Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Kvantificering af den potentielle indvirkning af glyphosatbaserede produkter på mikrobiomer

Published: January 10, 2022 doi: 10.3791/63109
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 2,3,4
1Biodiversity Unit, University of Turku, 2Department of Biology, University of Turku, 3Nutrition and Health Unit, Eurecat Technology Centre of Catalonia, 4Department of Biochemistry and Biotechnology, Rovira i Virgili University

Summary

Glyphosatbaserede produkter (GBP) er de mest almindelige bredspektrede herbicider på verdensplan. I denne artikel introducerer vi generelle retningslinjer for at kvantificere effekten af GBP på mikrobiomer, fra feltforsøg til bioinformatikanalyser.

Abstract

Glyphosatbaserede produkter (GBP) er de mest almindelige bredspektrede herbicider på verdensplan. Målet for glyphosat er enzymet 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphatsyntase (EPSPS) i shikimatvejen, som er næsten universel i planter. Inhiberingen af enzymet stopper produktionen af tre essentielle aminosyrer: phenylalanin, tyrosin og tryptofan. EPSPS er også til stede i svampe og prokaryoter, såsom arkæer og bakterier; Anvendelsen af GBP kan således have en indvirkning på mikrobiomsammensætningen af jordbund, planter, planteædere og sekundære forbrugere. Denne artikel har til formål at præsentere generelle retningslinjer for vurdering af effekten af GBP på mikrobiomer fra feltforsøg til bioinformatikanalyser og give et par testbare hypoteser. To feltforsøg præsenteres for at teste GBP på organismer uden for målgruppen. For det første udtages og analyseres planterelaterede mikrober fra 10 replikerede kontrol- og GBP-behandlingsplotter, der simulerer no-till-beskæring. I det andet forsøg blev der opnået prøver fra forsøgsparceller befrugtet af enten fjerkrægødning indeholdende glyphosatrester eller ikke-behandlet kontrolgødning. Bioinformatikanalyse af EPSPS-proteinsekvenser anvendes til at bestemme mikrobernes potentielle følsomhed over for glyphosat. Det første skridt i estimeringen af effekten af GBP på mikrobiomer er at bestemme deres potentielle følsomhed over for målenzymet (EPSPS). Mikrobielle sekvenser kan opnås enten fra offentlige arkiver eller ved hjælp af PCR-forstærkning. I de fleste feltstudier er mikrobiomsammensætningen imidlertid blevet bestemt ud fra universelle DNA-markører såsom 16S rRNA og den interne transskriberede afstandslinje (ITS). I disse tilfælde kan følsomheden over for glyphosat kun estimeres gennem en sandsynlighedsanalyse af EPSPS-sekvenser ved hjælp af nært beslægtede arter. Kvantificeringen af organismers potentielle følsomhed over for glyphosat baseret på EPSPS-enzymet giver en robust tilgang til yderligere forsøg med henblik på at undersøge mål- og ikke-målresistente mekanismer.

Introduction

Den store brug af pesticider i det moderne landbrug er helt klart en stor bidragyder til nedgangen i biodiversiteten1. Dette papir fokuserer på glyphosat, fordi glyphosatbaserede produkter (GBP'er) er blevet de mest anvendte pesticider globalt på grund af deres effektivitet og overkommelige pris 2,3. Ud over at dræbe ukrudt i landbrugsmarker anvendes GBP'er almindeligvis i silvikultur, bymiljøer og hjemmehaver; Desuden er de blevet erklæret for ugiftige for organismer uden for målgruppen, hvis de anvendes i overensstemmelse med fabrikantens anvisninger. Et stigende antal nylige undersøgelser har imidlertid vist, at restkoncentrationer af glyphosat og dets nedbrydningsprodukter kan tilbageholdes og transporteres i jordbunden og derved have kaskadevirkninger på organismer uden for målgruppen 4,5,6,7,8 . Virkningerne af glyphosat er ikke kun begrænset til planter - shikimatvejen er også til stede i mange svampe og prokaryoter. Glyphosat er rettet mod enzymet 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphatsyntase (EPSPS) i shikimatvejen, også kendt som aroA9. Dette enzym er i centrum af shikimatvejen i syntesen af de tre essentielle aromatiske aminosyrer (phenylalanin, tyrosin og tryptofan), og det er til stede i de fleste prokaryoter, planter og svampe10,11. Nogle mikrobielle arter har udviklet delvis eller absolut resistens over for glyphosat ved hjælp af flere mekanismer, herunder mutationer i EPSPS-sekvenserne. Det er således blevet foreslået, at brugen af GBP'er kan have en direkte effekt på plante- og dyremikrobiomer, herunder det humane tarmmikrobiom 12,13,14. Ikke desto mindre kan anvendelsen af GBP have en negativ indvirkning på stort set alle økosystemtjenester og -tjenester, der er afhængige af mikrober og mikrobe-faciliterede processer. De deraf følgende trusler kan vedrøre biokemiske jordprocesser, bestøvningsbiologi og dyrs og menneskers trivsel. Dette kræver en mere omfattende forståelse af, hvordan glyphosat påvirker shikimatveje og metoder til at vurdere mikrobers følsomhed over for glyphosat.

I denne protokol præsenterer vi en pipeline til test af effekten af glyphosat og GBP på mikrobiomet, fra feltforsøg til bioinformatikanalyser. Vi beskriver i detaljer en nyligt offentliggjort bioinformatikmetode, der kan bruges til at bestemme organismers potentielle følsomhed over for glyphosat12. Så vidt forskerne ved, er dette det første og hidtil eneste bioinformatikværktøj til at vurdere enzymet EPSPS's iboende følsomhed over for den aktive komponent i GBP'er. Denne bioinformatikmetode er baseret på påvisning af kendte aminosyremarkører i glyphosatmålenzymet (EPSPS)12. Pipelinen er opdelt i fem hovedarbejdsfaser (figur 1): 1) en kort introduktion til to felteksperimenter for at teste effekten af GBP'er, 2) et kort resumé af mikrobiomanalyser (16S rRNA, ITS og EPSPS-gen ), 3) indsamling af EPSPS-sekvenser fra offentlige arkiver, 4) bestemmelse af organismers potentielle følsomhed over for glyphosat og 5) vurdering af EPSPS-klassen fra universelle mikrobielle markører (16S rRNA og ITS).

Protocol

1. To felteksperimenter for at teste effekten af GBP'er

BEMÆRK: Denne protokol præsenterer to eksempler på felteksperimentelle designs til test af effekten af GBP'er på planterelaterede mikrober. Begge forsøg blev udført i jordudtagningsmarker uden tidligere historie med herbicid eller landbrugsanvendelser ved University of Turku Ruissalo Botaniske Have i Finland (60º26'N, 22º10'E). Jorden er sandet ler med en høj andel af organisk materiale.

