène avec un étirement anormal de polyQ codé par des répétitions trinucléotidiques CAG 1,2,3. Les protéines huntingtines mutantes avec plus de 37 répétitions de glutamine sont sujettes à s’agréger et à s’accumuler dans le cerveau des patients MH et des modèles animaux 4,5, ce qui conduit finalement à la neurodégénérescence 6. Malgré le manque de clarté sur les rôles des agrégats polyQ dans la pathologie de la maladie5, l’inhibition de l’agrégation polyQ et de sa toxicité associée est une stratégie thérapeutique utile pour la MH et d’autres maladies polyQ 4,7,8.
En raison de la conservation des voies de signalisation neuronale et des modèles de maladies transgéniques faciles à construire, Caenorhabditis elegans a été largement utilisé comme organisme modèle majeur pour l’étude des troubles neurologiques 9,10,11,12. Par exemple, les modèles transgéniques de C. elegans exprimant des expansions polyQ sujettes à l’agrégation peuvent imiter objectivement des caractéristiques de type MH telles que la perte sélective de cellules neuronales, la formation d’agrégats cytoplasmiques et les défauts de comportement13. L’étude des effets potentiels des échantillons d’essai pour inverser ces phénotypes dans des modèles de nématodes polyQ établis a conduit à l’identification d’une variété de candidats thérapeutiques prometteurs, par exemple les polysaccharides 7,14,15, les oligosaccharides16, les petites molécules naturelles17,18 et les extraits et formules de plantes19,20.
Sont décrits ici deux principaux modèles de polyQ C. elegans et des protocoles pertinents pour des applications potentielles, comme l’illustre l’étude sur l’astragalane, un polysaccharide isolé d’Astragalus membranaceus7. Pour le test d’agrégation polyQ chez C. elegans, le modèle utilisé est la souche transgénique AM141, qui montre des puncta fluorescents dispersés dans le muscle de sa paroi corporelle à l’âge adulte en raison de l’expression de la protéine de fusion Q40::YFP, un tractus polyQ de 40 résidus (polyQ40) fusionnés à la protéine fluorescente jaune (YFP)21,22 . La souche HA759 a été utilisée pour examiner la survie neuronale et le comportement de chimioavoidance car elle exprime à la fois la protéine fluorescente verte (GFP) et Htn-Q150 (un tractus polyQ dérivé de la huntingtine humaine de 150 résidus) fortement dans les neurones ASH mais faiblement dans d’autres neurones, entraînant une neurodégénérescence progressive et la mort cellulaire ASH 7,13. Un résumé complet du potentiel neuroprotecteur des candidats thérapeutiques est fourni en intégrant les résultats de différents tests.
Protocol
REMARQUE : Voir le tableau 1 pour les recettes des solutions utilisées dans ce protocole.
1. Préparation du matériel pour le test Caenorhabditis elegans
- Entretien des souches de C. elegans
- Obtenir des souches de C. elegans (AM141 et HA759) et d’Escherichia coli (OP50 et NA22) (voir le Tableau des matériaux).
- Maintenir les nématodes sur la plaque du milieu de croissance des nématodes (NGM) ensemencée avec E. coli OP50 à 20 °C pourAM141 21 ou 15 °C pour HA75923.
- Préparation de la culture bactérienne E. coli OP50
- Choisissez une seule colonie d’E. coli OP50 dans une plaque striée de Luria-Bertani (LB) et inoculez-la dans 50 mL de culture LB liquide.
- Incuber la bactérie OP50 dans un agitateur à 37 °C et 200 tr/min jusqu’à une densité optique d’environ 0,5 à 570 nm (OD570).
- Conservez la culture bactérienne OP50 à 4 °C et utilisez-la dans les deux semaines.
- Préparation de plaques NGM avec des bactéries OP50
- Ajouter 20 g de gélose, 2,5 g de peptone, 3,0 g de NaCl et 975 mL d’eau désionisée dans une bouteille autoclavable de 1 L. Autoclave à 121 °C pendant 30 min.
- Placez le flacon liquide de gélose NGM sur le banc pour refroidir à ~60 °C, puis ajoutez les solutions mères stériles suivantes : 1 mL de 1 MCaCl2, 1 mL de 1 M MgSO4, 1 mL de 5 mg/mL de cholestérol et 25 mL de phosphate de potassium 1 M (pH 6,0).
