Summary
本プロトコルは、肝臓 のin situ 灌流/脱細胞化および2光子顕微鏡法を最適化して、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)中の細胞外マトリックス(ECM)リモデリングのダイナミクスを視覚化するための信頼性の高いプラットフォームを確立します。
Abstract
非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)は、米国で最も一般的な慢性肝疾患であり、7,000万人以上のアメリカ人が罹患しています。NASHは線維症に進行し、最終的には肝細胞癌の重要な危険因子である肝硬変に進行する可能性があります。細胞外マトリックス(ECM)は、構造的サポートを提供し、母細胞シグナル を介して 肝臓の恒常性を維持します。肝線維症は、動的ECMリモデリングプロセスの不均衡に起因し、構造要素の過剰な蓄積とそれに伴うグリコサミノグリカンの変化を特徴としています。NASHの典型的な線維症パターンは「チキンワイヤー」と呼ばれ、マッソンのトリクローム染色とピクロシリウスレッド染色によって観察された特徴に基づいて、通常、ゾーン3の類洞周囲/細胞周囲線維症で構成されます。しかし、これらの従来の薄い2次元(2D)組織スライドベースのイメージング技術は、詳細な3次元(3D)ECM構造変化を実証することができず、肝線維症における動的ECMリモデリングの理解を制限します。
現在の研究では、上記の課題に対処するために、脱細胞化 を介して 肝臓のネイティブECM構造を画像化するための高速で効率的なプロトコルを最適化しました。マウスに固形飼料またはファーストフード食のいずれかを14週間与えた。その 場 門脈灌流後に脱細胞化を行い、2光子顕微鏡技術を適用してネイティブECMの変化を画像化および分析しました。正常肝臓とNASH肝臓の3D画像を再構成して分析しました。 in situ 灌流脱細胞化を行い、2光子顕微鏡で足場を分析することで、肝臓の動的ECMリモデリングを視覚化するための実用的で信頼性の高いプラットフォームが提供されました。
Introduction
非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)は最も一般的な肝疾患であり、成人人口の20%〜25%に影響を及ぼします。NAFLD患者の25%が非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)に進行し、肝硬変、肝不全、肝細胞癌のリスクが高まります1。今後20年間で、NASHは米国2で200万人の肝臓関連の死亡を占めると推定されています。承認された治療法がないため、NASH患者の肝線維化を引き起こすメカニズムを解読し、標的治療を開発することが急務です3。
細胞外マトリックス(ECM)は、細胞との双方向通信を発揮して組織の恒常性を調節する動的で複雑な微小環境です4。肝臓ECMは、プロテオグリカン、コラーゲン、フィブロネクチン、エラスチン、および他の非構造タンパク質(例えば、オルファクトメジンおよびトロンボスポンジン)などの構造要素で構成され、物理的および構造的支持体を提供する4。
肝線維症は、NASH3を含むさまざまな病因の肝障害に対する慢性創傷治癒反応です。これは、動的ECMマトリックスリモデリングプロセスの不均衡に起因し、損傷した肝臓4における過剰な構造タンパク質によって特徴付けられる。線維形成は、異なる肝細胞型間の動的な細胞間コミュニケーションに依存する。肝星細胞(HSC)は、活性化されると、平滑筋アルファ2アクチン発現、遊走、および増殖筋線維芽細胞様細胞に分化し、創傷閉鎖作用としてECMタンパク質を合成します。活性化造血幹細胞は、肝臓1の中心コラーゲン産生細胞である。
ECMリモデリングの分子メカニズム、線維症のパターン、および細胞イベントとの関係は明らかではありません。質量分析技術がECMタンパク質組成の分析に役立ったとしても、3次元(3D)ECM構造のより良い理解が依然として必要です4。伝統的に、マッソンのトリクローム染色、ピクロシリウスレッド染色、および第2高調波発生(SHG)イメージングは、2次元(2D)の薄い肝臓切片で行われてきました。NASHの典型的な線維症パターンは「チキンワイヤー」と呼ばれ、ゾーン3まで伸び、類洞周囲/細胞周囲線維症です5,6。しかし、天然肝臓の3D構造、特に組織切片を伴わない研究が不足しています。肝線維症における動的ECMリモデリング全体を通して線維症のパターンと特徴を特定するための堅牢なイメージングアプローチは、NASHメカニズムの理解を大幅に強化し、新しい治療標的を特定します。