  1. Forsøg 1
    BEMÆRK: Dette eksperiment blev designet til at simulere den generelle landbrugspraksis i no-till landbrug med GBP-applikationer før og efter vækstsæsonen for at bekæmpe ukrudt.
    1. Opdel forsøgsfeltet i 10 replikerede kontrol- og GBP-behandlingsområder (23 m x 1,5 m) med bufferstrimler af vegetation mellem tomterne ( i denne undersøgelse i foråret 201415) (figur 2).
    2. Sørg for, at plottene er beliggende med en roterende skovl til en dybde på 5 cm og behandles to gange om året. Her blev tomterne behandlet i begyndelsen (maj) og slutningen (oktober) af vækstsæsonen.
    3. Behandl kontrolarealerne med postevand (5 L/plot) og GBP-grundene med kommercielle GBP (glyphosatkoncentration 450 g· L-1, påføringshastighed 6,4 L·ha-1 i 5 l postevand pr. plot) for at efterligne den maksimalt tilladte dosering af glyphosat i landbrugspraksis (3 kg·ha-1).
    4. Påfør behandlingerne med en håndbetjent trykbeholder, der har en manuel sprøjte. To uger efter GBP-ansøgningen så havre (Avena sativa), faba bønner (Vicia faba), majroer (Brassica rapa subsp. oleifera) og plant kartofler (Solanum tuberosum) i tomterne i henhold til landbrugspraksis.
    5. I vækstsæsonen hånd-ludes plottene for at holde plantekonkurrencen og jordstrukturen så ens som muligt i kontrol- og GBP-behandlede tomter.
    6. Prøve mikrobiota fra forsøgsplanter. I denne undersøgelse blev mikrobiotaen udtaget fortløbende fra 2017 til 2020 i både de GBP-behandlede og kontrolbehandlingsplottet en gang pr. Vækstsæson i løbet af undersøgelsen.
    7. Der indsamles ti replikater af planteprøverne (rod og blade) fra marken, anbringes straks på is, og de bringes til laboratoriet med henblik på videre forarbejdning som beskrevet i punkt 2.1.
  2. Forsøg 2
    BEMÆRK: Dette eksperiment blev designet til at teste risici forbundet med den cirkulære fødevareøkonomi; mere præcist var det designet til at undersøge konsekvenserne af GBP-rester i gødning, der blev anvendt som gødning til afgrødeplanter2 (figur 3).
    1. Saml strøelse, herunder træspåner, afføring og noget spildt foder, fra vagtler fodret med GBP-forurenet eller kontrolfoder i et 12-måneders fugleforsøg16,17.
      BEMÆRK: Det GBP-forurenede foder bestod af økologisk foder til æglæggende kyllinger kombineret med et ækvivalent på 160 mg glyphosat/kg, hvilket svarer til et dagligt indtag på 12-20 mg glyphosat pr. kg legemsmasse i voksne japanske vagtler16,17.
    2. Til validering sendes prøverne til et akkrediteret laboratorium for glyphosatkoncentrationsmålinger i seks batcher foder.
    3. Desuden måles restkoncentrationerne af glyphosat i vagteludskillelsesprøver efter 12 måneders eksponering. Kontrolgruppen blev fodret med det samme økologiske foder uden16,17 GBP-tillæg.
    4. Under fugleeksperimentet skal du skifte sengetøj to gange om ugen. Opsaml det brugte sengetøj regelmæssigt fra 8-12 måneders eksponering fra GBP-behandling og kontrol, pool pr. behandling, og opbevar i lukkede beholdere i et tørt, mørkt opbevaringsrum ved 6 °C, før det anvendes som gødning.
    5. Spred 12 L af sengetøjene manuelt på hver af de 18 GBP og 18 kontrolplotter (størrelse 1 m x 1 m) i et 6 x 6 skakbrætgitter i forsøgsfeltet på to tidspunkter. I denne undersøgelse blev sengetøjet spredt i august 2018 og i maj 2019.
    6. Send strøelsesprøverne til et akkrediteret laboratorium for glyphosatkoncentrationsmålingerne direkte efter, at det er spredt (i denne undersøgelse i maj 2019).
    7. Plant flerårige græs- og jordbærplanter i hvert plot for at studere deres rod- og bladmikrobiota.
      BEMÆRK: I denne undersøgelse blev fire flerårige græsplanter (Festuca pratensis) og to jordbærplanter (Fragaria x vescana) plantet til hvert plot og undersøgt for deres rod- og bladmikrobiota.

2. Mikrobiomanalyser (16S rRNA, ITS og EPSPS gen)

BEMÆRK: De fleste mikrobiomundersøgelser er baseret på analysen af 16S rRNA-genet for bakterielle og interne transskriberede afstandsområder (ITS) for svampesamfund ved hjælp af næste generations sekventeringsteknologier. Papiret indeholder således ikke oplysninger om typen af EPSPS. EPSPS-sekvenser fra tusindvis af arter er tilgængelige i offentlige registre (protokolafsnit 3) (figur 4).

  1. 16S rRNA-gen
    1. Fra de løsrevne blad- og rodprøver, der er indsamlet i de ovenfor beskrevne eksperimenter, identificeres de endofytiske mikrober (dvs. mikrober, der lever inde i plantevæv).
    2. Vask planteprøverne med ledningsvand og steriliser dem derefter for at fjerne de epifytiske mikrober (dvs. mikrober på overfladen af plantevæv). Steriliser med 3% blegemiddel i 3 minutter, efterfulgt af en 70% ethanolopløsning i 1 min,og vask tre gange med autoklaveret ultrarent vand i 1 minut hver.
    3. Prøverne fryses ved -80 °C indtil genomisk DNA-ekstraktion.
    4. Udfør genomisk DNA-ekstraktion ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt plante-DNA-ekstraktionssæt efter producentens protokol.
    5. Målret mod de variable regioner V6-V8 af 16S rRNA-genet fra ekstraherede DNA-prøver ved hjælp af en indlejret tilgang med diskriminerende primere, der binder specifikt til bakterielt DNA18, hvilket minimerer amplifikationen fra værtsplante-DNA.
    6. Efter tre runder polymerasekædereaktion (PCR) mærkes målgenet med stregkode- og adaptersekvenser for at forberede det som skabelon til sekventering. Følg trin 2.1.7- 2.1.11 for PCR-forstærkning
    7. PCR-masterblandingen forberedes til det krævede antal prøver, således at hver reaktion har et samlet volumen på 30 μLof og består af 30 ng DNA, 1x PCR-buffer, 0,2 mM dNTP'er, 0,3 μM af hver primer og 2000 U/ml DNA-polymerase. Følg det samme trin for anden og tredje runde af PCR.
    8. Til den første runde af PCR skal du bruge primere 799F19 og 1492R (modificeret fra20) (tabel 1). Opsætning af forstærkningsprofilen på termocyklisten (3 minutters indledende denaturering ved 95 °C efterfulgt af 35 cyklusser med denaturering ved 95 °C i 45 s, udglødning ved 54 °C i 45 s og forlængelse ved 72 °C i 1 min). Udfør den endelige forlængelse ved 72 °C i 5 min.
    9. Som skabelon for anden runde af PCR skal forstærkning verificeres ved elektroforese (5 μL af PCR-produkterne på 1,5% agarosegel) og derefter fortyndes resten 25 μL af PCR-produktet i autoklaveret ultrarent vand i forholdet 1:10.
    10. Gentag PCR med de fortyndede PCR-skabeloner og primere uni-1062F21 og uni-1390R22 (tabel 1). Oprethold de samme PCR-reaktionsbetingelser og forstærkningsprofil (trin 2.1.8) undtagen at reducere antallet af cyklusser til 25.
    11. Fortynd de resulterende PCR-produkter i autoklaveret ultrarent vand i forholdet 1:1. Udfør den tredje runde af PCR for at mærke produkterne med stregkoderne og P1-adaptersekvensen med 8 cyklusser af samme PCR-profil som nævnt i trin 2.1.8.
  2. Forberedelse af biblioteket
    1. Kontroller koncentrationen og kvaliteten af PCR-produkter på en bioanalytiker, og pool de mængder, der udgør 30 ng DNA fra hver prøve, i et 1,5 ml rør for at forberede et ækvamolært bibliotek.
    2. Vælg ampliconerne i størrelse 350-550 bp efter størrelsesfraktionering ved hjælp af et automatiseret DNA-størrelsesvalgssystem på en agarosegelkassette. Bemærk, at dette også eliminerer ikke-specifikke ampliconer og PCR-reagenser fra biblioteket. Saml eluten bestående af ampliconer af den angivne størrelse i et hætteglas i kassetten, hvilket resulterer i et oprenset 16S rRNA-genbibliotek.
    3. Pipette elutten ud i et 1,5 ml rør og kontrollere renheden og koncentrationen på bioanalysen. Fortynd DNA-biblioteket ved hjælp af autoklaveret ultrarent vand til en endelig koncentration på 26 pM; prøven er klar til sekventering.
  3. DENS
    BEMÆRK: ITS-området forstærkes ved hjælp af ITS-specifikke primere (tabel 1), og det resulterende PCR-produkt er mærket med stregkoder og en P1-adaptersekvens til sekventering.
    1. PCR-masterblandingen forberedes i henhold til den samme protokol som nævnt i punkt 2.1 med ITS-primere .
    2. Anbringelsesprofilen på termocyklisten som 5 minutters indledende denaturering ved 95 °C efterfulgt af henholdsvis 35 cyklusser med denaturering, udglødning og forlængelse ved 95 °C i 30 s, 55 °C i 30 s, 72 °C i 1 min og endelig forlængelse 72 °C i 7 min.
    3. 5 μL af PCR-produktet analyseres på 1,5 % agarosegel, og de resterende 25 μL til 1:10 fortyndes med autoklaveret ultrarent vand. Brug det fortyndede PCR-produkt som skabelon til anden runde af PCR.
    4. Forbered PCR-mastermixet til det krævede antal prøver (se trin 2.1.6) med stregkodemærkede fremadrettede primere og P1-adaptermærkede omvendte primere. Forstærk med samme forstærkningsprofil som i trin 2.3.2, undtagen ved hjælp af 8 cyklusser.
    5. De resulterende PCR-produkter forberedes til sekventering i henhold til de protokoller, der er nævnt i punkt 2.2.
  4. EPSPS-gen
    1. Sekvensér og analyser mikrobernes EPSPS-gener .
      BEMÆRK: For at finde ud af, om GBP-eksponering ændrede sammensætningen af glyphosatfølsomme og resistente mikrober i samfundet, skal mikrobernes EPSPS-gener sekventeres og analyseres. Således blev 353 sekvenser af EPSPS-gener fra en bred samling af mikrobielle taxa i ATGC-databasen (Alignable Tight Genomic Clusters) indsamlet, og alle proteinsekvenser blev justeret22. Disse justeringer er tilgængelige på ATGC database23 og kan bruges til at generere primere fra bevarede regioner. Et brugervenligt bioinformatikværktøj er designet til at identificere bevarede regioner fra en justering af flere sekvenser, og dette er tilgængeligt på Pere Puigbo-forskning side24. Det er dog uden for denne publikations anvendelsesområde at give en detaljeret beskrivelse af denne webserver. Ikke desto mindre er en potentiel protokol til at anvende disse primere til amplifikation af EPSPS-genet for at finde mikrobiomets følsomhed over for glyphosat angivet i figur 4.