- Versez 20 mL de NGM dans une boîte de Petri stérile de 90 mm et laissez les plaques sur le banc refroidir et solidifier. Gardez les assiettes à l’envers et laissez-les sécher sur le banc à température ambiante pendant 2 jours.
- Distribuer 200 μL de la culture bactérienne OP50 sur chaque plaque NGM et répartir uniformément avec une tige de revêtement en verre stérile. Fermez les couvercles et incubez les plaques pendant la nuit à 37 °C.
- Conservez les plaques de NGM ensemencées avec OP50 dans une boîte en plastique avec un couvercle à température ambiante et utilisez-les dans les deux semaines.
- Préparation de la population de C. elegans synchronisée selon l’âge
- Recueillir les nématodes adultes gravides dans un tube de microcentrifugation stérile de 1,5 mL et centrifuger à 1000 × g pendant 1 min. Lavez trois fois et remettez en suspension les nématodes dans un tampon M9.
- Ajouter un volume égal de solution d’eau de Javel et agiter doucement pendant 3-5 min. Surveillez le blanchiment toutes les 15 s sous un microscope à dissection.
REMARQUE: La solution d’eau de Javel doit être préparée fraîchement avant utilisation en mélangeant des volumes égaux de 10% de NaOCl et de 1 M NaOH (tableau 1)20. - Une fois que la plupart des nématodes sont cassés, arrêtez la digestion en diluant avec un tampon M9. Centrifugez rapidement pour retirer le surnageant et remettez la pastille dans un tampon M9 pour répéter le lavage trois fois.
- Remettre en suspension la pastille en milieu S. Laissez les résidus de nématodes se déposer par gravité pendant 2-3 min pendant que les œufs restent dans le surnageant.
- Aspirer le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifugeuse stérile. Recueillir les œufs par centrifugation à 1000 × g pendant 1 min.
- Jeter ~80% du surnageant et transférer les œufs dans une fiole stérile contenant 20 mL de milieu S. Placer la fiole dans un shaker et incuber les œufs pendant la nuit sans nourriture à 120 tr/min pour obtenir des nématodes L1 synchronisés.
2. Dosage d’agrégation PolyQ
- Préparation de nématodes pour le test d’agrégation polyQ
- Transférer 300 à 500 larves L1 synchronisées d’AM141 dans chaque puits d’une plaque de 48 puits avec 500 μL de milieu S contenant de l’OP50 (OD570 de 0,7-0,8) et 5 mg/mL d’astragalane, généralement un puits par traitement pour un point temporel.
- Sceller la plaque avec un parafilm et incuber à 20 °C et 120 tr/min pendant 24, 48, 72 et 96 h.
- Récolter les nématodes dans un tube stérile de microcentrifugation de 1,5 mL et laver avec un tampon M9 >3 fois par centrifugation (1000 × g pendant 1 min) pour éliminer le reste de l’OP50. Remettez en suspension les nématodes AM141 dans le tampon M9 et gardez-les prêts pour l’acquisition d’images.
- Acquisition d’images fluorescentes et analyse de données
REMARQUE: Les données sont automatiquement analysées avec ce système d’imagerie à haut contenu. Si un dispositif d’imagerie automatisé n’est pas disponible, une méthode conventionnelle pour préparer un tampon d’agarose pour l’acquisition d’images peut être utilisée pour obtenir des performances similaires en utilisant un microscope fluorescent commun 7,15,17 (voir les étapes 3.2 et 3.3).- Transférer 10 à 15 nématodes dans chaque puits dans une plaque de 384 puits (volume final 80 μL par puits). Fixez 10 puits répliqués pour chaque traitement.
- Ajouter 10 μL d’azoture de sodium de 200 mM à chaque puits pour paralyser les nématodes et les laisser se déposer au fond (5-10 min).
- Placez la plaque dans un système d’imagerie à haut contenu pour acquérir des images fluorescentes (voir le Tableau des matériaux pour obtenir des informations sur les appareils et les logiciels).
- Ouvrez le logiciel d’acquisition d’images et configurez les paramètres suivants.
- Ouvrez la fenêtre Configuration de l’acquisition de plaques et créez un ensemble d’expériences et un nom.
