Summary
Ici, nous décrivons un protocole pour créer des organoïdes cardiaques humains (hHO) pertinents pour le développement en utilisant efficacement des cellules souches pluripotentes humaines par auto-organisation. Le protocole repose sur l’activation séquentielle des signaux de développement et produit des tissus cardiaques humains très complexes et fonctionnellement pertinents.
Abstract
La capacité d’étudier le développement cardiaque humain dans la santé et la maladie est fortement limitée par la capacité de modéliser la complexité du cœur humain in vitro. Le développement de plateformes plus efficaces semblables à des organes capables de modéliser des phénotypes in vivo complexes, tels que des organoïdes et des organes sur puce, améliorera la capacité d’étudier le développement cardiaque humain et les maladies. Cet article décrit un protocole pour générer des organoïdes cardiaques humains (hHO) très complexes par auto-organisation à l’aide de cellules souches pluripotentes humaines et activation progressive de la voie de développement à l’aide d’inhibiteurs de petites molécules. Les corps embryoïdes (EB) sont générés dans une plaque de 96 puits avec des puits à fond rond et à fixation ultra-basse, facilitant la culture en suspension de constructions individualisées.
Les EB subissent une différenciation en hHO par une stratégie de modulation de signalisation Wnt en trois étapes, qui implique une activation initiale de la voie Wnt pour induire le destin du mésoderme cardiaque, une deuxième étape d’inhibition Wnt pour créer des lignées cardiaques définitives et une troisième étape d’activation Wnt pour induire des tissus d’organes proépicardiques. Ces étapes, réalisées dans un format de 96 puits, sont très efficaces, reproductibles et produisent de grandes quantités d’organoïdes par course. L’analyse par imagerie par immunofluorescence du jour 3 au jour 11 de la différenciation révèle les première et deuxième spécifications du champ cardiaque et les tissus très complexes à l’intérieur des hHO au jour 15, y compris le tissu myocardique avec des régions de cardiomyocytes auriculaires et ventriculaires, ainsi que des chambres internes tapissées de tissu endocardique. Les organoïdes présentent également un réseau vasculaire complexe dans toute la structure et une paroi externe du tissu épicardique. D’un point de vue fonctionnel, les hHO battent de manière robuste et présentent une activité calcique normale déterminée par l’imagerie en direct Fluo-4. Dans l’ensemble, ce protocole constitue une plate-forme solide pour les études in vitro dans les tissus cardiaques humains ressemblant à des organes.
Introduction
Les malformations cardiaques congénitales (CHD) sont le type de malformation congénitale le plus courant chez l’homme et affectent environ 1% de toutes les naissances vivantes1,2,3. Dans la plupart des cas, les raisons des maladies coronariennes demeurent inconnues. La capacité de créer des modèles cardiaques humains en laboratoire qui ressemblent étroitement au cœur humain en développement constitue un pas en avant important pour étudier directement les causes sous-jacentes des maladies coronariennes chez l’homme plutôt que dans des modèles animaux de substitution.
La quintessence des modèles tissulaires cultivés en laboratoire sont les organoïdes, des constructions cellulaires 3D qui ressemblent à un organe d’intérêt pour la composition cellulaire et la fonction physiologique. Les organoïdes sont souvent dérivés de cellules souches ou de cellules progénitrices et ont été utilisés avec succès pour modéliser de nombreux organes tels que le cerveau4,5, le rein6,7, l’intestin8,9, le poumon10,11, le foie12,13 et le pancréas14,15 , pour n’en nommer que quelques-uns. Des études récentes ont émergé démontrant la faisabilité de créer des organoïdes cardiaques auto-assemblés pour étudier le développement cardiaque in vitro. Ces modèles comprennent l’utilisation de cellules souches embryonnaires (CSM) de souris pour modéliser le développement cardiaque précoce16,17 jusqu’à la spécification auriculo-ventriculaire18 et de cellules souches pluripotentes humaines (CSEh) pour générer des organoïdes cardio-endodermiques multi-germinaux19 et des cardioïdes chambrés20 avec une composition cellulaire très complexe.
Cet article présente un nouveau protocole de modulation WNT en 3 étapes pour générer des hHO très complexes de manière efficace et rentable. Les organoïdes sont générés dans des plaques de 96 puits, ce qui donne un système évolutif à haut débit qui peut être facilement automatisé. Cette méthode repose sur la création d’agrégats hPSC et le déclenchement des étapes de développement de la cardiogenèse, y compris la formation du mésoderme et du mésoderme cardiaque, la spécification du premier et du deuxième champ cardiaque, la formation d’organes proépicardiques et la spécification auriculo-ventriculaire. Après 15 jours de différenciation, les hHO contiennent toutes les principales lignées cellulaires présentes dans le cœur, des chambres internes bien définies, des chambres auriculaires et ventriculaires et un réseau vasculaire dans tout l’organoïde. Ce système organoïde cardiaque hautement sophistiqué et reproductible se prête à l’étude d’analyses structurelles, fonctionnelles, moléculaires et transcriptomiques dans l’étude du développement cardiaque, des maladies et du dépistage pharmacologique.
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Protocol
1. Culture et maintenance des CSEh
REMARQUE: Les CSP d’origine humaine (hiPSC) ou les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) doivent être cultivées pendant au moins 2 passages consécutifs après décongélation avant d’être utilisées pour générer des EB en vue de leur différenciation ou d’une cryoconservation ultérieure. Les cSEh sont cultivés dans un milieu PSC (voir le Tableau des matériaux) sur des plaques de culture à 6 puits revêtues de matrice extracellulaire de membrane sous-basale (BM-ECM). Lorsque vous effectuez des changements de milieu sur des CSEh dans des plaques à 6 puits, ajoutez le milieu directement à l’intérieur du puits plutôt que directement sur les cellules pour éviter le détachement ou le stress indésirable des cellules. Les utilisateurs doivent se méfier des milieux PSC préchauffés qui ne doivent pas être réchauffés à 37 °C; tous les supports PSC utilisés dans ce protocole étaient thermostables.