3. Indsamling af EPSPS-proteinsekvenser fra offentlige arkiver

  1. EPSPS-sekvenser, der skal anvendes i makroevolutionsundersøgelser
    1. Indsamle EPSPS-proteiner fra offentlige depoter såsom PFAM23 (en database over proteinfamilier25), GenBank24 (en database over gener, genomer og proteiner26 ), COG25 (Clusters of Orthologous Groups27; en database over ortologe proteiner fra arkæer og bakterier); og PDB26 (Protein Data Bank28; en database over proteinstrukturer).
      BEMÆRK: En nylig undersøgelse foretaget af forskerne viste, at disse proteiner kunne bruges til at udføre mikroevolutionære og komparative analyser af den potentielle virkning af glyphosat på organismer, der har shikimatvejen12. Forfatterne har udviklet en brugervenlig hjemmeside, der samler information om titusindvis af EPSPS-proteinsekvenser29, herunder et manuelt kurateret datasæt af proteiner fra det humane tarmmikrobiom12. Oplysningerne i disse forudberegnede datasæt omfatter den nuværende EPSPS-klassificering i formodede følsomme og resistente over for glyphosat, taksonomiske oplysninger om arter, anmærkninger af det aktive EPSPS-sted og links til PDB- og NCBI-databaser. Desuden indeholder webserveren EPSPS' ID-koder og links til flere eksterne databaser (tabel 2).
  2. EPSPS-sekvenser, der skal anvendes i mikroevolutionsundersøgelser ATGC
    BEMÆRK: Generelle lagre af proteinsekvenser er nyttige til at udføre sammenlignende undersøgelser blandt relativt fjerne organismer; Den potentielle virkning af glyphosat er imidlertid relativt ny fra et evolutionært synspunkt. I nogle undersøgelser er det derfor nødvendigt at sammenligne nært beslægtede arter (f.eks. forskellige stammer fra samme bakterieart) for at bestemme effekten af glyphosat14. I disse tilfælde er databasen over Alignable Tight Genomic Clusters (ATGC)30, som indeholder en omfattende liste over nært beslægtede arkæale og bakterielle genomer, en mere egnet ressource. ATGC-databasen indeholder oplysninger om flere millioner proteiner fra tusindvis af genomer organiseret i hundredvis af klynger30. Hver genomklynge er justerbar (genomer deler synteny over ≥85% af deres længder) og stram (har en synonym substitutionshastighed under mætning). Forskerne brugte ATGC-datasættet i en nylig undersøgelse til at analysere mikroevolutionære ændringer i EPSPS-proteiner14. Følgende trin er nødvendige for at identificere EPSPS-proteinsekvensen i ATGC:
    1. Download hele databasen over ATCC'er fra link31 og alle proteiner fra COG0128 (kode svarende til EPSPS-proteiner i databasen)32 til et lokalt projekt.
      BEMÆRK: Hvis forskerne/eksperimenterne er baseret i Finland, stiller CSC-IT Center for Science33 lager- og softwarefaciliteter til sig. Det er vigtigt at samle alle sekvenser i FASTA-format.
    2. Bygget en blastdatabase af COG0128, der indeholder ortologer af EPSPS-proteinet i et repræsentativt sæt arter af prokaryoter. CSC har blastprogrammet34 forudinstalleret, hvilket gør det muligt at bruge kommandoen makeblastdb -in COG0128.fa -dbtype prot til at oprette en referencedatabase med EPSPS-sekvenser.
    3. Kortlæg ATGC-databasen på COG0128.fa (EPSPS-proteiner) ved hjælp af en iterativ blastsøgning med kommandoen blastp -query [ATGC_X.fa] -db [COG0128.fa] -max_target_seqs 1 -outfmt 6 -out tmpfile -evalue 1e-150.
    4. Som et resultat opretter det et datasæt med EPSPS-proteinsekvenser inden for hver. Et forudberegnet datasæt med nært beslægtede EPSPS-proteinsekvenser fra ATGC-databasen ertilgængeligt 29.