- Sélectionnez Grossissement comme 2x, Caméra binning comme 1 et Type de plaque comme plaque 384-well.
- Définissez les puits et les sites (site unique) à visiter.
- Sélectionnez le filtre d’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) et activez les options de mise au point basées sur l’image.
- Réglez l’exposition sur 300 ms.
REMARQUE: Les paramètres ci-dessus peuvent être testés et ajustés pour optimiser les paramètres d’imagerie. - Enregistrez les paramètres d’acquisition d’image et cliquez sur le bouton Acquérir la plaque pour l’exécuter.
- Analysez les données d’image à l’aide du logiciel d’analyse d’image.
- Ouvrez la fenêtre Vérifier les données de la plaque et sélectionnez la plaque de test pour l’analyse d’image.
- Double-cliquez sur un puits de test pour afficher son image.
- Sélectionnez Count Nuclei comme méthode d’analyse et cliquez sur le bouton Configurer les paramètres pour afficher une fenêtre pour les paramètres suivants.
- Définissez l’image source à partir du canal FITC et sélectionnez l’algorithme standard.
- Définissez les paramètres d’analyse d’image comme suit : largeur minimale approximative = 10 μm (= 2 pixels) ; largeur maximale approximative = 50 μm (= 12 pixels); intensité au-dessus du fond local = 1 000 à 2 000 niveaux de gris.
- Testez les paramètres actuels pour optimiser la méthode d’analyse.
- Enregistrez les paramètres et exécutez l’analyse sur tous les puits.
REMARQUE: Il faut environ 20 minutes pour terminer l’analyse d’une plaque de 384 puits. - Exportez le total des noyaux en tant que nombre total d’agrégats Q40::YFP dans chaque puits.
- Comptez le nombre de nématodes dans chaque puits.
- Calculez le nombre moyen d’agrégats Q40::YFP par nématode dans chaque groupe et appliquez un ajustement de courbe non linéaire aux données de chaque point temporel.
- Calculez l’indice d’inhibition en utilisant eq (1) ci-dessous :
Indice d’inhibition =
(1)
OùL’échantillon N témoin etL’échantillon N sont le nombre moyen d’agrégats Q40::YFP dans les groupes témoin et traitement, respectivement.
(1)3. Tests de neurotoxicité médiés par PolyQ
- Traitement de C. elegans avec des échantillons d’essai
- Pour préparer les nématodes au test de neurotoxicité polyQ, transférer 300 à 500 larves L1 synchronisées de HA759 à chaque puits d’une plaque de 48 puits contenant 500 μL de milieu S contenant DE l’OP50 (OD570 de 0,7 à 0,8) et 5 mg/mL d’astragalane, généralement trois puits répliqués pour chaque traitement.
- Sceller la plaque avec un parafilm et incuber à 15 °C et 120 tr/min pendant 3 jours23.
- Recueillir les nématodes par centrifugation et laver 3-5 fois avec un tampon M9. Remettre en suspension les nématodes dans le tampon M9 pour les utiliser dans les tests de survie neuronale et d’évitement.
- Préparation du tampon d’agarose
- Ajouter 2 g d’agarose à 100 mL de tampon M9 (2 %, p/v) et chauffer la solution d’agarose au micro-ondes jusqu’à ce qu’elle soit presque bouillante.
- Distribuer 0,5 mL d’agarose fondue sur le centre d’une lame de verre de microscopie de 1 mm d’épaisseur placée entre deux morceaux de plaques de verre de 2 mm d’épaisseur. Couvrir avec une autre glissière verticalement. Une fois que l’agarose refroidit et est solidifiée, retirez doucement la glissière supérieure.
- Test de survie neuronale ASH
- Ajouter une goutte d’azoture de sodium de 20 mM sur le tampon d’agarose. Transférez 15 à 20 nématodes HA759 dans la goutte pour les immobiliser.
- Placez doucement un couvercle sur les nématodes. Conservez la lame sous un microscope à fluorescence équipé d’un appareil photo numérique. Sélectionnez une lentille d’objectif 40x et un filtre FITC pour détecter les neurones ASH GFP positifs dans la région de la tête des nématodes.
