Summary
Il presente protocollo ottimizza i metodi di perfusione/decellularizzazione del fegato in situ e microscopia a due fotoni per stabilire una piattaforma affidabile per visualizzare la dinamica del rimodellamento della matrice extracellulare (ECM) durante la steatoepatite non alcolica (NASH).
Abstract
La steatoepatite non alcolica (NASH) è la malattia epatica cronica più comune negli Stati Uniti, che colpisce oltre 70 milioni di americani. La NASH può progredire verso la fibrosi e, infine, verso la cirrosi, un fattore di rischio significativo per il carcinoma epatocellulare. La matrice extracellulare (ECM) fornisce supporto strutturale e mantiene l'omeostasi epatica tramite segnali matricellulari. La fibrosi epatica deriva da uno squilibrio nel processo dinamico di rimodellamento della MEC ed è caratterizzata da un eccessivo accumulo di elementi strutturali e cambiamenti associati nei glicosaminoglicani. Il tipico modello di fibrosi della NASH è chiamato "filo di pollo", che di solito consiste nella fibrosi perisinusoidale / pericellulare della zona 3, basata sulle caratteristiche osservate dalla colorazione tricromica di Masson e dalle macchie rosse di Picrosirius. Tuttavia, queste tradizionali tecniche di imaging basate su vetrini tissutali sottili (2D) non possono dimostrare i cambiamenti strutturali dettagliati tridimensionali (3D) della ECM, limitando la comprensione del rimodellamento dinamico dell'ECM nella fibrosi epatica.
Il lavoro attuale ha ottimizzato un protocollo rapido ed efficiente per visualizzare la struttura ECM nativa nel fegato tramite demilitarizzazione per affrontare le sfide di cui sopra. I topi sono stati nutriti con chow o dieta fast-food per 14 settimane. La decellularizzazione è stata eseguita dopo la perfusione della vena porta in situ e le tecniche di microscopia a due fotoni sono state applicate per visualizzare e analizzare i cambiamenti nella ECM nativa. Le immagini 3D dei fegati normali e NASH sono state ricostituite e analizzate. L'esecuzione della decellularizzazione della perfusione in situ e l'analisi dello scaffold mediante microscopia a due fotoni hanno fornito una piattaforma pratica e affidabile per visualizzare il rimodellamento dinamico dell'ECM nel fegato.
Introduction
La steatosi epatica non alcolica (NAFLD) è la malattia epatica più comune, che colpisce il 20% -25% della popolazione adulta. Il 25% dei pazienti con NAFLD progredisce verso la steatoepatite non alcolica (NASH), dove aumenta il rischio di cirrosi, insufficienza epatica e carcinoma epatocellulare1. Nei prossimi 20 anni, si stima che la NASH rappresenterà 2 milioni di decessi correlati al fegato negli Stati Uniti2. Poiché non esistono trattamenti approvati, vi è un urgente bisogno di decifrare i meccanismi che causano la fibrosi epatica nei pazienti con NASH e sviluppare un trattamento mirato3.
La matrice extracellulare (ECM) è un microambiente dinamico e complesso che esercita una comunicazione bidirezionale con le cellule per regolare l'omeostasi tissutale4. La ECM epatica è composta da elementi strutturali come proteoglicani, collagene, fibronectina, elastina e altre proteine non strutturali (ad esempio, olfattomadina e trombospondina) per fornire supporto fisico e strutturale4.
La fibrosi epatica è una risposta cronica di guarigione delle ferite al danno epatico di varie eziologie, tra cui la NASH3. Deriva da uno squilibrio nel processo dinamico di rimodellamento della matrice ECM ed è caratterizzato da eccessive proteine strutturali nel fegato danneggiato4. La fibrogenesi dipende dalla comunicazione dinamica cellula-cellula tra diversi tipi di cellule epatiche. Le cellule stellate epatiche (HSC), quando attivate, si differenziano in cellule simili ai miofibroblasti alfa 2 che esprimono l'actina, migrano e proliferano e sintetizzano le proteine ECM come azione di chiusura della ferita. Le HSC attivate sono le cellule centrali produttrici di collagene nel fegato1.