4. Algoritme til bestemmelse af organismers potentielle følsomhed over for glyphosat (EPSPSClass-webserver: input, behandling og output)

BEMÆRK: Forskerne har implementeret en brugervenlig server, der er frit tilgængelig ved 29 for at bestemme klassen af EPSPS-proteinsekvenser12,35. Serveren kræver kun et input af proteinsekvens i FASTA-format for at bestemme identitetsprocenten for hver af EPSPS-klasserne og deres potentielle følsomhed over for glyphosat. Desuden kan brugerne bruge webserveren til at teste deres egne referencesekvenser og aminosyremarkører. For det første justerer algoritmen (figur 5) forespørgselssekvenser og referencesekvenser ved hjælp af et program til justering af flere sekvenser35 for at bestemme aminosyrepositioner. Derefter søger den efter tilstedeværelsen af aminosyremarkører for at identificere EPSPS-klassen (I, II, III eller IV) i forespørgselssekvensen.

  1. Indfør en EPSPS-proteinsekvens i FASTA-format i inputtekstfeltet for at identificere enzymets klasse (figur 6A), og tryk på Send.
  2. Vurder forespørgselssekvensens potentielle følsomhed over for glyphosat (figur 6B-E) fra den server, der leveres output:
    Output 1: Brøkdel af aminosyremarkører (dvs. identitet), der er til stede i forespørgselssekvenserne (klasse I, II og IV), og antallet af motiver (klasse III).
    Output 2: Justeringer af forespørgsels- og referencesekvenserne baseret på restmarkører.
    Output 3: Fulde parvise justeringer af forespørgsels- og referencesekvenserne.
    Output 4: EPSPS-referencesekvenser: Vibrio cholerae(vcEPSPS, klasse I), Coxiella burnetii(cbEPSPS, klasse II), Brevundimonas vesicularis(bvEPSPS, klasse III), Streptomyces davawensis(sdEPSPS, klasse IV).
  3. I slutningen af outputsiden finder du links til eksterne værktøjer såsom blastp og bevarede domæner for yderligere at analysere forespørgsels-EPSPS-sekvensen (figur 6F).

5. Vurdering af EPSPS-klassen ud fra universelle mikrobielle markører (16S rRNA og ITS )

BEMÆRK: De fleste mikrobiomundersøgelser er baseret på analysen af 16S rRNA og / eller ITS36. I sådanne tilfælde er det ikke muligt at foretage en direkte analyse af EPSPS-sekvensen. Det er således nødvendigt med en probabilistisk tilgang til at estimere organismers potentielle følsomhed over for glyphosat. Denne analyse er ligetil og giver et rimeligt skøn over typen af EPSPS-sekvenser i et mikrobiomprojekt. Processen er opdelt i 3 trin (figur 7 og figur 8):

  1. Identificer EPSPS-sekvenser fra offentlige registre. EPSPS-klassen af et omfattende datasæt af repræsentative sekvenser er blevet kompileret og forudberegnet fra PFAM37, GenBank38, COG39, PDB40, ATGC30. Få adgang til disse datasæt fra EPSPSClass-serverens hovedside, der indeholder taksonomiske oplysninger og EPSPS-klassen på over 50 000 sekvenser (figur 7).
  2. Mål højden på forsøgsanlæggene hver anden uge i vækstsæsonen, og vej planternes biomasse over jorden i slutningen af marksæsonen for at sammenligne planternes vækst i GBP og kontrolarealer.
    BEMÆRK: Mikrobiotaanalyserne fra feltforsøgene er endnu ikke fuldt ud analyseret.
  3. Brug et regneark til at kortlægge de bakterielle OTU'er (baseret på 16S rRNA eller ITS) fra mikrobiomeksperimenter til forudberegnede datasæt.
    BEMÆRK: Tidligere undersøgelser har vist, at EPSPS-klassen (dvs. den iboende følsomhed over for glyphosat) er stærkt bevaret inden for en fylogenetisk gruppe14. Det er således relativt sikkert at antage, at nært beslægtede arter fra stærkt bevarede taxoner kan have lignende EPSPS-reaktioner på glyphosat (figur 8).
  4. I samme regneark beregnes den indre følsomhed over for glyphosat baseret på en sandsynlighedsscore (S = s / (s + r + u), hvor S: Følsomhedsscore; s: antal potentielt følsomme sekvenser; r: antal potentielt resistente sekvenser; u: antal uklassificerede sekvenser) beregnet ud fra kendte EPSPS-sekvenser i offentlige databaser.
    BEMÆRK: Denne score varierer fra 0 (der findes ingen følsomme EPSPS-sekvenser i et taxon) til 1 (alle sekvenser i et taxon er følsomme over for glyphosat) (figur 8). Desuden er der mellemværdier - dvs. arter med følsomme, resistente eller ukendte stammer.

Representative Results

Formålet med denne protokol er at tilvejebringe en generel pipeline, fra feltforsøg til bioinformatikanalyser, der kvantificerer organismers potentielle følsomhed over for herbicidet glyphosat. I forsøg 2 var den gennemsnitlige glyphosatkoncentration i vagtelfoderet 164 mg/kg, og den gennemsnitlige glyphosatkoncentration af udskillelsesprøverne (urin og fækalt stof kombineret) var 199 mg/kg. Strøelse indsamlet fra vagtler fodret med GBP-forurenet foder havde i gennemsnit 158 mg/kg og kontrolstrøelse på 0,17 mg/kg glyphosat (tabel 3). I feltforsøgene reagerede plantearterne forskelligt på rester af glyphosat i jorden (afsnit 1). Biomasse af havre og majroer var større i kontroljord sammenlignet med GBP-behandlet jord. Fababønner og kartoffel syntes imidlertid at drage fordel af GBP-behandling i slutningen afvækstsæsonen 15. Glyphosat i fjerkrægødning reducerede plantevæksten i græs (Festuca pratensis) og jordbær (Fragaria x vescana) (afsnit 1). Mikrobiotaanalyserne fra feltforsøgene er endnu ikke fuldt analyseret og præsenteres ikke her (afsnit 2). Resultaterne af denne protokol giver, når de læses enten direkte (som vist i afsnit 3 og 4) eller indirekte (afsnit 5), et mål for andelen af potentielt følsomme og resistente organismer over for glyphosat i et datasæt (figur 9). Anvendelsen af denne metode blev testet med en samling EPSPS-proteinsekvenser fra mikrobielle arter af det centrale humane tarmmikrobiom, der blev opnået fra offentlige arkiver12. I undersøgelsen blev 890 stammer fra de 101 mest udbredte bakteriearter analyseret med EPSPSClass-metoden for at kvantificere andelen af følsomme og resistente bakterier. Resultaterne viste, at 54% af arterne i det centrale menneskelige tarmmikrobiom er potentielt følsomme over for glyphosat12. Denne tendens ses også i det meste af den prokaryote verden; Derudover er andelen af potentielt følsomme arter i eukaryoter (hovedsagelig planter og svampe) endnu højere12. Desuden har vi brugt denne metode til at kvantificere ændringer i følsomhed i EPSPS-proteinet på et mikrorevolutionært niveau (figur 10)14. Vi identificerede ændringer i følsomhedsstatus i 12 ud af 32 nært beslægtede grupper af analyserede prokaryoter (tabel 4)14. Således kan den kontinuerlige anvendelse af GBP'erne producere mikrobiel dysbiose (dvs. en ubalance mellem følsomme og resistente bakteriearter) i plante-, dyre- og jordmikrobiomer. Desuden er det blevet antaget, at en stigning i glyphosatresistente bakterier kan fremme multiresistente mikrobiomer 14,41,42. Denne protokol kaster således lys over fortolkningen af alle disse scenarier, da EPSPS-klassificeringsmetoden giver et direkte skøn over mikrobiomers iboende følsomhed over for glyphosat. På grund af EPSPS-proteinets iboende følsomhed over for glyphosat fylogenetisk konserveret14 er det muligt at ekstrapolere resultaterne fra eksisterende datasæt til ukendte mikrobiomer (figur 8).