- Sélectionnez plus de 50 nématodes dans chaque groupe au hasard pour compter le nombre de nématodes avec des neurones ASH bilatéraux marqués GFP dans leur régionde tête 7. Calculez le taux de survie des neurones ASH en utilisant eq (2) ci-dessous.
Survie neuronale (%) =
(2)
Où Nsurvie et Ntotal sont le nombre de nématodes avec des neurones ASH GFP positifs et le nombre total de nématodes testés dans chaque groupe, respectivement.
- Essai d’évitement osmotique
- Divisez une plaque de NGM sans nourriture (9 cm) en zones normales (N) et pièges (T) par une ligne de glycérol de 8 M (~ 30 μL) au milieu. Étaler une ligne d’azoture de sodium de 200 mM (~20 μL) à environ 1 cm de la ligne de glycérol pour paralyser les nématodes traversant la barrière du glycérol dans la zone T.
- Transférer environ 200 nématodes chacun sur la zone N de trois plaques répliquées pour chaque groupe. Ajouter une goutte de butanedione à 1 % (~2 μL) sur la zone T (1 cm du bord de la plaque) pour attirer les nématodes. Couvrir immédiatement le couvercle de la boîte de Pétri et incuber à 23 °C pendant 90 min.
- Notez le nombre de nématodes sur les zones N et T au microscope. Calculez l’indice d’évitement à l’aide de eq (3)20.
Indice d’évitement =
(3)
Où N et T sont le nombre de nématodes dans les zones N et T, respectivement. Les données sont présentées comme des moyennes ±'écart-type (ET) de trois répétitions, représentatives des expériences indépendantes de >3. - Effectuez un test t non apparié à deux queues pour comparer les données des groupes astragale et témoin.
(2)
(3)4. Création d’une carte radar
- Ouvrez le logiciel graphique et importez les données de différents tests dans une nouvelle feuille. Entrez la colonne A(X) comme titre des axes radiaux, la colonne A(Y) comme données du groupe témoin et la colonne B(Y) comme données du groupe de traitement.
- Sélectionnez les données requises et cliquez sur Tracer | Spécialisé : Bouton Radar dans le menu de la barre d’outils pour générer un graphique radar.
- Double-cliquez sur l’axe radial et ajustez les étiquettes Échelle, Coche et Coche de chaque axe si nécessaire.
- Cliquez sur Fichier dans le menu et sélectionnez Exporter les graphiques pour enregistrer l’image sous *.tiff.
REMARQUE: Les sites Web du logiciel dans la table des matériaux fournissent des documents d’aide détaillés et des didacticiels vidéo sur la création de cartes radar.
Representative Results
La souche transgénique polyQ AM141 exprime fortement les protéines de fusion Q40::YFP dans les cellules musculaires de la paroi de son corps 7,21. Comme le montre la figure 1A, le phénotype agrégé discret de cette souche peut être identifié par le protocole d’imagerie et d’analyse automatisé décrit dans cet article. La quantité d’agrégats Q40::YFP dans les nématodes AM141 a augmenté de manière significative après 48 h à partir du stade L1. Cependant, cette tendance à l’augmentation a été inhibée par un traitement à l’astragalane (figure 1B), démontrant le potentiel protecteur de l’astragalane contre l’agrégation polyQ. En règle générale, 72 h ou 96 h peuvent être facilement utilisés comme points de temps pour compter les agrégats Q40::YFP afin d’évaluer l’effet anti-agrégation des échantillons de test. Dans ce protocole, les agrégats fluorescents du nématode AM141 ont été capturés par un système d’imagerie automatisé, bien que des microscopes à fluorescence puissent également être utilisés à cette fin7.
La souche HA759 de C. elegans exprime à la fois le marqueur GFP et Htn-Q150 dans ses neurones ASH sensoriels, entraînant une perte progressive et un dysfonctionnement de ces neurones11,13. Les nématodes ont été montés sur des coussinets d’agarose à 2 % pour déterminer la viabilité neuronale de l’ASH (Figure 2A) et visualisés au microscope pour détecter les neurones ash. Une perte de fluorescence GFP dans les neurones ASH bilatéraux dans les régions de la tête des nématodes indique la mort neuronale ASH (Figure 2B). Le taux de survie des neurones ASH chez les nématodes HA759 est de <40% dans le groupe témoin après incubation à 15 °C pendant 3 jours 7,20, ce qui indique une neurotoxicité médiée par polyQ. Par conséquent, ce test de survie neuronale ASH peut être utilisé pour évaluer visuellement les effets des composés testés sur les neurones de C. elegans, par exemple l’effet neuroprotecteur de l’astragalane mais pas du glycane Poria (Figure 2C).