- Pour recouvrir les plaques de puits avec le BM-ECM, décongeler une aliquote du BM-ECM (stockée à -20 °C selon les instructions du fabricant) sur de la glace et mélanger 0,5 mg du BM-ECM avec 12 mL de milieu Eagle’s modifié du Dulbecco froid (DMEM)/F12 (stocké à 4 °C). Répartir 2 mL du mélange DMEM/F12-BM-ECM sur chaque puits d’une plaque de 6 puits et incuber à 37 °C pendant au moins 2 h.
- Pour décongeler les cellules, tout d’abord, décongelez le criovial hPSC dans une perle ou un bain-marie à 37 °C pendant 1 à 2 minutes jusqu’à ce que seule une petite quantité de glace soit visible. Transférer les cellules décongelées dans un tube de centrifugeuse et ajouter lentement 8 à 9 mL du milieu PSC complété par 2 μM de l’inhibiteur de ROCK, la thiazovivine (Thiaz), et centrifuger à 300 × g pendant 5 min. Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans le milieu PSC complété par 2 μM de Thiaz. Répartir les cellules dans le milieu de culture dans 1-2 puits en fonction de la concentration de cellules cryoviales et de la culture à 37 °C, 5% de CO2 pendant 24 h avant de changer le milieu PSC.
- Changez le milieu sur les cellules à des intervalles de 48 heures. Effectuez des lavages et des changements de milieu à l’aide de DMEM/F12 (1 mL/puits) et du milieu PSC (2 mL/puits), respectivement.
REMARQUE: Les lavages aident à éliminer les déchets cellulaires et les débris, tandis que les changements de milieux frais fournissent aux cellules une source renouvelée de nutriments. - Passage des cellules sur sous-fluidité (60-80% confluent) en aspirant le milieu, puis en lavant chaque puits avec 1 mL de 1x solution tamponnée au phosphate de Dulbecco (pas de calcium, pas de magnésium; DPBS). Aspirer le DPBS et ajouter 1 mL du réactif de dissociation pour les hPSC (voir le tableau des matériaux), suivi de l’aspiration de tous les films du réactif sauf un film mince après 10 s.
- Incuber pendant 2 à 5 minutes avec le film mince du réactif de dissociation pour les CSEh jusqu’à ce que des espaces se forment entre les cellules.
REMARQUE: Le temps d’arrêt de la dissociation dépend de la lignée cellulaire. - Ajouter 1 mL du milieu PSC complété par 2 μM de Thiaz (milieu PSC + Thiaz) au puits et tapoter doucement la plaque pour induire le détachement cellulaire. Pipeter les cellules détachées dans le milieu 1-2 fois pour briser les grandes colonies, et remettre en suspension les cellules dans le milieu PSC + Thiaz dans un rapport de puits 1: 6 (cellules de 1 puits remises en suspension dans 12 mL de milieu de culture). Replaquez les cellules sur des puits revêtus de BM-ECM.
2. Génération d’organoïdes cardiaques humains auto-assemblés en 3D
- Formation du corps embryoïde (EB) :
REMARQUE: Il est impératif de limiter les cellules différenciées observables avant la formation du corps embryoïde. Deux à trois puits d’une plaque de 6 puits à une confluence de 60 à 80% produiront suffisamment de cellules pour une seule plaque d’organoïdes de 96 puits. Tous les milieux doivent être alicités et réchauffés dans une perle ou un bain-marie à 37 °C avant tout changement de milieu afin de minimiser le choc thermique sur les EB ou les organoïdes (cela n’inclut pas les réactifs de dissociation cellulaire). Voir figure 1A,B.- Jour -2
- Pour créer des EB, le jour -2, lavez les CSEh sous-confluents (60-80% confluents) avec du DPBS pendant au moins 10 s pour laver les débris cellulaires et aspirer le DPBS.
- Pour détacher les cellules et les libérer dans un état unicellulaire, ajoutez 1 mL de réactif de dissociation cellulaire à température ambiante (voir le tableau des matériaux) à chaque puits pendant 3 à 6 minutes. Tapotez doucement la plaque ~ 5 fois par minute pour induire un détachement tout en vérifiant au microscope. Ajouter 1 mL de milieu PSC + Thiaz pour arrêter la réaction.
- Pour collecter les cellules et briser les agrégats restants, pipettez le média de haut en bas dans le puits 2 à 3 fois pour générer une suspension à cellule unique. Transférer la suspension monocellulaire dans un tube de centrifugeuse et tourner pendant 5 min à 300 × g.
- Pour obtenir la concentration cellulaire souhaitée, jeter le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 1 mL de milieu PSC + Thiaz. Comptez les cellules à l’aide d’un compteur cellulaire ou d’un hémocytomètre et diluez les cellules dans le milieu PSC + Thiaz à une concentration de 100 000 cellules / mL.
- Pour distribuer les cellules pour la formation d’EB, utilisez une pipette multicanal pour ajouter 100 μL (10 000 cellules) à chaque puits d’une plaque à 96 puits à fond rond ultra-faible. Centrifuger la plaque à 100 × g pendant 3 min et incuber pendant 24 h à 37 °C, 5% de CO2.
- Jour -1
- Retirer délicatement 50 μL de milieu de chaque puits et ajouter 200 μL de milieu frais de CSP réchauffé à 37 °C pour obtenir un volume final de 250 μL par puits. Incuber les cellules pendant 24 h à 37 °C, 5% de CO2.
REMARQUE: Retirer et ajouter soigneusement le milieu sur le côté du puits pour éviter de déranger les EB au fond du puits. En raison de la nature délicate des EB et de la culture en suspension, il est nécessaire de laisser un petit volume de liquide dans chaque puits lors du changement de milieu pour éviter de perturber les EB.