Figure 1
Figur 1: Generel pipeline Dette er en generel pipeline til analyse af følsomhed over for GBP fra felteksperimenter til bioinformatikanalyse. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Feltforsøg 1 for at teste virkningerne af GBP-rester på afgrødeplanterelaterede mikrober. Forsøgsfeltet består af skiftevis 10 kontrolparceller og 10 GBP behandlingsarealer (23 m x 1,5 m) med 1,5 m brækbånd mellem parceller. To gange om året siden 2014 blev GBP-plottene behandlet med kommercielle GBP (glyphosatkoncentration 450 g L-1, påføringshastighed 6,4 L ha-1 i 5 liter ledningsvand pr. Grund) og kontrolarealerne med samme mængde ledningsvand uden glyphosat. Behandlingerne blev påført med en håndbetjent trykbeholder ved hjælp af en plasthætte i sprinklerspidsen for at beskytte GBP'er mod at sprede sig uden for behandlingsplotterne. Efter en to-ugers sikkerhedsperiode efter GBP-ansøgningen blev havre (Avena sativa), fababønner (Vicia faba) og majroer (Brassica rapa subsp. oleifera) sået, og kartofler (Solanum tuberosum) blev plantet i grundene. Mikrobiotaprøver fra de undersøgte afgrødeplanter, blade og rødder, er blevet indsamlet flere gange siden forsøgets start i 2014. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Feltforsøg 2 testede konsekvenserne af GBP-rester i gødningsgødning for to flerårige afgrøder og deres tilhørende mikrobiota. Strøelse indsamlet fra et 12-måneders fugleforsøg med japanske vagtler fodret med kontrol eller GBP-forurenet foder blev brugt som gødningsgødning i et feltforsøg. Forsøgsfeltet bestod af 18 kontrol- og 18 GBP-plots (1 m x 1 m) arrangeret i et 6 x 6 skakbrætgitter. Sengetøjet blev spredt på forsøgsmarken to gange, i august 2018 og maj 2019 (25 L / plot). Kontrolplotter blev befrugtet med strøelse indsamlet fra vagtler fodret med kontrolfoder og GBP-tomter med strøelse fra vagtler fodret med GBP-forurenet foder. Rester af glyphosat i kontrolstrøelse var 0,17 mg/kg glyphosat, og i GBP-strøelse var mængden 158 mg/kg glyphosat. To endofytsymbiotiske (E+), to endofytfrie (E-) Festuca pratensis og to Fragaria x vescana blev plantet pr. grund i september 2018, cirka en måned efter spredningen af de første strøelser. Målinger af plantens ydeevne og egnethed samt prøveudtagning for rod- og bladassocieret mikrobiota blev udført i to på hinanden følgende vækstsæsoner (2019 & 2020). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Analyse af den mikrobielle taxa ved anvendelse af 16S rRNA-gen/ITS-region og mikrobiomers følsomhed over for glyphosat ved anvendelse af EPSPS-genet . (A) Analyse af 16S rRNA- eller ITS-sekvenser til identifikation af mikrobiel taxa. (B) Analyse af EPSPS-sekvenser for at identificere mikrobers følsomhed over for glyphosat (GS-glyphosatfølsom/GR-glyphosatresistent) Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Algoritme til identifikation af klassen af EPSPS-proteinsekvenser. Indgangen er en EPSPS-proteinsekvens i FASTA-format. Algoritmen udfører sammenligninger med kendte aminosyremarkører i referenceproteinsekvenser, der bestemmer den potentielle følsomhed over for glyphosat. Algoritmen blev implementeret på den frit tilgængelige webserver EPSPSClass29. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Grundlæggende indgange og udgange fra EPSPSClass-webserveren. A) Input: en EPSPS-proteinsekvens i FASTA-format. B) Output 1 - identitet: brøkdel af aminosyremarkører, der er til stede i forespørgselssekvenserne (klasse I-IV) og motiverne (klasse III). (C) Output 2 - identitet: justeringer af forespørgsels- og referencesekvenserne. (D) Output 3 - parvise justeringer af forespørgsels- og referencesekvenserne. E) EPSPS-referencesekvenser: Vibrio cholerae (vcEPSPS, klasse I), Coxiella burnetii (cbEPSPS, klasse II), Brevundimonas vesicularis (bvEPSPS, klasse III), Streptomyces davawensis (sdEPSPS, klasse IV). (F) Links til at udføre yderligere blastp-søgninger og identifikation af bevarede domæner Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 7
Figur 7: Adgang til forudberegnede datasæt af EPSPS-sekvenser. Følg angivelserne i figuren for at få adgang til det forudberegnede datasæt for EPSPS-sekvenser. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 8
Figur 8: Eksempel på, hvordan man estimerer den potentielle følsomhed i mikrobiomprojekter uden EPSPS-sekvenser. Eksemplet bruger værdier fra databasen alignable Tight Genomic Clusters30, som indeholder sekvenser fra prokaryote arter. Hypotetiske arter fra et mikrobiomprojekt er Staphylococcus aureus, Corynebacterium diphtheriae, Campylobacter jejuni, Chlamydia psittaci og Sulfolobus islandicus. Følsomhedsscoren for glyphosat beregnes som Number_Sensitive_Sequences/Total_Number_Of_Sequences. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 9
Figur 9: Skema for fortolkningen af resultaterne fra denne protokol og hypotetiske evolutionære scenarier. (A) I et mikrobiom er andelen af potentiel følsomhed (i grøn) og resistens (i rød) bakterier ca. 50:50. Sorte prikker betegner mikrobielle arter uklassificeret; således er deres følsomhed over for glyphosat ukendt. I nogle mikrobiomer er andelen af følsomme bakterier lidt højere, som i det humane tarmmikrobiom12. (B) Over tid kan brugen af glyphosat føre til mikrobiel dysbiose (dvs. en ubalance i andelen af følsomme og resistente bakterier), hvilket kan føre til forskellige hypotetiske scenarier. C) Hypotetisk tilfælde 1 (ingen udvælgelse): Anvendelsen af glyphosat påvirker ikke mikrobiomet; andelen af følsomme og resistente bakterier forbliver således konstant. D) Hypotetisk tilfælde 2: Anvendelsen af glyphosat fjerner bakterier, der er følsomme over for glyphosat, fra befolkningen. Vi spekulerer i, at dette scenario kan være dosisafhængigt. (E) Hypotetisk tilfælde 3: Selektionstryk fra brugen af glyphosat forstærker mutationer i EPSPS-genet , der ændrer bakteriernes følsomhedsstatus. Således bliver hele den mikrobielle befolkning resistent over for glyphosat. Desuden kan der i dette scenario være en stigning i multiresistente bakterier. F) Hypotetisk tilfælde 4: Anvendelsen af glyphosat ændrer sammensætningen af visse bakteriearter og skaber en ubalance over for resistente bakterier, mens nogle bakteriearter forbliver uændrede, muligvis på grund af yderligere resistente mekanismer såsom effluxpumper eller ved overekspression af EPSPS-genet 13. Dette scenarie kan også føre til en stigning i glyphosatresistente bakterier samt en stigning i bakterieresistens over for yderligere antibiotika. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 10
Figur 10: Fordeling af den forventede følsomhed over for glyphosat på tværs af artstræet. Cirkeldiagrammer angiver andelen af arter, der formodes at være følsomme (grønne) eller resistente (røde) over for glyphosat og uklassificerede (sorte). Denne figur er blevet tilpasset med tilladelse fra Rainio et al.14. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 11
Figur 11: Input og output fra EPSPSClass-webserveren til test af brugerens egen referencesekvens. (A) Input 1: forespørgselssekvens. B) Indgang 2: referencesekvens. C) Input 3: aminosyremarkører i referencesekvenserne. D) Output: identitet: brøkdel af aminosyremarkører i forespørgselssekvenserne (klasse I-IV og brugerens egne referencesekvenser). Klik her for at se en større version af denne figur.