Comme le dysfonctionnement du comportement est un symptôme clinique majeur dans les maladies polyQ, le test d’évitement chimiosensoriel (Figure 3A) utilisant un grand nombre de nématodes HA759 est conçu comme un test simplifié pour examiner l’effet des échantillons de test sur la perte fonctionnelle des neurones ASH médiés par l’agrégation polyQ. Comme le montre la figure 3B, l’indice d’évitement des nématodes HA759 dans le groupe témoin non traité était d’environ 0,5, semblable à ce qui avait été rapporté précédemment14. Fait intéressant, l’indice d’évitement a augmenté à >0,6 chez les nématodes traités par l’astragalane à 15 °C pendant 3 jours (Figure 3B), démontrant un effet neuroprotecteur du polysaccharide contre les troubles du comportement.
Pour évaluer la capacité neuroprotectrice globale des composés d’essai, les données des essais individuels ci-dessus peuvent être intégrées et présentées sous forme de diagramme radar pour plusieurs phénotypes, ce qui en fait une caractéristique unificatrice des phénotypes polyQ adaptés à la comparaison directe et à la visualisation directe. Comme le montre la figure 4, l’aire du triangle dans le groupe de traitement par astragalane est supérieure à celle du groupe témoin, ce qui indique les effets anti-polyQ du polysaccharide.
Figure 1: Effet de l’astragalane sur l’agrégation de polyQ40. (A) Images représentatives des nématodes AM141 après traitement avec ou sans astragalane pendant 96 h à 20 °C. Les images fluorescentes (panneaux de gauche) ont été acquises à partir de plaques de 384 puits à l’aide d’un système d’imagerie et d’analyse à haut contenu, et les agrégats Q40::YFP (panneaux de droite) ont été automatiquement identifiés par le système. Les encarts sont les vues agrandies d’images de nématodes montrant les agrégats polyQ. Barres d’échelle = 500 μm. (B) Quantification des agrégats Q40::YFP. Le nombre d’agrégats Q40::YFP dans les nématodes AM141 a été surveillé à l’aide du système d’imagerie à haute teneur toutes les 24 heures pendant 4 jours après le traitement avec ou sans astragalane à 20 °C. Environ 100 à 150 nématodes de chaque groupe ont été notés pour les agrégats à chaque point temporel. Les résultats sont présentés sous forme de courbes ajustées basées sur le nombre moyen d’agrégats par nématode. Abréviations: polyQ = polyglutamine; YFP = protéine fluorescente jaune; FITC = isothiocyanate de fluorescéine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Effet de l’astragalane sur la mort neuronale de l’ASH médiée par Htn-Q150. (A) Diagramme schématique de la préparation des lames d’agarose. (B) Micrographies représentatives des nématodes HA759 avec survie neuronale ASH et mort en utilisant un grossissement de 400x. Barres d’échelle = 20 μm. Les nématodes HA759 ont été photographiés à l’aide d’un microscope à fluorescence après traitement avec ou sans astragalane à 15 °C pendant 3 jours à partir de L1. (C) Effet protecteur de l’astragalane contre la mort neuronale DE CENDRE médiée par polyQ. Poria glycan, un polysaccharide de Poria cocos, a été utilisé comme témoin. Les données sont présentées comme des moyens ± SD de trois réplications, représentatives de plus de trois expériences indépendantes. L’analyse statistique a été effectuée à l’aide d’un test t à deux queues non apparié pour comparer les données du groupe témoin avec celles des groupes astragalan et Poria glycane. *p < 0,05; ns = pas significatif. Abréviation : GFP = protéine fluorescente verte. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3: Effet de l’astragalane sur le dysfonctionnement comportemental médié par Htn-Q150. (A) Diagramme schématique de la plaque d’essai d’évitement. (B) Résultats représentatifs de l’essai d’évitement. L’indice d’évitement a été défini comme le rapport entre les nématodes dans la zone N et le nombre total de nématodes sur la plaque. Les résultats sont présentés comme des moyens ± SD de trois répétitions, représentatives de trois expériences indépendantes. L’analyse statistique de l’indice d’évitement a été effectuée à l’aide d’un test t non apparié à deux queues. **p < 0,01. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Capacité neuroprotectrice globale de l’astragalane. Les données de trois essais différents sont importées dans le logiciel OriginPro pour créer un graphique radar, qui est présenté pour profiler l’effet général de l’astragalane sur plusieurs phénotypes médiés par polyQ. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Tableau 1. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Discussion