- Retirer délicatement 50 μL de milieu de chaque puits et ajouter 200 μL de milieu frais de CSP réchauffé à 37 °C pour obtenir un volume final de 250 μL par puits. Incuber les cellules pendant 24 h à 37 °C, 5% de CO2.
- Jour -2
- Différenciation des organoïdes cardiaques humains (hHO) :
REMARQUE: Tous les supports doivent être réchauffés dans un bain-marie ou un bain-marie à 37 °C avant tout changement de support. Retirer et ajouter soigneusement le milieu sur le côté du puits pour éviter de perturber les organoïdes en développement au fond du puits. Les lavages ne sont pas nécessaires entre les changements de milieu pour minimiser l’agitation et permettre l’élimination progressive des inhibiteurs et des facteurs de croissance. RPMI avec supplément de B-27 à 2% (Table des matériaux) a été utilisé tout au long du protocole de différenciation. Le supplément de B-27 contient de l’insuline sauf indication contraire (sans insuline dans les jours 0-5). Voir la figure 1C.- Jour 0
- Pour amorcer la différenciation vers une lignée mésodermique, retirer 166 μL de milieu de chaque puits (~2/3e du volume total du puits) et ajouter 166 μL de RPMI 1640 contenant un supplément de B-27 sans insuline, 6 μM CHIR99021, 1,875 ng/mL de protéine morphogénétique osseuse 4 (BMP4) et 1,5 ng/mL d’activine A pour une concentration finale de puits de 4 μM CHIR99021, 1,25 ng/mL BMP4 et 1 ng/mL d’Activine A. Incuber pendant 24 h à 37 °C, 5 % de CO2.
- Jour 1
- Retirer 166 μL de milieu de chaque puits et ajouter 166 μL de RPMI 1640 frais avec un supplément de B-27 sans insuline. Incuber pendant 24 h à 37 °C, 5% de CO2.
- Jour 2
- Pour induire la spécification du mésoderme cardiaque, retirer 166 μL de milieu de chaque puits et ajouter 166 μL de RPMI 1640 contenant un supplément de B-27 sans insuline et 3 μM Wnt-C59 pour une concentration finale du puits de 2 μM Wnt-C59. Incuber pendant 48 h à 37 °C, 5% de CO2.
- Jour 4
- Retirer 166 μL de milieu de chaque puits et ajouter 166 μL de RPMI 1640 frais avec un supplément de B-27 sans insuline. Incuber pendant 48 h à 37 °C, 5% de CO2.
- Jour 6
- Retirer 166 μL de milieu de chaque puits et ajouter 166 μL de RPMI 1640 avec le supplément de B-27. Incuber pendant 24 h à 37 °C, 5% de CO2.
- Jour 7
- Pour induire une différenciation proépicardique, retirer 166 μL de milieu de chaque puits et ajouter 166 μL de RPMI 1640 frais contenant du supplément de B-27 et 3 μM de CHIR99021 pour une concentration finale de puits de 2 μM CHIR99021. Incuber pendant 1 h à 37 °C, 5% de CO2.
- Retirer 166 μL de milieu de chaque puits et ajouter 166 μL de RPMI 1640 frais contenant du supplément de B-27. Incuber pendant 48 h à 37 °C, 5% de CO2.
REMARQUE: Une prudence supplémentaire est recommandée à ce deuxième changement de milieu le jour 7 car les organoïdes sont plus enclins au mouvement en raison des changements de média. - À partir du jour 7 jusqu’à la collecte ou le transfert pour analyse ou expérimentation, effectuer des changements de milieu toutes les 48 h en retirant 166 μL de milieu de chaque puits et ajouter 166 μL de RPMI 1640 frais contenant du supplément de B-27.
REMARQUE: Les organoïdes sont prêts pour les analyses et l’expérimentation au jour 15, sauf si des stades de développement plus précoces sont intéressants. Ils peuvent être cultivés au-delà du jour 15 pour des expériences de culture ou de maturation à long terme.
- Jour 0
3. Analyse organoïde
- Transfert d’organoïdes entiers (vivants ou fixes)
REMARQUE: Pour le transfert d’organoïdes vivants, assurez-vous que les embouts de pipette utilisés sont stériles.- Coupez la pointe d’une pointe de pipette P200 à 5-10 mm de l’ouverture de la pointe, ce qui donne une large ouverture d’environ 2-3 mm de diamètre.
- Insérez la pointe directement dans le puits à fond rond contenant l’organoïde afin que la pipette soit complètement verticale (perpendiculaire à la plaque). Assurez-vous que le piston de la pipette est déjà enfoncé avant d’insérer la pointe dans le milieu.
- Relâchez lentement le piston de la pipette, en prenant suffisamment de milieu (100-200 μL) pour recueillir l’organoïde.
- Transférer l’organoïde dans le milieu vers la destination cible (p. ex., pour la fixation, l’imagerie en direct, l’enregistrement électrophysiologique, la nouvelle culture sur plaque).
- Fixation des organoïdes
REMARQUE: La fixation et la coloration des organoïdes peuvent être effectuées soit dans la plaque de culture à 96 puits, soit dans des tubes de microcentrifugation. Le paraformaldéhyde (PFA) ne doit être manipulé que dans une hotte.- Pour la fixation dans des tubes de microcentrifugation, transférez les organoïdes vivants dans des tubes séparés avec 1 à 8 organoïdes par tube.
REMARQUE: Ne pas dépasser 8 organoïdes par tube. - Retirez et jetez soigneusement autant de milieu que possible du tube sans toucher les organoïdes.
- Ajouter 4 % de PFA à chaque tube ou puits (300-400 μL par tube de microcentrifugation et 100-200 μL par puits d’une plaque de 96 puits). Incuber à température ambiante pendant 30-45 min.