Tabel 1: Liste over primere til PCR-amplifikation af 16S rRNA-gen og ITS-region i mikrobiomanalyse Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 2: Koder for enzymet 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphatsyntase (EPSPS) i forskellige databaser Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 3: Gennemsnitlig glyphosatkoncentration Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 4: Sammenfattende tabel over procentdelen af arter, der er følsomme/resistente over for glyphosat. Denne tabel er blevet tilpasset med tilladelse fra Rainio et al.14. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 5: Aminosyrermarkørernes positioner i referencesekvenserne Klik her for at downloade denne tabel.

Discussion

Denne protokol indeholder generel vejledning i, hvordan man kvantificerer effekten af GBP på mikrobiomer baseret på analysen af EPSPS-proteinet. Protokollen har tre vigtige kritiske trin: (i) Kvantificering af EPSPS-proteinet fra mikrobiomdata. Dette trin er kritisk, fordi EPSPS er herbicidets direkte målenzym. Således kan arter, der har en kopi af EPSPS-genet, blive påvirket af brugen af GBP. Ikke desto mindre kan selv arter, der mangler en kopi af EPSPS-genet, blive påvirket af herbicidet gennem alternative ikke-målmekanismer43,44. (ii) Hvis analysen af EPSPS-genet ikke indgår i undersøgelsens design, er det muligt at få et godt skøn ved at analysere 16S rRNA (bakterier) eller ITS (svampe). I dette tilfælde er det vigtigt at basere sig på en omfattende referencetabel (f.eks. indeholder ATGC-databasen sekvenser af EPSPS-proteinet fra flere nært beslægtede arter). iii) EPSPS-proteinet er opdelt i potentielt følsomt eller resistent over for glyphosat afhængigt af visse aminosyrerester fra EPSPS' aktive sted. Mutationer, der påvirker en enkelt aminosyre, kan dog ændre denne klassifikation45, og overgange mellem klasser kan forekomme på relativt kort tid14.

Organismers potentielle følsomhed over for glyphosat kan bestemmes ved hjælp af referencegenomer, aminosyremarkører og sekvensjusteringer. i) Referencegenomer: EPSPS-enzymet kan klassificeres som potentielt følsomt (klasse I [alfa eller beta]46,47) eller resistent (klasse II 48,49, III50 og IV51) over for glyphosat på grundlag af tilstedeværelsen af aminosyremarkører og -motiver (for så vidt angår klasse III). Disse aminosyremarkører og motiver er baseret på placeringen af aminosyrerester i EPSPS-proteinet af Vibrio cholerae (vcEPSPS, klasse I), Coxiella burnetii (cbEPSPS, klasse II), Brevundimonas vesicularis (bvEPSPS, klasse III) og Streptomyces davawensis (sdEPSPS, klasse IV). ii) Aminosyremarkører: Glyphosat interagerer med EPSPS-enzymet og konkurrerer med phosphoenolpyruvat (PEP, EPSPS-enzymets andet substrat)52,53. Hos visse arter giver små aminosyreændringer i EPSPS-sekvensen en højere affinitet for PEP og en resistens over for glyphosat 12,14,52,54,55. I andre sekvenser binder glyphosat EPSPS-sekvensen i en ikke-hæmmende konformation 45. Selv om mange resistente 12,14,48,49,52,54,55 og tolerante 56,57 EPSP-sekvenser over for glyphosat er blevet beskrevet, er det nuværende klassificeringssystem for EPSPS opdelt i fire hovedklasser (I-IV)12 (tabel 5 ). (iii) Sekvensjusteringer: For at klassificere et EPSPS-enzym udførte vi parvise justeringer med et program med flere sekvensjusteringsprogram-standardparametre35-af forespørgselssekvensen mod hver enkelt af referencesekvenserne (vcEPSPS, cbEPSPS, bvEPSPS og sdEPSPS). Disse justeringer er nødvendige for at identificere aminosyrermarkørernes positioner i forespørgselssekvensen. Som følge heraf klassificeres et enzym som beskreveti klasse I, II og/eller IV baseret på tilstedeværelsen af aminosyremarkører og klasse III-baserede motivmarkører.

Protokollen er baseret på fire kendte typer EPSPS: den ene type er følsom, de tre andre er resistente). Imidlertid er ca. 10 % af EPSPS-sekvenserne i prokaryoter endnu uklassificerede (16 % i arkæer og 8 % i bakterier)12. Således bør yderligere forskning analysere disse sekvenser for at bestemme glyphosatfølsomheden. EPSPSClass-serveren giver mulighed for at teste nye genetiske markører. Identifikationen af kendte klasser i EPSPS er ligetil, som vist i afsnit 4.4. og figur 5. I de tilfælde, hvor brugerne ønsker at sammenligne deres egne forespørgsels- og referenceproteiner, giver serveren desuden mulighed for manuelt at medtage en referencesekvens og et sæt aminosyremarkører (figur 11). Denne mulighed kan bruges til at identificere nye klasser af EPSPS samt til at teste andre herbicider og målsekvenser.

Analysen af EPSPS-klassen bestemmes ved sekvensanalyse og tilstedeværelsen/fraværet af aminosyremarkører. Dette er et foreløbigt skøn, der kan bruges til hypotesetest på området. Aminosyremarkører er blevet bestemt i litteraturen baseret på empiriske og observationsstudier 46,47,48,49,50,51. Referenceproteinsekvenser til bestemmelse af EPSPS-klassen er dog kun blevet testet i et begrænset antal arter og kan lejlighedsvis ikke forklare resistens over for glyphosat. Virkningen af kompenserende mutationer og EPSPS-associerede domæner (hovedsagelig i svampe) kan også påvirke følsomheden over for glyphosat58. Dette papirs analyse er baseret på fire EPSPS-klasser. En undersøgelse af bakterier i det humane tarmmikrobiom viste, at omkring 30 % af dem var uklassificerede (dvs. EPSPS-proteiner fra disse arter tilhører ikke nogen af de kendte klasser), og der er behov for yderligere undersøgelser for at identificere andre EPSPS-klasser. Det skal også bemærkes, at EPSPS-proteinsekvensen i bakterier og planter er unidomain, mens svampe-EPSPS-proteiner indeholder flere domæner59. Således kan en proteinfoldning i svampe føre til en anden reaktion fra EPSPS-enzymet på glyphosat. Desuden tages der ikke hensyn til yderligere resistensmekanismer, der ikke er mål (f.eks. effluxpumper og overekspression af EPSPS-genet 13) eller følsomhed over for glyphosat (f.eks. glyphosats virkning på mitokondrietransportkæden12).

Selvom GBP'er har eksisteret som et herbicid siden 1974 og er blevet udbredt siden 1991, er dette den første bioinformatikmetode til at bestemme organismers potentielle følsomhed over for glyphosat. Metoden er baseret på identifikation af kendte aminosyrerester i målsekvensen. Vores metode giver således et baseline estimat af glyphosats potentielle effekt på arten. I den nærmeste fremtid bør nye bioinformatikmetoder omfatte yderligere klasser af EPSPS-proteinet for at bestemme den potentielle følsomhed over for glyphosat af uklassificerede sekvenser 12,54,55. I betragtning af at EPSPS-enzymets nøjagtige opførsel kan variere efter enkelte aminosyreændringer 12,14,52,54,55, bør der yderligere i silico-forsøg tages hensyn til små variationer i foldningen af EPSPS-proteinet samt effekten af de EPSPS-associerede domæner på proteinstrukturen i svampe58 . Desuden har det vist sig, at tolerance over for glyphosat kan frembringes ved overekspression af EPSPS-proteinet56,57; således kan bioinformatikanalyser baseret på forbedring af kodonbrug60 anvendes til at identificere nye EPSPS-sekvenser, der maksimerer eller minimerer genekspression.