これらの課題に対処するために、高速で効率的なプロトコルを最適化して、脱細胞化 を介して ネイティブの肝臓ECMをイメージングしました7。全肝臓脱細胞化は、界面活性剤灌流を通じてネイティブ3D ECMネットワークを維持しながら、肝細胞含有量を除去するアプローチです。マウスに、固形飼料またはファーストフード食(FFD)のいずれかを14週間与えた。脱細胞化は、トリプルヘリカルおよびネイティブの原線維コラーゲン構造を維持するために、中性洗剤および低流速によるin situ 門脈灌流後に実行されました。ECMにおけるコラーゲン構造の変化を解析するために、二光子顕微鏡を適用した。正常およびNASH肝臓における天然ECM構造の3D画像を再構成し、分析した。 in situ 灌流脱細胞化を行い、2光子顕微鏡で足場を分析することで、肝臓の動的ECMリモデリングを視覚化するための実用的で手頃なプラットフォームが提供されます。
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Protocol
動物実験は、スタンフォード大学の施設動物管理および使用委員会(IACUC)およびパロアルトの退役軍人病院によって承認された実験手順に従って行われます。6〜8週齢の雄C57BL / 6Jマウスに、飲料水中の4.2%高果糖コーンシロップ( 材料の表を参照)を添加した固形飼料またはファーストフード食のいずれかを14週間与えました5。マウスは、12時間の暗/明サイクルで標準的なケージに保管されました。
1.肝灌流の外科的準備と手順
- 手順の前にマウスの重量を量ります。
- ケタミン(90 mg / kg)とキシラジン(10 mg / kg)( 材料の表を参照)を腹腔内注射で投与することにより、マウスを麻酔します。.次のステップに進む前に、つま先をつまんでマウスが完全に麻酔されていることを確認してください。
注:イソフルランは非生存手術であるため、ここでは必要ありません。 - バリカンを使用して腹側を剃り、70%エタノールで皮膚を消毒します。マウスを背中に置き、脚をテープで手術用ボードに固定します。
- つま先ピンチで麻酔の深さを再確認した後、メイヨーハサミとアドソン鉗子( 資料表を参照)を使用して、下腹部を横方向に3 cm切開し、次に下腹部から剣状突起まで垂直に5 cm切開します。胸腔を開かないように注意してください。
- 腹膜を開いた後、腸を動物の左側にそっと置き、レーヨン先端のアプリケーター( 材料の表を参照)で肝臓の右葉を持ち上げて門脈を露出させます。
- 24 G IVカテーテルを使用して門脈をカテーテル挿入します。カテーテルを門脈の遠位端に導入します。門脈が肝葉に分岐する前にカテーテルの先端を配置します。
- カテーテルが静脈に入ったらすぐに針を抜いてください。カテーテルを介して1mLシリンジを使用して肝臓をPBSに灌流することにより、カテーテルが静脈内に正しく配置されていることを確認します。
注意: PBS灌流すると、すべての葉がすぐに白くなるはずです。カテーテルが正しく配置されている場合、静脈血はカテーテルをすばやく流れます。 - デュモンマイクロ鉗子、カストロビエホマイクロニードルホルダー、および4-0縫合糸( 材料の表を参照)を使用して、門脈の分岐の下にステッチを配置し、1cm下に2番目のステッチを配置してカテーテルを固定します。
2.組織の脱細胞化
- カテーテルをルアーコネクタでシリコンチューブ(長さ~1 m、内径3 mm、外径4.1 mm)に接続します。シリコンチューブを蠕動ポンプと脱イオン水を含むリザーバーに接続します(材料表を参照)。
- チューブ内の気泡を慎重に取り除き、灌流中に新しい気泡が発生しないようにしてください。ペリスタルティックポンプの流量出力を0.2 mL / min(つまり、288 mL / 24時間)に設定します。
- 最初に脱イオン水(~50 mL/マウス)で2時間灌流します。肝臓の色は灌流中に赤から黄色に変わります。
注:動物は10分間の灌流後に期限切れになります。 - 灌流溶液を0.5%(wt/vol)デオキシコール酸ナトリウム(DOC、 材料表を参照)に切り替え、一晩(18時間、~250mL /マウス)続けます。肝臓は灌流の終わりに白くなります(図1)。
- 灌流溶液を脱イオン水(~50 mL/マウス)に切り替え、2時間灌流します。
- デュモンマイクロ鉗子とマイクロスプリングはさみ( 材料の表を参照)を使用して脱細胞化された肝臓を収集し、PBSを含むペトリ皿で注意深く洗浄します。
- 脱細胞化組織を小片に切断してすぐにイメージングするか、-80°Cで凍結してタンデム質量分析、ELISA、ウェスタンブロットなどの生化学的分析を行います。
3. イメージング用スライド作製(多光子/共焦点蛍光顕微鏡による)
- 脱細胞化肝臓の小片(<3 x 3 x 3 mm)を顕微鏡スライドに移し、組織を中央に置きます。
- 10 μLの退色防止封入剤( 材料の表を参照)をピペットで組織に追加し、組織の乾燥を防ぎます。
- 組織をカバーガラスで覆い、小さな力を加えてサンプルを平らにします。カバーガラスの端を無色透明のマニキュアでシールします(図2)。
注:顕微鏡を通して直立した2光子の設定により、サンプルにはカバーガラスが使用されました。ただし、倒立顕微鏡を使用すると、サンプルの配置が異なる場合があります。
4. 画像取得
- カバーガラスの上部に液浸オイルを一滴置き、スライドを顕微鏡スライドホルダーに置きます。20倍のオイル対物レンズを液浸オイルに接触するまで下げます。