REMARQUE: Les temps d’incubation supérieurs à 1 h peuvent nécessiter des étapes de récupération de l’antigène et ne sont pas recommandés. - Jetez le PFA en toute sécurité sans déranger les organoïdes. Effectuer 3 lavages avec du DPBS complété par 1,5 g/L de glycine (DPBS/Gly), en utilisant le même volume que celui utilisé pour le PFA à 4%, en attendant 5 min entre les lavages. Retirer le DPBS/Gly et procéder à des analyses immunocolorantes ou autres ou ajouter du DPBS et conserver à 4 °C pour une utilisation future jusqu’à 2 semaines.
REMARQUE: Le stockage d’organoïdes fixes pendant plus de 2 semaines peut entraîner une dégradation et une contamination des tissus et n’est pas recommandé.
- Pour la fixation dans des tubes de microcentrifugation, transférez les organoïdes vivants dans des tubes séparés avec 1 à 8 organoïdes par tube.
- Coloration immunofluorescente de montage entier
- Ajouter 100 μL de solution bloquante/perméabilisante (10 % de sérum d’âne normal + 0,5 % d’albumine sérique bovine (BSA) + 0,5 % de Triton X-100 dans 1x DPBS) à chaque puits ou tube contenant les organoïdes fixes. Incuber à température ambiante pendant la nuit sur un shaker.
REMARQUE: Ne pas dépasser 8 organoïdes par tube. - Retirez et jetez soigneusement autant de solution bloquante que possible sans toucher les organoïdes. Effectuez 3 lavages avec DPBS, en attendant 5 minutes entre les lavages.
- Préparer la solution d’anticorps primaires (1 % de sérum d’âne normal + 0,5 % de BSA + 0,5 % de Triton X-100 dans 1x DPBS) avec les anticorps primaires souhaités aux concentrations recommandées. Incuber à 4 °C pendant 24 h sur un agitateur.
- Retirez et jetez soigneusement autant de solution d’anticorps que possible sans toucher les organoïdes. Effectuez 3 lavages avec DPBS, en attendant 5 minutes entre les lavages.
- Préparer une solution d’anticorps secondaires (1 % de sérum d’âne normal + 0,5 % de BSA + 0,5 % de Triton X-100 dans 1x DPBS) avec les anticorps secondaires souhaités aux concentrations recommandées. Si les anticorps sont marqués par fluorescence, incuber à 4 °C dans l’obscurité (p. ex., recouvert de papier d’aluminium) pendant 24 h sur un agitateur.
- Retirez et jetez soigneusement autant de solution d’anticorps que possible sans toucher les organoïdes. Effectuez 3 lavages avec DPBS, en attendant 5 minutes entre les lavages.
- Préparez les lames avec des perles (90-300 μm de diamètre) montées dans un support de montage (voir la Table des matériaux) près des bords de la diapositive où le couvercle avec les organoïdes sera placé.
REMARQUE: Il est recommandé de laisser sécher le support de montage autour des perles avant de continuer; cela empêchera les perles de se déplacer. Voir la figure 2. - Transférez les organoïdes colorés à l’aide d’une pointe de pipette coupée sur la glissière, entre les perles, en assurant l’espacement pour éviter tout contact entre les organoïdes une fois sur la lame. Utilisez le coin d’une lingette de laboratoire enroulée pour éliminer soigneusement l’excès de liquide autour de l’organoïde.
- Couvrir les organoïdes avec un milieu de montage-dégagement (la solution de nettoyage du fructose-glycérol est de 60% (vol/vol) de glycérol et de 2,5 M de fructose)37 en utilisant 120-150 μL du milieu de montage-dégagement par lame.
REMARQUE: Il est recommandé d’utiliser une pointe de pipette coupée lorsque vous travaillez avec le support de montage-dégagement car il est très visqueux. - Passez le curseur de couverture sur la glissière avec les organoïdes recouverts d’une solution de montage-dégagement et appuyez lentement sur le couvercle sur la glissière, en vous assurant que les organoïdes sont entre les perles montées.
- Scellez le périmètre du couvercle sur la glissière à l’aide d’un vernis à ongles de couche supérieure. Laisser sécher la lame dans l’obscurité à température ambiante pendant 1 h. Conserver à 4 °C dans l’obscurité pour un stockage à long terme.
- Ajouter 100 μL de solution bloquante/perméabilisante (10 % de sérum d’âne normal + 0,5 % d’albumine sérique bovine (BSA) + 0,5 % de Triton X-100 dans 1x DPBS) à chaque puits ou tube contenant les organoïdes fixes. Incuber à température ambiante pendant la nuit sur un shaker.
- Imagerie transitoire du calcium dans les organoïdes cardiaques vivants
NOTE: Selon les instructions du fabricant, Fluo4-AM a été reconstitué en sulfoxyde de diméthyle (DMSO) à une concentration finale en solution mère de 0,5 mM. Fluo4-AM a été ajouté directement au puits organoïde dans la plaque de 96 puits.- Effectuez 2 lavages sur les organoïdes à l’aide du milieu RPMI 1640.
- Retirer 166 μL du milieu usé du puits.
- Ajouter 166 μL de milieu RPMI 1640 réchauffé, retirer 166 μL de milieu et ajouter 166 μL de milieu RPMI 1640 frais.
REMARQUE: Les lavages sont effectués pour éliminer les déchets et les débris cellulaires. Les deux tiers du milieu sont retirés des puits pendant les lavages pour éviter de perturber les organoïdes au fond du puits avant le test fonctionnel.
- Ajouter le milieu Fluo4-AM aux organoïdes.
- Ajouter Fluo4-AM reconstitué dans du DMSO au RPMI 1640 contenant du supplément de B-27 pour préparer une solution de 1,5 μM.
- Retirer 166 μL de milieu du puits.
- Ajouter 166 μL de Fluo4-AM de 1,5 μM dans rpmI 1640 contenant du supplément de B-27 pour une concentration finale du puits de 1 μM. Incuber à 37 °C, 5 % de CO2 pendant 30 min.
- Effectuez 2 lavages comme à l’étape 3.4.1.