Landmænd, politikere og beslutningstagere har akut brug for en grundig forståelse af de risici, der er forbundet med den store brug af pesticider. Således er både bioinformatiske værktøjer, der afslører organismernes potentielle følsomhed over for pesticider og velreplikaterede, randomiserede og feltrealistiske eksperimentelle undersøgelser udført i forskellige miljøer, nødvendige. Den præsenterede bioinformatiske metode, der er designet til at undersøge organismers følsomhed over for glyphosat, kan moduleres for andre pesticider. Tilsvarende kan metoderne til eksperimentel økologi anvendes til at studere eventuelle relaterede økologiske spørgsmål. Sammen kan metoderne bruges til at demonstrere tab mellem feltobservationer, genomiske data og pesticidbrug. Alle præsenterede metoder er uvurderlige i risikovurderingen. Bioinformatiske metoder kan f.eks. anvendes til overvågning af mikrobielle tilpasninger til landbrugskemikalier og til at tilvejebringe en kvantitativ metode til at teste de potentielle andre tilknyttede risici, såsom en stigning i patogeners resistens over for landbrugskemikalier, negative virkninger på mikrober, der anvendes som biologiske bekæmpelsesmidler i integreret bekæmpelse af skadegørere (IPM), og antibiotikaresistens i bakterier.

Disclosures

Interessekonflikter: ingen.

Acknowledgments

Dette arbejde blev finansieret af Finlands Akademi (bevilling nr. 311077 til Marjo Helander).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2100 Bioanalyzer Instrument Agilent G2939B To check the concentration and quality of PCR products
dNTP mix (10 mM each) ThermoFisher Scientific R0192 For PCR reactions
GoTaq G2 DNA Polymerase kit Promega M7848 PCR buffer and DNA Polymerase for PCR amplification
Invisorb Spin Plant Mini Kit INVITEK Molecular 1037100300 Genomic DNA extraction from plant tissues
Ion Chip Minifuge ThermoFisher Scientific 4479672 For targeted sequencing of microbial PCR products
Ion PGM System ThermoFisher Scientific 4462921 For targeted sequencing of microbial PCR products
Ion PGM Torrent Server ThermoFisher Scientific 4483643 For targeted sequencing of microbial PCR products
Pippinprep SageScience PIP0001 For size fractionation of PCR amplicons
Pressure tank Berthoud 102140 For sprayin glyphosate based products in field
Primers Sigma Aldrich Custom-made For PCR amplification
Rotary tiller Grillo 984511 For tilling the soil in experimental plots
S1000 ThermalCycler BIO-RAD 1852196 For PCR amplification

