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Bioengineering

परमेबिलाइजेशन डिटेक्शन के साथ एक निरंतर प्रवाह, माइक्रो-इलेक्ट्रोपोरेशन सिस्टम का निर्माण और संचालन

Published: January 7, 2022 doi: 10.3791/63103
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1, 1
1The Department of Biomedical Engineering, Rutgers, The State University of New Jersey, 2The Department of Mechanical and Aerospace Engineering, Rutgers, The State University of New Jersey

Summary

यह प्रोटोकॉल लैब-ऑन-ए-चिप, माइक्रोफ्लुइडिक इलेक्ट्रोपोरेशन डिवाइस बनाने के लिए आवश्यक माइक्रोफैब्रिकेशन तकनीकों का वर्णन करता है। प्रायोगिक सेटअप एक निरंतर प्रवाह में नियंत्रित, एकल-सेल-स्तरीय अभिकर्मक करता है और इसे जनसंख्या-आधारित नियंत्रण के साथ उच्च थ्रूपुट तक बढ़ाया जा सकता है। वास्तविक समय में कोशिका झिल्ली परमेबिलाइजेशन की डिग्री की विद्युत रूप से निगरानी करने की क्षमता का प्रदर्शन करते हुए एक विश्लेषण प्रदान किया जाता है।

Abstract

वर्तमान चिकित्सीय नवाचार, जैसे कि सीएआर-टी सेल थेरेपी, वायरल-मध्यस्थता जीन वितरण पर बहुत अधिक निर्भर हैं। हालांकि कुशल, यह तकनीक उच्च विनिर्माण लागत के साथ है, जिसने जीन वितरण के लिए वैकल्पिक तरीकों का उपयोग करने में रुचि लाई है। इलेक्ट्रोपोरेशन जीन और अन्य बहिर्जात सामग्रियों के इंट्रासेल्युलर वितरण के लिए एक इलेक्ट्रो-भौतिक, गैर-वायरल दृष्टिकोण है। एक विद्युत क्षेत्र के आवेदन पर, कोशिका झिल्ली अस्थायी रूप से कोशिका में आणविक वितरण की अनुमति देती है। आमतौर पर, बड़ी संख्या में कोशिकाओं को संसाधित करने के लिए मैक्रोस्केल पर इलेक्ट्रोपोरेशन किया जाता है। हालांकि, इस दृष्टिकोण के लिए व्यापक अनुभवजन्य प्रोटोकॉल विकास की आवश्यकता होती है, जो प्राथमिक और मुश्किल-से-ट्रांसक्रिप्ट सेल प्रकारों के साथ काम करते समय महंगा है। लंबे प्रोटोकॉल विकास, कोशिकाओं को स्थिर करने के लिए पर्याप्त विद्युत-क्षेत्र शक्तियों को प्राप्त करने के लिए बड़े वोल्टेज की आवश्यकता के साथ मिलकर, माइक्रो-स्केल इलेक्ट्रोपोरेशन उपकरणों के विकास का नेतृत्व किया है। इन सूक्ष्म-इलेक्ट्रोपोरेशन उपकरणों को सामान्य माइक्रोफैब्रिकेशन तकनीकों का उपयोग करके निर्मित किया जाता है और उच्च थ्रूपुट क्षमताओं को बनाए रखने की क्षमता के साथ अधिक प्रयोगात्मक नियंत्रण की अनुमति देता है। यह काम एक माइक्रोफ्लुइडिक-इलेक्ट्रोपोरेशन तकनीक का निर्माण करता है जो निरंतर प्रवाह के तहत एकल-कोशिका स्तर पर कोशिका झिल्ली पारगम्यता के स्तर का पता लगाने में सक्षम है। हालांकि, यह तकनीक प्रति सेकंड संसाधित 4 कोशिकाओं तक सीमित थी, और इस प्रकार सिस्टम थ्रूपुट को बढ़ाने के लिए एक नया दृष्टिकोण प्रस्तावित और यहां प्रस्तुत किया गया है। सेल-जनसंख्या-आधारित प्रतिक्रिया नियंत्रण के रूप में निरूपित यह नई तकनीक, विभिन्न प्रकार की इलेक्ट्रोपोरेशन स्पंदन स्थितियों के लिए सेल परमेबिलाइजेशन प्रतिक्रिया पर विचार करती है और परीक्षण के तहत सेल प्रकार के लिए सबसे उपयुक्त इलेक्ट्रोपोरेशन पल्स स्थितियों को निर्धारित करती है। एक उच्च-थ्रूपुट मोड का उपयोग किया जाता है, जहां इस 'इष्टतम' पल्स को पारगमन में सेल निलंबन पर लागू किया जाता है। डिवाइस को बनाने, माइक्रोफ्लुइडिक प्रयोगों को स्थापित करने और चलाने और परिणामों का विश्लेषण करने के चरणों को विस्तार से प्रस्तुत किया गया है। अंत में, इस माइक्रो-इलेक्ट्रोपोरेशन तकनीक को हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) के लिए एचईके 293 कोशिकाओं में डीएनए प्लास्मिड एन्कोडिंग प्रदान करके प्रदर्शित किया जाता है।

Introduction

बायोमेडिकल अनुसंधान में वर्तमान चिकित्सीय नवाचार, जैसे कि सीएआर-टी (चिमेरिक एंटीजन रिसेप्टर इंजीनियर्ड टी सेल) सेल थेरेपी और सीआरआईएसपीआर (क्लस्टर नियमित रूप से इंटरस्पेस्ड शॉर्ट पैलिंड्रोमिक रिपीट डीएनए अनुक्रमों) / सीएएस 9 का उपयोग करके आनुवंशिक संपादन, इंट्रासेल्युलर स्पेस1 में बहिर्जात सामग्री को सफलतापूर्वक और कुशलता से वितरित करने की क्षमता पर बहुत अधिक निर्भर करता है। सीएआर-टी थेरेपी में, सेल थेरेपी निर्माण में जीन वितरण चरण करने के लिए स्वर्ण मानक वायरल वैक्टर2 का उपयोग कर रहा है। हालांकि वायरल-मध्यस्थता जीन वितरण एक कुशल वितरण पद्धति है, लेकिन इसमें कई कमियां भी हैं। इनमें विनिर्माण लागत, साइटोटॉक्सिसिटी, इम्युनोजेनेसिस, म्यूटेनेसिस / ट्यूमरजेनिसिस क्षमता, और वितरित किए जाने वाले जीन (ओं) पर आकार सीमाएं शामिलहैं। इन सीमाओं ने वैकल्पिक, गैर-वायरल वितरण प्रौद्योगिकियों के अनुसंधान और विकास को जन्म दिया है।

इलेक्ट्रोपोरेशन, वायरल-मध्यस्थता जीन वितरण का एक विकल्प, कोशिकाओं के डीएनए, आरएनए और प्रोटीन अभिकर्मक करने के लिए एक इष्टतम विद्युत पल्स वेवफॉर्म के आवेदन पर निर्भर करता है। बाहरी विद्युत क्षेत्र के आवेदन के बाद, कोशिका झिल्ली से संक्षेप में समझौता किया जाता है, जिससे सेल अन्यथा अभेद्य बहिर्जात सामग्री के इंट्रासेल्युलर वितरण के लिए अतिसंवेदनशील होजाता है। वायरल-मध्यस्थता वितरण की तुलना में, इलेक्ट्रोपोरेशन फायदेमंद है क्योंकि यह आम तौर पर सुरक्षित है, संचालित करने में आसान है, और इसमें कम परिचालन लागत है। इलेक्ट्रोपोरेशन छोटे और बड़े आणविक कार्गो दोनों को वितरित कर सकता है और वंश 5 की परवाह किए बिना कोशिकाओं को स्थानांतरित करने में कुशल हो सकताहै। इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद वांछनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए, यानी, अच्छी व्यवहार्यता और अच्छी इलेक्ट्रो-अभिकर्मक दक्षता, विभिन्न प्रकार के प्रयोगात्मक मापदंडों को सह-अनुकूलित करने की आवश्यकता है। इनमें सेल प्रकार6, सेल घनत्व, अणु एकाग्रता7, इलेक्ट्रोपोरेशन बफर गुण (जैसे, आणविक संरचना, चालकता और परासरण) 8, इलेक्ट्रोड आकार / ज्यामिति9, और विद्युत पल्स वेवफॉर्म (आकार, ध्रुवीयता, दालों की संख्या) 10 (एक चित्रण के लिए चित्रा 1 देखें) शामिल हैं। यद्यपि इनमें से प्रत्येक पैरामीटर इलेक्ट्रोपोरेशन प्रयोगों के परिणामों पर महत्वपूर्ण प्रभाव डाल सकता है, पल्स वेवफॉर्म का विशेष रूप से बहुत विस्तार से अध्ययन किया गया है, क्योंकि लागू पल्स (एस) की विद्युत ऊर्जा परिणामी सेल व्यवहार्यता और इलेक्ट्रो-अभिकर्मक दक्षता8 के बीच आंतरिक व्यापार-बंद की जड़ है।

आमतौर पर, इलेक्ट्रोपोरेशन प्रयोग मैक्रो-स्केल पर किए जाते हैं, जहां कोशिकाओं को इलेक्ट्रोपोरेशन क्यूवेट के भीतर बड़े, समानांतर-प्लेट इलेक्ट्रोड के एक सेट के बीच बफर के माइक्रोलीटर के 100 एस में निलंबित कर दिया जाता है। इलेक्ट्रोड आमतौर पर 1-4 मिमी की इलेक्ट्रोड दूरी के साथ एल्यूमीनियम से निर्मित होते हैं। एक बार जब कोशिकाओं को पिपेट के माध्यम से मैन्युअल रूप से लोड किया जाता है, तो क्यूवेट विद्युत रूप से एक भारी, विद्युत पल्स जनरेटर से जुड़ा होता है जहां उपयोगकर्ता सेल निलंबन को इलेक्ट्रोपोरेट करने के लिए पल्स वेवफॉर्म पैरामीटर सेट और लागू कर सकता है। यद्यपि मैक्रो-स्केल या बल्क इलेक्ट्रोपोरेशन सेल घनत्व >106 सेल / एमएल को संसाधित कर सकता है, लेकिन विद्युत पल्स वेवफॉर्म सेटिंग्स को अनुकूलित करते समय यह सुविधा बेकार हो सकती है। यह विशेष रूप से चिंता का विषय है जब प्राथमिक सेल प्रकारों को इलेक्ट्रोपोरेट किया जाता है जहां सेल जनसंख्या संख्या सीमित हो सकती है। इसके अतिरिक्त, इलेक्ट्रोड के बीच बड़ी दूरी के कारण, पल्स जनरेटर को विद्युत क्षेत्र की ताकत >1kV/ cm 11 प्राप्त करने के लिए बड़े वोल्टेज की आपूर्ति करने में सक्षम होना चाहिए। ये उच्च वोल्टेज इलेक्ट्रोलाइट बफर के माध्यम से प्रतिरोधक शक्ति अपव्यय का कारण बनते हैं जिसके परिणामस्वरूप जूल हीटिंग होती है, जो परिणामस्वरूप सेल व्यवहार्यता12 के लिए हानिकारक हो सकती है। अंत में, कोशिकाओं के घने निलंबन पर इलेक्ट्रोपोरेशन करने से परिणामस्वरूप इलेक्ट्रो-अभिकर्मक दक्षता और सेल व्यवहार्यता में जन्मजात परिवर्तनशीलता का बोझ लगातार पड़ेगा। निलंबन में प्रत्येक सेल आसपास की कोशिकाओं के कारण एक अलग विद्युत क्षेत्र की ताकत का अनुभव कर सकता है। इस बात पर निर्भर करता है कि अनुभवी विद्युत क्षेत्र की ताकत या तो बढ़ी है या कम हो गई है, परिणामस्वरूप सेल व्यवहार्यता या इलेक्ट्रो-अभिकर्मक दक्षता प्रत्येक नकारात्मक रूप से प्रभावित हो सकतीहै। मैक्रो-स्केल इलेक्ट्रोपोरेशन के इन डाउनसाइड्स ने वैकल्पिक प्रौद्योगिकियों की खोज और विकास को जन्म दिया है जो माइक्रो-स्केल पर काम करते हैं और एकल-सेल स्तर पर बेहतर नियंत्रण की अनुमति देते हैं।

बायोएमईएमएस, या बायोमेडिकल माइक्रो-इलेक्ट्रो-मैकेनिकल सिस्टम का क्षेत्र, माइक्रोइलेक्ट्रॉनिक उद्योग में की गई तकनीकी प्रगति से उपजा है। विशेष रूप से, बायोमेडिकल अनुसंधान की प्रगति के लिए माइक्रो-डिवाइस विकसित करने के लिए माइक्रोफैब्रिकेशन प्रक्रियाओं का उपयोग करना। इन प्रगतियों में विवो इलेक्ट्रिकल मॉनिटरिंग13 के लिए माइक्रो-इलेक्ट्रोड सरणियों का विकास, सीटू इलेक्ट्रोपोरेशन14 के लिए कैपेसिटिव माइक्रो-इलेक्ट्रोड, लघु अंग-ऑन-ए-चिप डिवाइस15, माइक्रोफ्लुइडिक पॉइंट-ऑफ-केयर डायग्नोस्टिक्स16, बायोसेंसर17, और दवा वितरण प्रणाली18 शामिल हैं, जिसमें नैनो और माइक्रो-इलेक्ट्रोपोरेशन डिवाइस 19,20,21 शामिल हैं। . जैविक कोशिकाओं के समान आकार के पैमाने पर उपकरणों को डिजाइन और निर्माण करने की क्षमता के कारण, नैनो- और माइक्रो-इलेक्ट्रोपोरेशन प्रौद्योगिकियां उनके मैक्रो-स्केल समकक्ष22,23 की तुलना में फायदेमंद हैं। ये इलेक्ट्रोपोरेशन डिवाइस उच्च वोल्टेज पल्स अनुप्रयोगों की आवश्यकता को समाप्त करते हैं, क्योंकि माइक्रोमीटर के 10 से 100 के बीच की दूरी वाले इलेक्ट्रोड सेट आमतौर पर एकीकृत होते हैं। यह सुविधा इलेक्ट्रोलाइट के माध्यम से वर्तमान को काफी कम कर देती है, जो बदले में विषाक्त इलेक्ट्रोलिसिस उत्पादों के संचय और इन प्रणालियों में जूल हीटिंग के प्रभाव को कम करती है। सूक्ष्म पैमाने के चैनल यह भी सुनिश्चित करते हैं कि पल्स अनुप्रयोग के दौरान कोशिकाओं पर एक अधिक समान विद्युत क्षेत्र मज़बूती से लागू होता है, जिसके परिणामस्वरूप अधिक सुसंगत परिणामहोते हैं। इसके अलावा, माइक्रो-इलेक्ट्रोपोरेशन उपकरणों को माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म में एकीकृत करना भी आम है जो भविष्य में पूरी तरह से स्वचालित तकनीक में एकीकरण के लिए खुद को उधार देताहै, सेल थेरेपी निर्माण में एक अत्यधिक वांछनीय क्षमता। अंत में, माइक्रो-स्केल इलेक्ट्रोपोरेशन इलेक्ट्रोपोरेशन घटनाओं की विद्युत पूछताछ की अनुमति देता है। उदाहरण के लिए, सेल झिल्ली परमेबिलाइजेशन की डिग्री को वास्तविक समय में एकल कोशिका स्तर26,27 पर निगरानी की जा सकती है। इस पद्धति का उद्देश्य माइक्रोफैब्रिकेशन, सिस्टम ऑपरेशन और माइक्रोफ्लुइडिक, सिंगल-सेल माइक्रो-इलेक्ट्रोपोरेशन डिवाइस के विश्लेषण का वर्णन करना है, जो इलेक्ट्रोपोरेशन प्रोटोकॉल को अनुकूलित करने के लिए सेल झिल्ली परमेबिलाइजेशन की डिग्री को मापने में सक्षम है, फिर भी पिछले अत्याधुनिक पर थ्रूपुट बढ़ रहा है।

एकल-कोशिका स्तर इलेक्ट्रोपोरेशन का प्रदर्शन अब एक नई तकनीक नहीं है, क्योंकि यह पहली बार 2001 में रुबिन्स्की एट अल द्वारा एक स्थिर सेल इलेक्ट्रोपोरेशन तकनीक28 के विकास के साथ प्रदर्शित किया गया था। उनका माइक्रो-डिवाइस अभिनव था क्योंकि वे विद्युतीकरण की घटना की विद्युत निगरानी करने की क्षमता का प्रदर्शन करने वाले पहले व्यक्ति थे। इसने स्थैतिक, एकल-सेल इलेक्ट्रोपोरेशन प्रौद्योगिकियों के विकास को आगे बढ़ाया है जो उपकरणों के थ्रूपुट को बढ़ाने के लिए समानांतर तरीके से सेल झिल्ली परमेबिलाइजेशन की डिग्री का विद्युत रूप से पता लगाने में सक्षम हैं। हालांकि, समानांतरकरण और बैच प्रोसेसिंग के साथ भी, इन उपकरणों में कोशिकाओं की कुल संख्या की गंभीर रूप से कमी होती है जो वे प्रति यूनिट समय29,30 को संसाधित कर सकते हैं। इस सीमा ने प्रवाह-माध्यम उपकरणों के विकास को जन्म दिया है जो एकल-कोशिका स्तर के माइक्रो-इलेक्ट्रोपोरेशन को बहुत अधिक थ्रूपुट31 पर करने में सक्षम हैं। यह उपकरण संक्रमण, स्थिर से प्रवाह-माध्यम से पर्यावरण तक, इलेक्ट्रोपोरेशन पल्स के आवेदन के बाद कोशिका झिल्ली परमेबिलाइजेशन की डिग्री की विद्युत निगरानी की क्षमता को सीमित करता है। इस काम में वर्णित विधि इन दो प्रौद्योगिकियों के बीच की खाई को पुल करती है, एक सूक्ष्म-इलेक्ट्रोपोरेशन तकनीक जो विद्युत यी रूप से पता लगाने, स्पंदन करने और व्यक्तिगत कोशिकाओं के सेल झिल्ली परमेबिलाइजेशन की डिग्री की निगरानी करने में सक्षम है, एक निरंतर-प्रवाह, सीरियल फैशन में।

इस तकनीक को हाल ही में झेंग एट अल में वर्णित किया गया था। उस काम में, इस तकनीक की क्षमताओं को एक पैरामीट्रिक अध्ययन के पूरा होने के साथ पेश किया गया था, जहां इलेक्ट्रोपोरेशन पल्स के आयाम और अवधि दोनों विविध थे, और आगामी विद्युत संकेत, कोशिका झिल्ली परमेबिलाइजेशन का संकेत,32 का पता लगाया गया था। परिणामों से पता चला है कि इलेक्ट्रोपोरेशन पल्स की तीव्रता में वृद्धि (यानी, लागू विद्युत क्षेत्र में वृद्धि या पल्स अवधि में वृद्धि) ने मापा कोशिका झिल्ली परमेबिलाइजेशन में वृद्धि का कारण बना। सिस्टम को और मान्य करने के लिए, सफल इलेक्ट्रोपोरेशन का एक सामान्य फ्लोरोसेंट संकेतक, प्रोपिडियम आयोडाइड33, सेल निलंबन में जोड़ा गया था, और विद्युत पल्स के आवेदन के तुरंत बाद एक प्रतिदीप्ति छवि कैप्चर की गई थी। ऑप्टिकल सिग्नल, यानी, सेल के अंदर प्रोपिडियम आयोडाइड की प्रतिदीप्ति तीव्रता, इस विद्युत माप की विश्वसनीयता को सत्यापित करते हुए, कोशिका झिल्ली परमेबिलाइजेशन की डिग्री के विद्युत माप के साथ दृढ़ता से सहसंबद्ध थी। हालांकि, इस काम ने केवल छोटे अणु प्रोपिडियम आयोडाइड के वितरण पर विचार किया, जिसका कोई हस्तांतरणीय महत्व नहीं है।

इस काम में, जैविक रूप से सक्रिय प्लास्मिड डीएनए (पीडीएनए) वेक्टर प्रदान करते समय सिस्टम के थ्रूपुट में सुधार करने और इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद पुन: उत्पन्न और सुसंस्कृत कोशिकाओं की इलेक्ट्रो-अभिकर्मक दक्षता का आकलन करने के लिए इस तकनीक का एक नया अनुप्रयोग पेश किया गया है। हालांकि पिछले काम ने मौजूदा माइक्रो-इलेक्ट्रोपोरेशन प्रौद्योगिकियों से बेहतर प्रदर्शन किया है जो विद्युतीकरण की घटना को विद्युत रूप से मापने में सक्षम हैं, डिवाइस की वर्तमान स्थिति को अभी भी सेल डिटेक्शन, पल्स एप्लिकेशन और सेल झिल्ली परमेबिलाइजेशन माप करने के लिए इलेक्ट्रोड सेट (~ 250 एमएस) के बीच लंबे सेल पारगमन समय की आवश्यकता होती है। एक एकल चैनल के साथ, यह थ्रूपुट को 4 कोशिकाओं / एस तक सीमित करता है। इस सीमा का मुकाबला करने के लिए, पीडीएनए इलेक्ट्रो-अभिकर्मक करने के लिए सेल-जनसंख्या-आधारित प्रतिक्रिया-नियंत्रित इलेक्ट्रोपोरेशन की एक नई अवधारणा पेश की गई है। हाइपो-फिजियोलॉजिकल चालकता इलेक्ट्रोपोरेशन बफर का उपयोग करके, यह प्रणाली इलेक्ट्रोपोरेशन पल्स अनुप्रयोगों की भीड़ में एकल कोशिकाओं की विद्युत पूछताछ की अनुमति देती है। विद्युत प्रतिक्रिया के आधार पर, एक 'इष्टतम' इलेक्ट्रोपोरेशन पल्स तब निर्धारित किया जाता है। एक 'उच्च-थ्रूपुट' मोड तब लागू किया जाता है जहां कोशिका झिल्ली पारगम्यता निर्धारण शून्य हो जाता है, प्रवाह दर बढ़ जाती है, और इलेक्ट्रोड के बीच पारगमन में प्रति सेल एक पल्स सुनिश्चित करने के लिए इलेक्ट्रोपोरेशन पल्स ड्यूटी चक्र को सेल ट्रांजिट समय से मिलान किया जाता है। यह काम माइक्रो-डिवाइस के निर्माण के लिए माइक्रोफैब्रिकेशन चरणों, प्रयोग करने के लिए आवश्यक सामग्री / उपकरण और उनके सेटअप, और डिवाइस के संचालन / विश्लेषण और इसकी इलेक्ट्रो-अभिकर्मक दक्षता (ईटीई) में व्यापक विवरण प्रदान करेगा।

Figure 1
(बाएं) सेल सस्पेंशन- इलेक्ट्रोपोरेशन की शुरुआत से पहले विचार करने के लिए महत्वपूर्ण कारकों में शामिल हैं: पेलोड (इस मामले में, पीडीएनए), एकाग्रता, सेल घनत्व और इलेक्ट्रोपोरेशन बफर गुण। विचार करने के लिए इलेक्ट्रोपोरेशन बफर गुण चालकता, परासरण और इन मूल्यों में योगदान देने वाली सटीक आणविक संरचना हैं। (मध्य) पल्स अनुप्रयोग- सटीक पल्स-प्रकार (वर्ग तरंग बनाम घातीय क्षय) और पल्स वेवफॉर्म (एकल पल्स बनाम पल्स ट्रेन) को परिणामी सेल व्यवहार्यता और इलेक्ट्रो-अभिकर्मक दक्षता दोनों को अधिकतम करने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। इलेक्ट्रोपोरेशन प्रक्रियाओं में कार्यान्वित सामान्य पल्स ट्रेनें आमतौर पर उच्च वोल्टेज (एचवी) दालों की एक श्रृंखला या एचवी और लो वोल्टेज (एलवी) पल्स परिमाण के बीच घूमने वाली दालों की श्रृंखला से बनी होती हैं। (दाएं) सेल रिकवरी-डाउन-स्ट्रीम प्रोसेसिंग चरण, विशेष रूप से, रिकवरी सेल कल्चर मीडिया जिसे कोशिकाओं को स्थानांतरित किया जाता है, को अनुकूलित किया जाना चाहिए। चित्रित नहीं (सुदूर बाएं), समग्र इलेक्ट्रोपोरेशन प्रक्रिया अनुकूलन के लिए अतिरिक्त अपस्ट्रीम सेल प्रोसेसिंग चरणों को लागू किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Protocol

नोट: उपयोगकर्ताओं को इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली सामग्रियों और आपूर्ति के लिए सभी एमएसडीएस की समीक्षा करनी चाहिए। प्रत्येक चरण में उपयुक्त पीपीई पहना जाना चाहिए और प्रयोग के दौरान बाँझ तकनीक का उपयोग किया जाना चाहिए। खंड 1-7 डिवाइस निर्माण पर चर्चा करते हैं।

1. डिवाइस निर्माण- मास्क डिजाइन

नोट: माइक्रोफैब्रिकेशन प्रक्रिया के चित्रण के लिए चित्रा 2 देखें। माइक्रोफैब्रिकेशन चरणों को एक स्वच्छ कमरे के वातावरण में किया जाना है। अतिरिक्त पीपीई आवश्यक है (हेयर नेट, चेहरे के बालों का जाल, मास्क, क्लीनरूम सूट, जूता कवर)।

  1. पसंद का एक सीएडी सॉफ्टवेयर स्थापित करें, माइक्रोफ्लुइडिक चैनल और इलेक्ट्रोड दोनों का 2-आयामी 'मास्क' डिजाइन करें और वांछित फ़ाइल प्रारूप (यानी, .dxf, .dwg) में डिजाइन को सहेजें।
    नोट: 2-आयामी मास्क योजनाबद्ध के उदाहरण के लिए पूरक चित्र 1 देखें।
  2. मुद्रित होने के लिए पसंद के आपूर्तिकर्ता को भेजें। सुनिश्चित करें कि डिजाइन के आयाम आपूर्तिकर्ता की संकल्प क्षमताओं के भीतर हैं।

2. डिवाइस निर्माण- फोटोलिथोग्राफी

नोट: प्रदान किए गए माइक्रोफैब्रिकेशन व्यंजनों को फोटोरेसिस्ट निर्माता की सिफारिशों से अपनाया जाता है और केवल शुरुआती बिंदु34 के रूप में उपयोग किया जाना चाहिए। बेकिंग समय, एक्सपोजर समय आदि के लिए सटीक मूल्यों को प्रत्येक निर्माण प्रोटोकॉल के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता है। सिलिकॉन वेफर्स और ग्लास स्लाइड दोनों को संभालने के लिए वेफर ट्वीज़र्स का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है।

  1. माइक्रोफ्लुइडिक चैनल निर्माण
    1. सिलिकॉन वेफर और सोडा-लाइम ग्लास स्लाइड सफाई: सिलिकॉन वेफर और 1 "× 3" सोडा-लाइम ग्लास स्लाइड सफाई (दोनों को 'सब्सट्रेट' कहा जाता है) करने के लिए चरण 2.1.2-2.1.3 का पालन करें।
    2. सब्सट्रेट्स को एसीटोन स्नान, एक आइसोप्रोपेनॉल (आईपीए) स्नान और एक विआयनीकृत जल स्नान में 10 मिनट के लिए डुबोएं। कमरे के तापमान पर इस 3-चरणीय धोने को क्रमिक रूप से करें।
    3. दबाव युक्त नाइट्रोजन या फ़िल्टर किए गए वायु गैस स्रोत का उपयोग करके सतह को हटा दें और सुखाएं। शेष नमी के वाष्पीकरण की अनुमति देने के लिए सब्सट्रेट्स को न्यूनतम 30 मिनट के लिए 150 डिग्री सेल्सियस ओवन में रखें।
    4. सिलिकॉन वेफर पर एसयू -8 फोटोलिथोग्राफी: चरण 2.1.5-2.1.14 का पालन करते हुए सिलिकॉन वेफर पर फोटोलिथोग्राफी करें।
      नोट: 20 μm की माइक्रोफ्लुइडिक चैनल ऊंचाई प्राप्त करने के लिए, SU-8 2000 श्रृंखला नकारात्मक फोटोरेसिस्ट का उपयोग किया गया था। एसयू -8 (यानी, 2010, 2015, आदि) के निर्माण के आधार पर सटीक स्पिन दरें अलग-अलग होंगी; हालांकि, निम्नलिखित शर्तें एसयू -8 2010 फॉर्मूलेशन35 के लिए हैं।
    5. 150 डिग्री सेल्सियस ओवन से सिलिकॉन वेफर को निकालें और इसे कमरे के तापमान (आरटी) पर ठंडा होने दें।
    6. स्पिन कोटर के वैक्यूम सिस्टम का उपयोग करके वेफर स्पिन कोटर के चक पर वेफर को सुरक्षित करें। स्पिनर को प्रोग्राम करें। चरण 1 - 100 आरपीएम / सेकंड के त्वरण पर 10 सेकंड के लिए 500 आरपीएम, चरण 2 - 30 सेकंड के लिए 300 आरपीएम / सेकंड के त्वरण पर 1000 आरपीएम।
    7. सिलिकॉन वेफर के केंद्र पर एसयू -8 2010 फोटोरेसिस्ट के 4 एमएल वितरित करें। प्रोग्राम चलाएँ। एक बार सिस्टम बंद हो जाने के बाद, वैक्यूम को बंद कर दें।
    8. चिमटी का उपयोग करके, नरम बेक के लिए 4-5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर गर्म प्लेट पर एसयू -8 लेपित सिलिकॉन वेफर स्थानांतरित करें। फिर वेफर को गर्म प्लेट से निकालें और इसे आरटी में ठंडा होने दें।
      नोट: प्रयोगशाला-विशिष्ट फोटोलिथोग्राफिक मास्क संरेखक के लिए उचित स्टार्ट अप प्रक्रिया का पालन करें।
    9. मास्क धारक पर 2 डी माइक्रोफ्लुइडिक चैनल डिजाइन के साथ फोटोमास्क सुरक्षित करें। सिलिकॉन वेफर डालें, जिसमें एसयू -8 कोटिंग ऊपर की ओर है, वेफर चक पर।
    10. 150 एमजे / सेमी2 के लिए एक्सपोज़र सेटिंग्स सेट करें और मशीन चलाएं।
      चेतावनी: संभावित आंखों की क्षति से बचने के लिए सीधे यूवी प्रकाश स्रोत को न देखें।
    11. एसयू -8 लेपित सिलिकॉन वेफर को पोस्ट-एक्सपोज़र बेक के लिए 4-5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर गर्म प्लेट पर रखें।
    12. एसयू -8 डेवलपर समाधान में सिलिकॉन वेफर को 3-4 मिनट के लिए डुबोएं ( सामग्री की तालिका देखें)। कोमल आंदोलन लागू करें। घोल से वेफर निकालें और आईपीए के साथ सतह को कुल्ला करें।
    13. दबाव युक्त नाइट्रोजन या फ़िल्टर किए गए वायु गैस स्रोत का उपयोग करके सतह को सुखाएं। यूवी फिल्टर का उपयोग करके माइक्रोस्कोप के तहत सुविधाओं का निरीक्षण करें और सुनिश्चित करें कि माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों में कोई स्पष्ट दोष नहीं है।
    14. सिलिकॉन वेफर को हार्ड बेक के लिए न्यूनतम 30 मिनट के लिए 150 डिग्री सेल्सियस ओवन में रखें।
    15. आरटी को ठंडा करने की अनुमति दें और चैनल साइडवॉल की सटीक ऊंचाई और ढलान को मापने के लिए स्टाइलस प्रोफाइलोमेट्री का उपयोग करें।
  2. ग्लास स्लाइड्स पर फोटोलिथोग्राफी
    नोट: हेक्सामेथिलडिसिलाज़ेन (एचएमडीएस) का उपयोग एस 1818 पॉजिटिव फोटोरेसिस्ट36 के लिए आसंजन प्रमोटर के रूप में किया जाता है।
    1. ग्लास स्लाइड को 150 डिग्री सेल्सियस ओवन से निकालें और इसे आरटी तक ठंडा होने दें।
    2. वैक्यूम का उपयोग करके स्पिनर के चक पर ग्लास स्लाइड को सुरक्षित करें और स्पिनर को प्रोग्राम करें। चरण 1 - 100 आरपीएम / सेकंड के त्वरण पर 10 सेकंड के लिए 500 आरपीएम। चरण 2 - 30 के लिए 3000 आरपीएम 300 आरपीएम / सेकंड का त्वरण बैठता है।
    3. ग्लास स्लाइड की सतह पर एचएमडीएस की 3-4 बूंदें वितरित करें। प्रोग्राम चलाएँ।
      नोट: ~ 3 μm की सतह कोटिंग प्राप्त करने के लिए, S1800 सकारात्मक फोटोरेसिस्ट श्रृंखला का उपयोग किया जाना चाहिए। सूत्रीकरण के आधार पर सटीक स्पिन दरें अलग-अलग होंगी; नीचे दी गई सिफारिशें एस 1818 फॉर्मूलेशन34 के लिए हैं।
    4. ग्लास स्लाइड की सतह पर 1 एमएल फोटोरेसिस्ट वितरित करें। सतह क्षेत्र को कवर करने के लिए पर्याप्त सुनिश्चित करें।
    5. प्रोग्राम चलाएँ। एक बार सिस्टम रुकने के बाद, वैक्यूम को बंद कर दें, और ग्लास स्लाइड को हटा दें।
    6. नरम बेक के लिए 4 मिनट के लिए 120 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म प्लेट पर एस 1818 लेपित ग्लास स्लाइड रखें। निकालें और आरटी पर आने की अनुमति दें।
    7. मास्क धारक पर 2 डी इलेक्ट्रोड डिज़ाइन के साथ फोटोमास्क सुरक्षित करें।
    8. ग्लास स्लाइड डालें और संरेखित करें, जिसमें एस 1818 कोटिंग ऊपर की ओर, वेफर चक पर है। 250 एमजे / सेमी2 के लिए एक्सपोज़र सेटिंग्स सेट करें और मशीन चलाएं।
      नोट: विभिन्न संपर्क संरेखक मॉडल गैर-परिपत्र, अलग-अलग मोटाई सब्सट्रेट्स के लिए कम या ज्यादा समायोजित हो सकते हैं।
    9. ग्लास स्लाइड को एमएफ -319 डेवलपर समाधान में 2 मिनट के लिए डुबोएं। कोमल आंदोलन लागू करें। कांच की स्लाइड की सतह को विआयनीकृत पानी से धो लें।
    10. दबाव युक्त नाइट्रोजन या फ़िल्टर किए गए वायु गैस स्रोत का उपयोग करके सतह को सुखाएं और यूवी फ़िल्टर का उपयोग करके माइक्रोस्कोप के तहत सुविधाओं का निरीक्षण करें। सुनिश्चित करें कि लिथोग्राफिक पैटर्न में कोई स्पष्ट दोष नहीं हैं।
    11. ग्लास स्लाइड को 150 डिग्री सेल्सियस ओवन में रखें, यह सुनिश्चित करते हुए कि हार्ड बेक के लिए कम से कम 30 मिनट के लिए ब्याज की सब्सट्रेट सतह सामने आ रही है। ओवन से निकालें और प्रकाश से सुरक्षित रखें।

3. डिवाइस निर्माण: हाइड्रोफ्लोरिक एसिड (एचएफ) एच

चेतावनी: इस कदम में हाइड्रोफ्लोरिक एसिड (एचएफ) की हैंडलिंग और निपटान शामिल है, जो गहरे, दर्दनाक रासायनिक जलने का कारण बन सकता है। हैंडलर (फेस शील्ड, कोहनी की लंबाई वाले रासायनिक प्रतिरोधी दस्ताने, आस्तीन के साथ रासायनिक रूप से प्रतिरोधी एप्रन) की रक्षा के लिए अतिरिक्त पीपीई का उपयोग किया जाना चाहिए। कैल्शियम ग्लूकोनेट एसिड न्यूट्रलाइज़र और स्किन जेल को लैब बेंच की निकटता में रखा जाना चाहिए। यह कदम अकेले नहीं किया जाना चाहिए। एचएफ को कभी भी कांच के कंटेनरों में संग्रहीत या वितरित नहीं किया जाना चाहिए क्योंकि कंटेनर एसिड द्वारा उकेरा जाएगा।

नोट: एचएफ समान रूप से उजागर ग्लास (यानी, इलेक्ट्रोड डिज़ाइन) को ग्लास में अवकाश बनाने के लिए जोड़ता है, जिससे धातु के जमाव के बाद इलेक्ट्रोड पैटर्न के बेहतर किनारे रिज़ॉल्यूशन की अनुमति मिलती है (खंड 4)।

  1. ग्लास स्लाइड को पॉलीटेट्राफ्लोरोएथिलीन कंटेनर में 1 मिनट के लिए 10: 1 बफर एचएफ समाधान में डुबोएं। कांच की स्लाइड्स को विआयनीकृत पानी में स्थानांतरित करें और धो लें। वॉश स्टेप को 3 बार दोहराएं।
  2. दबाव युक्त नाइट्रोजन या फ़िल्टर किए गए वायु गैस स्रोत का उपयोग करके सतह को सुखाएं। किसी भी शेष नमी को हटाने के लिए रात भर 65 डिग्री सेल्सियस ओवन में ग्लास सब्सट्रेट रखें। सबस्ट्रेट्स को प्रकाश से कवर करें।

4. डिवाइस निर्माण: भौतिक वाष्प जमाव

नोट: इस चरण में इलेक्ट्रोड पैटर्न को परिभाषित करने के लिए ग्लास स्लाइड सब्सट्रेट्स पर धातु का जमाव शामिल है। आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले धातु इलेक्ट्रोड क्रोमियम / सोना और टाइटेनियम / प्लैटिनम हैं। सोना और प्लैटिनम ग्लास सब्सट्रेट का पालन नहीं करते हैं, इसलिए आसंजन37 को बढ़ावा देने के लिए क्रमशः क्रोमियम या टाइटेनियम की एक बीज आसंजन परत की आवश्यकता होती है।

  1. इन-हाउस पीवीडी सिस्टम को संचालित करने के लिए क्लीनरूम-विशिष्ट प्रोटोकॉल का पालन करें। यह काम ~ 8 mTorr और 200 W शक्ति के दबाव पर 100 SCCM Argon गैस के साथ एक डीसी स्पटरिंग सिस्टम और स्पटर का उपयोग करता है।
  2. ~ 100 A / min की दर से 8 मिनट के लिए टाइटेनियम का छिड़काव करें। ~ 200 A / min की दर से 10 मिनट के लिए प्लेटिनम को स्पटर करें। पीवीडी कक्ष से सब्सट्रेट्स को हटा दें।

5. डिवाइस निर्माण: फोटोरेसिस्ट लिफ्ट-ऑफ

नोट: इस चरण में एसीटोन स्नान में फोटोरेसिस्ट परत को भंग करना शामिल है, जिससे ग्लास स्लाइड पर चिपके हुए प्लैटिनम इलेक्ट्रोड पैटर्न हो जाते हैं।

  1. धातु-लेपित ग्लास स्लाइड को ~ 10 मिनट के लिए एसीटोन स्नान में डुबोएं।
  2. बिना धातु की फिल्म को तोड़ने के लिए आंदोलन शुरू करने के लिए स्नान करें। यदि आवश्यक हो तो किसी भी अवशेष को हटाने के लिए एसीटोन-भिगोए हुए पोंछे का उपयोग करें।
  3. एक बार जब सभी फोटोरेसिस्ट / धातु हटा दिए जाते हैं, तो इलेक्ट्रोड पैटर्न को विआयनीकृत पानी से धो लें, और किसी भी शेष सतह की नमी को हटाने के लिए उन्हें रात भर 65 डिग्री सेल्सियस ओवन में रखें।
  4. पैटर्न इलेक्ट्रोड की प्रोफ़ाइल को मापने के लिए स्टाइलस प्रोफाइलोमेट्री का उपयोग करें।

6. डिवाइस निर्माण: सॉफ्ट लिथोग्राफी

नोट: इस चरण में इलास्टोमर, पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) का उपयोग करके एसयू -8 मास्टर राहत संरचना पर माइक्रोफ्लुइडिक चैनल को ढालना शामिल है।

  1. सिलिकॉन वेफर सिलनाइजेशन
    नोट: यह एक वैकल्पिक कदम है; हालांकि, यह एसयू -8 राहत संरचना के जीवनकाल को बढ़ाएगा जिसे उपधारा 2.1 में गढ़ा गया था। यह चरण एक रासायनिक फ्यूम हुड में किया जाना चाहिए।
    1. वेफर को पेट्री डिश के निचले हिस्से में सुरक्षित करें और पेट्री डिश को डेसिकेटर में रखें।
    2. सिलिकॉन वेफर की परिधि को ट्राइक्लोरो (1एच, 1एच, 2एच, 2एच, 2एच-परफ्लोरोक्टिल) सिलेन के लगभग 50 μL के साथ घेर लें। वैक्यूम (वैक्यूम पंप या हाउस वैक्यूम लाइन) कनेक्ट करें और 20 मिनट तक चलाएं।
  2. पीडीएमएस प्रतिकृति मोल्डिंग
    1. एक डिस्पोजेबल कंटेनर (जैसे, वजन नाव, प्लास्टिक कप) में, इलेक्ट्रॉनिक संतुलन के शीर्ष पर 10: 1 वजन अनुपात पर पीडीएमएस इलास्टोमेर बेस को हार्डनर में मिलाएं। सिलिकॉन वेफर पर पीडीएमएस समाधान डालें और मिश्रण को सभी हवा के बुलबुले को हटाने के लिए वैक्यूम के नीचे रखें।
    2. कम से कम 4 घंटे के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर इलाज करें जिससे पीडीएमएस को ठोस होने की अनुमति मिलती है। रेजर ब्लेड की नोक का उपयोग करके, मोल्ड किए गए पीडीएमएस को काट लें और सिलिकॉन वेफर से छील लें।
    3. एक तेज बायोप्सी पंच का उपयोग करके, डिवाइस के इनलेट / आउटलेट से पीडीएमएस को हटा दें। इस डिवाइस के लिए, क्रमशः इनलेट्स और आउटलेट के लिए 0.75 मिमी और 3 मिमी बायोप्सी पंच का उपयोग किया गया था।
      नोट: जलाशयों में ट्यूबिंग की तंग सील सुनिश्चित करने के लिए उपयोग किए गए बायोप्सी पंच में इंटरकनेक्टिंग ट्यूबिंग के बाहरी व्यास की तुलना में थोड़ा छोटा व्यास होना चाहिए।
  3. पीडीएमएस की सोनिकेशन सफाई
    1. पीडीएमएस उपकरणों को आईपीए में डुबोएं और उन्हें इनलेट / आउटलेट से किसी भी पीडीएमएस मलबे को हटाने के लिए 30-45 मिनट के लिए एक सोनिकेटर में रखें। पीडीएमएस आईपीए समाधान में सूज सकता है।
    2. विआयनीकृत पानी से कुल्ला करें और रात भर 65 डिग्री सेल्सियस ओवन में रखें ताकि पीडीएमएस सामान्य आकार में वापस आ सके।
      नोट: कोई भी बचा हुआ मलबा प्रयोग के दौरान डिवाइस को बंद कर सकता है। सोनिकेशन से पहले स्कॉच टेप के एक टुकड़े का उपयोग करके पीडीएमएस सतह से मलबे के बड़े टुकड़ों को हटाया जा सकता है।

7. डिवाइस निर्माण: पीडीएमएस बॉन्डिंग /

नोट: इस चरण में पीडीएमएस और ग्लास सब्सट्रेट की सतह को ऑक्सीजन प्लाज्मा के साथ इलाज करना शामिल है ताकि पीडीएमएस और ग्लास38 के बीच एक अपरिवर्तनीय बंधन बनाया जा सके। प्रदान की गई नुस्खा को प्रयोगशाला में उपयोग की जाने वाली सटीक प्रणाली के अनुकूल बनाने की आवश्यकता हो सकती है।

  1. उपकरणों को आकार में काटें और सुनिश्चित करें कि पीडीएमएस डिवाइस की सतह साफ है। यदि स्पष्ट नहीं है, तो उपखंड 6.3 में दिए चरणों का पालन करें।
  2. प्लाज्मा जनरेटर प्रोग्राम करें। 70 डब्ल्यू पर बिजली सेट करें, 35 सेकंड तक समय, दबाव 325 मीटर तक, ऑक्सीजन गैस की प्रवाह दर 60 एससीसीएम तक। पीडीएमएस और इलेक्ट्रोड ग्लास स्लाइड को सिस्टम में सुविधाओं के साथ रखें और प्रोग्राम चलाएं।
  3. उपकरणों को हटा दें और स्टीरियोस्कोप का उपयोग करके इलेक्ट्रोड के लिए चैनल सुविधाओं को जल्दी से संरेखित करें। बॉन्डिंग इंटरफ़ेस पर किसी भी अवांछित हवा के बुलबुले को हटाने के लिए पीडीएमएस के केंद्र से पक्षों की ओर दृढ़ता से दबाव लागू करें।
  4. बॉन्डिंग प्रक्रिया को अंतिम रूप देने के लिए कम से कम 2 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म जगह पर रखें और डिवाइस को आरटी पर ठंडा होने दें।
  5. ~ 6 " लंबाई पर 22-जी ठोस तार के 2 टुकड़े काटें और दोनों सिरों से इन्सुलेटर को पट्टी करें।
  6. चांदी प्रवाहकीय एपॉक्सी का उपयोग करके तारों को इलेक्ट्रोड पैड से बांधें। रात भर 65 डिग्री सेल्सियस ओवन में पूर्ण उपकरण रखें।

Figure 2
(ए) माइक्रोफ्लुइडिक चैनल फैब्रिकेशन-प्रमुख कदम: सिलिकॉन वेफर सफाई (चरण 2.1.1-2.1.3), फोटोरेसिस्ट कोटिंग और सॉफ्ट बेक (चरण 2.1.7-2.1.8), यूवी एक्सपोजर (चरण 2.1.10), विकास (चरण 2.1.12), और पीडीएमएस डालना (उपधारा 6.2)। (बी) इलेक्ट्रोड फैब्रिकेशन-कुंजी चरण: ग्लास स्लाइड क्लीनिंग (चरण 2.1.1-2.1.3), एचएमडीएस कोटिंग और फोटोरेसिस्ट कोटिंग (चरण 2.2.3-2.2.4), यूवी एक्सपोज़र (चरण 2.2.8), विकास (चरण 2.2.9), एचएफ एचएच (खंड 3), भौतिक वाष्प जमाव (खंड 4), और फोटोरेसिस्ट लिफ्ट-ऑफ (खंड 5)। (सी) डिवाइस फाइनलाइजेशन-कुंजी चरण: इनलेट / आउटलेट एक्सेस और सोनिकेशन (चरण 6.2.3 और धारा 6.3), पीडीएमएस बॉन्डिंग, और वायर अटैचमेंट (धारा 7)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

8. सेल संस्कृति और फसल

नोट: मानक सेल संस्कृति और बाँझ हैंडलिंग प्रक्रियाओं का उपयोग किया जाना चाहिए। सेल संस्कृति के लिए सेल-प्रकार-विशिष्ट प्रोटोकॉल का पालन करें।

  1. सेल संस्कृति
    1. सेल मार्ग: चरण 8.1.2-8.1.5 का पालन करते हुए कोशिकाओं को संस्कृति और मार्ग।
    2. पूर्ण डीएमईएम समाधान (88% डीएमईएम, 10% गर्मी-निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम, 1% एल-ग्लूटामाइन, 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन) में एक इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस, 95% ओ 2, 5% सीओ 2 पर टी 25 फ्लास्क में एचईके 293 कोशिकाएं।
    3. पिपेट या वैक्यूम सिस्टम का उपयोग करके मीडिया को एस्पिरेट करें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए 0.25% ट्रिप्सिन-ईडीटीए (2 एमएल-टी 25 फ्लास्क) में कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। संस्कृति मीडिया की दोगुनी मात्रा के साथ ट्रिप्सिन को बेअसर करें।
    4. सेल निलंबन को 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें और 2 मिनट के लिए 770 x g पर HEK293 कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज HEK293 कोशिकाओं को स्थानांतरित करें। पिपेट या वैक्यूम सिस्टम का उपयोग करके सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें
    5. पूर्व-गर्म डीएमईएम के 1 एमएल में एचईके 293 कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें।
    6. सेल चढ़ाना: चरण 8.1.7-8.1.8 का पालन करते हुए कोशिकाओं को प्लेट करें
    7. संस्कृति को जारी रखने के लिए टी 25 फ्लास्क (डीएमईएम के 5 एमएल) में कोशिकाओं को 10: 1 से 20: 1 कमजोर पड़ने पर प्लेट करें।
    8. इलेक्ट्रोपोरेशन प्रयोगों के लिए काटे जाने के लिए कोशिकाओं को 6-वेल प्लेट (प्रति कुएं डीएमईएम के 2 एमएल) में 5: 1 से 20: 1 कमजोर पड़ने पर प्लेट करें।
      नोट: एचईके 293 कोशिकाओं को सेल फसल (उपधारा 8.3) पर ~ 70% स्थिरता प्राप्त करने के लिए इलेक्ट्रोपोरेशन प्रयोगों से 24 घंटे पहले चढ़ाया गया था। एक असंगत फसल अनुसूची इलेक्ट्रोपोरेशन परिणामों में परिवर्तनशीलता पैदा कर सकती है।
  2. इलेक्ट्रोपोरेशन बफर
    1. इलेक्ट्रोपोरेशन बफर तैयार करें
      नोट: इलेक्ट्रोपोरेशन बफर तैयारी8 पर बारीकियों के लिए शेरबा एट अल देखें। बफर संरचना 285 mM सुक्रोज, 0.7 mM MgCl2, 1 mM KCl, 10 mM HEPES, 3 mM NaOH (pH: 7.4; ऑस्मोलैलिटी: 310 mOsm, चालकता: 500 μS / सेमी) थी। इलेक्ट्रोपोरेशन बफर को बाँझ तरीके से तैयार किया जाना चाहिए और ~ 1 महीने के शेल्फ जीवन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाना चाहिए। इलेक्ट्रोपोरेशन बफर फॉर्मूलेशन को प्रति सेल प्रकार के आधार पर अनुकूलित किया जाना चाहिए।
  3. सेल फसल और पीडीएनए जोड़
    1. सेल मार्ग (8.1.2-8.1.4) के समान चरणों का पालन करें।
    2. कोशिकाओं को बाँझ 1x PBS में धोएं, 15 mL शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरण-सेल निलंबन, और 2 मिनट के लिए 770 x g पर सेंट्रीफ्यूज कोशिकाओं को धोएं।
    3. इलेक्ट्रोपोरेशन बफर में एचईके 293 सेल पेलेट धोएं और 2 मिनट के लिए 770 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। इलेक्ट्रोपोरेशन बफर में कोशिकाओं को ~ 5 मिलियन कोशिकाओं / एमएल पर पुन: निलंबित किया जाता है।
      नोट: सेल घनत्व प्रति सेल प्रकार अनुकूलित किया जाना चाहिए।
    4. हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) के लिए पीडीएनए एन्कोडिंग को 20 μg / mL की अंतिम एकाग्रता में जोड़ें। सेल सस्पेंशन को धीरे से मिलाएं और प्रयोग के लिए निलंबन को 1 सीसी सिरिंज में स्थानांतरित करें।

9. हार्डवेयर / प्रायोगिक सेटअप

नोट: प्रयोग के लिए कोशिकाओं की कटाई से पहले, सुनिश्चित करें कि प्रयोगात्मक सेटअप पूरा हो गया है ताकि इलेक्ट्रोपोरेशन बफर में कोशिकाओं को निलंबित करने की मात्रा को कम किया जा सके। वार्म अप करने के लिए प्रयोगों से 20-30 मिनट पहले इलेक्ट्रॉनिक्स चालू करें। एकल-सेल डिटेक्शन मॉड्यूल के संचालन के लिए प्रयोगात्मक सेटअप के योजनाबद्ध के लिए चित्रा 3 देखें।

नोट: लॉक-इन एम्पलीफायर का उपयोग करके एकल-सेल स्तर का पता लगाने के लिए आवश्यक संवेदनशीलता और पर्याप्त रूप से मजबूत इलेक्ट्रोपोरेशन दालों को लागू करने के लिए आवश्यक उच्च वोल्टेज दोनों को समायोजित करने के लिए एक कस्टम-निर्मित पीए 90 ओपी-एएमपी सर्किट विकसित किया गया था। अनुशंसित सर्किटरी 39 पर विनिर्देशों के लिएPA90 डेटाशीट देखें।

  1. लॉक-इन एम्पलीफायर को वर्तमान प्री-एम्पलीफायर सेटिंग्स के साथ प्रारंभ करें और एल्गोरिदम के माध्यम से सेट करें। लॉक-इन सेटिंग्स32 पर बारीकियों के लिए झेंग एट अल देखें।
  2. बिजली की आपूर्ति, फ़ंक्शन जनरेटर, और एम्पलीफायर
    1. पावर सप्लाई 1: सर्किट के नकारात्मक छोर को पावर देने के लिए -15 वी पर सेट करें।
    2. पावर सप्लाई 2 (फ़ंक्शन जनरेटर): डीसी सिग्नल आउटपुट करने के लिए सेट करें और आयाम को 2 वी पर सेट करें।
    3. स्क्वायर वेव के लिए प्रोग्राम इलेक्ट्रोपोरेशन पल्स जनरेटर: वांछित पल्स चौड़ाई (ड्यूटी चक्र) और वांछित पल्स आयाम (वोल्ट) सेट करें।
    4. ट्रिगर मोड (1 पल्स) के लिए आउटपुट सेट करें। आउटपुट को 50x एम्पलीफायर के इनपुट से कनेक्ट करें।
      नोट: पल्स आयाम प्रोग्रामिंग करते समय 50x लाभ को याद रखें। यानी, 1 kV / cm की विद्युत क्षेत्र शक्ति प्राप्त करने के लिए, कुल 30 V की आवश्यकता होती है, 30 V / 300 μm (इलेक्ट्रोड के बीच की दूरी), इसलिए फ़ंक्शन जनरेटर आउटपुट को 30/50, या 600 mV पर सेट किया जाना चाहिए।
    5. ऑसिलोस्कोप का उपयोग करके 50x एम्पलीफायर के आउटपुट की जाँच करें। पावर सप्लाई 2 (9.2.2) से आउटपुट 1-100 वी। इलेक्ट्रोपोरेशन पल्स के लिए आउटपुट 2-चर आयाम (9.2.4)।
    6. चरण 7.6 में एक 10x जांच को एक ऑसिलोस्कोप चैनल और पूर्ण माइक्रो-डिवाइस (परीक्षण के तहत डिवाइस, डीयूटी) से कनेक्ट करें जहां इलेक्ट्रोपोरेशन पल्स लागू होने जा रहा है। प्रयोग के दौरान प्रणाली की निगरानी करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि दालों को लागू किया जा रहा है।
    7. सुनिश्चित करें कि लॉक-इन यूएसबी जुड़ा हुआ और पंजीकृत है। एल्गोरिथ्म कोड (सबसे महत्वपूर्ण, लॉक-इन आउटपुट आवृत्ति) में सभी लॉक-इन सेटिंग्स को डबल-चेक करें।
  3. माइक्रोस्कोप/सीसीडी कैमरा
    1. माइक्रो-डिवाइस को स्लाइड होल्डर के माध्यम से माइक्रोस्कोप के चरण पर रखें। सीसीडी कैमरा चालू करें और माइक्रोफ्लुइडिक चैनल को फोकस में लाएं। 4x या 10x उद्देश्य का उपयोग करें।

Figure 3
चित्रा 3: प्रायोगिक सेटअप योजनाबद्ध-एकल सेल का पता लगाना। उच्च-शक्ति ऑप-एएमपी (पीए -90) लॉक-इन आउटपुट एसी सिग्नल पर उच्च वोल्टेज इलेक्ट्रोपोरेशन पल्स के सुपरपोजिशन के लिए अनुमति देता है जो एकल-सेल का पता लगाने के लिए आवश्यक है। यह उत्तेजना संकेत माइक्रो-इलेक्ट्रोपोरेशन डिवाइस (डिवाइस अंडर टेस्ट, डीयूटी) से गुजरता है जहां वर्तमान को वर्तमान प्री-एम्पलीफायर द्वारा प्रवर्धित किया जाता है और एल्गोरिदम में खिलाया जाता है। सिस्टम सेल डिटेक्शन इवेंट के लिए लगातार निगरानी करता है। सेल प्रवेश पर, लॉक-इन एम्पलीफायर द्वारा एक डिजिटल सिग्नल उत्पन्न होता है ताकि पारगमन में सेल (ओं) में इलेक्ट्रोपोरेशन पल्स के आवेदन को ट्रिगर किया जा सके। किंवदंती: पीए -90 (उच्च शक्ति ऑप एम्पांड), डीयूटी (परीक्षण के तहत डिवाइस), डीआईओ (डिजिटल इनपुट / आउटपुट), एफजी-ईपी (फ़ंक्शन जनरेटर / इलेक्ट्रोपोरेशन पल्स), 50 एक्स (50 एक्स एम्पलीफायर), पीएस-वी- (पीए 90 के लिए बिजली आपूर्ति / नकारात्मक वोल्टेज), एफजी-वी + (फ़ंक्शन जनरेटर, पीए 90 के लिए सकारात्मक वोल्टेज)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

10. प्रायोगिक ऑपरेशन

  1. माइक्रोफ्लुइडिक चैनल प्राइमिंग
    1. सेल-लोडेड सिरिंज से सभी हवा के बुलबुले हटा दें। सेल-लोडेड सिरिंज में 30 जी सुई संलग्न करें।
    2. चिमटी का उपयोग करके, सुई की लंबाई के नीचे टायगन टयूबिंग स्लाइड करें। रिकवरी मीडिया (एंटीबायोटिक दवाओं के बिना चरण 8.1.2 के समान), ~ 40-50 μL के साथ आउटलेट जलाशय को प्री-फिल करें।
    3. अंगूठे का उपयोग करके, धीरे से प्लंजर पर दबाव लागू करें ताकि तरल पदार्थ धीरे-धीरे टयूबिंग लाइन के अंत तक पहुंच जाए।
    4. सिरिंज को सिरिंज पंप पर सुरक्षित करें। सिरिंज पंप को चालू करें और सुनिश्चित करें कि यह छिड़काव को आगे बढ़ाने के लिए सेट है।
    5. प्रवाह दरों को सटीक सुनिश्चित करने के लिए सिरिंज के उचित व्यास के लिए पंप प्रोग्राम करें। सिरिंज व्यास पर बारीकियों के लिए पंप मैनुअल देखें।
      नोट: कोशिकाओं को सिरिंज में बसने से रोकने के लिए, सिरिंज पंप को क्लैंप स्टैंड पर सुरक्षित करें ताकि यह सिरिंज के अंत को नीचे की ओर रखकर ऊर्ध्वाधर स्थिति में काम कर सके।
    6. सिरिंज पंप प्रवाह दर, ~ 10-20 μL / min सेट करें, और पंप को तब तक चलने दें जब तक कि तरल पदार्थ टयूबिंग लाइन के अंत तक नहीं पहुंच जाता। माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस के लिए सुरक्षित ट्यूबिंग।
    7. सिरिंज पंप प्रवाह दर को कम करें, ~ 5-10 μL / min, और पंप को तब तक चलने दें जब तक कि माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस से सभी हवा निष्कासित न हो जाए और कोशिकाएं डिवाइस आउटलेट तक न गुजरें।
    8. पिपेट आकांक्षा के माध्यम से आउटलेट से कोशिकाओं को हटा दें। रिकवरी मीडिया (एंटीबायोटिक दवाओं के बिना चरण 8.1.2 के समान), ~ 40-50 μL के साथ आउटलेट जलाशय को फिर से भरें।
  2. एकल-कोशिका इलेक्ट्रोपोरेशन-सेल झिल्ली परमेबिलाइजेशन मैपिंग
    नोट: क्रमशः सेल झिल्ली परमेबिलाइजेशन और सेल झिल्ली परमेबिलाइजेशन मैपिंग के विद्युत डेटा संकेतक की बेहतर समझ के लिए चित्रा 4 और चित्रा 5 देखें।
    1. इलेक्ट्रोड सेट के माध्यम से एकल कोशिकाओं के प्रवाह को सुनिश्चित करने के लिए सिरिंज पंप प्रवाह दर ~ 0.1-0.3 μL / min पर सेट करें। इलेक्ट्रोड के बीच सेल पारगमन समय ~ 250 एमएस होना चाहिए।
    2. रन पर क्लिक करके कंप्यूटर प्रोग्राम प्रारंभ करें। सुनिश्चित करें कि सिस्टम विद्युत डेटा को सहेज रहा है।
    3. सुनिश्चित करें कि सिस्टम कंप्यूटर-नियंत्रित पल्स अनुप्रयोगों को ट्रिगर करने के लिए विश्वसनीय रूप से कोशिकाओं का पता लगा रहा है। तदनुसार डिटेक्शन थ्रेशोल्ड समायोजित करें।
    4. प्रारंभिक, सबसे कम विद्युत ऊर्जा इलेक्ट्रोपोरेशन पल्स के लिए पल्स पैरामीटर सेट करें। इस अध्ययन में इलेक्ट्रोपोरेशन स्पंदन मापदंडों के लिए तालिका 1 देखें।
    5. इलेक्ट्रोपोरेशन पल्स जनरेटर (चरण 9.2.3.) के लिए आउटपुट चैनल चालू करें।
    6. पल्स अनुप्रयोगों (एन = 100) की पूर्व-निर्धारित संख्या का पालन करें। प्रत्येक परीक्षण की गई स्थिति के अंत में, माइक्रोडिवाइस आउटलेट से एस्पिरेटेड कोशिकाएं और रिकवरी मीडिया के साथ आउटलेट को फिर से भरें।
    7. अगले इलेक्ट्रोपोरेशन पल्स स्थिति के लिए पुनरावृत्ति करें। तब तक दोहराएं जब तक कि सभी इलेक्ट्रोपोरेशन पल्स स्थितियों का परीक्षण न किया जाए।
    8. परीक्षण किए गए प्रत्येक पल्स अनुप्रयोग के लिए कोशिका झिल्ली परमेबिलाइजेशन की डिग्री निर्धारित करें। (पोस्ट-प्रोसेस सत्यापन उपधारा 11.1 में वर्णित है)। कोशिका झिल्ली परमेबिलाइजेशन मानचित्र उत्पन्न करें (चित्रा 5)।
    9. उच्च-थ्रूपुट, जनसंख्या-आधारित प्रतिक्रिया के लिए इलेक्ट्रोपोरेशन पल्स पैरामीटर निर्धारित करें।
    10. सिरिंज पंप को बंद करें, आउटलेट जलाशय से कोशिकाओं को हटा दें, और रिकवरी मीडिया के साथ आउटलेट को फिर से भरें।
  3. जनसंख्या-आधारित प्रतिक्रिया-नियंत्रित इलेक्ट्रोपोरेशन-उच्च थ्रूपुट
    नोट: जनसंख्या-आधारित प्रतिक्रिया प्रक्रिया को दर्शाने वाले योजनाबद्ध के लिए चित्रा 6 देखें।
    1. इलेक्ट्रोड सेट के माध्यम से एकल कोशिकाओं के प्रवाह को सुनिश्चित करने के लिए सिरिंज पंप प्रवाह दर ~ 1-3 μL / min पर सेट करें। इलेक्ट्रोड के बीच सेल पारगमन समय ~ 25 एमएस होना चाहिए।
    2. पल्स आयाम को 'अनुकूलित' स्थिति (10.2.9) पर सेट करें, ट्रिगर मोड बंद करें, और सेल पारगमन समय से मेल खाने के लिए पल्स चौड़ाई सेट करें।
    3. ड्यूटी चक्र को इस तरह सेट करें कि पल्स ऑन टाइम 'अनुकूलित' स्थिति से मेल खाता है। तालिका 1 देखें।
    4. आउटपुट चैनल फ़ंक्शन जनरेटर को चालू करें, सिरिंज पंप चालू करें, और सिस्टम को तब तक चलने दें जब तक कि वांछित संख्या में कोशिकाओं को इलेक्ट्रोपोरेट नहीं किया जाता है।
    5. जब ऐसा हो जाए, तो सिरिंज पंप और फ़ंक्शन जनरेटर दोनों को बंद कर दें।
    6. आउटलेट जलाशय से कोशिकाओं को उचित आकार के सेल कल्चर फ्लास्क/प्लेट में स्थानांतरित करें जो प्री-वार्म्ड रिकवरी मीडिया से भरा हो और कल्चर फ्लास्क/प्लेट को इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करें।

11. विश्लेषण

  1. एकल-कोशिका स्तर झिल्ली परमेबिलाइजेशन का पता लगाना
    नोट: यह सुनिश्चित करने के लिए कि उच्च थ्रूपुट मॉड्यूल के दौरान 'इष्टतम' पल्स का उपयोग किया गया था, उपधारा 10.2 से निर्यात किए गए विद्युत डेटा को सत्यापित करने के लिए एक पोस्ट-प्रयोग विश्लेषण किया जाना चाहिए। इलेक्ट्रोपोरेशन के कारण झिल्ली पारगम्यता के विद्युत संकेत प्रतिनिधि के ग्राफिकल प्रतिनिधित्व के लिए कृपया चित्रा 4 देखें।
    1. एक विश्लेषण सॉफ्टवेयर (MATLAB, Python, आदि) में डेटा लोड करें। प्रत्येक स्पंदन स्थिति के लिए वर्तमान बनाम समय का एक प्लॉट उत्पन्न करें।
    2. मैन्युअल रूप से कोशिका झिल्ली परमेबिलाइजेशन की डिग्री निर्धारित करें (1आई पी / चित्र 4 देखें। सभी परीक्षण की गई पल्स स्थितियों पर सेल मेम्ब्रेन परमेबिलाइजेशन मैप (आईआई पी /आईसी बनाम इलेक्ट्रिकल एनर्जी, चित्रा 5) उत्पन्न करें। 'इष्टतम' स्पंदन स्थिति की पुष्टि करें।
  2. इलेक्ट्रो-अभिकर्मक दक्षता (eTE)
    1. 24-घंटे की इनक्यूबेशन अवधि के बाद, इनक्यूबेटर से इलेक्ट्रोपोरेट कोशिकाओं को हटा दें।
    2. एक लाइव सेल दाग का प्रदर्शन करें। सेल कल्चर पोत में 5 μM की अंतिम सांद्रता के लिए DRAQ5 1: 1000 को पतला करें। धीरे से कोशिकाओं / धुंधला घोल मिलाएं और 5-30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
      नोट: इस चरण में एक अलग दाग लागू किया जा सकता है। सुनिश्चित करें कि फ्लोरोसेंट गुण फ्लोरोसेंट मार्कर के साथ ओवरलैप नहीं होते हैं जो सफल इलेक्ट्रो-अभिकर्मक का संकेत देते हैं (यानी, जीएफपी हरे तरंग दैर्ध्य में है और डीआरएक्यू 5 दूर-लाल है)।
    3. एक एपिफ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप, लैंप और कैमरे चालू करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    4. इनक्यूबेटर से कोशिकाओं को हटा दें और उन्हें माइक्रोस्कोप पर ध्यान केंद्रित करें।
    5. चयनित फ़ील्ड की एक चरण-कंट्रास्ट छवि (ब्राइटफील्ड) कैप्चर करें।
    6. FITC (GFP) और Far-Red (DRAQ5) फिल्टर का उपयोग करके एक ही फ़ील्ड की एपिफ्लोरोसेंट छवियों को कैप्चर करें। छवि सेट का मैन्युअल रूप से या एल्गोरिथ्म के माध्यम से विश्लेषण करें।
      नोट: प्रतिनिधि छवियों के लिए चित्रा 7 देखें।
    7. सभी छवियों में जीएफपी-पॉजिटिव कोशिकाओं की कुल संख्या की गणना करें। सभी छवियों में DRAQ5 दाग वाली कोशिकाओं की कुल संख्या की गणना करें। ईटीई की गणना करें (जीएफपी सकारात्मक कोशिकाओं का अनुपात डीआरएक्यू 5 दाग वाली कोशिकाओं से)।

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Representative Results

चित्रा 4 एकल पल्स आयाम के लिए एकल-कोशिका-स्तरीय झिल्ली परमेबिलाइजेशन डिटेक्शन के पीछे ऑपरेटिंग सिद्धांतों पर प्रकाश डालता है। इलेक्ट्रोपोरेशन प्रयोग की शुरुआत के बाद, सेल डिटेक्शन एल्गोरिदम एक बिंदु-दर-बिंदु, ढलान-आधारित पहचान विधि के माध्यम से सेल का पता लगाने के लिए एक इष्टतम सीमा निर्धारित करता है। सिस्टम तब मापा विद्युत प्रवाह में एक महत्वपूर्ण नकारात्मक परिवर्तन के लिए लगातार (1) निगरानी करता है, जो एक सेल के प्रवेश का संकेत है। यह जैविक कोशिका झिल्ली की इन्सुलेट प्रकृति के कारण होता है, जैसे कि जब कोशिका इलेक्ट्रोड सेट के माध्यम से गुजरती है, तो प्रतिबाधा में तात्कालिक वृद्धि होती है, जिसके परिणामस्वरूप मापा प्रवाह में तेज, कमी होती है, जिससे लगातार सेल डिटेक्शन (2) की अनुमति मिलती है, जो अंततः कंप्यूटर-नियंत्रित पल्स एप्लिकेशन (4) पर स्विच को ट्रिगर करता है। इंसुलेटेड सेल इलेक्ट्रोड के बीच इलेक्ट्रोलाइट की मात्रा को विस्थापित करता है, जिसके परिणामस्वरूप वर्तमान में गिरावट होती है जो सेल के आकार के आनुपातिक होती है। धारा में इस परिवर्तन को 3 केरूप में निरूपित किया जाता है। IC गणना के तुरंत बाद, पूर्व-निर्धारित, विद्युत पल्स को पारगमन में सेल को प्रशासित (4) किया जाता है। ऊर्जा का यह तात्कालिक प्रवाह सिस्टम (ग्रे बॉक्स) में एक संक्षिप्त संवेदन कलाकृति का परिचय देता है। सिग्नल पर फिर से लॉक करने पर, यानी, सेल मॉनिटरिंग पर वापस स्विच करने पर, (5) यह स्पष्ट है कि इलेक्ट्रोड सेट के बीच सेल की उपस्थिति के कारण विद्युत परिवर्तन के परिमाण के रूप में इलेक्ट्रोपोरेशन पल्स कोशिका झिल्ली को स्थिर करता है (6). कोशिका के प्रतिबाधा परिमाण पूर्व/बाद इलेक्ट्रोपोरेशन पल्स अनुप्रयोग के कारण धारा में दो बूंदों में अंतर को परमेबिलाइजेशन धारा कहा जाता है और इसे एआईपी के रूप में निरूपित किया जाता है। एक बार जब सेल इलेक्ट्रोड के बीच की मात्रा से बाहर निकल जाता है, तो बेसलाइन स्थिर हो जाती है, और सिस्टम सेल डिटेक्शन मोड में लौट आता है (1). कोशिकाओं की पूर्व-निर्धारित संख्या को इलेक्ट्रोपोरेट करने के बाद, अगली उच्चतम ऊर्जा इलेक्ट्रोपोरेशन पल्स का परीक्षण किया जाता है (पल्स सेटिंग्स के लिए तालिका 1 देखें)। परीक्षण किए गए प्रत्येक इलेक्ट्रोपोरेशन पल्स के लिए, एक औसत 'झिल्ली परमेबिलाइजेशन की डिग्री' निर्धारित की जाती है। इस मान की गणना 111000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 एक बार जब प्रत्येक पूर्व-निर्धारित इलेक्ट्रोपोरेशन पल्स का परीक्षण किया जाता है, तोए आईपी / आईआई सी को लागू विद्युत ऊर्जा घनत्व (σ एक्स ई2 एक्स टी) के खिलाफ प्लॉट किया जाता है, जहां σ समाधान चालकता (एस / सेमी) है, ई विद्युत क्षेत्र शक्ति (केवी / सेमी) है, और टी पल्स अवधि (एमएस) है। इस उदाहरण में उपयोग किए जाने वाले एचईके 293 कोशिकाओं के लिए कोशिका झिल्ली परमेबिलाइजेशन मानचित्र के लिए चित्रा 5 देखें।

तालिका 1: इलेक्ट्रोपोरेशन पल्स पैरामीटर। इस अध्ययन के लिए, इलेक्ट्रोपोरेशन दालों को इस तरह चुना गया था कि चार्ज फ्लक्स (σ×ई×टी) स्थिर रहता है, जहां σ समाधान चालकता (एस / सेमी) है, ई विद्युत क्षेत्र शक्ति (केवी / सेमी) है और टी पल्स अवधि (एमएस) है। परिणाम लागू पल्स विद्युत ऊर्जा का एक स्पेक्ट्रम है। निर्दिष्ट पल्स मापदंडों को प्राप्त करने के लिए आवश्यक ड्यूटी चक्र (डीसी) के उदाहरण प्रारंभिक (सिंगल-सेल-डिटेक्शन) प्रवाह दर में 5× और 10× वृद्धि दोनों के लिए प्रदान किए जाते हैं। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: एकल कोशिका झिल्ली परमेबिलाइजेशन - एल्गोरिथ्म ऑपरेशन। (शीर्ष) पल्स अनुप्रयोगों की एक श्रृंखला की विद्युत रिकॉर्डिंग (वर्तमान में तेज स्पाइक्स द्वारा इंगित)। (नीचे) एकल कोशिका का पता लगाने और स्पंदन के लिए सिस्टम ऑपरेशन। (1) सिस्टम बिंदु-दर-बिंदु ढलान गणना के माध्यम से धारा में परिवर्तन के लिए लगातार संवेदन कर रहा है। (2) ढलान में तेज कमी का पता लगाया जाता है, इलेक्ट्रोड के बीच एक सेल के प्रवेश का संकेत देता है और कंप्यूटर-नियंत्रित पल्स एप्लिकेशन को ट्रिगर करता है। (3) एक धारा की गिरावट (111) निर्धारित की जाती है और यह कोशिका के आकार के समानुपाती होती है। (4) इलेक्ट्रोपोरेशन पल्स को पारगमन में सेल पर लागू किया जाता है, जिससे विद्युत संकेत (ग्रे बॉक्स) में एक संवेदन विरूपण साक्ष्य होता है। (5) लॉक-इन एम्पलीफायर सेल निगरानी में वापस आ जाता है क्योंकि यह पारगमन में सेल में फिर से लॉक हो जाता है। (6) सेल इलेक्ट्रोड सेट से बाहर निकलता है, जिससे धारा में एक और, छोटा परिमाण स्पाइक होता है (आईआई सी > (आई6 - आई5))। प्रतिबाधा माप में अंतर इंसुलेटेड सेल झिल्ली के माध्यम से छिद्र गठन के कारण होता है। धारा में इस परिवर्तन को परमेबिलाइजेशन करंट (1आईपी) कहा जाता है। कोशिका झिल्ली पारगम्यता की डिग्री की गणना की जाती है (आईपी / बेसलाइन स्थिर हो जाती है और सिस्टम डिटेक्शन मोड पर लौट आता है (1). कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

लागू विद्युत ऊर्जा और कोशिका झिल्ली परमेबिलाइजेशन की डिग्री (चित्रा 5) के बीच एक अलग सहसंबंध देखा जाता है, एक संक्रमण क्षेत्र के अस्तित्व के साथ जहां कोशिका झिल्ली परमेबिलाइजेशन की डिग्री में पर्याप्त वृद्धि होती है। उस अंत तक, विद्युत ऊर्जा के साथ एक पल्स जो इस संक्रमण क्षेत्र को पार करती है, को माइक्रो-इलेक्ट्रोपोरेशन प्रक्रिया के उच्च-थ्रूपुट चरण के लिए चुना जाता है (चित्रा 6)। इस प्रयोग में, 1.8 kV / cm: 670 μs पल्स को 'इष्टतम' के रूप में निर्धारित किया गया था। जैसा कि प्रोटोकॉल की उपधारा 10.3 में विस्तार से वर्णित किया गया था, सिस्टम प्रवाह दर में वृद्धि हुई है, और फ़ंक्शन जनरेटर एक सेट पल्स और ड्यूटी चक्र के साथ एक पल्स को लगातार आउटपुट करने के लिए सेट है ( 1.5 μL/ min और 3.0 μL / min प्रवाह दरों के लिए पल्स सेटिंग्स के लिए तालिका 1 देखें) यह सुनिश्चित करने के लिए कि पारगमन में प्रत्येक सेल पर 1 पल्स लागू किया गया है। इस अध्ययन में, प्रवाह दर को 5x तक बढ़ा दिया गया था, इस प्रकार पल्स चौड़ाई को 2.7% के ड्यूटी चक्र (डीसी) पर 50 एमएस (सेल पारगमन समय से मेल खाते हुए) पर सेट किया गया था।

Figure 5
चित्र 5: HEK293 कोशिका झिल्ली परमेबिलाइजेशन मैपिंग -Ip / विद्युत डेटा (1.0 P/I C) को औसत ± SEM के रूप मेंदर्शाया जाता है। स्पंदन की स्थिति (बाएं से दाएं)- 0.4 kV/cm : 3 ms, 0.8 kV/cm: 1.5 ms, 1.0 kV/cm : 1.2 ms, 1.2 kV/cm : 1 ms, 1.8 kV/cm : 0.67 ms, 2.4 kV/cm : 0.5 ms कोशिका झिल्ली परमेबिलाइजेशन की डिग्री और लागू पल्स के विद्युत ऊर्जा घनत्व के बीच एक स्पष्ट सहसंबंध देखा जाता है। प्रयोग के इस दौर के लिए, 1.8 केवी / सेमी: 0.67 एमएस पल्सिंग स्थिति को उच्च-थ्रूपुट मॉड्यूल के लिए 'इष्टतम' इलेक्ट्रोपोरेशन पल्स के रूप में चुना गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्रा 6: सेल-जनसंख्या-आधारित प्रतिक्रिया-नियंत्रित इलेक्ट्रोपोरेशन-प्रक्रिया वर्कफ़्लो। शुरू करने के लिए, एकल-सेल-स्तरीय विद्युत पूछताछ की अनुमति देने के लिए एक प्रारंभिक प्रवाह दर (क्यू0) प्रोग्राम की जाती है। प्रत्येक पूर्व-निर्धारित इलेक्ट्रोपोरेशन स्पंदन स्थितियों (ई 0/टी 0 से ईएन /टीएन) पर कोशिकाओं की एक प्रोग्राम करने योग्य संख्या को स्पंदित किया जाता है, जिसमें इलेक्ट्रोपोरेशन पल्स अनुप्रयोगों के प्रत्येक पुनरावृत्ति के साथ लागू विद्युत ऊर्जा बढ़ जाती है। अध्ययन में शामिल उच्चतम विद्युत ऊर्जा पल्स, ईएन / टी एन के पूरा होने के बाद, कोशिका झिल्ली परमेबिलाइजेशन वक्र प्लॉट किया जाता है, और परीक्षण के तहत सेल आबादी के लिए इष्टतम इलेक्ट्रोपोरेशन पल्स निर्धारित किया जाता है। सिस्टम उच्च-थ्रूपुट मोड में आगे बढ़ता है, जहां प्रवाह दर को क्यूथ्रूपुट तक बढ़ा दिया जाता है, और दर-सीमित एकल-सेल पूछताछ चरणों को छोड़ दिया जाता है। इष्टतम पल्स ट्रेन को लगातार लागू किया जाएगा ईऑप्ट / टीऑप्ट डी.सी.ऑप्ट पर इस तरह से कि पारगमन में प्रत्येक सेल को सेल पारगमन समय और पल्स चौड़ाई ड्यूटी चक्र (डीसी) के आधार पर एक एकल इलेक्ट्रोपोरेशन पल्स प्राप्त होगा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

इलेक्ट्रोपोरेशन रिकवरी के 24 घंटे के बाद, कोशिकाओं को इलेक्ट्रो-अभिकर्मक दक्षता (ईटीई) निर्धारित करने के लिए चित्रित किया गया था। जैसा कि प्रोटोकॉल की उपधारा 11.2 में वर्णित है, ईटीई को जीएफपी को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं की कुल संख्या के रूप में निर्धारित किया गया था, जो डीआरएक्यू 5 से सना कोशिकाओं की कुल संख्या से सामान्यीकृत था। 1.8 kV/cm: 670 μs पल्स के लिए eTE ~ 70% निर्धारित किया गया था (चित्रा 7A)। सेल मेम्ब्रेन परमेबिलाइजेशन की डिग्री को सटीक रूप से मैप करने और उच्च-थ्रूपुट मोड में संक्रमण करते समय पर्याप्त रूप से उच्च इलेक्ट्रोपोरेशन पल्स ऊर्जा का चयन करने के लिए सिस्टम के महत्व को उजागर करने के लिए, ईटीई (चित्रा 7 बी) के संदर्भ में 0.4 केवी / सेमी: 3 एमएस पल्स स्थिति का भी पता लगाया गया था। इस मामले में, 24 घंटे में परिणामी ईटीई 5% से कम था।

Figure 7
चित्रा 7: 24 घंटे पर इलेक्ट्रो-अभिकर्मक दक्षता-जीएफपी अभिव्यक्ति। एचईके 293 कोशिकाओं को माइक्रो-इलेक्ट्रोपोरेशन प्रयोगों के बाद 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया गया था। सभी कोशिकाओं को DRAQ5 (लाल) से दाग दिया गया था, और इलेक्ट्रो-अभिकर्मक दक्षता (eTE) को कुल सेल संख्या (लाल) के लिए GFP (हरे) को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं के अनुपात के आधार पर निर्धारित किया गया था। इस अध्ययन में सेल व्यवहार्यता को परिणाम मीट्रिक के रूप में मूल्यांकन नहीं किया गया था। (ए) एचईके 293 कोशिकाओं की प्रतिनिधि, स्टैक्ड 4× फ्लोरेसेंस छवि को 1.8 केवी / सेमी: 670 μs पल्स के माध्यम से सफलतापूर्वक स्थानांतरित किया गया, जो लगभग 70% का ईटीई दिखाता है। (बी) एचईके 293 कोशिकाओं की प्रतिनिधि, स्टैक्ड 4× फ्लोरेसेंस छवि 0.4 केवी / सेमी: 3 एमएस पल्स के माध्यम से असफल रूप से स्थानांतरित होती है जो ईटीई << 5% दिखाती है। स्केल पट्टी: 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

पूरक चित्रा 1: 2-आयामी सीएडी योजनाबद्ध। माइक्रो-इलेक्ट्रोपोरेशन डिवाइस में 1 मिमी व्यास इनलेट और 3 मिमी व्यास आउटलेट के साथ एक सीधा, 100 μm चौड़ा माइक्रो-चैनल होता है। प्रत्येक इलेक्ट्रोड ट्रेस 100 μm चौड़ा है और इलेक्ट्रोड सेट डिवाइस के इलेक्ट्रोपोरेशन क्षेत्र को शामिल करता है, जो 300 μm लंबा है। माइक्रो-चैनल की 3-आयामी ऊंचाई को फोटोरेसिस्ट की मोटाई द्वारा नियंत्रित किया जाता है। इस काम में, डिवाइस की ऊंचाई 20 μm थी। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

इस प्रोटोकॉल के भीतर प्रस्तुत पद्धति मुख्य रूप से एक माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस के माइक्रोफैब्रिकेशन पर केंद्रित है जिसे बाद में एक विशेष इलेक्ट्रोपोरेशन प्रयोगात्मक सेटअप में एकीकृत किया जाता है। शब्द 'नुस्खा', जिसका उपयोग अक्सर माइक्रोफैब्रिकेशन प्रक्रिया की बारीकियों का वर्णन करते समय किया जाता है, एक कार्यशील डिवाइस को सफलतापूर्वक बनाने के लिए प्रत्येक चरण का पालन / अनुकूलन करने के महत्व पर संकेत देता है। हालांकि, प्रक्रिया के भीतर कुछ महत्वपूर्ण कदम, जब अनुकूलित नहीं होते हैं, जैसे कि यूवी एक्सपोजर समय / ऊर्जा, पीवीडी स्पटरिंग दर / अवधि, और ऑक्सीजन प्लाज्मा जनरेटर सेटिंग्स, निर्माण प्रक्रिया के साथ-साथ इलेक्ट्रोपोरेशन प्रयोगों के सफल निष्पादन दोनों के लिए समस्याग्रस्त हो सकते हैं। निर्माण प्रक्रिया का समस्या निवारण मुख्य रूप से परीक्षण और त्रुटि या प्रयोगों के अधिक नियंत्रित डिजाइन प्रयोगात्मक डिजाइन के माध्यम से किया जाता है। इसके अतिरिक्त, वैकल्पिक माइक्रोफैब्रिकेशन तकनीकें हैं, जैसे कि डीप रिएक्टिव आयन एचिंग (डीआरआईई), जिन्हें प्रोटोकॉल के भीतर विभिन्न चरणों को करने के लिए प्रतिस्थापित किया जा सकता है (यानी, नरम लिथोग्राफी प्रक्रिया करने के लिए डीआरआईई अंकित मोल्डिंग संरचना का उपयोग करना)। इसके अलावा, व्यंजनों को अनुकूलित करना और डिजाइन / फैब्रिकिंग उपकरणों को क्षेत्र में नौसिखियों के लिए समय लेने वाला हो सकता है। हालांकि, एक बार माइक्रोफैब्रिकेशन प्रक्रिया सफलतापूर्वक विकसित हो जाने के बाद, इंजीनियर / वैज्ञानिक को एक उपकरण डिजाइन करने की स्वतंत्रता होती है जो उनकी विशिष्ट आवश्यकताओं के लिए उपयुक्त है।

उस अंत तक, इस प्रोटोकॉल के भीतर वर्णित डिवाइस को हमारे पिछले काम32 पर विस्तार करने के लिए विकसित किया गया था। इसमें एकल-कोशिका झिल्ली परमेबिलाइजेशन इलेक्ट्रिकल डिटेक्शन का उपयोग शामिल था, लेकिन उच्च-थ्रूपुट तरीके से। भीतर वर्णित प्रयोगात्मक सेटअप के लिए विशेष उपकरणों की आवश्यकता होती है, यानी, लॉक-इन एम्पलीफायर, जो मानक अनुसंधान प्रयोगशाला के लिए असामान्य हो सकता है और इस प्रकार इस तकनीक की संभावित आउटरीच और अनुकूलनशीलता को सीमित कर सकता है। हालांकि, इस प्रोटोकॉल का पालन करते हुए एक 'नंगे-हड्डियों' माइक्रोफ्लुइडिक इलेक्ट्रोपोरेशन डिवाइस को लागू किया जा सकता है, जिसमें इलेक्ट्रोपोरेशन पल्स उत्पन्न करने के लिए केवल एक फ़ंक्शन जनरेटर और संभवतः एक वोल्टेज एम्पलीफायर की आवश्यकता होती है।

फिर भी, यह माइक्रो-इलेक्ट्रोपोरेशन प्लेटफॉर्म खुद को अन्य एकल-सेल इलेक्ट्रोपोरेशन प्रौद्योगिकियों से अलग करता है। निरंतर प्रवाह वातावरण में एकल-सेल निलंबन पर विद्युत यी रूप से पता लगाने और इलेक्ट्रोपोरेशन मापदंडों को अनुकूलित करने की क्षमता वास्तव में अभिनव है। भविष्य के काम में इस मंच की समग्र प्रभावशीलता को और बेहतर बनाने के लिए सफल इलेक्ट्रोपोरेशन परिणामों से संबंधित अन्य महत्वपूर्ण प्रयोगात्मक मापदंडों को अनुकूलित करना शामिल है ( चित्रा 1 देखें)। माइक्रो-इलेक्ट्रोपोरेशन प्लेटफॉर्म से जुड़े किसी भी संभावित नकारात्मक डाउनस्ट्रीम प्रभावों का आकलन करने के लिए अतिरिक्त व्यवहार्यता और चयापचय परख विकसित और कार्यान्वित की जाएगी। इसके अलावा, उच्च सेलुलर थ्रूपुट प्राप्त करने के लिए माइक्रोफ्लुइडिक डिजाइन में सुधार जारी रखा जा सकता है, जैसा कि अन्यसमूहों द्वारा प्रदर्शित किया गया है। इन चिंताओं को संबोधित करने पर, इस तकनीक में जीन वितरण और / या जीन संपादन करने के लिए सेल थेरेपी निर्माण प्रक्रिया में अपनाए जाने की क्षमता है, क्योंकि यह पद्धति एक बंद और स्वचालित प्रक्रिया दोनों के लिए अत्यधिक उत्तरदायी है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

लेखक नेशनल साइंस फाउंडेशन (एनएसएफ सीबीईटी 0967598, डीबीआई आईडीबीआर 1353918) और यूएस डिपार्टमेंट ऑफ एजुकेशन के ग्रेजुएट ट्रेनिंग इन इमर्जिंग एरियाज प्रिसिजन एंड पर्सनलाइज्ड मेडिसिन (पी 200 ए 150131) द्वारा फेलोशिप पर स्नातक छात्र जेजेएस को वित्त पोषित करने के लिए वित्तीय सहायता को स्वीकार करना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
150-mm diameter petri dishes VWR 25384-326 step 6.1.1 to secure wafer
24-well tissue culture plates VWR 10062-896 step 10.3.6 to plate electroporated cells
33220A Waveform/Function generator Agilent step 9.2.3 electroporation pulse generator
4'' Si-wafers University Wafer subsection 2.1 for microfluidic channel fabrication
6-well tissue culture plates VWR 10062-892 step 8.1.8 to plate cells
Acetone Fisher Scientific A18-4 step 2.1.2 for cleaning and  step 5.1 photoresist lift-off
Allegra X-22R Centrifuge Beckman Coulter steps 8.1.4 , 8.3.2. and 8.3.3. to spin down cells
AutoCAD 2018 Autodesk subsection 1.1. to design transparency masks
Buffered oxide etchant 10:1 VWR 901621-1L subsection 3.1 for HF etching
CCD Monochrome microscope camera Hamamatsu Orca 285 C4742-96-12G04 step 11.2.3. for imaging
CMOS camera- Sensicam QE 1.4MP PCO subsection 9.3 part of the experimental setup
Conductive Epoxy CircuitWorks CW2400 subsection 7.6. for wire attachement
Conical Centrifuge Tubes, 15 mL Fisher Scientific 14-959-70C step 8.1.4. for cell centrifuging
Dektak 3ST Surface Profilometer Veeco (Sloan/Dektak) step 2.1.15 and 5.4 for surface profilometry
Disposable biopsy punch, 0.75 mm Robbins Instruments RBP075 step 6.2.3 for inlet access
Disposable biopsy punch, 3 mm Robbins Instruments RBP30P step 6.2.3 for outlet access
DRAQ5 abcam ab108410 step 11.2.2. for live cell staining
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium ThermoFisher Scientific 11885084 step 8.1.2. part of media composition
E3631A Bipolar Triple DC power supply Agilent step 9.2.1.-9.2.2.part of the experimental setup
Eclipse TE2000-U Inverted  Microscope Nikon  subsection 9.3. part of the experimental setup
EVG620 UV Lithography System EVG  step 2.1.9. and 2.2.7. for UV Exposure
Fetal Bovine Serum Neuromics FBS001 step 8.1.2. part of media composition
FS20 Ultrasonic Cleaner Fisher Scientific subsection 5.1. for photoresist lift-off
Glass Media Bottle with Cap, 100mL Fisher Scientific FB800100 step 8.2.1. for buffer storage
Glass Media Bottle with Cap, 500mL Fisher Scientific FB800500 step 8.1.2.for media storage
HEK-293 cell line ATCC CRL-1573 subsection 8.1 for cell culturing
HEPES buffer solution Sigma Aldrich 83264-100ML-F step 8.2.1 part of electroporation buffer composition
Hexamethyldisilazane Sigma Aldrich 379212-25ML step 2.2.3 adhesion promoter
HF2LI Lock-in Amplifier Zurich Instruments subsection 9.2 part of the experimental setup
HF2TA Current amplifier Zurich Instruments subsection 9.2 part of the experimental setup
Isopropyl Alcohol Fisher Scientific A459-1 step 2.1.2 for cleaning, step 2.1.14 for rinsing wafer following SU-8 development, and step 6.3.1 for cleaning PDMS
IX81 fluorescence microscope Olympus step 11.2.3 for imaging
L-Glutamine Solution Sigma Aldrich G7513-20ML step 8.1.2. part of media composition
M16878/1BFA 22 gauge wire AWC B22-1 subsection 7.5 for device fabrication
Magnesium chloride Sigma Aldrich 208337-100G step 8.1.2 part of electroporation buffer composition
MF 319 Developer Kayaku Advanced Materials 10018042 step 2.2.9. photoresist developer
Microposit S1818 photoresist Kayaku Advanced Materials 1136925 step 2.2.4 positive photoresist for electrode patterning
Microscope slides, 75 x 25 mm VWR 16004-422 step 2.2.1 electrode soda lime glass substrate
Model 2350 High voltage amplifier TEGAM 2350 step 9.2.5. part of the experimental setup
National Instruments LabVIEW National Instruments data acquisition
Needle, 30G x 1 in BD Scientific 305128 step 10.1.1. part of the system priming
PA90 IC OPAMP Power circuit Digi-key 598-1330-ND Part of the custom circuit
Penicillin-Streptomycin Sigma Aldrich P4458-20ML step 8.1.2. part of media composition
Plasmid pMAX-GFP Lonza VCA-1003 step 8.3.4. for intracellular delivery
Plastic tubing, 0.010'' x 0.030" VWR 89404-300 step 10.1.2. for system priming
Platinum targets Kurt J. Lesker subsection 4.2. for physical vapor deposition
Potassium chloride Sigma Aldrich P9333-500G step 8.2.1. part of electroporation buffer composition
Pump 11 PicoPlus microfluidic syringe pump Harvard Apparatus MA1 70-2213 step 10.1.4. for system priming
PVD75 Physical vapor deposition system Kurt J. Lesker subsection 4.1. for physical vapor deposition
PWM32 Spinner System Headway Research steps 2.1.6 and 2.2.2. for substrate coating with photoresist
PX-250 Plasma treatment system March Instruments subsection 7.2 for PDMS and glass substrate bonding
SDG1025 Function/Waveform generator Siglent step 9.2.2. part of the experimental setup
Sodium hydroxide Sigma Aldrich S8045-500G step 8.2.1. part of electroporation buffer composition
SU-8 2010 negative photoresist Kayaku Advanced Materials Y111053 step 2.1.7. for microfluidic channel patterning
SU-8 developer Microchem Y010200 step 2.1.12. for photoresist developing
Sucrose Sigma Aldrich S7903-1KG step 8.2.1. part of electroporation buffer composition
Sylgard 184 elastomer kit Dow Corning 3097358-1004 step 6.2.1  10 : 1 mixture of PDMS polymer and hardening agent
Syringe, 1 ml BD Scientific 309628 step 8.3.4. part of system priming
SZ61 Stereomicroscope System Olympus subsection 7.3. for channel and electrode alignment
Tissue Culture Treated T25 Flasks Falcon 353108 step 8.1.2 for cell culturing
Titanium targets Kurt J. Lesker subsection 4.2. for physical vapor deposition
Transparency masks CAD/ART Services steps 2.1.9. and 2.2.7. for photolithography
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane Sigma Aldrich 448931-10G step 6.1.2. for wafer silanization
Trypsin-EDTA solution Sigma Aldrich T4049-100ML steps 8.1.3. and 8.3.1. for cell harvesting

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