- Ajouter 166 μL de RPMI 1640 contenant du supplément de B-27 au puits.
- À l’aide d’une pointe coupée d’une pointe de pipette P200, transférez l’organoïde dans une boîte de Petri à fond de verre (par exemple, verre de couverture chambré à 8 puits avec verre de couverture haute performance n ° 1,5) avec 100 à 200 μL de milieu.
REMARQUE: Voir la section 3.1 sur le transfert d’organoïdes entiers. - Imagez les organoïdes vivant sous un microscope avec une chambre à température et CO2 contrôlée à 37 °C, 5% co2.
- Enregistrez plusieurs vidéos de 10 à 20 s à divers endroits de l’organoïde, montrant l’augmentation et la diminution des niveaux d’intensité de fluorescence à mesure que le calcium entre et sort des cellules.
REMARQUE: Pour les enregistrements haute résolution, il est recommandé d’enregistrer à une vitesse de 10 ips ou plus; 50 fps est recommandé. - Analysez les vidéos à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images (par exemple, ImageJ) en sélectionnant les régions d’intérêt et en mesurant les niveaux d’intensité au fil du temps.
- Normalisez les enregistrements d’intensité en utilisant ΔF/F0 par rapport au temps en millisecondes et tracez.
- Effectuez 2 lavages sur les organoïdes à l’aide du milieu RPMI 1640.
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Representative Results
Pour obtenir un hHO auto-organisé in vitro, nous avons modifié et combiné les protocoles de différenciation précédemment décrits pour la différenciation monocouche 2D des cardiomyocytes21 et des cellules épicardiques22 à l’aide de modulateurs de la voie Wnt et pour les organoïdes précardiaques 3D16 en utilisant les facteurs de croissance BMP4 et Activin A. En utilisant le protocole de différenciation EB et hHO à 96 puits décrit ici et illustré à la figure 1 , les concentrations et les durées d’exposition de l’activateur de la voie Wnt CHIR99021 ont été optimisées pour produire des hHO hautement reproductibles et complexes dérivés de CSP humains. Les CSEh ou les CSEh cultivés en milieu de CSP jusqu’à 60 à 80 % de confluence dans une formation semblable à une colonie avec une différenciation visible minime ou nulle sont idéales pour la génération d’EB (Figure 1B).
Les EB ont été autorisés à incuber pendant 48 h avec un changement moyen après 24 h avant de commencer la différenciation au jour 0. Le jour 0, les EB devraient apparaître sous la forme d’un agrégat sphérique sombre au centre de chaque puits sous un microscope optique (Figure 1B). Le protocole de différenciation commence le jour 0 avec l’activation de la voie Wnt et l’ajout de facteur de croissance pendant exactement 24 h. Cette induction du mésoderme suivie d’une induction du mésoderme cardiaque le jour 2 à l’aide de l’inhibiteur de la voie Wnt Wnt-C59 entraînera un élargissement significatif de l’organoïde d’environ 200 μm de diamètre à 500-800 μm de diamètre au jour 4 et jusqu’à 1 mm (les organoïdes peuvent connaître une légère réduction de taille au jour 15 (Figure 1C)). Le hHO commencera à battre dès le jour 6 (vidéo 1), avec 100% des organoïdes montrant des battements visibles au jour 10 (vidéo 2) (sauf si vous suivez un traitement médicamenteux ou si des CSEh inadéquats ont été utilisés pour générer les EB). Cela a été observé dans 5 lignées cellulaires hPSC distinctes23.
Pour évaluer la capacité des hHO à représenter différentes étapes du développement physiologique du cœur, nous avons recueilli des organoïdes à différents moments du protocole de différenciation et recherché la présence et l’expression transcriptomique de marqueurs du champ cardiaque. La coloration immunofluorescente du premier marqueur de champ cardiaque (FHF), HAND1, et du deuxième marqueur de champ cardiaque (SHF), HAND2, a révélé leur présence nucléaire dans ces cellules progénitrices cardiaques survenant vers le jour 3 et le jour 5, respectivement (Figure 3A).
L’expression des deux marqueurs se produit dans les régions des organoïdes dont la taille diminue après le jour 7 pour le FHF et après le jour 9 pour le SHF. Fait intéressant, les images à fort grossissement des organoïdes du jour 7 ont révélé que la plupart des cellules exprimant HAND1 étaient d’origine cardiomyocytaire (comme le montre le marqueur spécifique aux cardiomyocytes TNNT2). En revanche, de nombreuses cellules exprimant HAND2 n’exprimaient pas le marqueur cardiomyocytaire (Figure 3B). Cette observation est en accord avec les organoïdes précardiaques dérivés de CSE de souris démontrant le développement de cellules non myocytaires à partir de cellules progénitrices SHF16. Il est important de noter que les données de séquençage de l’ARN montrent que les transcriptions de l’ARN pour HAND1 et HAND2 ont été exprimées à partir du jour 3, le marqueur FHF étant plus fortement exprimé entre les jours 3 et 11 et le marqueur SHF étant plus fortement exprimé après le jour 13 (Figure 3C).
La coloration par immunofluorescence a révélé la présence de marqueurs de diverses lignées de type cellulaire qui composent le cœur humain. Tissu myocardique (identifiable à l’aide du marqueur spécifique au cardiomyocyte TNNT2) adjacent au tissu épicardique (marqué par le facteur de transcription nucléaire WT1 et le marqueur de membrane épithéliale TJP1) (Figure 4A). Des cellules endocardiques exprimant NFATC1 ont été détectées tapissant les parois de structures internes ressemblant à des chambres dans les organoïdes (figure 4B). Les cellules endothéliales dans un réseau de type vaisseau peuvent être vues dès le jour 13 de la différenciation (Figure 4C). Enfin, nous signalons la présence de fibroblastes cardiaques mélangés dans l’ensemble de l’organoïde (Figure 4D). Ces marqueurs de type cellulaire ont également été observés dans les profils d’expression génique RNA-Seq (Figure 4E). La composition des types de cellules dans les organoïdes, mesurée par la surface de l’organoïde qu’ils occupent, s’est avérée être d’environ 58% de cardiomyocytes, le reste comprenant des cellules cardiaques non myocytaires, y compris des cellules épicardiques (~15%), des cellules endocardiques (~13%), des fibroblastes cardiaques (~12%) et des cellules endothéliales (~1%) (Figure 4F).