Étant donné que l’agrégation et la protéotoxicité des polyQ sont des caractéristiques importantes des troubles polyQ, tels que la maladie de Huntington13, nous recommandons l’utilisation de plusieurs modèles et méthodes pour évaluer de manière exhaustive la capacité neuroprotectrice des composés testés, y compris le test d’agrégation polyQ dans la souche AM141, le test de survie neuronale ASH dans la souche HA759 et le test d’évitement chimiosensoriel dans la souche HA759. Les protocoles présentés ici ont été utilisés pour évaluer les capacités neuroprotectrices des échantillons d’essai contre la toxicité polyQ, y compris les effets inhibiteurs sur l’agrégation polyQ et la neurotoxicité associée 7,14,15,16,17,19,20, démontrant leur potentiel dans la découverte de médicaments pour la MH et d’autres maladies polyQ.
Un système automatisé d’imagerie et d’analyse est introduit pour la détection et le comptage des agrégats polyQ dans le test d’agrégation polyQ. Cette méthode présente l’avantage d’être à haut débit et rapide et entraîne une réduction significative des erreurs subjectives dans le processus de comptage laborieux. Pour une plaque entière de 384 puits, il ne faut que <1 h pour terminer l’acquisition et l’analyse de l’image. Cependant, la méthode d’imagerie microscopique conventionnelle a également montré des performances similaires dans ce laboratoire sans utiliser le dispositif d’imagerie automatisé7.
Un total de 100 à 150 nématodes par traitement est recommandé dans un test d’agrégation Q40::YFP typique pour chaque point temporel, qui peut être effectué dans des puits répliqués contenant 10 à 15 nématodes chacun. Cependant, il convient de noter que les larves de L1 peuvent être plus sensibles à certains traitements ou à des concentrations plus élevées. Par conséquent, des doses plus élevées de composés d’essai pourraient inhiber leur croissance, conduisant à des résultats faussement positifs en raison d’une croissance lente et, par conséquent, d’une agrégation polyQ retardée. Habituellement, un essai de clairance des aliments peut être effectué pour répondre à cette préoccupation et assurer la plage de concentration appropriée des composés d’essai23.
Les nématodes transgéniques HA759 utilisés dans les tests de neurotoxicité polyQ coexpriment OSM-10::GFP et Htn-Q150, ce qui permet d’identifier sans ambiguïté les neurones sensoriels ASH bilatéraux. Par conséquent, la survie des neurones ASH est évaluée par la présence ou l’absence d’expression de GFP; habituellement, ~ 40-75% des neurones ASH dans les nématodes témoins sont morts 23,24. Fait intéressant, le fond génétique mutant pqe-1 (polyglutamine enhancer-1) dans la souche HA759 (pqe-1; Htn-Q150) accélère la toxicité médiée par le polyQ, entraînant la mort de la plupart des neurones ASH en trois jours, même à 15 °C, et donc cette souche est cultivée à 15 °C pour le test de survie neuronale, comme indiqué précédemment23,24.
La perte fonctionnelle des neurones ASH chez les nématodes HA759 peut se produire avant la détection de la mort cellulaire et des agrégats de protéines13; par conséquent, le test du comportement d’évitement osmotique est essentiel pour l’évaluation de la toxicité médiée par le polyQ. Pour minimiser l’impact potentiel des nématodes HA759 moins actifs à basse température sur les expériences comportementales, les plaques de test d’évitement sont incubées dans un incubateur humidifié à 23 °C plutôt qu’à 15 °C comme dans le test de survie neuronale utilisant cette souche. En outre, il a été rapporté que les nématodes transgéniques Htn-Q150/OSM-10::GFP sont très sensibles au toucher du nez; par conséquent, une autre détection de la fonction neuronale ASH est le test de toucher du nez13.
Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.
Acknowledgments
Nous remercions les anciens membres du huang Lab qui ont contribué à développer et à améliorer les protocoles utilisés dans cet article, en particulier Hanrui Zhang, Lingyun Xiao et Yanxia Xiang. Ce travail a été soutenu par le projet 111 (numéro de subvention B17018) et la Fondation des sciences naturelles de la province du Hebei (numéro de subvention H2020207002).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C. elegans strains | |||
| AM141 rmIs133 [unc-54p::Q40::YFP] |
Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/strain/AM141 | |
| HA759 rtIs11 [osm-10p::GFP + osm-10p::HtnQ150 + dpy-20(+)] |
Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/strain/HA759 | |
| E. coli strains | |||
| NA22 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/strain/NA22 | |
| OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/strain/OP50 | |
| Reagent | |||
| Agar | Shanghai EKEAR Bio-Technology Co., Ltd. | EQ1001-500G | https://www.ekear.com |
| Agarose | Biowest | 111860 | |
| Butanedione | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 80042427 | https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/d027c00e64c9404d9aa41391fbb59 5d0 |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | https://www.sigmaaldrich.cn/CN/zh/product/sigma/c8667?context=product |
| Glycerol | Aladdin Co., Ltd. | G116203 | https://www.aladdin-e.com/zh_cn/g116203.html |
| Peptone | Guangdong HuanKai Microbial Science and Technology Co., Ltd. | 050170B | https://www.huankai.com/show/21074.html |
| Sodium azide | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 80115560 | https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/5e981aa807664e26af 551e96ff5f07cd |
| Sodium hydroxide | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10019718 | https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/450dfdb1132a4d8a817 d3d8c68ec25e6 |
| Sodium hypochlorite solution | Guangzhou Chemical Reagent Factory | 7681-52-9 | http://www.chemicalreagent.com/product/DetailProduct.aspx?id=125 |
| Tryptone | Oxoid Ltd. | LP0042B | https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/LP0042B#/LP0042B |
| Yeast extract | Oxoid Ltd. | LP0021B | https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/LP0021B#/LP0021B |
| Equipment | |||
| 384-well cell culture plate | Nest Biotechnology Co., Ltd. | 761001 | https://www.cell-nest.com/page94?_l=en&product_id=85 |
| 48-well cell culture plate | Nest Biotechnology Co., Ltd. | 748001 | https://www.cell-nest.com/page94?_l=en&product_id=85 |
| 90 mm Petri dish | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | F611003 | https://www.sangon.com/productDetail?productInfo.code=F611003 |
| Autoclave | Panasonic | MLS-3781L-PC | |
| Dissecting microscope | ChongQing Optical Co., Ltd. | ZSA0745 | http://www.coicuop.com/plus/view.php?aid=64 |
| Fluorescence microscope | Guangzhou Micro-shot Optical Technology Co., Ltd. | Mshot MF31-LED | https://www.mshot.com/article/442.html |
| High-content imaging system | Molecular Devices | ImageXpress | https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems#High-Content-Imaging |
| Microcentrifuge | GeneCompany | GENESPEED X1 | https://www.genecompany.com/index.php/Home/Goods/goodsdetails/gid/189.html |
| Microscope digital camera | Guangzhou Micro-shot Optical Technology Co., Ltd. | MS60 | https://www.mshot.com/article/677.html |
| Microwave | Midea Corp. | M1-211A | https://www.midea.cn/10000/10000000001 00511264425.html |
| Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | https://www.sigmaaldrich.cn/CN/en/product/sigma/p7793?context=product |
| Shaker | Zhicheng Inc. | ZWY-2102C | http://www.zhicheng.net/Product/0865291356.html |
| Software | |||
| Image acquisition and analysis software | Molecular Devices | MetaXpress | https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/acquisition-and-analysis-software/metaxpress |
| OriginPro | OriginLab Corp. | Version 9.8.5.204 | 1. Software introduction: https://www.originlab.com/index.aspx?go=Products/Origin 2. Instruction for creating a radar chart: https://www.originlab.com/doc/Origin-Help/RadarChart-Graph 3. Video tutorial for creating a radar chart: https://www.originlab.com/videos/details.aspx?pid=1813 |
References
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