Il meccanismo molecolare del rimodellamento della ECM, i modelli di fibrosi e la loro relazione con gli eventi cellulari non sono chiari. È ancora necessaria una migliore comprensione della struttura tridimensionale (3D) della ECM, anche se le tecniche di spettrometria di massa hanno contribuito ad analizzare la composizione della proteina ECM4. Tradizionalmente, la colorazione tricromatica di Masson, le macchie Picro Sirius Red e l'imaging di seconda generazione armonica (SHG) sono stati eseguiti su sezioni di fegato sottili bidimensionali (2D). Il tipico modello di fibrosi della NASH è chiamato "filo di pollo", che si estende alla zona 3 ed è la fibrosi perisinusoidale / pericellulare 5,6. Tuttavia, c'è stata una mancanza di studi incentrati sulla struttura 3D del fegato nativo, in particolare quelli che non coinvolgono il sezionamento dei tessuti. Robusti approcci di imaging per identificare modelli e caratteristiche della fibrosi attraverso il rimodellamento dinamico della ECM nella fibrosi epatica rafforzerebbero significativamente la comprensione dei meccanismi della NASH e identificherebbero nuovi bersagli terapeutici.
Per affrontare queste sfide, è stato ottimizzato un protocollo rapido ed efficiente per visualizzare l'ECM epatica nativa tramite decellularizzazione7. La decellularizzazione dell'intero fegato è un approccio per rimuovere il contenuto cellulare epatico mantenendo la rete ECM 3D nativa attraverso la perfusione di detergenti. I topi sono stati nutriti con chow o dieta fast-food (FFD) per 14 settimane. La decellularizzazione è stata eseguita dopo perfusione venosa porta in situ con detergente delicato e basse portate per preservare le strutture di collagene fibrillare a tripla elica e nativa. La microscopia a due fotoni è stata applicata per analizzare i cambiamenti nelle strutture del collagene nell'ECM. Le immagini 3D della struttura ECM nativa nei fegati normali e NASH sono state ricostituite e analizzate. L'esecuzione della decellularizzazione della perfusione in situ e l'analisi dello scaffold mediante microscopia a due fotoni fornisce una piattaforma pratica e conveniente per visualizzare il rimodellamento dinamico dell'ECM nel fegato.
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Protocol
Gli esperimenti sugli animali vengono eseguiti secondo le procedure sperimentali approvate dai comitati istituzionali per la cura e l'uso degli animali (IACUC) della Stanford University e del Veterans Affairs Hospital di Palo Alto. Topi maschi C57BL / 6J di 6-8 settimane sono stati alimentati con chow o una dieta fast-food integrata con sciroppo di mais ad alto contenuto di fruttosio al 4,2% (vedi Tabella dei materiali) in acqua potabile per 14 settimane5. I topi sono stati tenuti in gabbie standard a un ciclo buio/luce di 12 ore.
1. Preparazione chirurgica e procedure di perfusione epatica
- Pesare il mouse prima della procedura.
- Anestetizzare il topo somministrando ketamina (90 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) (vedere Tabella dei materiali) tramite iniezione intraperitoneale. Assicurarsi che il mouse sia completamente anestetizzato dal pizzicamento delle dita prima di procedere al passaggio successivo.
NOTA: L'isoflurano non è necessario qui poiché si tratta di un intervento chirurgico di non sopravvivenza. - Rasare l'area ventrale con un tagliacapelli e disinfettare la pelle con etanolo al 70%. Posizionare il mouse sul dorso e immobilizzare le gambe sulla scheda chirurgica con del nastro adesivo.
- Dopo aver riconfermato la profondità dell'anestesia con un pizzico di punta, utilizzare le forbici Mayo e la pinza Adson (vedi Tabella dei materiali) per fare un'incisione di 3 cm lateralmente nell'addome inferiore e quindi un'incisione di 5 cm verticalmente dall'addome basso al processo xifoideo. Fare attenzione a non aprire la cavità toracica.
- Dopo aver aperto il peritoneo, posizionare delicatamente l'intestino alla sinistra dell'animale e sollevare il lobo destro del fegato con un applicatore con punta di rayon (vedi Tabella dei materiali) per esporre la vena porta.