La fonction électrophysiologique des organoïdes a été mesurée par imagerie calcique vivante de cellules individuelles dans des organoïdes entiers. L’intensité de la fluorescence Fluo-4 varie au fil du temps en raison de l’entrée et de la sortie du calcium de la cellule, révélant des potentiels d’action réguliers (Figure 5A). Les cartes thermiques montrant les intensités de calcium sur une région à fort grossissement de l’organoïde montrent l’intensité accrue due aux transitoires de calcium dans les cellules individuelles (Figure 5B et Vidéo 3).
Figure 1: Génération du corps embryoïde et étapes de différenciation des organoïdes cardiaques. (A) (1-2) Les cellules dissociées sont ensemencées dans des puits d’une plaque de fixation ultra-basse de 96 puits via une pipette multicanal. (3) La plaque de 96 puits est ensuite centrifugée, ce qui permet aux cellules de s’agréger au centre. (4) Au fil du temps, après l’ajout de facteurs de croissance et de modulateurs de voies, le corps embryoïde commence à se différencier en plusieurs lignées cardiaques et à former des populations cellulaires distinctes spatialement et physiologiquement pertinentes entourant les microchambres internes. (B) Images représentatives de la progression de la génération du corps embryoïde, commençant par une culture iPSC en 2 dimensions (à gauche) et se terminant par un corps embryoïde de jour 0 (à droite); barre d’échelle = 500 μm. (C) Résumé du protocole de différenciation des organoïdes cardiaques humains, y compris les modulateurs et les inhibiteurs des voies chimiques avec les points temporels et les durées et le développement d’images organoïdes respectives sous microscopie optique du jour 1 au jour 15; barre d’échelle = 500 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2 : Montage d’organoïdes entiers sur des diapositives pour l’imagerie. Étapes de préparation des diapositives et montage des organoïdes pour l’imagerie. (A) Placement de microbilles à la périphérie d’une lame de verre. (B) Couvrir les microbilles avec un support de montage. (C) Transfert d’organoïdes sur la glissière entre les billes et élimination de l’excès de liquide entourant les organoïdes. (D) Couvrir les organoïdes avec un support de dégagement/montage. (E) Placer le couvercle sur le dessus de la lame avec des organoïdes et des perles. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : La spécification du premier champ cardiaque et du deuxième champ cardiaque dans les hHO récapitule le développement physiologique du cœur humain. (A) Images d’immunofluorescence confocale du jour 3 au jour 11 hHOs montrant la formation de FHF (HAND1, en haut) et de SHF (HAND2, en bas), et de cardiomyocytes (TNNT2) et de colorant nucléaire DAPI; barres d’échelle = 500 μm. (B) Images à fort grossissement d’organoïdes du jour 7 montrant la colocalisation de HAND1 et HAND2 avec le marqueur cardiomyocytaire TNNT2; barres d’échelle = 50 μm. (C) Profils d’expression génique ARN-Seq du marqueur FHF HAND1 (rouge) et du marqueur SHF HAND2 (bleu) du jour 0 au jour 19. Abréviations: hHOs = organoïdes cardiaques humains; FHF = premier champ cardiaque; SHF = deuxième champ cardiaque; HAND = dérivés du cœur et de la crête neurale exprimés; TNNT2 = troponine cardiaque T2; DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Les hHO développent plusieurs lignées cardiaques. (A-D) Images d’immunofluorescence confocale du jour 15 hHOs montrant la formation de cardiomyocytes (TNNT2) et la coloration avec le colorant nucléaire DAPI dans les cellules cardiaques non myocytaires. (A) Organoïde entier et fort grossissement du marqueur épicardique WT1 (vert) et du marqueur de membrane épithéliale TJP1 (blanc) montrant des cellules épicardiques d’origine épithéliale sur le dessus et à côté du tissu myocardique; barre d’échelle = 500 μm, encart = 50 μm. (B) Expression du marqueur endocardique NFATC1 (vert) sur la paroi des chambres; barre d’échelle = 500 μm. (C) Réseau de vaisseaux endothéliaux dans les hHO montrés par PECAM1 (vert). Barre d’échelle = 500 μm. (D) Les marqueurs de fibroblastes cardiaques THY1 et VIM sont représentés en vert et en blanc, respectivement, répartis dans l’organoïde. Barre d’échelle = 500 μm. (E) Profils d’expression génique ARN-Seq des principaux types cellulaires présents dans les hHO des jours 0 à 19 de différenciation. Abréviations: hHOs = organoïdes cardiaques humains; TNNT2 = troponine cardiaque T2; DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole; WT1 = facteur de transcription de la tumeur-1 de Wilm; NFATC1 = facteur nucléaire cytoplasmique des lymphocytes T activés; PECAM1 = molécule d’adhésion des cellules endothéliales plaquettaires-1; VIM = vimentine. (F) Diagramme circulaire de la composition moyenne du type de tissu dans les hHO, calculé comme la zone en pourcentage avec le marqueur cellulaire respectif sur un organoïde entier par coloration nucléaire sur trois plans Z dans l’ensemble de l’organoïde à l’aide d’ImageJ. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Enregistrements transitoires de calcium vivant fluo-4 dans des organoïdes cardiaques humains vivants. (A) Enregistrements transitoires représentatifs du calcium de cardiomyocytes individuels dans des organoïdes entiers. (B) Carte thermique montrant les niveaux de calcium faibles et maximaux entre les potentiels d’action déterminés par l’intensité fluo-4; barres d’échelle = 10 μm. Veuillez cliquer ici pour afficher une version plus grande de cette figure.