- バイオレット(405 nm)チャンネルに切り替え、シャッターをオンにして、サンプルに焦点を合わせます。イメージングの対象地域をナビゲートして配置します。レーザー光による画像取得に移行する前に、シャッターを切ってください。
- コンピューター制御に切り替えて、2光子レーザーを開始します。最初に2光子レーザーをオンにし(図3A)、次に2光子レーザーコントローラー(材料表を参照)とシャッターをオンにします(図3B、C)。出力電力が 2.5 W を超えていることを確認します。
レーザー出力を下げて、蛍光消光を防ぎます。検出器(光電子増倍管とハイブリッドの両方)を選択して調整し、選択した蛍光色素に対応します。
注:2光子イメージングは、励起波長860nmで行われました。コラーゲンSHGおよび2光子励起蛍光(TPEF)画像用にそれぞれ2つのチャネルを選択しました。415-445nmの波長範囲に対応する1つのチャネルは、SHG信号からコラーゲンの詳細な構造を検出しました。別のチャネルは、TPEF信号を収集するために465〜669nmの範囲をカバーしました。 - 同時または順次画像取得を選択します。ピンホールを最高値に調整します。レーザーの波長、ゲイン、パワー、オフセットを調整します。ピクセル滞留時間、ピクセルサイズ、平均化、およびズームを調整します(図4A)。
- コンピューターの Z コントローラーをスクロールして Z 寸法を設定し、開始点と終了点を定義し、ボリューム (Z スタック) 内で指定された画像の数を選択します。画像を取得します。
注:ここでは、20 μmのZボリュームと1 μmのZステップサイズを選択しました(図4B)。
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Representative Results
コラーゲン線維は、第2高調波発生および2光子顕微鏡で検出されました。シグナルは、壊れやすいトリプルヘリカルおよび天然の原線維コラーゲン構造からのものです。特異的抗体はコラーゲンサブタイプの分析には使用しなかった。ただし、これはイメージング技術に追加できます。
肝臓組織を脱細胞化せずに研究する場合、コラーゲンネットワークの高解像度画像を取得することは困難です (図5A)。 脱細胞化ECMでは、コラーゲン線維(緑色)が平行または織り交ぜられています (図5B)。 固形飼料肝臓とFFD肝臓の間でECM成分の形態と空間分布に明らかな違いがありました。飼料中のマウスのコラーゲン繊維は、織り交ぜられたよく組織化されたネットワークを示しました。しかし、FFDを投与されたマウスでは、コラーゲン束はより少ない接続性で観察されました (図5B)。
肝臓ECMの3D構造をさらに研究するために、スライスの画像を20μmのZ体積(厚さ)と1μmのZステップサイズでキャプチャしました。飼料を摂取したマウスのコラーゲン繊維は、よく組織化されたネットワークを示しましたが、FFDを摂取したマウスでは示しませんでした(図6)。脱細胞化ECMにおける原線維性コラーゲンの品質を確認するために、スライドを固定してパラフィンに包埋し、ヘマトキシリンとエオシン(H&E)とピクロシリウスレッド(PSR)で染色しました( 材料の表を参照)。H&Eは、すべてのセルが削除されたことを示しています。PSRは、パラフィン包埋組織切片のコラーゲンを強調するために一般的に使用される組織学的手法です(図7)。
図1:灌流中のマウス肝臓。 肝臓は灌流の終わりに白く半透明になります。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:イメージング用のスライド準備。 組織をカバーガラスで覆い、小さな力を加えてサンプルを平らにします。カバーガラスの端は無色透明のマニキュアで密封されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:2光子レーザーを開始した2光子レーザーソフトウェアのスクリーンショット。 (A)まず、2光子レーザーを点灯させます。(イ)(C)2光子レーザーコントローラーとシャッターがオンになっています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:画像取得中の2光子レーザーソフトウェアのスクリーンショット 。 (A)ピンホールを最大値(赤い矢印)に設定してください。レーザーの波長、ゲイン、パワー、オフセットを調整します。ピクセル滞留時間、ピクセルサイズ、平均化、ズームを調整します。(B) Zボリュームを20μm、Zステップサイズを1μmに設定してください。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:2光子顕微鏡で画像化された脱細胞化ECM 。 (A)脱細胞化せずに6μmの肝臓スライス(新鮮凍結)からのコラーゲン線維のSHG画像。(B)SHG画像は、正常対照、飼料中のマウスの肝臓におけるよく組織化されたコラーゲンネットワークを描写する。ファーストフード食(FFD)のマウスのコラーゲンネットワークを改造しました。