- Cateterizzare la vena porta utilizzando un catetere IV da 24 G. Introdurre il catetere nell'estremità distale della vena porta. Posizionare la punta del catetere prima che la vena porta si dirama nei lobi epatici.
- Prelevare immediatamente l'ago quando il catetere entra nella vena. Controllare che il catetere sia posizionato correttamente all'interno della vena perfondendo il fegato con PBS utilizzando una siringa da 1 ml attraverso il catetere.
NOTA: Dopo la perfusione PBS, tutti i lobi dovrebbero immediatamente sbiancarsi. Se il catetere è posizionato correttamente, il sangue venoso fluirà rapidamente attraverso il catetere. - Utilizzare una pinza Dumont, un supporto per microaghi Castroviejo e una sutura 4-0 (vedi Tabella dei materiali) per posizionare un punto sotto la ramificazione della vena porta e un secondo punto 1 cm sotto per fissare il catetere.
2. Decellularizzazione dei tessuti
- Collegare il catetere a un tubo di silicone (~ 1 m di lunghezza, 3 mm di diametro interno e 4,1 mm di diametro esterno) con un connettore Luer. Collegare il tubo in silicone a una pompa peristaltica e un serbatoio contenente acqua deionizzata (vedi Tabella dei materiali).
- Rimuovere con attenzione le bolle d'aria all'interno del tubo ed evitare di generare nuove bolle durante la perfusione. Impostare la pompa peristaltica su una portata di 0,2 mL/min (cioè 288 mL/24 h).
- Perfondere prima con acqua deionizzata (~50 mL/mouse) per 2 ore. Il colore del fegato cambierà da rosso a giallo durante la perfusione.
NOTA: L'animale scadrà dopo 10 minuti di perfusione. - Passare la soluzione di perfusione allo 0,5% (wt/vol) di sodio desossicolato (DOC; vedere Tabella dei materiali) e continuare per tutta la notte (18 ore, ~250mL/mouse). Il fegato diventerà bianco alla fine della perfusione (Figura 1).
- Commutare la soluzione di perfusione in acqua deionizzata (~50 mL/mouse) e perfondere per 2 ore.
- Utilizzare micro pinze Dumont e micro-forbici a molla (vedi Tabella dei materiali) per raccogliere il fegato decellularizzato e lavarlo accuratamente in una capsula di Petri con PBS.
- Tagliare il tessuto decellularizzato in piccoli pezzi per l'imaging immediato o congelare a -80 ° C per ulteriori analisi biochimiche come spettrometria di massa tandem, ELISA o western blot.
3. Preparazione del vetrino per l'imaging (con un microscopio a fluorescenza multifotone/confocale)
- Trasferire un piccolo pezzo di fegato decellularizzato (<3 x 3 x 3 mm) su un vetrino da microscopio e posizionare il tessuto nel mezzo.
- Aggiungere 10 μL di mezzo di montaggio antisbiadimento (vedere Tabella dei materiali) al tessuto con una pipetta per evitare l'essiccazione del tessuto.
- Coprire il tessuto con un vetro di copertura e applicare una piccola forza per appiattire il campione. Sigillare i bordi del vetro di copertura con smalto per unghie incolore e trasparente (Figura 2).
NOTA: A causa dell'impostazione del bifotone verticale attraverso il microscopio, è stato utilizzato un vetro di copertura sul campione. Tuttavia, i campioni potrebbero essere posizionati in modo diverso se viene utilizzato un microscopio invertito.
4. Acquisizione di immagini
- Posizionare una goccia di olio per immersione sulla parte superiore del vetro di copertura e posizionare il vetrino sul supporto del vetrino del microscopio. Abbassare l'obiettivo dell'olio 20x fino a quando non entra in contatto con l'olio ad immersione.
- Passare al canale viola (405 nm), accendere l'otturatore e concentrarsi sul campione. Naviga e posiziona l'area di interesse per l'imaging. Spegnere l'otturatore prima di passare all'acquisizione delle immagini utilizzando la luce laser.
- Passare al controllo del computer e avviare il laser a due fotoni. Accendere prima il laser a due fotoni (Figura 3A), quindi accendere il controller laser a due fotoni (vedere Tabella dei materiali) e l'otturatore (Figura 3B,C). Assicurarsi che la potenza di uscita sia superiore a 2,5 W.
Ridurre la potenza del laser per prevenire la tempra a fluorescenza. Selezionare e regolare i rivelatori (sia fotomoltiplicatori che ibridi) per adattarsi ai fluorofori scelti.
NOTA: L'imaging a due fotoni è stato eseguito a una lunghezza d'onda di eccitazione di 860 nm. Sono stati selezionati due canali rispettivamente per le immagini di collagene SHG e fluorescenza eccitata a due fotoni (TPEF). Un canale corrispondente all'intervallo di lunghezze d'onda di 415-445 nm ha rilevato la struttura dettagliata del collagene dai segnali SHG. Un altro canale copriva l'intervallo di 465-669 nm per raccogliere i segnali TPEF. - Scegli acquisizioni di immagini simultanee o sequenziali. Regolate il foro stenopeico sul valore più alto. Regola le lunghezze d'onda del laser, il guadagno, la potenza e l'offset. Regolare il tempo di permanenza dei pixel, la dimensione dei pixel, la media e lo zoom (Figura 4A).
- Scorrere lo z-controller del computer e impostare le dimensioni z, definire l'inizio e gli endpoint e scegliere il numero di immagini fornite all'interno di un volume (z-stack). Acquisire immagini.
NOTA: Qui, è stata scelta una dimensione del volume Z di 20 μm e una dimensione del passo Z di 1 μm (Figura 4B).
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Representative Results
Le fibre di collagene sono state rilevate con la seconda generazione armonica e la microscopia a due fotoni. Il segnale proviene dalle strutture frangibili di collagene fibrillare a tripla elica e nativa. Non sono stati utilizzati anticorpi specifici per analizzare i sottotipi di collagene; Tuttavia, questo potrebbe essere aggiunto alla tecnica di imaging.
Quando il tessuto epatico viene studiato senza decellularizzazione, è difficile ottenere immagini ad alta risoluzione della rete di collagene (Figura 5A). Nell'ECM decellularizzata, le fibre di collagene (verde) appaiono parallele o intrecciate (Figura 5B). C'erano evidenti differenze nella morfologia e nella distribuzione spaziale delle componenti ECM tra i fegati Chow e FFD. Le fibre di collagene nei topi con una dieta chow hanno mostrato una rete intrecciata e ben organizzata. Nei topi su FFD, tuttavia, sono stati osservati fasci di collagene con meno connettività (Figura 5B).
Per studiare ulteriormente la struttura 3D della ECM epatica, sono state catturate immagini delle fette con un volume Z di 20 μm (spessore) e 1 μm di dimensione Z-step. Le fibre di collagene nei topi con dieta chow hanno mostrato una rete ben organizzata, ma non nei topi su FFD (Figura 6). Per confermare la qualità del collagene fibrillare nell'ECM decellularizzata, i vetrini sono stati fissati e incorporati in paraffina e colorati con ematossilina ed eosina (H & E) e rosso Picrosirius (PSR) (vedi Tabella dei materiali). H & E mostra che tutte le cellule sono state rimosse. Il PSR è una tecnica istologica comunemente usata per evidenziare il collagene nelle sezioni di tessuto incorporate in paraffina (Figura 7).
Figura 1: Fegato di topo durante la perfusione. Il fegato diventa bianco e semitrasparente alla fine della perfusione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Preparazione delle diapositive per l'imaging. Il tessuto è coperto da un vetro di copertura e viene applicata una piccola forza per appiattire il campione. I bordi del vetro di copertura sono sigillati con smalto per unghie incolore e trasparente. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Screenshot del software laser a due fotoni, che avvia il laser a due fotoni. (A) Innanzitutto, il laser a due fotoni è acceso. (B) (C) Il controller laser a due fotoni e l'otturatore sono accesi. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Screenshot del software laser a due fotoni durante l'acquisizione dell'immagine. (A) Assicurarsi di impostare il foro stenopeico sul valore più alto (frecce rosse). Regola le lunghezze d'onda del laser, il guadagno, la potenza e l'offset. Regola il tempo di permanenza dei pixel, la dimensione dei pixel, la media e lo zoom. (B) Impostare il volume Z su 20 μm e la dimensione Z-step su 1 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: ECM decellularizzato con microscopia a due fotoni . (A) Immagini SHG di fibre di collagene da una fetta di fegato da 6 μm (fresco congelato) senza decellularizzazione. (B) Le immagini SHG raffigurano una rete di collagene ben organizzata nei fegati di topi con una dieta di controllo normale. Rete di collagene rimodellata nei topi con dieta fast-food (FFD). Freccia, area fibrosi. Stella, rete di collagene rimodellata. Barra di scala = 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 6: Struttura 3D della rete di collagene epatico. Le fibre di collagene nei topi sulla dieta chow hanno mostrato una rete ben organizzata, ma non nei topi fast-food diet (FFD). Le immagini sono state catturate con un volume Z di 20 μm (spessore) e una dimensione Z-step di 1 μm. Barra di scala = 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 7: Colorazione con ematossilina ed eosina (H&E) e colorazione rosso Picrosirius (PSR) della ECM decellularizzata. H & E mostra che tutte le cellule sono state rimosse. Nelle immagini di colorazione PSR, l'ECM dei topi alimentati con chow ha rivelato una rete ben organizzata e, al contrario, i topi con dieta fast-food (FFD) hanno mostrato fibre di collagene più dense. Volume Z (spessore) = 6 μm. Barra di scala = 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
Il presente protocollo mostra che la decellularizzazione attraverso una perfusione DOC in situ a bassa portata preserva le strutture frangibili di collagene fibrillare a tripla elica e nativa, fornendo una piattaforma affidabile ed economica per catturare il rimodellamento dinamico dell'ECM nella fibrosi epatica NASH. Sebbene la decellularizzazione sia stata eseguita in fegati normali e fibrotici prima di identificare i componenti della ECM o generare scaffold biologici per la coltura cellulare, la dinamica del rimodellamento della ECM nella fibrosi epatica non è stata ben studiata 8,9,10. Questo metodo consente ai ricercatori di tracciare confronti tra vari modelli di fibrosi.
Attualmente, ci sono varietà di protocolli di perfusione che utilizzano DNasi, sodio dodecilsolfato (SDS) o Triton X-10011. Il costo di DNase è elevato perché sono necessari grandi volumi di soluzioni. SDS è una soluzione denaturante dura, un detergente anionico che distrugge le membrane cellulari e denatura le proteine. Pertanto, preservare l'intera rete di collagene dopo la perfusione SDS è impegnativo. Al contrario, Triton X-100, come detergente delicato non denaturante e non ionico, interrompe le interazioni lipidi-lipidi e lipidi-proteine e preserva le interazioni proteina-proteina. Tuttavia, è stato riportato che Triton X-100 perturba gli scaffold ECM, rendendo l'ECM epatica decellularizzata inadatta per ulteriori analisi di spettrometria di massa11.
Il protocollo di perfusione con DOC è stato modificato dal precedente lavoro7, dimostrando una migliore conservazione delle strutture di collagene fibrillare a tripla elica e nativa nella maggior parte dei tessuti. La rete di collagene è stata studiata con microscopia di seconda generazione armonica (SHG) senza anticorpi, riflettendo le strutture di collagene fibrillare a tripla elica e nativa. È stata testata anche la ECM epatica decellularizzata dei topi FFD e sono stati confermati i cambiamenti strutturali nella NASH.
I passaggi più critici del protocollo sono il posizionamento del catetere e la configurazione del sistema di perfusione. Il cateterismo della vena porta è vitale, ma la vena cava inferiore potrebbe anche essere utilizzata se la vena porta è danneggiata. Le bolle nel tampone e nei tubi devono essere evitate perché influenzano la perfusione. Poiché è stato utilizzato un microscopio verticale a due fotoni, la dimensione del campione era limitata. Questo può essere modificato se deve essere utilizzato un microscopio invertito.