Vidéo 1 : Imagerie en direct d’organoïdes représentatifs dérivés de CSEh au jour 6 de différenciation sous microscopie optique à température ambiante. Abréviation : hPSC = cellule souche pluripotente humaine. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
Vidéo 2: Imagerie en direct d’organoïdes représentatifs dérivés de cSEh au jour 15 de différenciation sous microscopie optique à température ambiante. Abréviation : hPSC = cellule souche pluripotente humaine. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
Vidéo 3: Enregistrement en direct d’organoïdes du jour 10 montrant une carte thermique des transitoires de calcium sous un microscope à fluorescence. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
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Discussion
Les progrès récents dans les cardiomyocytes dérivés de cellules souches humaines et d’autres cellules d’origine cardiaque ont été utilisés pour modéliser le développement cardiaque humain22,24,25 et la maladie26,27,28 et comme outils pour dépister les agents thérapeutiques29,30 et toxiques31,32 . Ici, nous rapportons un protocole facile à mettre en œuvre et hautement reproductible pour générer et différencier les EB en hHO très complexes. Ce protocole a été couronné de succès dans plusieurs lignées cellulaires, y compris les hPSC et les hESC23, montrant des fréquences de battement et une organisation de type cellulaire cohérentes. Ce protocole s’inspire des protocoles précédemment décrits pour la différenciation cardiomyocytaire24, la différenciation des cellules épicardiques22 et les organoïdes précardiaques dérivés des CSE16 de souris et optimise la modulation par étapes de la signalisation WNT canonique à l’aide d’inhibiteurs chimiques et de facteurs de croissance dans un milieu entièrement défini. Plusieurs méthodologies d’optimisation ont été utilisées dans la génération de ce protocole.
Tout d’abord, les concentrations d’inhibiteurs chimiques et les durées d’exposition, ainsi que l’ajout de facteurs de croissance, ont été optimisés pour l’environnement 3D et sont discutés dans des travaux antérieurs23. Ceux-ci ont été optimisés pour élucider les structures avec la complexité physiologique et la représentation du cœur humain in vivo , avec la composition physiologique et les rapports des cardiomyocytes aux types de cellules cardiaques non myocytaires (cellules épicardiques, fibroblastes cardiaques). Deuxièmement, la stratégie de changement de milieu des deux tiers permet une agitation minimale des EB / organoïdes, car ils sont en suspension près du fond du puits, tout en facilitant une exposition au gradient aux inhibiteurs chimiques et aux facteurs de croissance lorsque le milieu est rafraîchi. La combinaison de la différenciation du mésoderme cardiaque par l’activation de la voie Wnt, suivie de l’inhibition24, et de l’induction ultérieure de la spécification proépicardique via une deuxième activation de la voie Wnt22, permet à un seul protocole de produire des hHO très complexes. Les organoïdes atteignent 1 mm après 15 jours de différenciation et peuvent être facilement transférés pour des analyses et des essais vivants ou fixes. Troisièmement, compte tenu de la grande taille des organoïdes, l’utilisation de microbilles ou d’autres structures similaires pour maintenir l’espace entre la lame et le couvercle s’est avérée mieux préserver la structure 3D des organoïdes et améliorer le processus d’imagerie.
Ce modèle cardiaque humain en développement permet d’accéder à des stades autrement inaccessibles du développement cardiaque, tels que la spécification précoce du premier et du deuxième champ cardiaque - observée entre les jours 3 et 9 de différenciation - et l’organisation en cellules progénitrices cardiaques qui donnent naissance à des tissus cardiaques, y compris le myocarde, l’endocarde, l’épicarde, le vascularisation endothéliale et les fibroblastes cardiaques de soutien, qui ont été observés au jour 15 de la différenciation. Les types de tissus présents dans les organoïdes cardiaques dérivés de ce protocole sont très représentatifs du cœur fœtal humain à la fois dans la composition33 et le profil transcriptomique23,34. Ils peuvent donc faciliter les interactions tissu-tissu et cellule-cellule d’ordre supérieur ressemblant à celle du cœur in vivo. Ce protocole était très efficace et reproductible à travers les expériences et les lignées cellulaires, produisant des organoïdes qui comprennent principalement des cardiomyocytes et comprennent des cellules cardiaques non myocytaires, telles que les cellules épicardiques, les cellules endocardiques, les fibroblastes cardiaques et les cellules endothéliales, représentant la composition physiologique23,33,35.
Les analyses de l’ultrastructure des cardiomyocytes en formation par microscopie électronique à transmission et le développement de chambres et d’un réseau vasculaire par tomographie par cohérence optique et imagerie confocale sont discutés en détail dans des travaux antérieurs23. Un grand avantage de ce protocole organoïde cardiaque par rapport à d’autres protocoles existants récemment publiés17,18,19,20,36,37 est la formation robuste d’un réseau endothélial dans tout l’organoïde, permettant la capacité d’étudier le développement vasculaire et la maladie dans le cœur humain précoce, sans avoir besoin d’autres inductions externes au protocole. Enfin, l’analyse fonctionnelle des organoïdes cardiaques est réalisable grâce à diverses approches, y compris l’utilisation d’un colorant sensible au calcium pour suivre les transitoires de calcium dans les cardiomyocytes à travers l’organoïde. En utilisant la microscopie à haute résolution, nous avons enregistré l’intensité de fluorescence du calcium entrant et sortant des cellules et observé des potentiels d’action très représentatifs. D’autres méthodes d’analyse fonctionnelle possibles incluent l’utilisation d’une lignée transgénique avec un indicateur sensible au calcium ou l’enregistrement direct à l’aide d’un réseau de microélectrodes23.
Les organoïdes cardiaques décrits ici sont récapitulatifs du cœur fœtal humain en développement, mais sont limités dans la démonstration de caractéristiques plus matures, semblables à celles de l’adulte. Les protocoles futurs pourraient s’appuyer sur le protocole décrit ici pour induire la maturation de ces organoïdes et produire des constructions qui modélisent mieux le cœur adulte. De plus, ce protocole est conçu pour créer des modèles miniatures du cœur humain et se limite aux études de recherche sur le développement cardiaque et les maladies ou pour le dépistage pharmaceutique et peut ne pas convenir comme moyen d’intervention clinique tel que le remplacement du tissu cardiaque par transplantation. Dans l’ensemble, nous décrivons ici un protocole facile à suivre et rentable pour générer des organoïdes cardiaques humains hautement reproductibles et sophistiqués qui peuvent faciliter les études de recherche sur le développement cardiaque humain, l’étiologie des maladies et le dépistage pharmacologique.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le National Heart, Lung, and Blood Institute des National Institutes of Health sous les numéros de prix K01HL135464 et R01HL151505 et par l’American Heart Association sous le numéro de prix 19IPLOI34660342. Nous tenons à remercier le noyau de microscopie avancée de MSU et le Dr William Jackson du département de pharmacologie et de toxicologie de MSU pour l’accès aux microscopes confocaux, au noyau de microscopie IQ et au noyau de génomique MSU pour les services de séquençage. Nous tenons également à remercier tous les membres du Laboratoire Aguirre pour leurs précieux commentaires et conseils.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| Alexa Fluor 488 Donkey anti- mouse | Invitrogen | A-21202 | 1:200 |
| Alexa Fluor 488 Donkey anti- rabbit | Invitrogen | A-21206 | 1:200 |
| Alexa Fluor 594 Donkey anti- mouse | Invitrogen | A-21203 | 1:200 |
| Alexa Fluor 594 Donkey anti- rabbit | Invitrogen | A-21207 | 1:200 |
| Alexa Fluor 647 Donkey anti- goat | Invitrogen | A32849 | 1:200 |
| HAND1 | Abcam | ab196622 | Rabbit; 1:200 |
| HAND2 | Abcam | ab200040 | Rabbit; 1:200 |
| NFAT2 | Abcam | ab25916 | Rabbit; 1:100 |
| PECAM1 | DSHB | P2B1 | Rabbit; 1:50 |
| TNNT2 | Abcam | ab8295 | Mouse; 1:200 |
| THY1 | Abcam | ab133350 | Rabbit; 1:200 |
| TJP1 | Invitrogen | PA5-19090 | Goat; 1:250 |
| VIM | Abcam | ab11256 | Goat; 1:250 |
| WT1 | Abcam | ab89901 | Rabbit; 1:200 |
| Media and Reagents | |||
| Accutase | Innovative Cell Technologies | NC9464543 | cell dissociation reagent |
| Activin A | R&D Systems | 338AC010 | |
| B-27 Supplement (Minus Insulin) | Gibco | A1895601 | insulin-free cell culture supplement |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504-044 | cell culture supplement |
| BMP-4 | Gibco | PHC9534 | |
| Bovine Serum Albumin | Bioworld | 50253966 | |
| CHIR-99021 | Selleck | 442310 | |
| D-(-)-Fructose | Millipore Sigma | F0127 | |
| DAPI | Thermo Scientific | 62248 | 1:1000 |
| Dimethyl Sulfoxide | Millipore Sigma | D2650 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 10566016 | |
| Essential 8 Flex Medium Kit | Gibco | A2858501 | pluripotent stem cell (PSC) medium containing 1% penicillin-streptomycin |
| Fluo4-AM | Invitrogen | F14201 | |
| Glycerol | Millipore Sigma | G5516 | |
| Glycine | Millipore Sigma | 410225 | |
| Matrigel GFR | Corning | CB40230 | Basement membrane extracellular matrix (BM-ECM) |
| Normal Donkey Serum | Millipore Sigma | S30-100mL | |
| Paraformaldehyde | MP Biomedicals | IC15014601 | Powder dissolved in PBS Buffer – use at 4% |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffer Solution | Gibco | 10010049 | |
| Phosphate Buffer Solution (10x) | Gibco | 70011044 | |
| Polybead Microspheres | Polysciences, Inc. | 73155 | 90 µm |
| ReLeSR | Stem Cell Technologies | NC0729236 | dissociation reagent for hPSCs |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | |
| Thiazovivin | Millipore Sigma | SML1045 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | T8787 | |
| Trypan Blue Solution | Gibco | 1525006 | |
| VECTASHIELD Vibrance Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H170010 | |
| WNT-C59 | Selleck | NC0710557 | |
| Other | |||
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 02682002 | |
| 15 mL Falcon Tubes | Fisher Scientific | 1495970C | |
| 2 mL Cryogenic Vials | Corning | 13-700-500 | |
| 50 mL Reagent Reservoirs | Fisherbrand | 13681502 | |
| 6-Well Flat Bottom Cell Culture Plates | Corning | 0720083 | |
| 8 Well chambered cover Glass with #1.5 high performance cover glass | Cellvis | C8-1.5H-N | |
| 96-well Clear Ultra Low Attachment Microplates | Costar | 07201680 | |
| ImageJ | NIH | Image processing software | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional | 06-666 | laboratory wipes |
| Micro Cover Glass | VWR | 48393-241 | 24 x 50 mm No. 1.5 |
| Microscope Slides | Fisherbrand | 1255015 | |
| Moxi Cell Counter | Orflo Technologies | MXZ001 | |
| Moxi Z Cell Count Cassette – Type M | Orflo Technologies | MXC001 | |
| Multichannel Pipettes | Fisherbrand | FBE1200300 | 30-300 µL |
| Olympus cellVivo | Olympus | For Caclium Imaging, analysis with Imagej | |
| Sorvall Legend X1 Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004261 | |
| Thermal Mixer | ThermoFisher Scientific | 13-687-717 | |
| Top Coat Nail Varish | Seche Vite | Can purchase from any supermarket |
References
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