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Williams, G. M., Kroes, R., Munro, I. C. Safety evaluation and risk assessment of the herbicide Roundup and its active ingredient, glyphosate, for humans. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 31, 117-165 (2000).
  2. Muola, A., et al. Risk in the circular food economy: Glyphosate-based herbicide residues in manure fertilizers decrease crop yield. The Science of the Total Environment. 750, 141422 (2021).
  3. Helander, M., Saloniemi, I., Saikkonen, K. Glyphosate in northern ecosystems. Trends in Plant Science. 17 (10), 569-574 (2012).
  4. Fuchs, B., Saikkonen, K., Helander, M. Glyphosate-Modulated Biosynthesis Driving Plant Defense and Species Interactions. Trends in Plant Science. 26 (4), 312-323 (2021).
  5. Helander, M., Saloniemi, I., Omacini, M., Druille, M., Salminen, J. -P., Saikkonen, K. Glyphosate decreases mycorrhizal colonization and affects plant-soil feedback. The Science of the Total Environment. 642, 285-291 (2018).
  6. Bai, S. H., Ogbourne, S. M. Glyphosate: environmental contamination, toxicity and potential risks to human health via food contamination. Environmental Science and Pollution Research International. 23 (19), 18988-19001 (2016).
  7. Cuhra, M., Bøhn, T., Cuhra, P. Glyphosate: too much of a good thing. Frontiers in Environmental Science. 4, (2016).
  8. de Brito Rodrigues, L., et al. Impact of the glyphosate-based commercial herbicide, its components and its metabolite AMPA on non-target aquatic organisms. Mutation Research. 842, 94-101 (2019).
  9. Steinrücken, H. C., Amrhein, N. The herbicide glyphosate is a potent inhibitor of 5-enolpyruvylshikimic acid-3-phosphate synthase. Biochemical and Biophysical Research Communications. 94 (4), 1207-1212 (1980).
  10. Bentley, R. The shikimate pathway--a metabolic tree with many branches. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 25 (5), 307-384 (1990).
  11. Richards, T. A., et al. Evolutionary origins of the eukaryotic shikimate pathway: gene fusions, horizontal gene transfer, and endosymbiotic replacements. Eukaryotic Cell. 5 (9), 1517-1531 (2006).
  12. Leino, L., et al. Classification of the glyphosate target enzyme (5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase) for assessing sensitivity of organisms to the herbicide. Journal Of Hazardous Materials. 408, 124556 (2021).
  13. Rainio, M. J., Ruuskanen, S., Helander, M., Saikkonen, K., Saloniemi, I., Puigbò, P. Adaptation of bacteria to glyphosate: a microevolutionary perspective of the enzyme 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate (EPSP) synthase. BioRxiv. , (2020).
  14. Rainio, M. J., Ruuskanen, S., Helander, M., Saikkonen, K., Saloniemi, I., Puigbò, P. Adaptation of bacteria to glyphosate: a microevolutionary perspective of the enzyme 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase. Environmental Microbiology Reports. 13 (3), 309-316 (2021).
  15. Helander, M., Pauna, A., Saikkonen, K., Saloniemi, I. Glyphosate residues in soil affect crop plant germination and growth. Scientific Reports. 9 (1), 19653 (2019).
  16. Ruuskanen, S., Rainio, M. J., Uusitalo, M., Saikkonen, K., Helander, M. Effects of parental exposure to glyphosate-based herbicides on embryonic development and oxidative status: a long-term experiment in a bird model. Scientific Reports. 10 (1), 6349 (2020).
  17. Ruuskanen, S., et al. female preference and adverse developmental effects of glyphosate-based herbicides on ecologically relevant traits in Japanese quails. Environmental Science & Technology. 54 (2), 1128-1135 (2020).
  18. Mäki, A., Rissanen, A. J., Tiirola, M. A practical method for barcoding and size-trimming PCR templates for amplicon sequencing. Biotechniques. 60 (2), 88-90 (2016).
  19. Chelius, M. K., Triplett, E. W. The diversity of archaea and bacteria in association with the roots of Zea mays L. Microbial Ecology. 41 (3), 252-263 (2001).
  20. Lane, D. J. 16S/23S rRNA sequencing. Nucleic acid techniques in bacterial systematics. , John Wiley & Sons. New York. 115-175 (1991).
  21. Ghyselinck, J., Pfeiffer, S., Heylen, K., Sessitsch, A., De Vos, P. The effect of primer choice and short read sequences on the outcome of 16S rRNA gene based diversity studies. Plos One. 8 (8), 71360 (2013).
  22. Zheng, D., Alm, E. W., Stahl, D. A., Raskin, L. Characterization of universal small-subunit rRNA hybridization probes for quantitative molecular microbial ecology studies. Applied and Environmental Microbiology. 62 (12), 4504-4513 (1996).
  23. JoVE Supplementary Material. , Available from: https://ppuigbo.me/programs/EPSPSClass/JOVE_SM (2021).
  24. Alignments Conserved Positions. , Available from: https://ppuigbo.me/programs/primers (2021).
  25. Protein Families. , Available from: http://pfam.xfam.org (2021).
  26. NCBI GenBank. , Available from: https://www.ncbi.nim.nih.gov/genbank (2021).
  27. COG Database. , Available from: https://www.ncbi.nim.nih.gov/research/cog (2021).
  28. Protein Data Bank. , Available from: https://www.rcsb.org (2021).
  29. EPSPSClass. , Available from: https://ppuigbo.me/programs/EPSPSClass (2021).
  30. Kristensen, D. M., Wolf, Y. I., Koonin, E. V. ATGC database and ATGC-COGs: an updated resource for micro- and macro-evolutionary studies of prokaryotic genomes and protein family annotation. Nucleic Acids Research. 45, 210-218 (2017).
  31. ATG_NCBI. , Available from: http://ftp.ncbi.nim.nih.gov/pub/kristensen/ATGC/atgc_home.html (2021).
  32. COG2020. , Available from: http://ftp.ncbi.nim.nih.gov/pub/COG/COG2020/data (2021).
  33. CSC - IT CENTER FOR SCIENCE LTD. , Available from: https://www.csc.fi (2021).
  34. Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. Journal of Molecular Biology. 215 (3), 403-410 (1990).
  35. Edgar, R. C. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Research. 32 (5), 1792-1797 (2004).
  36. Tkacz, A., Hortala, M., Poole, P. S. Absolute quantitation of microbiota abundance in environmental samples. Microbiome. 6 (1), 110 (2018).
  37. El-Gebali, S., et al. The Pfam protein families database in 2019. Nucleic Acids Research. 47, 427-432 (2019).
  38. Benson, D. A., et al. GenBank. Nucleic Acids Research. 41, Database issue 36-42 (2013).
  39. Galperin, M. Y., Makarova, K. S., Wolf, Y. I., Koonin, E. V. Expanded microbial genome coverage and improved protein family annotation in the COG database. Nucleic Acids Research. 43, Database issue 261-269 (2015).
  40. Burley, S. K., Berman, H. M., Kleywegt, G. J., Markley, J. L., Nakamura, H., Velankar, S. Protein data bank (PDB): the single global macromolecular structure archive. Methods in Molecular Biology. 1607, 627-641 (2017).
  41. Raoult, D., Hadjadj, L., Baron, S. A., Rolain, J. -M. Role of glyphosate in the emergence of antimicrobial resistance in bacteria. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 76 (7), 1655-1657 (2021).
  42. Liu, J., Gefen, O., Ronin, I., Bar-Meir, M., Balaban, N. Q. Effect of tolerance on the evolution of antibiotic resistance under drug combinations. Science. 367 (6474), 200-204 (2020).
  43. Peixoto, F. Comparative effects of the Roundup and glyphosate on mitochondrial oxidative phosphorylation. Chemosphere. 61 (8), 1115-1122 (2005).
  44. Peillex, C., Pelletier, M. The impact and toxicity of glyphosate and glyphosate-based herbicides on health and immunity. Journal of Immunotoxicology. 17 (1), 163-174 (2020).
  45. Funke, T., Han, H., Healy-Fried, M. L., Fischer, M., Schönbrunn, E. Molecular basis for the herbicide resistance of Roundup Ready crops. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (35), 13010-13015 (2006).
  46. Light, S. H., Krishna, S. N., Minasov, G., Anderson, W. F. An unusual cation-binding site and distinct domain-domain interactions distinguish Class II Enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases. Biochemistry. 55 (8), 1239-1245 (2016).
  47. Firdous, S., Iqbal, S., Anwar, S., Jabeen, H. Identification and analysis of 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS) gene from glyphosate-resistant Ochrobactrum intermedium Sq20. Pest Management Science. 74 (5), 1184-1196 (2018).
  48. Barry, G. F., Kishore, G. M., Padgette, S. R., Stallings, W. C. Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases. United States Patient. , US5627061A (1997).
  49. Priestman, M. A., Funke, T., Singh, I. M., Crupper, S. S., Schönbrunn, E. 5-Enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase from Staphylococcus aureus is insensitive to glyphosate. FEBS Letters. 579, 728-732 (2005).
  50. Carozzi, N., Carr, B., Hammer, P. E. Identification of a new class of EPSP synthases. World Intellectual Property Organization Publ.of the Int.Appl. without Int.search. , REP. WO2006US13161 (2006).
  51. Lira, J. M., Cicchillo, R. M., Nair, S. K. Novel class of glyphosate resistance genes. US Patent. , US20130217577A1 (2013).
  52. Funke, T., et al. Structural basis of glyphosate resistance resulting from the double mutation Thr97 -> Ile and Pro101 -> Ser in 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase from Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 284 (15), 9854-9860 (2009).
  53. Schönbrunn, E., et al. Interaction of the herbicide glyphosate with its target enzyme 5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate synthase in atomic detail. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (4), 1376-1380 (2001).
  54. Stalker, D. M., Hiatt, W. R., Comai, L. A single amino acid substitution in the enzyme 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase confers resistance to the herbicide glyphosate. The Journal of Biological Chemistry. 260 (8), 4724-4728 (1985).
  55. Eschenburg, S., Healy, M. L., Priestman, M. A., Lushington, G. H., Schönbrunn, E. How the mutation glycine96 to alanine confers glyphosate insensitivity to 5-enolpyruvyl shikimate-3-phosphate synthase from Escherichia coli. Planta. 216 (1), 129-135 (2002).
  56. Achary, V. M. M., et al. Overexpression of improved EPSPS gene results in field level glyphosate tolerance and higher grain yield in rice. Plant Biotechnology Journal. 18 (12), 2504-2519 (2020).
  57. Huang, Z., Liu, Y., Zhang, C., Jiang, C., Huang, H., Wei, S. Molecular basis of natural tolerance to glyphosate in Convolvulus arvensis. Scientific Reports. 9 (1), 8133 (2019).
  58. Tall, T. A census analysis of the 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate (EPSP) synthase and EPSP-associated domains. , (2020).
  59. Tall, T., Puigbò, P. The glyphosate target enzyme 5-Enolpyruvyl Shikimate 3-Phosphate Synthase (EPSPS) contains several EPSPS-associated domains in fungi. ATLA Summary of Proceedings. 76 (1), 6 (2020).
  60. Puigbò, P., Guzmán, E., Romeu, A., Garcia-Vallvé, S. OPTIMIZER: a web server for optimizing the codon usage of DNA sequences. Nucleic Acids Research. 35, Web server issue 126-131 (2007).

Tags

Miljøvidenskab udgave 179
Kvantificering af den potentielle indvirkning af glyphosatbaserede produkter på mikrobiomer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mathew, S. A., Muola, A., Saikkonen, … More

Mathew, S. A., Muola, A., Saikkonen, K., Saloniemi, I., Helander, M., Puigbò, P. Quantification of the Potential Impact of Glyphosate-Based Products on Microbiomes. J. Vis. Exp. (179), e63109, doi:10.3791/63109 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter