Summary
Denne protokollen beskriver mikrofabrikasjonsteknikkene som kreves for å bygge en lab-on-a-chip, mikrofluidisk elektroporeringsenhet. Det eksperimentelle oppsettet utfører kontrollerte transfeksjoner på enkeltcellenivå i en kontinuerlig flyt og kan utvides til høyere gjennomstrømning med populasjonsbasert kontroll. En analyse er gitt som viser evnen til elektrisk å overvåke graden av cellemembranpermeabilisering i sanntid.
Abstract
Nåværende terapeutiske innovasjoner, som CAR-T-celleterapi, er sterkt avhengige av virusmediert genlevering. Selv om den er effektiv, er denne teknikken ledsaget av høye produksjonskostnader, noe som har ført til interesse for å bruke alternative metoder for genlevering. Elektroporering er en elektrofysisk, ikke-viral tilnærming for intracellulær levering av gener og andre eksogene materialer. Ved påføring av et elektrisk felt tillater cellemembranen midlertidig molekylær levering inn i cellen. Vanligvis utføres elektroporering på makroskala for å behandle et stort antall celler. Denne tilnærmingen krever imidlertid omfattende empirisk protokollutvikling, noe som er kostbart når man arbeider med primære og vanskelige å transfekte celletyper. Langvarig protokollutvikling, kombinert med kravet om store spenninger for å oppnå tilstrekkelige elektriske feltstyrker for å gjennomsyre cellene, har ført til utvikling av mikroskala elektroporeringsenheter. Disse mikroelektroporeringsenhetene er produsert ved hjelp av vanlige mikrofabrikasjonsteknikker og gir mulighet for større eksperimentell kontroll med potensial til å opprettholde høy gjennomstrømningskapasitet. Dette arbeidet bygger på en mikrofluidisk-elektroporeringsteknologi som er i stand til å oppdage nivået av cellemembranpermeabilisering på enkeltcellenivå under kontinuerlig strømning. Imidlertid ble denne teknologien begrenset til 4 celler behandlet per sekund, og dermed foreslås og presenteres en ny tilnærming for å øke systemgjennomstrømningen her. Denne nye teknikken, betegnet som cellepopulasjonsbasert tilbakemeldingskontroll, vurderer cellepermeabiliseringsresponsen på en rekke elektroporeringspulserende forhold og bestemmer de best egnede elektroporasjonspulsforholdene for celletypen som testes. Deretter brukes en høyere gjennomstrømningsmodus, hvor denne "optimale" pulsen påføres cellesuspensjonen under transport. Trinnene for å fremstille enheten, sette opp og kjøre mikrofluidiske eksperimenter og analysere resultatene presenteres i detalj. Til slutt demonstreres denne mikroelektroporeringsteknologien ved å levere en DNA-plasmidkoding for grønt fluorescerende protein (GFP) i HEK293-celler.
Introduction
Nåværende terapeutiske innovasjoner innen biomedisinsk forskning, som CAR-T (Chimeric Antigen Receptor Engineered T cell) celleterapi og genetisk redigering ved hjelp av CRISPR (gruppert regelmessig interspaced korte palindromiske repeterende DNA-sekvenser) / Cas9, er sterkt avhengig av evnen til å levere eksogent materiale både vellykket og effektivt inn i det intracellulære rommet1. I CAR-T-terapi er gullstandarden for å utføre genleveringstrinnet i celleterapiproduksjon ved bruk av virale vektorer2. Selv om virusmediert genlevering er en effektiv leveringsmodalitet, har den også flere ulemper. Disse inkluderer produksjonskostnader, cytotoksisitet, immunogenisitet, mutagenese / tumorigenese potensial, og størrelsesbegrensninger på genet (e) som skal leveres3. Disse begrensningene har ført til forskning og utvikling av alternative, ikke-virale leveringsteknologier.
Elektroporering, et alternativ til virusmediert genlevering, er avhengig av anvendelse av en optimal elektrisk pulsbølgeform for å utføre DNA-, RNA- og proteintransfeksjoner av celler. Etter påføring av et eksternt elektrisk felt, blir cellemembranen kort kompromittert, noe som gjør cellen utsatt for intracellulær levering av ellers ugjennomtrengelige eksogene materialer4. Sammenlignet med virusmediert levering er elektroporering fordelaktig, da det generelt er trygt, enkelt å betjene og har lave driftskostnader. Elektroporering kan levere både liten og stor molekylær last og kan være effektiv i transfektering av celler uavhengig av avstamning5. For å oppnå ønskelige resultater etter elektroporering, dvs. god levedyktighet og god elektrotransfeksjonseffektivitet, må en rekke eksperimentelle parametere samoptimaliseres. Disse inkluderer celletype6, celletetthet, molekylkonsentrasjon7, elektroporeringsbufferegenskaper (f.eks. molekylær sammensetning, ledningsevne og osmolaritet)8, elektrodestørrelse/geometri9 og elektrisk pulsbølgeform (form, polaritet, antall pulser)10 (se figur 1 for illustrasjon). Selv om hver av disse parametrene kan ha en betydelig effekt på resultatene av elektroporeringseksperimenter, har pulsbølgeform blitt spesielt studert i detalj, da den elektriske energien til den påførte pulsen (e) er roten til den iboende avveiningen mellom den resulterende cellens levedyktighet og elektrotransfeksjonseffektivitet8.
Vanligvis utføres elektroporeringseksperimenter på makroskalaen, hvor celler suspenderes i 100-tallet av mikroliter buffer mellom et sett med store, parallelle plateelektroder i en elektroporasjonskyvett. Elektrodene er vanligvis produsert av aluminium med en elektrodeavstand på 1-4 mm. Når cellene er lastet manuelt via pipette, kobles kyvetten elektrisk til en klumpete, elektrisk pulsgenerator hvor brukeren kan stille inn og bruke pulsbølgeformparametrene for å elektroporere cellesuspensjonen. Selv om makroskala eller bulkelektroporering kan behandle celletettheter >106 celler / ml, kan denne funksjonen være bortkastet når du optimaliserer innstillingene for elektrisk pulsbølgeform. Dette er spesielt bekymringsfullt ved elektropulering av primære celletyper der cellepopulasjonstallene kan begrenses. I tillegg, på grunn av den store avstanden mellom elektrodene, må pulsgeneratoren kunne levere store spenninger for å oppnå elektriske feltstyrker >1kV / cm11. Disse høye spenningene forårsaker resistiv strømspredning gjennom elektrolyttbufferen som resulterer i Joule-oppvarming, noe som kan være skadelig for den resulterende cellens levedyktighet12. Til slutt vil elektroporering på en tett suspensjon av celler konsekvent bli belastet med en medfødt variasjon i den resulterende elektrotransfeksjonseffektiviteten og cellens levedyktighet. Hver celle i suspensjon kan oppleve en annen elektrisk feltstyrke på grunn av de omkringliggende cellene. Avhengig av om den erfarne elektriske feltstyrken enten økes eller reduseres, kan den resulterende cellens levedyktighet eller elektrotransfeksjonseffektivitet hver bli negativt påvirket11. Disse ulempene med makroskala elektroporering har ført til jakten og utviklingen av alternative teknologier som opererer på mikroskala og gir bedre kontroll på enkeltcellenivå.
Feltet BioMEMS, eller biomedisinske mikro-elektromekaniske systemer, stammer fra de teknologiske fremskrittene som er gjort i mikroelektronikkindustrien. Spesielt ved hjelp av mikrofabrikasjonsprosesser for å utvikle mikro-enheter for å fremme biomedisinsk forskning. Disse fremskrittene inkluderer utvikling av mikroelektrodearrayer for in vivo elektrisk overvåking 13, kapasitive mikroelektroder for in situ elektroporering 14, miniatyriserte organ-on-a-chip-enheter15, mikrofluidisk pasientnær diagnostikk 16, biosensorer 17 og legemiddelleveringssystemer 18, inkludert nano- og mikroelektroporeringsenheter 19,20,21 . På grunn av evnen til å designe og produsere enheter i samme størrelsesskala som biologiske celler, er nano- og mikroelektroporeringsteknologier fordelaktige sammenlignet med deres makroskala motpart22,23. Disse elektroporeringsenhetene eliminerer kravet til høyspenningspulsapplikasjoner, da elektrodesett med avstander på 10s til 100s mikrometer vanligvis er integrert. Denne funksjonen reduserer strømmen drastisk gjennom elektrolytten, noe som igjen reduserer akkumuleringen av giftige elektrolyseprodukter og effekten av Joule-oppvarming i disse systemene. Mikroskalakanalene sikrer også at et mye mer ensartet elektrisk felt påføres cellene pålitelig under pulspåføring, noe som resulterer i mer konsistente utfall24. I tillegg er det også vanlig at mikroelektroporeringsenheter integreres i en mikrofluidisk plattform som egner seg for fremtidig integrering i en helautomatisk teknologi, en svært ønskelig evne i celleterapiproduksjon25. Til slutt tillater mikroskala elektroporering elektrisk avhør av elektroporeringshendelser. For eksempel kan graden av cellemembranpermeabilisering overvåkes i sanntid på et enkeltcellenivå26,27. Formålet med denne metoden er å beskrive mikrofabrikasjon, systemoperasjon og analyse av en mikrofluidisk, encellet mikroelektroporeringsenhet som er i stand til å måle graden av cellemembranpermeabilisering for optimalisering av elektroporeringsprotokoller, men likevel øke gjennomstrømningen i forhold til den forrige toppmoderne.