Vi è un crescente interesse per la ECM rimodellata nelle malattie croniche del fegato e nell'epatocarcinogenesi12,13,14. Gli scaffold ECM decellularizzati sono stati impiegati nella riparazione chirurgica e nella medicina rigenerativa come materiale di scaffold biologico appropriato15,16,17. Tuttavia, questo lieve processo di decellularizzazione ha anche dei limiti, poiché alcuni componenti cellulari come il DNA o i residui lipidici potrebbero non essere completamente rimossi. Un tempo di perfusione DOC più lungo e un aumento della portata possono aiutare a ottenere scaffold decellularizzati ultra-purificati. L'aggiunta di DNasi nella soluzione di lavaggio dopo la perfusione DOC può anche aiutare a rimuovere il DNA. Il protocollo può essere adattato per le biopsie epatiche umane, migliorando così la comprensione delle alterazioni della ECM durante la progressione della NASH.
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Disclosures
Gli autori dichiarano che non ci sono conflitti di interesse riguardo a questo articolo.
Acknowledgments
Ringraziamo Hyesuk Park per l'aiuto tecnico. Questa ricerca è stata sostenuta dal finanziamento del National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK), NIH (R01 2DK083283, a NJT), National Institute on Aging (NIA), NIH (1R01AG060726, a NJT). Ringraziamo Jon Mulholland e Kitty Lee del Cell Sciences Imaging Facility del Beckman Center per l'assistenza tecnica con l'imaging al microscopio a due fotoni.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-0 MONOCRYL UNDYED 1 x 18" P-3 | MONOCRYL | Y494G | |
| 4-0 suture | fisher scientific | 10-000-649 | https://www.fishersci.com/shop/products/monomid-nylon-non-absorbable-sutures-7/10000649?keyword=true |
| AnaSed Injection (xylazine) | AnaSed | NDC 59399-110-20 | this drug to use by or on the order of a licensed veterinarian. |
| BD INSYTE AUTOGUARD I.V. CATHETER WITH BC TECHNOLOGY | BD | 382612 | |
| Chow diet | Envigo | # 2918 | Control diet. A fixed formula, non-autoclavable diet manufactured with high quality ingredients and designed to support gestation, lactation, and growth of rodents. |
| Fast-food diet (AIN76A Western Diet) | Test Diet | 1810060 | https://www.testdiet.com/cs/groups/lolweb/@testdiet/documents/web_content/mdrf/mdux/~edisp/ducm04_051601.pdf |
| Hematoxylin and Eosin Stain Kit | vectorlabs | H-3502 | https://vectorlabs.com/hematoxylin-and-eosin-stain-kit.html |
| Kent Scientific Rat Surgical Kit | fisher scientific | 13-005-205 | https://www.fishersci.com/shop/products/rat-surgical-kit/13005205#?keyword=mouse%20surgery%20kit |
| KETAMINE HYDROCHLORIDE INJECTION | Vedco | NDC 50989-996-06 - 10 mL - vial. | KetaVed has been clinically studied in subhuman primates in addition to those species listed under Administration and Dosage. |
| Leica SP5 upright Confocal, multi-photon | Leica | SP5 | |
| Luer connector (Three-way stopcock with SPIN-LOCK®) | bbraun | D300 | https://www.bbraunusa.com/en/products/b0/three-way-stopcockwithspin-lock.html |
| Picrosirius Red Stain Kit | Polysciences, Inc. | 24901 | https://www.polysciences.com/default/picrosirius-red-stain-kit-40771 |
| Rayon tipped applicator | puritan | 25-806 1PR | |
| Sodium deoxycholate | sigmaaldrich | D6750-100G | |
| Syrup | www.target.com | 24 fl oz | https://www.target.com/p/pancake-syrup-24-fl-oz-market-pantry-8482/-/A-13007801 |
| Variable Speed Peristaltic Pump | INTLLAB | BT100 | https://www.amazon.com/gp/product/B082K97W5W/ref=ox_sc_saved_title_2?smid=A12NUUP87ZRRAR&psc=1 |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | vectorlabs | H-1000-10 | https://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium.html |
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