矢印、線維症領域。スター、改造されたコラーゲンネットワーク。スケールバー = 100 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:肝臓コラーゲンネットワークの3D構造。 固形飼料を摂取したマウスのコラーゲン繊維は、よく組織化されたネットワークを示しましたが、ファーストフード食(FFD)マウスでは示されませんでした。画像は、20 μmのZ体積(厚さ)と1 μmのZステップサイズでキャプチャされました。スケールバー = 100 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図7:脱細胞化ECMのヘマトキシリンおよびエオジン染色(H&E)およびピクロシリウスレッド(PSR)染色。 H&Eは、すべてのセルが削除されたことを示しています。PSR染色画像では、飼料給餌マウスのECMはよく組織化されたネットワークを明らかにし、対照的に、ファーストフード食(FFD)のマウスはより密度の高いコラーゲン線維を示しました。Z体積(厚さ)= 6μm。スケールバー = 100 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
本プロトコルは、低流速DOC in situ灌流による脱細胞化が、壊れやすいトリプルヘリカルおよび天然の原線維コラーゲン構造を保存し、NASH肝線維症における動的ECMリモデリングを捕捉するための信頼性が高く費用効果の高いプラットフォームを提供することを示しています。ECM成分を同定したり、細胞培養用の生物学的足場を生成したりする前に、正常および線維性の肝臓で脱細胞化が行われていましたが、肝線維症におけるECMリモデリングのダイナミクスは十分に研究されていません8,9,10。この方法により、研究者はさまざまな線維症モデル間で比較を行うことができます。
現在、DNase、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、またはTriton X-10011を使用する灌流プロトコルにはさまざまなものがあります。大量の溶液が必要なため、DNaseのコストは高くなります。SDSは過酷な変性溶液であり、細胞膜を破壊し、タンパク質を変性させる陰イオン界面活性剤です。したがって、SDS灌流後にコラーゲンネットワーク全体を保存することは困難です。対照的に、Triton X-100は、穏やかな非変性、非イオン性界面活性剤として、脂質-脂質および脂質-タンパク質相互作用を破壊し、タンパク質間相互作用を維持します。しかし、Triton X-100がECM足場を乱し、脱細胞化肝臓ECMをさらなる質量分析分析に適さないことが報告されています11。
DOCによる灌流プロトコルは、以前の研究7から変更され、ほとんどの組織におけるトリプルヘリカルおよび天然の繊維状コラーゲン構造のより良い保存が実証されました。コラーゲンネットワークは、抗体を含まない第2高調波発生(SHG)顕微鏡で研究され、トリプルヘリカルおよびネイティブの原線維コラーゲン構造を反映しています。FFDマウスの脱細胞化肝臓ECMも試験し、NASHの構造変化を確認した。
プロトコルの最も重要なステップは、カテーテルの配置と灌流システムのセットアップです。門脈カテーテル法は不可欠ですが、門脈が損傷している場合は下大静脈も使用できます。バッファーとチューブ内の気泡は灌流に影響を与えるため、避ける必要があります。正立2光子顕微鏡を使用したため、サンプルサイズは限られていました。倒立顕微鏡を使用する場合は、これを変更できます。
慢性肝疾患および肝発癌における改造ECMへの関心が高まっている12,13,14。脱細胞化ECM足場は、適切な生物学的足場材料として外科的修復および再生医療に採用されている15、16、17。ただし、この軽度の脱細胞化プロセスには、DNAや脂質残骸などの一部の細胞成分が完全に除去されない可能性があるため、制限もあります。より長いDOC灌流時間と流速の増加は、超精製された脱細胞化足場を得るのに役立つ可能性があります。DOC灌流後に洗浄液にDNaseを添加することも、DNAの除去に役立つ場合があります。プロトコルはヒト肝生検用に調整できるため、NASH進行中のECM変化の理解を深めることができます。
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Disclosures
著者は、この記事に関して利益相反がないことを宣言します。
Acknowledgments
技術的な支援をしてくれたHyesuk Parkに感謝します。この研究は、国立糖尿病・消化器・腎臓病研究所(NIDDK)、NIH(R01 2DK083283、NJT)、国立老化研究所(NIA)、NIH(1R01AG060726、NJT)からの資金提供によって支援されました。ベックマンセンターの細胞科学イメージング施設のジョン・マルホランドとキティ・リーが、2光子顕微鏡イメージングの技術支援をしてくれたことに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-0 MONOCRYL UNDYED 1 x 18" P-3 | MONOCRYL | Y494G | |
| 4-0 suture | fisher scientific | 10-000-649 | https://www.fishersci.com/shop/products/monomid-nylon-non-absorbable-sutures-7/10000649?keyword=true |
| AnaSed Injection (xylazine) | AnaSed | NDC 59399-110-20 | this drug to use by or on the order of a licensed veterinarian. |
| BD INSYTE AUTOGUARD I.V. CATHETER WITH BC TECHNOLOGY | BD | 382612 | |
| Chow diet | Envigo | # 2918 | Control diet. A fixed formula, non-autoclavable diet manufactured with high quality ingredients and designed to support gestation, lactation, and growth of rodents. |
| Fast-food diet (AIN76A Western Diet) | Test Diet | 1810060 | https://www.testdiet.com/cs/groups/lolweb/@testdiet/documents/web_content/mdrf/mdux/~edisp/ducm04_051601.pdf |
| Hematoxylin and Eosin Stain Kit | vectorlabs | H-3502 | https://vectorlabs.com/hematoxylin-and-eosin-stain-kit.html |
| Kent Scientific Rat Surgical Kit | fisher scientific | 13-005-205 | https://www.fishersci.com/shop/products/rat-surgical-kit/13005205#?keyword=mouse%20surgery%20kit |
| KETAMINE HYDROCHLORIDE INJECTION | Vedco | NDC 50989-996-06 - 10 mL - vial. | KetaVed has been clinically studied in subhuman primates in addition to those species listed under Administration and Dosage. |
| Leica SP5 upright Confocal, multi-photon | Leica | SP5 | |
| Luer connector (Three-way stopcock with SPIN-LOCK®) | bbraun | D300 | https://www.bbraunusa.com/en/products/b0/three-way-stopcockwithspin-lock.html |
| Picrosirius Red Stain Kit | Polysciences, Inc. | 24901 | https://www.polysciences.com/default/picrosirius-red-stain-kit-40771 |
| Rayon tipped applicator | puritan | 25-806 1PR | |
| Sodium deoxycholate | sigmaaldrich | D6750-100G | |
| Syrup | www.target.com | 24 fl oz | https://www.target.com/p/pancake-syrup-24-fl-oz-market-pantry-8482/-/A-13007801 |
| Variable Speed Peristaltic Pump | INTLLAB | BT100 | https://www.amazon.com/gp/product/B082K97W5W/ref=ox_sc_saved_title_2?smid=A12NUUP87ZRRAR&psc=1 |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | vectorlabs | H-1000-10 | https://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium.html |
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