Å utføre encellet nivå elektroporering er ikke lenger en ny teknikk, som den først ble demonstrert av Rubinsky et al. i 2001 med utviklingen av en statisk celleelektroporeringsteknologi28. Deres mikro-enhet var nyskapende som de var de første til å demonstrere evnen til å elektrisk overvåke hendelsen av elektroporering. Dette har videre ført til utvikling av statiske, encellede elektroporeringsteknologier som er i stand til elektrisk å oppdage graden av cellemembranpermeabilisering på en parallellisert måte for å øke gjennomstrømningen til enhetene. Men selv med parallellisering og batchbehandling mangler disse enhetene alvorlig det totale antallet celler de kan behandle per tidsenhet29,30. Denne begrensningen har ført til utvikling av gjennomstrømningsanordninger som er i stand til å utføre mikroelektroporering på enkeltcellenivå ved mye større gjennomstrømninger31. Denne enhetsovergangen, fra statisk til gjennomstrømningsmiljø, begrenser muligheten til elektrisk overvåking av graden av cellemembranpermeabilisering etter påføring av elektroporasjonspulsen. Metoden beskrevet i dette arbeidet bygger bro over gapet mellom disse to teknologiene, en mikroelektroporeringsteknologi som er i stand til elektrisk å oppdage, pulsere og overvåke graden av cellemembranpermeabilisering av individuelle celler, på en kontinuerlig strømning, seriell måte.
Denne teknologien ble nylig beskrevet i Zheng et al. I det arbeidet ble evnen til denne teknologien introdusert med ferdigstillelsen av en parametrisk studie, hvor både amplituden og varigheten av elektroporasjonspulsen ble variert, og det påfølgende elektriske signalet, som indikerer cellemembranpermeabilisering, ble utforsket32. Resultatene viste at en økning i intensiteten til elektroporasjonspulsen (dvs. økning i påført elektrisk felt eller økning i pulsvarighet) forårsaket en økning i den målte cellemembranpermeabiliseringen. For ytterligere å validere systemet ble en vanlig fluorescerende indikator for vellykket elektroporering, propidiumjodid33, tilsatt til cellesuspensjonen, og et fluorescensbilde ble tatt umiddelbart etter påføring av den elektriske pulsen. Det optiske signalet, dvs. fluorescensintensiteten av propidiumjodid inne i cellen, var sterkt korrelert med den elektriske målingen av graden av cellemembranpermeabilisering, og verifiserte påliteligheten av denne elektriske målingen. Imidlertid vurderte dette arbeidet bare levering av det lille molekylet propidiumjodid, som har liten eller ingen oversettbar betydning.
I dette arbeidet introduseres en ny anvendelse av denne teknologien for å forbedre systemets gjennomstrømning samtidig som den leverer en biologisk aktiv plasmid DNA (pDNA) vektor og vurderer elektrotransfeksjonseffektiviteten til celler som er replisert og dyrket etter elektroporering. Selv om det forrige arbeidet overgår eksisterende mikroelektroporeringsteknologier som er i stand til elektrisk å måle hendelsen av elektroporering, krever enhetens nåværende tilstand fortsatt lange celletransittider mellom elektrodesettet (~ 250 ms) for å utføre celledeteksjon, pulsapplikasjon og måling av cellemembranpermeabilisering. Med en enkelt kanal begrenser dette gjennomstrømningen til 4 celler/er. For å bekjempe denne begrensningen introduseres et nytt konsept for cellepopulasjonsbasert tilbakemeldingsstyrt elektroporering for å utføre pDNA-elektrotransfeksjon. Ved å bruke en hypofysiologisk ledningsevne elektroporeringsbuffer, tillater dette systemet elektrisk forhør av enkeltceller over en rekke elektroporeringspulsapplikasjoner. Basert på den elektriske responsen bestemmes deretter en "optimal" elektroporeringspuls. En "high-throughput" -modus implementeres deretter der bestemmelsen av cellemembranpermeabilisering oppheves, strømningshastigheten økes, og elektroporasjonspulsens driftssyklus tilpasses cellens transittid for å sikre en puls per celle i transitt mellom elektrodene. Dette arbeidet vil gi omfattende detaljer om mikrofabrikasjonstrinnene for produksjon av mikroenheten, materialet / utstyret og deres oppsett som kreves for å utføre eksperimenteringen, og drift / analyse av enheten og dens elektrotransfeksjonseffektivitet (eTE).
Figur 1: Eksperimentelle faktorer som påvirker utfallet av elektroporering. (Venstre) Cellesuspensjon - Viktige faktorer å vurdere før elektroporering begynner, inkluderer: Nyttelast (i dette tilfellet pDNA), konsentrasjon, celletetthet og elektroporeringsbufferegenskaper. Elektroporeringsbufferegenskaper å vurdere er ledningsevne, osmolaritet og den nøyaktige molekylære sammensetningen som bidrar til disse verdiene. (Midten) Pulsapplikasjon - Den nøyaktige pulstypen (firkantbølge vs. eksponentielt forfall) og pulsbølgeform (enkeltpuls vs. pulstog) må optimaliseres for å maksimere både den resulterende cellens levedyktighet og elektrotransfeksjonseffektivitet. Vanlige pulstog implementert i elektroporeringsprosesser består vanligvis av en serie høyspenningspulser (HV) eller serier av pulser som roterer mellom HV og lavspennings (LV) pulsstørrelser. (Høyre) Cell Recovery-Down-stream behandlingstrinn, spesielt gjenopprettingscellekulturmediet som cellene overføres til, bør optimaliseres. Ikke omtalt (Far Left), ytterligere oppstrøms cellebehandlingstrinn kan implementeres for generell elektroporeringsprosessoptimalisering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Brukere bør gå gjennom alle muskel- og skjelettlidelser for materialene og utstyret som brukes i denne protokollen. Egnet PPE skal brukes på hvert trinn og steril teknikk som brukes under eksperimentering. §§ 1-7 omhandler oppbyggingen av innretningen.
1. Enhetsfabrikasjon - Maskedesign
MERK: Se figur 2 for en illustrasjon av mikrofabrikasjonsprosessen. Mikrofabrikasjonstrinnene skal utføres i et renromsmiljø. Ytterligere PPE er nødvendig (hårnett, ansiktshårnett, maske, renromsdrakt, skodeksler).
- Installer en CAD-programvare etter eget valg, design en 2-dimensjonal "maske" av både mikrofluidisk kanal og elektroder og lagre designet i ønsket filformat (dvs. .dxf, .dwg).
MERK: Se supplerende figur 1 for et eksempel på et 2-dimensjonalt maskeskjema. - Send til en leverandør som skal skrives ut. Sørg for at dimensjonene til designene er innenfor leverandørens oppløsningsfunksjoner.
2. Fremstilling av enheter - Fotolitografi
MERK: De medfølgende mikrofabrikasjonsoppskriftene er hentet fra fotoresistprodusentens anbefalinger og skal kun brukes som utgangspunkt34. Nøyaktige verdier for steketider, eksponeringstider osv., må optimaliseres for hver fabrikasjonsprotokoll. Det anbefales å bruke waferpinsett for håndtering av både silisiumskiver og glassglass.
- Mikrofluidisk kanalfabrikasjon
- Silisium wafer og brus-lime glass lysbilde rengjøring: Følg trinn 2.1.2-2.1.3 for å utføre silisium wafer og 1 "× 3" soda-lime glass lysbilde rengjøring (begge referert til som "substrat").
- Senk substratene i et acetonbad, et isopropanol (IPA) bad og et avionisert vannbad i 10 minutter hver. Utfør denne 3-trinns vasken serielt ved romtemperatur.
- Fjern og tørk overflaten ved hjelp av et nitrogen under trykk eller filtrert luftgasskilde. Sett underlagene i en ovn på 150 °C i minst 30 minutter for å tillate fordampning av gjenværende fuktighet.
- SU-8 fotolitografi på silisiumskive: Utfør fotolitografi på silisiumskiven ved å følge trinn 2.1.5-2.1.14.
MERK: For å oppnå en mikrofluidisk kanalhøyde på 20 μm ble SU-8 2000-serien negativ fotoresist brukt. Eksakte spinnhastigheter vil variere avhengig av formuleringen av SU-8 (dvs. 2010, 2015, etc.); Følgende betingelser er imidlertid for SU-8 2010-formuleringen35. - Ta silikonskiven ut av ovnen på 150 °C og la den avkjøles til romtemperatur (RT).
- Fest waferen til chucken på wafer-spinnbeleggeren ved hjelp av spincoaterens vakuumsystem. Programmer spinneren. Trinn 1 - 500 o / min i 10 s ved en akselerasjon på 100 o / s, Trinn 2 - 1000 o / min i 30 s ved en akselerasjon på 300 o / s.
- Dispenser 4 ml SU-8 2010 fotoresist på midten av silisiumskiven. Kjør programmet. Når systemet stopper, slår du av vakuumet.
- Bruk pinsett til å overføre den SU-8-belagte silisiumskiven på en kokeplate ved 95 °C i 4-5 minutter for myk bake. Fjern deretter waferen fra kokeplaten og la den avkjøles til RT.
MERK: Følg riktig oppstartsprosedyre for den laboratoriespesifikke fotolitografiske maskejusteringen. - Fest fotomasken med 2D-mikrofluidiske kanaldesign på maskeholderen. Sett silisiumskiven, med SU-8-belegget vendt oppover, på wafer-chucken.
- Still inn eksponeringsinnstillingene til 150 mJ/cm2 og kjør maskinen.
FORSIKTIG: Ikke se direkte på UV-lyskilden for å unngå potensiell øyeskade. - Plasser den SU-8-belagte silisiumskiven på en kokeplate ved 95 °C i 4-5 minutter for bakebaking etter eksponering.
- Senk silisiumskiven i SU-8-utviklerløsningen (se materialfortegnelse) i 3-4 min. Påfør forsiktig agitasjon. Fjern waferen fra løsningen og skyll overflaten med IPA.
- Tørk overflaten med et nitrogen under trykk eller filtrert luftgasskilde. Inspiser funksjonene under et mikroskop ved hjelp av et UV-filter og sørg for ingen åpenbare feil i mikrofluidiske kanaler.
- Sett silikonskiven i en ovn på 150 °C i minst 30 minutter for hard bake.
- Tillat å kjøle seg ned til RT og bruk pekepennprofilometri for å måle nøyaktig høyde og helling på kanalens sidevegger.
- Fotolitografi på Glass Slides
MERK: Hexamethyldisilazane (HMDS) brukes som vedheftspromotor for S1818 positiv fotoresist36.- Fjern glassglasset fra ovnen på 150 °C og la det avkjøles til RT.
- Fest glassglasset til spinnerens chuck ved hjelp av vakuum og programmer spinneren. Trinn 1 - 500 o / min i 10 s ved en akselerasjon på 100 o / s. Trinn 2 - 3000 o / min for 30 satt en akselerasjon på 300 rpm / s.
- Dispenser 3-4 dråper HMDS over overflaten av glassglasset. Kjør programmet.
MERK: For å oppnå et overflatebelegg på ~ 3 μm, bør S1800 positiv fotoresistserie brukes. Eksakte spinnhastigheter vil variere avhengig av formuleringen; anbefalingene nedenfor er for S1818 formulering34. - Dispenser 1 ml fotoresist på overflaten av glassglasset. Sørg for nok til å dekke overflaten.
- Kjør programmet. Når systemet stopper, slår du av vakuumet og fjerner glassglasset.
- Legg S1818-belagt glassglass på en kokeplate ved 120 °C i 4 minutter for myk bake. Fjern og la komme til RT.
- Fest fotomasken med 2D-elektrodedesignene på maskeholderen.
- Sett inn og juster glassglasset, med S1818-belegget vendt oppover, på wafer-chucken. Still inn eksponeringsinnstillingene til 250 mJ/cm2 og kjør maskinen.
MERK: Ulike kontaktreguleringsmodeller kan være mer eller mindre imøtekommende for ikke-sirkulære underlag med varierende tykkelse. - Senk glassglasset i MF-319 utviklerløsning i 2 min. Påfør forsiktig agitasjon. Skyll overflaten av glassglasset med avionisert vann.
- Tørk overflaten med et nitrogen under trykk eller filtrert luftgasskilde og observer funksjonene under et mikroskop ved hjelp av et UV-filter. Pass på at det ikke er noen åpenbare feil i de litografiske mønstrene.
- Sett glassglid inn i ovnen på 150 °C, slik at underlagets overflate vender opp, i minst 30 minutter for hard bake. Fjern fra ovnen og hold deg beskyttet mot lys.
3. Enhetsfabrikasjon: Hydrfluorsyre (HF) etse
FORSIKTIG: Dette trinnet innebærer håndtering og avhending av flussyre (HF), som kan forårsake dype, smertefulle kjemiske forbrenninger. Ytterligere PPE skal brukes til å beskytte håndtereren (ansiktsskjerm, albuelengde kjemisk motstandsdyktige hansker, kjemisk motstandsdyktig forkle med ermer). Kalsiumglukonatsyrenøytralisator og hudgel bør oppbevares i nærheten av laboratoriebenken. Dette trinnet bør ikke utføres alene. HF skal aldri oppbevares i eller dispenseres i glassbeholdere, da beholderen vil bli etset av syren.
MERK: HF etser jevnt det eksponerte glasset (dvs. elektrodedesignet) for å danne en fordypning i glasset, noe som gir bedre kantoppløsning av elektrodemønsteret etter metallavsetning (avsnitt 4).
- Senk glassglasset i 10: 1 bufret HF-løsning i 1 minutt i en polytetrafluoretylenbeholder. Overfør og vask glassglassene i avionisert vann. Gjenta vasketrinnet 3 ganger.
- Tørk overflaten med et nitrogen under trykk eller filtrert luftgasskilde. Plasser glassunderlag i en ovn på 65 °C over natten for å fjerne eventuell gjenværende fuktighet. Dekk underlagene fra lys.
4. Enhetsfabrikasjon: Fysisk dampavsetning
MERK: Dette trinnet innebærer metallavsetning på glassglideunderlagene for å definere elektrodemønstrene. Vanlige metallelektroder er krom/gull og titan/platina. Gull og platina fester seg ikke til glassunderlaget, så det kreves et frøadhesjonslag av henholdsvis krom eller titan for å fremme vedheft37.
- Følg den renromsspesifikke protokollen for å betjene det interne PVD-systemet. Dette arbeidet bruker et DC sputtering system og sputter med 100 SCCM Argon gass ved et trykk på ~ 8 mTorr og 200 W effekt.
- Sputter titan i 8 min med en hastighet på ~ 100 Å / min. Sputter platina i 10 min med en hastighet på ~ 200 Å / min. Fjern substratene fra PVD-kammeret.
5. Enhetsfabrikasjon: Photoresist lift-off
MERK: Dette trinnet innebærer å oppløse fotoresistlaget i et acetonbad, og etterlate de vedlagte platinaelektrodene mønstret på glassglassene.
- Senk de metallbelagte glassglassene i et acetonbad i ~ 10 minutter.
- Sonicate badet for å introdusere agitasjon for å bryte opp den ufestede metallfilmen. Bruk en aceton-gjennomvåt våtserviett for å fjerne rester om nødvendig.
- Når all fotoresist/metall er fjernet, vask elektrodemønstrene med avionisert vann og sett dem i en ovn på 65 °C over natten for å fjerne eventuell gjenværende overflatefuktighet.
- Bruk pekepennprofilometri for å måle profilen til de mønstrede elektrodene.
6. Fremstilling av enheter: Myk litografi
MERK: Dette trinnet innebærer å replikere støping av den mikrofluidiske kanalen på SU-8-hovedavlastningsstrukturen ved hjelp av en elastomer, polydimetylsiloksan (PDMS).
- Silisium wafer silanisering
MERK: Dette er et valgfritt trinn; Det vil imidlertid øke levetiden til SU-8-avlastningsstrukturen som ble produsert i punkt 2.1. Dette trinnet skal utføres i en kjemisk avtrekkshette.- Fest waferen til bunnen av en petriskål og legg petriskålen i en desiccator.
- Omgi omkretsen av silisiumskiven med ca. 50 μL Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silan. Koble til vakuum (vakuumpumpe eller husvakuumledning) og kjør i 20 minutter.
- PDMS kopi støping
- I en engangsbeholder (f.eks. veiebåt, plastkopp), bland PDMS elastomerbase til herder med et vektforhold på 10:1 på toppen av en elektronisk vekt. Hell PDMS-løsningen over silisiumskiven og legg blandingen under et vakuum for å fjerne alle luftbobler.
- Herd ved 65 °C i minst 4 timer, slik at PDMS kan stivne. Bruk spissen av et barberblad, kutt ut den støpte PDMS og skrell fra silisiumskiven.
- Bruk en skjerpet biopsistans, fjern PDMS fra innløpet/utløpene til enheten. For denne enheten ble 0,75 mm og 3 mm biopsistanser brukt til henholdsvis innløpene og uttakene.
MERK: Biopsistansen som brukes skal ha en litt mindre diameter enn den ytre diameteren på sammenkoblingsslangen for å sikre en tett forsegling av slanger i reservoarene.
- Sonikering rengjøring av PDMS
- Senk PDMS-enhetene i IPA og plasser dem i en sonikator i 30-45 minutter for å fjerne PDMS-rusk fra innløpet / uttakene. PDMS kan svulme i IPA-løsningen.
- Skyll med avionisert vann og sett i en 65 °C ovn over natten for å la PDMS svulme tilbake til normal størrelse.
MERK: Alt rester av rusk kan tette enheten under eksperimentering. Store biter av rusk kan fjernes fra PDMS-overflaten ved hjelp av et stykke scotch tape før sonikering.
7. Enhetsfabrikasjon: PDMS-liming / ledningsfeste
MERK: Dette trinnet innebærer å behandle overflaten av PDMS og glasssubstrat med et oksygenplasma for å danne en irreversibel binding mellom PDMS og glass38. Oppskriften som gis, må kanskje tilpasses det nøyaktige systemet som brukes i laboratoriet.
- Klipp enhetene i størrelse og sørg for at overflaten på PDMS-enheten er ren. Hvis ikke reclean, følg trinnene i underavsnitt 6.3.
- Programmer plasmageneratoren. Sett effekt til 70 W, tid til 35 s, trykk til 325 mTorr, strømningshastighet for oksygengass til 60 SCCM. Plasser PDMS og elektrodeglass lysbilde inn i systemet med funksjonene vendt opp og kjør programmet.
- Fjern enhetene og juster raskt kanalfunksjonene til elektrodene ved hjelp av et stereoskop. Trykk godt fra midten av PDMS mot sidene for å fjerne uønskede luftbobler ved bindingsgrensesnittet.
- Plasser på et varmt sted ved 95 °C i minst 2 minutter for å fullføre limingsprosedyren og la enheten avkjøles ved RT.
- Skjær 2 stk 22-G solid wire på ~ 6 "lengder og stripe isolatoren fra begge ender.
- Bind ledningene til elektrodeputer ved hjelp av sølvledende epoksy. Plasser ferdige enheter i en ovn på 65 °C over natten.
Figur 2: Fremstilling av mikroenheter. (A) Mikrofluidisk kanalfabrikasjon - Viktige trinn: Silisiumskiverengjøring (trinn 2.1.1-2.1.3), fotoresistbelegg og myk bake (trinn 2.1.7-2.1.8), UV-eksponering (trinn 2.1.10), utvikling (trinn 2.1.12) og PDMS-helling (underavsnitt 6.2). (B) Elektrodefabrikasjon - Viktige trinn: Rengjøring av glassglass (trinn 2.1.1-2.1.3), HMDS-belegg og fotoresistbelegg (trinn 2.2.3-2.2.4), UV-eksponering (trinn 2.2.8), utvikling (trinn 2.2.9), HF-etsing (avsnitt 3), fysisk dampavsetning (avsnitt 4) og fotoresistløfting (avsnitt 5). (C) Enhetsavslutningsnøkkeltrinn: Tilgang til innløp / uttak og sonikering (trinn 6.2.3 og seksjon 6.3), PDMS-liming og ledningsfeste (avsnitt 7). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
8. Cellekultur og høsting
MERK: Standard cellekultur og sterile håndteringsprosedyrer bør benyttes. Følg celletypespesifikk protokoll for cellekultur.
- Cellekultur
- Cellepassasje: Kultur og passasje cellene etter trinn 8.1.2-8.1.5.
- HEK293-celler i komplett DMEM-løsning (88% DMEM, 10% varmeinaktivert fosterbovint serum, 1% L-glutamin, 1% penicillin-streptomycin) i en T25-kolbe i en inkubator ved 37 ° C, 95% O2, 5% CO2. Passasjeceller etter planen når du når ~ 80% sammenløp.
- Aspirer mediet ved hjelp av enten en pipette eller vakuumsystem og inkuber cellene i 0,25% trypsin-EDTA (2 ml-T25 kolbe) i 2 minutter ved 37 ° C. Nøytraliser trypsin med dobbelt så mye volum av kulturmedier.
- Overfør cellesuspensjonen til et 15 ml konisk rør og sentrifuger HEK293-celler ved 770 x g i 2 minutter. Aspirer supernatanten ved hjelp av enten en pipette eller et vakuumsystem
- Resuspender HEK293-celler i 1 ml forvarmet DMEM.
- Cell plating: Plate cellene følgende trinn 8.1.7-8.1.8
- Plate cellene ved en fortynning på 10: 1 til 20: 1 i en T25-kolbe (5 ml DMEM) for å fortsette kulturen.
- Plate cellene ved en 5: 1 til 20: 1 fortynning i en 6-brønnplate (2 ml DMEM per brønn) som skal høstes for elektroporeringseksperimenter.
MERK: HEK293-celler belagt 24 timer før elektroporeringseksperimenter for å oppnå ~ 70% sammenløp ved cellehøsting (underavsnitt 8.3). En inkonsekvent høstplan kan føre til variasjon i elektroporeringsresultater.
- Elektroporering buffer
- Forbered elektroporeringsbuffer
MERK: Se Sherba et al. for detaljer om elektroporeringsbufferpreparatet8. Buffersammensetningen var 285 mM Sukrose, 0,7 mM MgCl2, 1 mM KCl, 10 mM HEPES, 3 mM NaOH (pH: 7,4; osmolalitet: 310 mOsm, konduktivitet: 500 μS/cm). Elektroporeringsbuffer skal formuleres på en steril måte og oppbevares ved 4 °C i en holdbarhet på ~1 måned. Elektroporeringsbufferformulering bør optimaliseres per celletype.
- Forbered elektroporeringsbuffer
- Cellehøsting og pDNA-addisjon
- Følg de samme trinnene som cellepassasje (8.1.2-8.1.4).
- Vask cellene i steril 1x PBS, overføringscellesuspensjon i et 15 ml konisk rør og sentrifugeceller ved 770 x g i 2 minutter.
- Vask HEK293-cellepelleten i elektroporeringsbufferen og sentrifugen ved 770 x g i 2 minutter. Resuspender cellene i elektroporeringsbufferen ved ~ 5 millioner celler / ml.
MERK: Celletetthet bør optimaliseres per celletype. - Legg til pDNA-koding for grønt fluorescerende protein (GFP) til en endelig konsentrasjon på 20 μg / ml. Bland forsiktig pDNA/cellesuspensjonen og overfør suspensjonen til en 1 cc sprøyte for eksperimentering.
9. Maskinvare/eksperimentelt oppsett
MERK: Før høsting av celler for eksperimentering, må du sørge for at det eksperimentelle oppsettet er fullført for å minimere tiden cellene er suspendert i elektroporeringsbufferen. Slå på elektronikk 20-30 min før eksperimenter for å varme opp. Se figur 3 for et skjema over det eksperimentelle oppsettet for driften av enkeltcelledeteksjonsmodulen.
MERK: En spesialbygd PA90 Op-Amp-krets ble utviklet for å imøtekomme både følsomheten som kreves for deteksjon på enkeltcellenivå ved hjelp av innlåsingsforsterkeren og de høye spenningene som kreves for å påføre tilstrekkelig sterke elektroporeringspulser. Se PA90 datablad for spesifikasjoner på anbefalte kretser39.
- Initialiser innlåsingsforsterkeren med gjeldende forforsterkerinnstillinger og still inn via algoritmen. Se Zheng og medarbeidere for detaljer om innlåsingsinnstillingene32.
- Strømforsyninger, funksjonsgenerator og forsterker
- Strømforsyning 1: Sett til -15 V for å drive den negative enden av kretsen.
- Strømforsyning 2 (funksjonsgenerator): Sett til å sende ut DC-signal og sett amplituden til 2 V. Koble til 50x forsterkerinngang.
- Program Elektroporering Pulsgenerator for kvadratbølgen: Still inn ønsket pulsbredde (driftssyklus) og ønsket pulsamplitude (volt).
- Sett utgang til utløsermodus (1 puls). Koble utgangen til inngangen til 50x-forsterkeren.
MERK: Husk 50x gevinst når du programmerer pulsamplituden. Dvs. for å oppnå en elektrisk feltstyrke på 1 kV / cm, er det nødvendig med totalt 30 V, 30 V / 300 μm (avstand mellom elektroder), derfor bør funksjonsgeneratorutgangen settes til 30/50 eller 600 mV. - Kontroller utgangene til 50x-forsterkeren ved hjelp av et oscilloskop. Utgang 1-100 V fra strømforsyning 2 (9.2.2). Utgang 2-Variabel amplitude for elektroporasjonspulsen (9.2.4).
- Koble en 10x sonde til en oscilloskopkanal og til den ferdige mikroenheten (enhet under test, DUT) i trinn 7.6 der elektroporasjonspulsen skal påføres. Overvåk systemet under eksperimentering for å sikre at pulser blir påført.
- Forsikre deg om at innelåst USB er tilkoblet og registrert. Dobbeltsjekk alle innlåsingsinnstillinger i algoritmekoden (viktigst av alt, innlåsingsfrekvens).
- Mikroskop / CCD kamera
- Plasser mikroenheten på mikroskopets stadium via en lysbildeholder. Slå på CCD-kameraet og sett den mikrofluidiske kanalen i fokus. Bruk et mål på 4x eller 10x.
Figur 3: Eksperimentelt oppsett skjematisk-Enkeltcelledeteksjon. Den kraftige op-ampen (PA-90) gjør det mulig å superplassere høyspenningselektroporeringspulsen på det innebygde utgangssignalet som kreves for enkeltcelledeteksjon. Dette eksitasjonssignalet passerer gjennom mikroelektroporeringsenheten (Enhet under test, DUT) hvor strømmen deretter forsterkes av den nåværende forforsterkeren og mates inn i algoritmen. Systemet overvåker kontinuerlig for celledeteksjonshendelsen. Ved celleinngang genereres et digitalt signal av den låste forsterkeren for å utløse påføringen av elektroporasjonspulsen til cellen (e) under transport. Forklaring: PA-90 (høy effekt op amp), DUT (enhet under test), DIO (digital inngang/utgang), FG-EP (funksjonsgenerator / elektroporeringspuls), 50X (50X forsterker), PS-V- (strømforsyning / negativ spenning for PA 90), FG-V+ (funksjonsgenerator, positiv spenning for PA 90). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
10. Eksperimentell operasjon
- Mikrofluidisk kanalpriming
- Fjern alle luftbobler fra den cellebelastede sprøyten. Fest en 30 G kanyle til den cellebelastede sprøyten.
- Bruk pinsett, skyv tygonslangen nedover lengden på nålen. Forfyll utløpsreservoaret med gjenvinningsmedier (samme som trinn 8.1.2 uten antibiotika), ~40-50 μL.
- Bruk tommelen, trykk forsiktig på stempelet slik at væsken sakte når enden av rørledningen.
- Fest sprøyten til sprøytepumpen. Slå på sprøytepumpen og sørg for at den er satt til å videresende perfusjon.
- Programmer pumpen for riktig diameter på sprøyten for å sikre at strømningshastighetene er nøyaktige. Se pumpehåndboken for detaljer om sprøytediametre.
MERK: For å hindre at celler setter seg i sprøyten, fest sprøytepumpen på et klemmestativ slik at den kan fungere i vertikal stilling med sprøyteenden vendt nedover. - Still sprøytepumpens strømningshastighet, ~ 10-20 μL / min, og la pumpen gå til væsken når enden av slangen. Fest slangen til mikrofluidisk enhet.
- Senk sprøytepumpens strømningshastighet, ~ 5-10 μL / min, og la pumpen gå til all luft er utvist fra den mikrofluidiske enheten og celler krysser til enhetens utløp.
- Fjern cellene fra utløpet via pipetteaspirasjon. Fyll utløpsreservoaret på nytt med gjenvinningsmedier (samme som trinn 8.1.2 uten antibiotika), ~40-50 μL.
- Encellet elektroporering-cellemembran permeabilisering kartlegging
MERK: Se figur 4 og figur 5 for en bedre forståelse av de elektriske dataene som indikerer henholdsvis cellemembranpermeabilisering og kartlegging av cellemembranpermeabilisering.- Sett sprøytepumpens strømningshastighet til ~0,1-0,3 μL/min for å sikre en strøm av enkeltceller gjennom elektrodesettet. Cellens transittid mellom elektrodene skal være ~ 250 ms.
- Start dataprogrammet ved å klikke på Kjør. Forsikre deg om at systemet lagrer de elektriske dataene.
- Forsikre deg om at systemet pålitelig oppdager celler for å utløse de datastyrte pulsapplikasjonene. Juster deteksjonsterskelen tilsvarende.
- Still inn pulsparametrene for den første, laveste elektroporasjonspulsen for elektrisk energi. Se tabell 1 for elektroporeringspulserende parametere i denne studien.
- Slå på utgangskanalen for elektroporasjonspulsgeneratoren (trinn 9.2.3.).
- Følg et forhåndsbestemt antall celledeteksjons-/pulsapplikasjoner (n = 100). På slutten av hver testet tilstand, aspirer celler fra mikrodeviceutløpet og fyll på uttaket med gjenopprettingsmedier.
- Iterer til neste elektroporasjonspulstilstand. Gjenta til alle elektroporeringspulsforhold er testet.
- Bestem graden av cellemembranpermeabilisering for hver pulsapplikasjon som testes. (Validering etter prosessen er beskrevet i punkt 11.1). Generer kartet over permeabilisering av cellemembranen (figur 5).
- Bestem elektroporasjonspulsparametrene for populasjonsbasert tilbakemelding med høy gjennomstrømning.
- Slå av sprøytepumpen, fjern celler fra utløpsbeholderen og fyll på uttaket med gjenvinningsmedier.
- Populasjonsbasert feedback-kontrollert elektroporering-høy gjennomstrømning
MERK: Se figur 6 for et skjema som illustrerer den populasjonsbaserte tilbakemeldingsprosessen.- Sett sprøytepumpens strømningshastighet til ~ 1-3 μL / min for å sikre en strøm av enkeltceller gjennom elektrodesettet. Cellens transittid mellom elektrodene skal være ~ 25 ms.
- Sett pulsamplituden til den "optimaliserte" tilstanden (10.2.9), slå av utløsermodus og still inn pulsbredden slik at den samsvarer med cellens transittid.
- Still inn driftssyklusen slik at pulstiden PÅ samsvarer med den "optimaliserte" tilstanden. Se tabell 1.
- Sett utgangskanalfunksjonsgeneratoren til PÅ, slå på sprøytepumpen og la systemet kjøre til ønsket antall celler er elektroporert.
- Når du er ferdig, slår du av både sprøytepumpen og funksjonsgeneratoren.
- Overfør cellene fra utløpsreservoaret til riktig størrelse cellekulturkolbe/plate fylt med forvarmede gjenvinningsmedier og overføringskulturkolbe/plate inn i inkubatoren.
11. Analyse
- Deteksjon av membranpermeabilisering på enkeltcellenivå
MERK: For å sikre at den "optimale" pulsen ble brukt under modulen med høy gjennomstrømning, bør det utføres en analyse etter eksperimentet for å verifisere de elektriske dataene som eksporteres fra underavsnitt 10.2. Se figur 4 for en grafisk fremstilling av det elektriske signalet som er representativt for membranpermeabilisering på grunn av elektroporering.- Last inn data i en analyseprogramvare (MATLAB, Python, etc.). Generer et plott av Gjeldende versus Tid for hver pulserende tilstand.
- Manuelt bestemme graden av cellemembranpermeabilisering (Δ IP / ΔIC). Se figur 4. Generer cellemembranpermeabiliseringskartet (Δ IP / ΔIC versus elektrisk energi, figur 5) over alle testede pulsforhold. Bekreft "optimal" pulserende tilstand.
- Effektivitet ved elektrotransfeksjon (eTE)
- Etter 24-timers inkubasjonsperioden, fjern de elektroporerte cellene fra inkubatoren.
- Utfør en levende celleflekk. Fortynn DRAQ5 1:1000 til en endelig konsentrasjon på 5 μM i cellekulturbeholderen. Bland cellene/fargeløsningen forsiktig og inkuber ved 37 °C i 5-30 minutter.
MERK: En annen flekk kan implementeres i dette trinnet. Forsikre deg om at de fluorescerende egenskapene ikke overlapper med den fluorescerende markøren som indikerer vellykket elektrotransfeksjon (dvs. GFP er i den grønne bølgelengden og DRAQ5 er den langt røde). - Slå på et epifluorescerende mikroskop, lampe og kameraer (se Materialfortegnelse).
- Fjern cellene fra inkubatoren og ta dem i fokus på mikroskopet.
- Ta et fasekontrastbilde (lysfelt) av det valgte feltet.
- Ta epifluorescerende bilder av det samme feltet ved hjelp av FITC (GFP) og Far-Red (DRAQ5) filtre. Analyser bildesettene manuelt eller via en algoritme.
MERK: Se figur 7 for representative bilder. - Tell totalt antall GFP-positive celler i alle bildene. Tell totalt antall DRAQ5-fargede celler i alle bildene. Beregn eTE (forholdet mellom GFP-positive celler og DRAQ5-fargede celler).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 4 fremhever driftsprinsippene bak deteksjon av enkeltcellemembranpermeabilisering for en enkelt pulsamplitude. Etter initiering av elektroporeringseksperimentet bestemmer celledeteksjonsalgoritmen en optimal terskel for celledeteksjon via en punkt-for-punkt, skråningsbasert deteksjonsmetode. Systemet overvåker deretter kontinuerlig (1) for en signifikant negativ endring i den målte elektriske strømmen, noe som indikerer inngangen til en celle. Dette skyldes den biologiske cellemembranens isolerende natur, slik at når cellen krysser gjennom elektrodesettet, er det en øyeblikkelig økning i impedansen, noe som resulterer i en skarp, reduksjon i den målte strømmen, noe som muliggjør konsistent celledeteksjon (2), som til slutt utløser bryteren til den datastyrte pulsapplikasjonen (4). Den isolerte cellen forskyver et volum elektrolytt mellom elektrodene, noe som resulterer i et strømfall som er proporsjonalt med cellens størrelse. Denne endringen i strøm betegnes som ΔIC (3). Umiddelbart etter ΔIC-beregningen administreres den forhåndsbestemte, elektriske pulsen (4) til cellen under transport. Denne øyeblikkelige tilstrømningen av energi introduserer en kort sensorartefakt i systemet (grå boks). Ved relåsing på signalet, dvs. bytte tilbake til celleovervåking, (5) er det tydelig at elektroporasjonspulsen gjennomsyret cellemembranen som størrelsen på strømendring på grunn av cellens tilstedeværelse mellom elektrodesettet faller ved utgang (6). Forskjellen i de to dråpene i strøm på grunn av cellens impedansstørrelse før / etter elektroporeringspulsapplikasjon kalles permeabiliseringsstrømmen og betegnes som ΔIP. Når cellen går ut av volumet mellom elektrodene, stabiliseres grunnlinjen, og systemet går tilbake til celledeteksjonsmodus (1). Etter at et forhåndsbestemt antall celler er elektroporert, testes den nest høyeste energielektroporeringspulsen (se tabell 1 for pulsinnstillinger). For hver elektroporasjonspuls som testes, bestemmes en gjennomsnittlig "grad av membranpermeabilisering". Denne verdien beregnes som Δ IP/ΔIC. Når hver forhåndsbestemte elektroporeringspuls er testet, plottes Δ IP/ΔIC mot den påførte elektriske energitettheten (σ x E 2 x t), hvor σ er løsningens ledningsevne (S/cm), E er den elektriske feltstyrken (kV/cm), og t er pulsvarigheten (ms). Se figur 5 for cellemembranpermeabiliseringskartet for HEK293-celler som brukes i dette eksemplet.
Tabell 1: Parametere for elektroporasjonspuls. For denne studien ble elektroporeringspulser valgt slik at ladningsfluksen (σ×E×t) forblir konstant, hvor σ er løsningens ledningsevne (S / cm), E er den elektriske feltstyrken (kV / cm) og t er pulsvarigheten (ms). Resultatet er et spektrum av den påførte puls elektriske energien. Eksempler på den nødvendige driftssyklusen (d.c.) for å oppnå de angitte pulsparametrene er gitt for både en 5× og 10× økning i den første (enkeltcelledeteksjon) strømningshastigheten. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Figur 4: Enkeltcellemembranpermeabilisering - Algoritmeoperasjon. (Øverst) Elektrisk opptak av en serie enkeltcelledeteksjoner / pulsapplikasjoner (indikert av de skarpe piggene i strømmen). (Nederst) Systemoperasjon for deteksjon og pulsering av en enkelt celle. (1) Systemet registrerer kontinuerlig for en endring i strømmen, via en punkt-for-punkt-skråningsberegning. (2) En kraftig reduksjon i skråningen oppdages, noe som indikerer at en celle kommer inn mellom elektrodene og utløser den datastyrte pulsapplikasjonen. (3) Et strømfall (ΔIC) bestemmes og er proporsjonalt med størrelsen på cellen. (4) Elektroporasjonspulsen påføres cellen under transport, noe som forårsaker en sensingartefakt i det elektriske signalet (grå boks). (5) Innlåsingsforsterkeren bytter tilbake til celleovervåking når den låses inn i cellen under transport. (6) Cellen går ut av elektrodesettet, noe som forårsaker en annen, mindre størrelsespike i strøm (Δ IC > (I 6 - I5)). Forskjellen i impedansmålingene skyldes poredannelse gjennom den isolerte cellemembranen. Denne endringen i strøm kalles permeabiliseringsstrømmen (ΔIP). Graden av cellemembranpermeabilisering beregnes (Δ IP/ΔIC). Grunnlinjen stabiliseres og systemet går tilbake til deteksjonsmodus (1). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
En tydelig korrelasjon observeres mellom den anvendte elektriske energien og graden av cellemembranpermeabilisering (figur 5), med eksistensen av et overgangsområde hvor en betydelig økning i graden av cellemembranpermeabilisering oppstår. For dette formål velges en puls med elektrisk energi som overgår dette overgangsområdet for høygjennomstrømningsfasen av mikroelektroporeringsprosessen (figur 6). I dette eksperimentet ble pulsen på 1,8 kV/cm: 670 μs bestemt som «optimal». Som beskrevet i detalj i punkt 10.3 i protokollen, økes systemets strømningshastighet, og funksjonsgeneratoren settes til kontinuerlig å sende ut en puls med en innstilt puls og driftssyklus (se tabell 1 for pulsinnstillinger for 1,5 μL / min og 3,0 μL / min strømningshastigheter) for å sikre at 1 puls påføres hver celle under transport. I denne studien ble strømningshastigheten økt med 5x, og dermed ble pulsbredden satt til 50 ms (som samsvarer med cellens transittid) ved en driftssyklus (dc) på 2,7%.
Figur 5: HEK293 kartlegging av cellemembranpermeabilisering -Δ Ip/ ΔIc versus elektrisk energi. De elektriske dataene (Δ IP / ΔIC) er representert som gjennomsnittlig ± SEM. Pulserende forhold (fra venstre mot høyre) - 0,4 kV / cm: 3 ms, 0,8 kV / cm: 1,5 ms, 1,0 kV / cm: 1,2 ms, 1,2 kV / cm: 1 ms, 1,8 kV / cm: 0,67 ms, 2,4 kV / cm: 0,5 ms. En klar korrelasjon observeres mellom graden av cellemembranpermeabilisering og den elektriske energidensiteten til den påførte pulsen. For denne eksperimentrunden ble pulserende tilstand på 1,8 kV / cm: 0,67 ms valgt som den "optimale" elektroporeringspulsen for høygjennomstrømningsmodulen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: Cellepopulasjonsbasert tilbakemeldingsstyrt elektroporeringsprosess arbeidsflyt. For å starte, programmeres en innledende strømningshastighet (Q0) for å tillate elektrisk avhør på enkeltcellenivå. Et programmerbart antall celler pulseres ved hver forhåndsbestemt elektroporeringspulserende tilstand (E 0 / t0 til EN / tN), med den påførte elektriske energien økende med hver iterasjon av elektroporasjonspulsapplikasjoner. Etter fullføring av den høyeste elektriske energipulsen som er inkludert i studien, EN / tN, plottes cellemembranpermeabiliseringskurven, og den optimale elektroporasjonspulsen bestemmes for cellepopulasjonen som testes. Systemet går videre til høy gjennomstrømningsmodus, hvor strømningshastigheten økes tilQ-gjennomstrømning, og de hastighetsbegrensende encelleforhørstrinnene utelates. Det optimale pulstoget vil kontinuerlig bli brukt E opt / t opt på d.c.opt slik at hver celle i transitt vil motta en enkelt elektroporeringspuls basert på cellens transittid og pulsbreddens driftssyklus (dc). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Etter 24 timers gjenoppretting etter elektroporering ble cellene avbildet for å bestemme elektrotransfeksjonseffektiviteten (eTE). Som beskrevet i underavsnitt 11.2 i protokollen, ble eTE bestemt som det totale antallet celler som uttrykker GFP normalisert til det totale antall celler farget med DRAQ5. TE for pulsen på 1,8 kV/cm: 670 μs ble bestemt til å være ~70 % (figur 7A). For å markere viktigheten av systemet for nøyaktig å kartlegge graden av cellemembranpermeabilisering og velge en tilstrekkelig høy elektroporeringspulsenergi ved overgang til høykapasitetsmodus, ble 0,4 kV / cm: 3 ms pulstilstand også utforsket når det gjelder eTE (figur 7B). I dette tilfellet var den resulterende eTE etter 24 timer mindre enn 5%.
Figur 7: elektrotransfeksjonseffektivitet-GFP-uttrykk ved 24 timer. HEK293-celler ble inkubert ved 37 °C i 24 timer etter mikroelektroporeringsforsøk. Alle celler ble farget med DRAQ5 (rød), og elektrotransfeksjonseffektiviteten (eTE) ble bestemt basert på forholdet mellom celler som uttrykker GFP (grønn) og totalt cellenummer (rød). Cellens levedyktighet ble ikke vurdert som en utfallsmetrisk i denne studien. (A) Representativt, stablet 4× fluorescensbilde av HEK293-celler vellykket transfisert via en 1,8 kV / cm: 670 μs puls som viser eTE på ca. 70%. (B) Representativt, stablet 4× fluorescensbilde av HEK293-celler uten hell transfisert via en 0,4 kV / cm: 3 ms puls som viser eTE << 5%. Skala bar: 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende figur 1: 2-dimensjonal CAD-skjematisk. Mikroelektroporeringsanordningen består av en rett, 100 μm bred mikrokanal med et innløp på 1 mm diameter og et utløp på 3 mm diameter. Hvert elektrodespor er 100 μm bredt og elektrodesettet omfatter elektroporeringsområdet til enheten, som er 300 μm langt. Den 3-dimensjonale høyden på mikrokanalen styres av tykkelsen på fotoresisten. I dette arbeidet var høyden på enheten 20 μm. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metodikken som presenteres i denne protokollen fokuserer primært på mikrofabrikasjon av en mikrofluidisk enhet som deretter integreres i et spesialisert elektroporeringseksperimentelt oppsett. Begrepet "oppskrift", som ofte brukes når man beskriver detaljene i mikrofabrikasjonsprosessen, antyder viktigheten av å følge / optimalisere hvert trinn for å kunne fremstille en fungerende enhet. Imidlertid kan visse kritiske trinn i prosessen, når de ikke er optimalisert, for eksempel UV-eksponeringstid / energi, PVD-sputteringshastigheter / varigheter og oksygenplasmageneratorinnstillinger, være problematiske for både fabrikasjonsprosessen og vellykket gjennomføring av elektroporeringseksperimentene. Feilsøking av fabrikasjonsprosessen gjøres primært via prøving og feiling eller en mer kontrollert Design of Experiments eksperimentell design. I tillegg er det alternative mikrofabrikasjonsteknikker, for eksempel Deep Reactive Ion Etching (DRIE), som kan erstattes for å utføre de forskjellige trinnene i protokollen (dvs. ved hjelp av en DRIE-etset støpestruktur for å utføre den myke litografiprosessen). Videre kan optimalisering av oppskrifter og design / fabrikasjon av enheter være tidkrevende for nybegynnere i feltet. Men når mikrofabrikasjonsprosessen er vellykket utviklet, har ingeniøren / forskeren friheten til å designe en enhet som passer til deres spesifikke behov.
For det formål ble enheten beskrevet i denne protokollen utviklet for å utvide vårt tidligere arbeid32. Dette innebar utnyttelse av encellet membranpermeabilisering elektrisk deteksjon, men på en høyere gjennomstrømningsmåte. Det eksperimentelle oppsettet som er beskrevet i krever behovet for spesialutstyr, dvs. innlåsingsforsterker, som kan være uvanlig for standard forskningslaboratorium og dermed begrense potensiell oppsøkende og tilpasningsevne av denne teknikken. Imidlertid kan en "bare-bones" mikrofluidisk elektroporeringsenhet implementeres etter denne protokollen, og krever bare en funksjonsgenerator og muligens en spenningsforsterker for å generere elektroporeringspulser.
Likevel skiller denne mikroelektroporeringsplattformen seg fra andre encellede elektroporeringsteknologier. Evnen til både elektrisk å oppdage og optimalisere elektroporeringsparametere på en enkeltcellefjæring i et kontinuerlig strømningsmiljø er virkelig nyskapende. Fremtidig arbeid innebærer å optimalisere de andre viktige eksperimentelle parametrene knyttet til vellykkede elektroporeringsresultater (se figur 1) for ytterligere å forbedre den generelle effektiviteten til denne plattformen. Ytterligere levedyktighet og metabolske analyser vil bli utviklet og implementert for å vurdere eventuelle negative nedstrømseffekter knyttet til mikroelektroporeringsplattformen. Videre kan den mikrofluidiske designen fortsette å forbedres for å oppnå høyere cellulær gjennomstrømning, som det har blitt demonstrert av andre grupper40. Ved å ta opp disse bekymringene har denne teknologien potensial til å bli tatt i bruk i celleterapiproduksjonsprosessen for å utføre genlevering og / eller genredigering, da denne metoden er svært mottagelig for både en lukket og automatisert prosess.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å anerkjenne økonomisk støtte fra National Science Foundation (NSF CBET 0967598, DBI IDBR 1353918) og US Department of Education's Graduate Training in Emerging Areas of Precision and Personalized Medicine (P200A150131) for finansiering av kandidatstudent JJS på fellesskap.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 150-mm diameter petri dishes | VWR | 25384-326 | step 6.1.1 to secure wafer |
| 24-well tissue culture plates | VWR | 10062-896 | step 10.3.6 to plate electroporated cells |
| 33220A Waveform/Function generator | Agilent | step 9.2.3 electroporation pulse generator | |
| 4'' Si-wafers | University Wafer | subsection 2.1 for microfluidic channel fabrication | |
| 6-well tissue culture plates | VWR | 10062-892 | step 8.1.8 to plate cells |
| Acetone | Fisher Scientific | A18-4 | step 2.1.2 for cleaning and step 5.1 photoresist lift-off |
| Allegra X-22R Centrifuge | Beckman Coulter | steps 8.1.4 , 8.3.2. and 8.3.3. to spin down cells | |
| AutoCAD 2018 | Autodesk | subsection 1.1. to design transparency masks | |
| Buffered oxide etchant 10:1 | VWR | 901621-1L | subsection 3.1 for HF etching |
| CCD Monochrome microscope camera | Hamamatsu | Orca 285 C4742-96-12G04 | step 11.2.3. for imaging |
| CMOS camera- Sensicam QE 1.4MP | PCO | subsection 9.3 part of the experimental setup | |
| Conductive Epoxy | CircuitWorks | CW2400 | subsection 7.6. for wire attachement |
| Conical Centrifuge Tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 14-959-70C | step 8.1.4. for cell centrifuging |
| Dektak 3ST Surface Profilometer | Veeco (Sloan/Dektak) | step 2.1.15 and 5.4 for surface profilometry | |
| Disposable biopsy punch, 0.75 mm | Robbins Instruments | RBP075 | step 6.2.3 for inlet access |
| Disposable biopsy punch, 3 mm | Robbins Instruments | RBP30P | step 6.2.3 for outlet access |
| DRAQ5 | abcam | ab108410 | step 11.2.2. for live cell staining |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | ThermoFisher Scientific | 11885084 | step 8.1.2. part of media composition |
| E3631A Bipolar Triple DC power supply | Agilent | step 9.2.1.-9.2.2.part of the experimental setup | |
| Eclipse TE2000-U Inverted Microscope | Nikon | subsection 9.3. part of the experimental setup | |
| EVG620 UV Lithography System | EVG | step 2.1.9. and 2.2.7. for UV Exposure | |
| Fetal Bovine Serum | Neuromics | FBS001 | step 8.1.2. part of media composition |
| FS20 Ultrasonic Cleaner | Fisher Scientific | subsection 5.1. for photoresist lift-off | |
| Glass Media Bottle with Cap, 100mL | Fisher Scientific | FB800100 | step 8.2.1. for buffer storage |
| Glass Media Bottle with Cap, 500mL | Fisher Scientific | FB800500 | step 8.1.2.for media storage |
| HEK-293 cell line | ATCC | CRL-1573 | subsection 8.1 for cell culturing |
| HEPES buffer solution | Sigma Aldrich | 83264-100ML-F | step 8.2.1 part of electroporation buffer composition |
| Hexamethyldisilazane | Sigma Aldrich | 379212-25ML | step 2.2.3 adhesion promoter |
| HF2LI Lock-in Amplifier | Zurich Instruments | subsection 9.2 part of the experimental setup | |
| HF2TA Current amplifier | Zurich Instruments | subsection 9.2 part of the experimental setup | |
| Isopropyl Alcohol | Fisher Scientific | A459-1 | step 2.1.2 for cleaning, step 2.1.14 for rinsing wafer following SU-8 development, and step 6.3.1 for cleaning PDMS |
| IX81 fluorescence microscope | Olympus | step 11.2.3 for imaging | |
| L-Glutamine Solution | Sigma Aldrich | G7513-20ML | step 8.1.2. part of media composition |
| M16878/1BFA 22 gauge wire | AWC | B22-1 | subsection 7.5 for device fabrication |
| Magnesium chloride | Sigma Aldrich | 208337-100G | step 8.1.2 part of electroporation buffer composition |
| MF 319 Developer | Kayaku Advanced Materials | 10018042 | step 2.2.9. photoresist developer |
| Microposit S1818 photoresist | Kayaku Advanced Materials | 1136925 | step 2.2.4 positive photoresist for electrode patterning |
| Microscope slides, 75 x 25 mm | VWR | 16004-422 | step 2.2.1 electrode soda lime glass substrate |
| Model 2350 High voltage amplifier | TEGAM | 2350 | step 9.2.5. part of the experimental setup |
| National Instruments LabVIEW | National Instruments | data acquisition | |
| Needle, 30G x 1 in | BD Scientific | 305128 | step 10.1.1. part of the system priming |
| PA90 IC OPAMP Power circuit | Digi-key | 598-1330-ND | Part of the custom circuit |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P4458-20ML | step 8.1.2. part of media composition |
| Plasmid pMAX-GFP | Lonza | VCA-1003 | step 8.3.4. for intracellular delivery |
| Plastic tubing, 0.010'' x 0.030" | VWR | 89404-300 | step 10.1.2. for system priming |
| Platinum targets | Kurt J. Lesker | subsection 4.2. for physical vapor deposition | |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P9333-500G | step 8.2.1. part of electroporation buffer composition |
| Pump 11 PicoPlus microfluidic syringe pump | Harvard Apparatus | MA1 70-2213 | step 10.1.4. for system priming |
| PVD75 Physical vapor deposition system | Kurt J. Lesker | subsection 4.1. for physical vapor deposition | |
| PWM32 Spinner System | Headway Research | steps 2.1.6 and 2.2.2. for substrate coating with photoresist | |
| PX-250 Plasma treatment system | March Instruments | subsection 7.2 for PDMS and glass substrate bonding | |
| SDG1025 Function/Waveform generator | Siglent | step 9.2.2. part of the experimental setup | |
| Sodium hydroxide | Sigma Aldrich | S8045-500G | step 8.2.1. part of electroporation buffer composition |
| SU-8 2010 negative photoresist | Kayaku Advanced Materials | Y111053 | step 2.1.7. for microfluidic channel patterning |
| SU-8 developer | Microchem | Y010200 | step 2.1.12. for photoresist developing |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903-1KG | step 8.2.1. part of electroporation buffer composition |
| Sylgard 184 elastomer kit | Dow Corning | 3097358-1004 | step 6.2.1 10 : 1 mixture of PDMS polymer and hardening agent |
| Syringe, 1 ml | BD Scientific | 309628 | step 8.3.4. part of system priming |
| SZ61 Stereomicroscope System | Olympus | subsection 7.3. for channel and electrode alignment | |
| Tissue Culture Treated T25 Flasks | Falcon | 353108 | step 8.1.2 for cell culturing |
| Titanium targets | Kurt J. Lesker | subsection 4.2. for physical vapor deposition | |
| Transparency masks | CAD/ART Services | steps 2.1.9. and 2.2.7. for photolithography | |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Sigma Aldrich | 448931-10G | step 6.1.2. for wafer silanization |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma Aldrich | T4049-100ML | steps 8.1.3. and 8.3.1. for cell harvesting |
References
- Gao, Q. Q., et al. Therapeutic potential of CRISPR/Cas9 gene editing in engineered T-cell therapy. Cancer Medicine. 8 (9), 4254-4264 (2019).
- Aijaz, A., et al. Biomanufacturing for clinically advanced cell therapies. Nature Biomedical Engineering. 2 (6), 362-376 (2018).
- Milone, M. C., O'Doherty, U.
- Weaver, J. C., Chizmadzhev, Y. A.
- Kotnik, T., Rems, L., Tarek, M., Miklavcic, D. Membrane electroporation and electropermeabilization: mechanisms and models. Annual Review of Biophysics. 48, 63-91 (2019).
- Rosazza, C., Meglic, S. H., Zumbusch, A., Rols, M. P., Miklavcic, D. Gene electrotransfer: A mechanistic perspective. Current Gene Therapy. 16 (2), 98-129 (2016).
- Clauss, J., et al. Efficient non-viral T-cell engineering by sleeping beauty minicircles diminishing DNA toxicity and miRNAs silencing the endogenous T-cell receptors. Human Gene Therapy. 29 (5), 569-584 (2018).
- Sherba, J. J., et al. The effects of electroporation buffer composition on cell viability and electro-transfection efficiency. Scientific Reports. 10 (1), 3053 (2020).
- Lu, H., Schmidt, M. A., Jensen, K. F. A microfluidic electroporation device for cell lysis. Lab on a Chip. 5 (1), 23-29 (2005).
- Kar, S., et al. Single-cell electroporation: current trends, applications and future prospects. Journal of Micromechanics and Microengineering. 28 (12), (2018).
- Shi, J. F., et al. A review on electroporation-based intracellular delivery. Molecules. 23 (11), (2018).
- Wang, S. N., Zhang, X. L., Wang, W. X., Lee, L. J. Semicontinuous flow electroporation chip for high-throughput transfection on mammalian cells. Analytical Chemistry. 81 (11), 4414-4421 (2009).
- Wei, W. J., et al. An implantable microelectrode array for simultaneous L-glutamate and electrophysiological recordings in vivo. Microsystems & Nanoengineering. 1, (2015).
- Maschietto, M., Dal Maschio, M., Girardi, S., Vassanelli, S. In situ electroporation of mammalian cells through SiO2 thin film capacitive microelectrodes. Scientific Reports. 11 (1), (2021).
- Wu, Q. R., et al. Organ-on-a-chip: recent breakthroughs and future prospects. Biomedical Engineering Online. 19 (1), (2020).
- Pandey, C. M., et al.
- Vigneshvar, S., Sudhakumari, C. C., Senthilkumaran, B., Prakash, H. Recent advances in biosensor technology for potential applications - An overview. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, (2016).
- Nuxoll, E.
- Kang, S., Kim, K. H., Kim, Y. C. A novel electroporation system for efficient molecular delivery into Chlamydomonas reinhardtii with a 3-dimensional microelectrode. Scientific Reports. 5, (2015).
- Zheng, M. D., Shan, J. W., Lin, H., Shreiber, D. I., Zahn, J. D. Hydrodynamically controlled cell rotation in an electroporation microchip to circumferentially deliver molecules into single cells. Microfluidics and Nanofluidics. 20 (1), (2016).
- Santra, T. S., Kar, S., Chang, H. Y., Tseng, F. G.
- Lee, W. G., Demirci, U., Khademhosseini, A. Microscale electroporation: challenges and perspectives for clinical applications. Integrative Biology. 1 (3), 242-251 (2009).
- Santra, T. S., Chang, H. Y., Wang, P. C., Tseng, F. G. Impact of pulse duration on localized single-cell nano-electroporation. Analyst. 139 (23), 6249-6258 (2014).
- Geng, T., Lu, C. Microfluidic electroporation for cellular analysis and delivery. Lab on a Chip. 13 (19), 3803-3821 (2013).
- Hsi, P., et al. Acoustophoretic rapid media exchange and continuous-flow electrotransfection of primary human T cells for applications in automated cellular therapy manufacturing. Lab on a Chip. 19 (18), 2978-2992 (2019).
- Khine, M., Ionescu-Zanetti, C., Blatz, A., Wang, L. P., Lee, L. P. Single-cell electroporation arrays with real-time monitoring and feedback control. Lab on a Chip. 7 (4), 457-462 (2007).
- Ye, Y. F., et al. Single-cell electroporation and real-time electrical monitoring on a microfluidic chip. 2020 33rd Ieee International Conference on Micro Electro Mechanical Systems (Mems 2020). , 1040-1043 (2020).
- Huang, Y., Rubinsky, B. Microfabricated electroporation chip for single cell membrane permeabilization. Sensors and Actuators a-Physical. 89 (3), 242-249 (2001).
- Guo, X. L., Zhu, R. Controllable in-situ cell electroporation with cell positioning and impedance monitoring using micro electrode array. Scientific Reports. 6, (2016).
- Punjiya, M., Nejad, H. R., Mathews, J., Levin, M., Sonkusale, S. A flow through device for simultaneous dielectrophoretic cell trapping and AC electroporation. Scientific Reports. 9, (2019).
- Wang, H. Y., Lu, C. Microfluidic electroporation for delivery of small molecules and genes into cells using a common DC power supply. Biotechnology and Bioengineering. 100 (3), 579-586 (2008).
- Zheng, M. D., et al. Continuous-flow, electrically-triggered, single cell-level electroporation. Technology. 5 (1), 31-41 (2017).
- Batista Napotnik, T., Miklavcic, D. In vitro electroporation detection methods - An overview. Bioelectrochemistry. 120, 166-182 (2018).
- MICROPOSIT™ S1800® G2 Series Photoresists. KAYAKU. , Available from: https://kayakuam.com/wp-content/uploads/2019/09/S1800-G2.pdf (2021).
- SU-8 2000 Permanent Negative Epoxy Photoresist. KAYAKU. , Available from: https://kayakuam.com/wp-content/uploads/2020/08/KAM-SU-8-2000-2000.5-2015-Datasheet-8.13.20-final.pdf (2001).
- Substrate Preparation. MicroChemicals. , Available from: https://www.microchemicals.com/technical_information/subtrate_cleaning_adhesion_photoresist.pdf (2021).
- Lisinenkova, M., Hahn, L., Schulz, J. 4M 2006 - Second International Conference on Multi-Material Micro Manufacture. , Elsevier. 91-94 (2006).
- Beh, C. W., Zhou, W. Z., Wang, T. H. PDMS-glass bonding using grafted polymeric adhesive - alternative process flow for compatibility with patterned biological molecules. Lab on a Chip. 12 (20), 4120-4127 (2012).
- PA90 High Voltage Power Operational Amplifiers. APEX. , Available from: https://www.apexanalog.com/resources/products/pa90u.pdf (2021).
- Lissandrello, C. A., et al. High-throughput continuous-flow microfluidic electroporation of mRNA into primary human T cells for applications in cellular therapy manufacturing. Scientific Reports. 10 (1), 18045 (2020).
