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Bioengineering

モバイル1分子フレットプローブの自動二次元時空間解析

Published: November 23, 2021 doi: 10.3791/63124
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 1
1Institute of Applied Physics, TU Wien, 2Institute for Hygiene and Applied Immunology, Center for Pathophysiology, Infectiology and Immunology, Medical University of Vienna

Summary

本稿では、広視野蛍光顕微鏡を用いた移動式単分子フェルスター共鳴エネルギー伝達(smFRET)ベースのプローブの時空間解析方法を紹介する。新開発のソフトウェアツールキットは、正しいFRET効率や分子位置を含む移動プローブのsmFRET時間トレースを時間の関数として決定することを可能にします。

Abstract

単一分子フェルスター共鳴エネルギー伝達(smFRET)は、サブナノメートルからナノメートルの範囲の距離を報告する多目的な技術です。分子力の測定、生体分子の立体構造ダイナミクスの特徴づけ、タンパク質の細胞内共局在の観察、受容体リガンド相互作用時間の測定など、生物物理学的・分子生物学的実験の幅広い分野で使用されています。広視野顕微鏡構成では、実験は通常、表面固定化プローブを用いて行われる。ここでは、単一分子追跡と交互励起(ALEX)smFRET実験を組み合わせた方法が提示され、表面結合した、しかもガラス支持脂質二重層中の移動式プローブのsmFRET時間トレースの取得が可能となる。記録されたデータの分析のために、(i)蛍光シグナルの局在化、(ii)単粒子追跡、(iii)補正因子を含むFRET関連量の決定、(iv)smFRETトレースの厳格な検証、および(v)結果の直感的な提示を支持する自動化されたオープンソースソフトウェアコレクションが開発されました。生成されたデータは、プローブの拡散挙動の評価やFRET遷移の調査など、特殊なソフトウェアを介してさらなる探査のための入力として便利に使用できます。

Introduction

フェルスター共鳴エネルギー伝達(FRET)は、ナノメートル以下の分解能でプロセスの調査を可能にする分子生物学的および生物物理学的研究において主要な原動力となっています。ドナーとアクセプター蛍光体との間のエネルギー伝達の効率は、サブナノメートルからナノメートルの範囲における色素間距離に強く依存するため、生体分子の静的かつ動的な立体構造を探索する分光定規として有効に使用されています1,2,3,4.また、FRET現象はバルクレベル5,6で膜関連タンパク質と細胞内タンパク質の共局在化研究に広く用いられている。過去20年間で、この方法はsmFRETイベントを監視するために適応され、時間的および空間的分解能を大幅に増加させ、異種サンプル中のまれな亜集団でさえも解決しました。これらの技術を備えた、RNAポリメラーゼII8の転写処理率、DNAポリメラーゼ9,10の複製速度、ヌクレオソーム転座率11、組み立てられたスプリセソーム12の転写スプライシングおよび失速速度、リボソーム亜集団13の活性、およびkinininモータの歩行速度などの分子機械のダイナミクスにユニークな洞察を得たを挙に、いくつか名前を付けます。受容体リガンド相互作用持続時間15及び分子力16が定量化されている。

強度ベースのsmFRET研究は、通常、FRET効率を測定するために感作発光に依存しています:放出経路のビームスプリッターは、ドナー励起時にドナーとアクセプター蛍光体から発生する光を空間的に分離し、個々の蛍光強度の定量化を可能にします。その後、効率は、総フォトン数17に対してアクセクターによって放出される光子の割合として計算することができる。また、ドナー励起(ALEX)に続くアクセクサ励起は、FRET事象のストイチオメトリーの測定を可能にし、例えば、光漂白されたアクセクターフルオロフォア18を特徴とするプローブから生じる信号からの真の低FRET信号間の識別を助ける。

単一分子FRET実験は、一般的に2つの方法のいずれかで行われます。まず、サンプル体積の小さな領域を共焦点顕微鏡を用いて照光する。溶液中の単一のプローブ分子は、焦点体積内で拡散する場合に励起されます。この技術により、高速光子計数検出器を使用して、マイクロ秒以下の時間分解能を可能にします。第二に、プローブは表面に特異的に固定化され、広視野顕微鏡を介して監視され、多くの場合、バックグラウンド蛍光を最小限に抑えるために全内部反射(TIR)構成を使用する。プローブの固定化により、最初のアプローチを使用する場合よりもはるかに長い記録時間が可能になります。さらに、視野が大きいほど、複数のプローブを並列で監視できます。カメラの必要性は、この方法は、上記の方法と比較して遅くなります。時間の解像度は、ミリ秒から 2 番目の範囲に制限されます。

長い時間のトレースが必要な場合、例えば、ミリ秒から秒の時間スケールで動的プロセスを研究するために、蛍光バーストは通常短すぎるため、最初の方法は適用されません。第2のアプローチは、例えば細胞膜内に拡散するプローブを特徴とする生細胞実験において、固定化が実現不可能な場合には失敗する。さらに、生体モデルシステムは接触したsurface16の移動度に応じてその応答を劇的に変化させることができることが観察されている。

SmFRETと単粒子追跡実験を組み合わせて、モバイルFRETプローブを記録する実験が過去19回に行われてきたが、データの評価に公的に利用可能なソフトウェアはない。これにより、smFRET効率やストイチオメトリー、サブピクセル精度の位置、時間の関数としての蛍光強度など、移動式蛍光プローブの複数の特性を決定できる新しい分析プラットフォームの開発が促されました。段階的な漂白挙動、近傍距離、発光強度、およびその他の形質を調べることによって得られた痕跡をフィルタリングする方法を確立し、正しく合成され、機能的な単一プローブ分子を排他的に選択した。ソフトウェアはまた、信頼性の高い、定量的なsmFRET data17を生成するために、最近の多実験室研究で合意された実験的および分析的な技術をサポートしています。特に、この実装は、FRET効率と量イチオメトリーの計算のための検証済みの手順に従います。ドナー発光チャネルIDDおよびアクセプタ排出チャネルIDAにおけるドナー励起時の蛍光強度は、Eq(1)を用いた見かけのFRET効率効率の計算に使用される。

Equation 1 (1)

アクセクサ励起IAA時のアクセクサ発光チャネルにおける蛍光強度の助けを借りて、Eq(2)を用いて見かけのストイチオメトリーを計算する。

Equation 2 (2)

FRET効率とストイチオメトリーSは、4つの補正因子を考慮することで、EappとSappから導き出すことができます。

Equation 3

αは、アクセプター発光チャネルへのドナー蛍光の漏出を記述し、ドナー蛍光HORAのみを含むサンプルを使用して、またはアクセプターが漂白された軌道の一部を分析することによって決定することができる。δは、ドナー励起光源によるアクセプタの直接励起を補正し、アクセプタ蛍光色素のみを含むサンプルを使用するか、ドナーが漂白された軌道の一部を分析することによって測定することができる。

Equation 4.

γは、ドナーとアクセプターの放出チャネルの発散検出効率とフルオロフォアの異なる量子効率を是正するためにIDDをスケーリングします。この係数は、高いFRET効率20の軌道におけるアクソシドール漂白時のドナー強度の増加を分析するか、または複数の離散FRET状態を特徴とするサンプルを研究することによって計算することができる。

Equation 5

βは、ドナーとアクセクサの励起の異なる効率を修正するためにIAAをスケーリングします。γがアクサンパクサ漂白分析によって決定された場合、βは、既知のドナー間受け入れ子比21のサンプルから計算することができる。それ以外の場合、マルチステート FRET サンプルもβを生成します。

一緒に、補正は、Eq(3)を使用して補正FRET効率の計算を可能にする。

Equation 6 (3)

そして、Eq(4)を用いて修正されたストイチオメトリー。

Equation 7 (4)

理想的には、1:1ドナー対アクセクサ比に対する修正されたストイチオメトリーは 、S = 0.5を与える。実際には、信号対雑音比が低下すると 、Sの測定値の広がりが生じ、ドナー専用信号(S = 1)およびアクセクサ専用信号(S = 0)からの差別が妨げられます。結果として得られる時間トレースは、単一分子軌道のより詳細な分析のための入力として使用して、時空間的な力プロファイル16、単一分子事象22の移動性、または異なる状態間の遷移運動論などの情報を得ることができる1。

以下のプロトコルは、smFRET追跡実験の実験パラメータと手順、および新しく開発されたソフトウェアスイートを用いたデータ解析の動作原理について説明します。実験データの取得には、以下の要件を満たす顕微鏡のセットアップを使用することをお勧めします: i) 単一色素分子の放出を検出する能力;ii) 広視野照明: 特にライブセル実験では、全内部反射(TIR23,24,25)構成が推奨されます。iii)ドナーとアクセプター蛍光が同じカメラチップ25または異なるカメラの異なる領域に投影されるような波長に応じた発光光の空間的分離。iv)ドナーおよびアクセプター励起の光源の変調をミリ秒の精度で、例えば、直接変調可能なレーザーまたはアクロス視変調器を介した変調を使用する。これにより、ストロボスコープ照明は、蛍光色素の光の漂白を最小限に抑えるだけでなく、色素数を決定するために交互に興奮を可能にします。v) PIMS Python パッケージ26で読み取ることができる形式で記録された画像シーケンスごとに 1 つのファイルの出力。特に、複数ページの TIFF ファイルがサポートされています。

Protocol

1. ソフトウェアの前提条件

  1. ミニコンダの Python ディストリビューション27 (最小必要な Python バージョン: 3.7) をインストールします。
  2. Windowsのスタートメニューでアナコンダのプロンプトを開くか、ターミナルを開き、LinuxまたはmacOSを使用している場合 はcondaアクティベートを 実行します。
  3. 次のコマンドを実行して、コミュニティー 保守の conda-forge パッケージ・リポジトリー28 を使用可能にします。
    コンダ構成 -- チャンネルコンダフォージを追加する
    コンダ構成 --設定channel_priority厳密
    コンダアップデート --すべて
  4. 次のコマンドを実行して、必要な Python パッケージをインストールします。
    conda インストール opencv トラックピー lmfit ipympl サイキット学習 pyqt sdt-pythonジュピターラボ
  5. 解析ソフトウェアのユーザーインターフェイスである JupyterLabに慣れ親しみます(ソフトウェアのマニュアル29を参照)。
  6. Git バージョン管理システムをインストールし、後で分析ソフトウェアのダウンロードと更新に使用します。Linux を使用している場合は、ディストリビューションのパッケージ管理ソフトウェアを使用してダウンロードおよび更新します。それ以外の場合は、次のコマンドを実行します。
    コンダインストールギット
  7. 必要に応じて、解析中にステップをフィルタリングした後にデータセットを表示するサイドカー Python パッケージをインストールします。
    コンダインストールサイドカー

2. サンプルの測定

Figure 1
図1:画像取得。 (A) 励起シーケンス。405 nmレーザーを使用して色素ロードされたセルの任意画像を記録した後、ドナーとアクセプターは、それぞれ532 nmおよび640 nmレーザーを使用して照明時間のtillのために交互かつ繰り返し励起されます。ドナーとアクソクター励起の間の時間trは、カメラによる画像の読み出しを可能にするのに十分な長さでなければなりません。遅延時間のtdelayを使用して、取得フレームレートを調整し、従って、光漂白前の観察時間を調整することができます。このパネルは16から変更されます。(B) フィデューシャルマーカーは、2 つの放出チャネル間の座標変換の計算に使用されます。一致する受託者は色で示されます。いくつかのシフト画像は、視野全体がカバーされていることを確認するために記録する必要があります。(C) フラットフィールド補正用のレーザープロファイルは、密に標識されたサンプルを使用して記録されます。アクシビタープロファイルは記録され、その後ドナープロファイルの取得が続きます。サンプルの不完全性(例えば、画像の中央上部の明るいスポット)の影響を軽減するために、複数の画像を異なるサンプル領域で撮影し、平均化し、平滑化する必要があります。(D) Cに記載されている20のレーザープロファイルから計算されたフラットフィールド補正マップp(x,y)略語: FRET = フェルスター共鳴エネルギー伝達;ImDD = ドナー励起時のドナー放出画像;ImDA = ドナー励起時のアクソクエンサ放出画像ImAA = ドナー励起時のアクソクサ放出画像。スケールバー= 5 μm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

  1. 電子乗算電荷結合デバイス(EMCCD)カメラを使用する場合、EMゲインが高い信号対雑音比で単分子信号を観測できるようにします(メーカーの指示を参照)。
  2. 励起シーケンス(詳細は 図1A を参照)。
    1. 必要に応じて、セグメンテーション用の画像を記録し、データ分析を視野内の特定の領域に限定します。例えば、405 nmレーザーを使用してFura-2ロードされた細胞を励起し、510 nm前後の放出を捕捉して、細胞とサポートされる脂質二重層(SLB)の間の界縁部にあるプローブのみを評価します。その結果、時間 tr がカメラの読み出しを許可するのを待ちます。
      メモ: EMCCDカメラでは、trは選択した対象地域(ROI)の行数によって異なります。したがって、小さい ROI を選択すると、フレーム間の遅延と記録されたデータのサイズが減少するため、有利です。さらに、フレーム転送モードを有効にすると、tr をさらに削減できます。
    2. 交互にドナーとアクセプターフルオロフォアを繰り返し励起する。
      1. ドナーに照度の高さ(通常は5~10 msはモーションブラーを避けるほど短い)を励起し、同時にカメラをトリガーします。
      2. 時間 tr がカメラの読み出しを許可するのを待ちます。
      3. カメラをトリガーしながらアクシプレクターを励まします。
      4. 時間の遅延を待ちます。
        注: これは、カメラによる読み出しを有効にするには tr よりも長くする必要がありますが、それ以外の場合は任意に選択することができます。時間の解決とトレースの長さの要件のバランスをとるものとします。
      5. ステップ 2.2.2.1 - 2.2.2.4 を繰り返します。視野内のプローブあたり少なくとも1つの蛍光色素の光化を確実にするのに十分な大きさの繰り返し数を選択し、凝集体からの単一分子シグナルの識別に対する段階的な光漂白分析を可能にします。
        注:適切な 高音色と励起レーザー強度を選択するには、一般的に何らかの実験が必要です:照明時間が長く、レーザー強度が高いほど、結果の画像の信号対雑音比が優れていますが、結果の時間トレースは短くなります。
  3. 各サンプルに十分な数のムービーを記録します。

3. 補正係数の決定のための追加測定

  1. 画像登録のために両方の放出チャネルに表示される一連のランダムに配置された受託マーカーを記録します(すなわち、ドナー放出チャネルの座標をアクセプタの放出チャネルにマッピングする変換を見つける。 図 1B を参照してください。
    注:画像の登録はソフトウェアによって行われます。ステップ 6.1.4 を参照してください。
  2. フラットフィールド補正用のドナーとアクセクサ励起光源の両方の強度プロファイルを測定します(すなわち、視野全体で不均一な励起を補正します)。この目的のために、FRETプローブの高密度を特徴とするサンプルを調製し、最初にアクセクサ励起時に画像を取得し、続いて受理者のフォトブロイチ化とその後のドナー励起時の画像の記録を取得します。安定性を高めるには、異なるサンプル領域で数回繰り返します。図 1C,D を参照してください。あるいは、ドナー分子のみで装飾されたサンプルと、アクセプターフルオロフォアだけで飾られた2番目のサンプルを記録します。
    注: フラットフィールド補正は解析ソフトウェアによって行われます。ステップ 8.1.2 を参照してください。
  3. アクセプター蛍光機を使わないプローブの単分子サンプル(セクション2など)を記録し、アクセプターチャネルに漏れるドナー放出を判定します。
    注:ドナー漏れは、アクセクサの漂白後の実際のプローブの時間トレースから計算することもできます。このようなイベントの十分な数が記録されている場合、追加の測定は必要ありません。どちらのオプションも解析ソフトウェアでサポートされています。 補足情報、セクション 3.15 を参照してください。
  4. ドナー励起光源による直接アクセクター励起の定量化のためのドナー蛍光色素を含まないプローブの記録を取得する。
    注:直接アクセクサ励起はまた、ドナーの漂白後の実際のプローブの時間トレースから導き出すことができます。このようなイベントの十分な数が記録されている場合、追加の測定は必要ありません。どちらのオプションも解析ソフトウェアでサポートされています。 補足情報、セクション 3.15 を参照してください。
  5. ドナーとアクソクサの放出チャネルの異なる検出効率と色素の量子収率の異点を修正するために、2つの異なるFRET効率を特徴とする単一分子サンプルを記録します。
    注: このようなサンプルは、例えば、2つの立体構造間で変動するHolliday junctions1、または異なる明確な距離にFRETペアが取り付けられたDNA棒である可能性があります。プローブが高く、十分に一定のFRET効率を備えている場合、補正はプローブの時間トレースのアクセクサまたは漂白イベントから計算することもできます。どちらのオプションも解析ソフトウェアでサポートされています。 補足情報、セクション 3.15 を参照してください。

4. 単一分子局在化アルゴリズム

注: いくつかの分析ステップでは、単一分子の局在化が必要です。信号密度、背景、および信号対雑音比に応じて、ガウスフィッティングアルゴリズム30 と中心質量計算31のどちらかを選択します。

  1. ガウスフィッティングを実行するには、それぞれのユーザーインターフェイスを介して3D-DAOSTORM30アルゴリズムを選択します。
    注: 3D-DAOSTORM は、重なり合う点広がり関数を持つ偶数信号を区別するように設計されています。これは一般的に利点ですが、単一の明るい信号は、時折2つの隣接する信号として識別され、追跡アルゴリズムを混乱させ、単一の長い軌道ではなく2つの短い軌道を検出する可能性があります。
    次のパラメータを設定します(詳細については、アルゴリズムの実装を提供する sdt-python library32のドキュメントを参照してください)。
    1. 半径: ガウスフィット関数の初期σ値をピクセル単位で設定します(有効ピクセルサイズに応じて)。
    2. しきい値: ローカルの強度の最大値を調整するために、最小振幅(つまり、最も明るいピクセル値、推定ローカル背景に対して修正)を設定します。
      注: しきい値は、おそらく最も重要なパラメータです。設定が低すぎると、ノイズが蛍光信号とみなされ、明るい信号には2つのガウスが合う場合があります。設定が高すぎると、薄暗い信号が合わない。
    3. モデル: 円形ガウスに合わせて 2d に設定します。
      注: 他のモデルは smFRET データには適用されません。
    4. フィルターを見つける:低信号対雑音比の状況で役立つノイズを低減するために、ローカルの最大値を見つける前にフィルタを適用します。これは i) ID で指定できます。ii) クロッカー・グリア: クロッカー・グリアアルゴリズムからのバンドパスフィルター31,33;または iii) ガウス: シグマ パラメータで設定されたσを持つガウス ブラー。
      注意:クロッカー・グリアの場合、 feat.size パラメータは、ポイントスプレッド関数の半径(ピクセル単位)にする必要があります。
      注: 継ぎ手は、フィルタ処理されていない生データを使用して実行されます。
    5. 最小距離: 1 つのガウス単位で最小距離ピクセルで区切られた 2 つの見込みシグナルを適合させます。
      注: これは、明るい信号が 2 つの隣接する信号として誤って検出される前述のシナリオで役立ちます。
    6. サイズ範囲:ノイズによるスプリアス信号から検出を除去するために、フィットの最小および最大σを選択します。
  2. 質量の中心計算(クロッカーとグリアのidea33に基づく洗練されたアルゴリズム31)を実行するために、それぞれのユーザーインターフェイスを介してクロッカー・グリアアルゴリズムを選択します。
    注:このアルゴリズムは、低信号対雑音のシナリオでも非常に堅牢で、強度の範囲を特徴とする信号を扱う際に、重なり合う点広がり関数を持つ分子に正確に適合することはできません。
    1. 半径: ポイントスプレッド関数全体を含めるのに十分な大きさのディスクの半径(ピクセル単位)を設定します。
    2. シグナルスレッシュ:解析する局所強度の最大値の最小振幅(推定背景を上回る最も明るいピクセル)を設定します。
      注:設定が低すぎると、ノイズが蛍光信号と見なされることがあります。設定が高すぎると、薄暗い信号が合わない。
    3. 質量のスレッシュ:解析する信号の最小合計強度(背景補正ピクセル値の合計)を設定します。
      注: 上記と同じ考慮事項が適用されます。

5. ソフトウェアの初期化

  1. 分析スクリプトをダウンロードします。 Anaconda プロンプトで、( cd コマンドを使用して) 分析を保存するフォルダーに移動し、
    git クローン https://github.com/schuetzgroup/fret-analysis.git ターゲットフォルダ
    1. ターゲット フォルダーを 2021-06-FRET-実験などの説明的な名前14_Force置き換えます。
      注: 解析ソフトウェアは、このフォルダに入ります。このフォルダがあらかじめ存在していないことを確認してください。各実験の解析スクリプトのコピーをダウンロードすることをお勧めします。この方法では、後で解析を再検討し、使用されたパラメータを呼び戻して変更を行うことができます。
  2. ジュピターノートブックをコピーする(01.トラッキング.ipynb, 02.分析.イピンブ、03。新しく作成されたフォルダに plots.ipynb) (それ以降はルート フォルダと呼ばれます)。初めてソフトウェアを使用する場合は、ルート フォルダの notebooks サブフォルダから取得します。
    注: 類似したデータセットが既に解析されている場合は、パラメータがわずかに変更されている可能性があるため、以前の実験からノートブックをコピーすると便利です。
  3. Anaconda プロンプトで次のコマンドを実行して、JupyterLab を表示する Web ブラウザー ウィンドウを開いて JupyterLab サーバーを起動します。
    ジュピターラボ
    注: ブラウザはインターフェイスのみで、 Anaconda プロンプトで実行されているプロセスは実際の作業を行っています。その結果、ブラウザウィンドウを閉じる効果は最小限に抑えられます。セッションは、http://localhost:8888 にアクセスすることで復元できます 。 ただし、プロンプトで JupyterLab プロセスを中断するか、プロンプトを閉じると、解析が終了し、保存されていない作業が失われます。
  4. JupyterLab ブラウザ ウィンドウで、左側のペインを使用して ルート フォルダに移動します。 01. Tracking.ipynb をダブルクリックして、最初のノートブックを起動します。起動後、Python コードのボックス(いわゆるセル)を表示する新しいタブを探します。
    注: Jupyter ノートブックには、各コード セルの機能を説明するコメントが含まれています。さらに、すべてのメソッド呼び出しのドキュメントは、テキストカーソルを開く直前に置いて 表示することができます ( および Shift + Tab キーを押します)。
  5. データ分析プロセスの概要については、 図 2 を参照してください。

Figure 2
図 2: 一般的な分析パイプラインの概要 フィルタリング手順は、実験計画に従って適応される可能性があることに注意してください。この図は 16から修正されます。略語: FRET = フェルスター共鳴エネルギー伝達 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

注:ソフトウェアを試すサンプルデータは、https://github.com/schuetzgroup/fret-analysis/releases/tag/example_files からダウンロードすることができます

6. 単一分子の局在、追跡、蛍光強度分析(01.トラッキング.イピンブ)。

  1. を使用する 01. トラッキング.イピンブ 正確な定量化に合わせた単一分子信号の蛍光強度値の信頼性分析のためのジュピターノートブック、特にFRET測定で頻繁に発生する微弱な信号(例えば、高FRETイベントでのドナー信号の低さ、およびその逆など)に合わせた。
    注: このため、生データのピクセル強度とローカル背景の補正を直接統合することが実装されています。各分析ステップのスクリーンショットと関数呼び出しパラメータの説明については、 補足情報.
    1. 照射シーケンスを指定して、ドナーとアクセプター励起フレームの選択、および記録された画像シーケンスからのイメージセグメンテーション用のフレームを選択できます。
      注:ソフトウェアは、任意の照明プロトコルで記録されたデータの処理を可能にするので、フッ素の種類をエキサイティングにしながら、画像シーケンス内のどのフレームが取得されたかを示す必要があります。 補足情報、セクション 1.2、ステップ 3 を参照してください。元のイメージ シーケンスのフレーム番号は保持されます。
    2. データセットの説明と読み込み。同じイルミネーション設定を使用して記録されている場合は、複数のデータセットを一度に解析します。各データセットに、それぞれのイメージ シーケンス ファイル名に一致する識別子とパターンを割り当てます。また、画像登録用の受託者マーカーの記録、フラットフィールド補正用の励起光プロファイル、オプションでドナー専用サンプルおよびアクセプタ専用サンプルなど、特別な目的に特化したデータセットを定義して、補正係数を決定します。
    3. 両方のチャンネルが 1 つのカメラを使用して記録された場合は、生画像で放出チャネルを選択します。このためには、適切なグラフィカルウィジェットを使用して、ドナーとアクセクサの排出に適した領域を選択します。
    4. 両方の放出チャネルで受託マーカーをローカライズし、画像登録を行います。提供されたユーザーインターフェイスを使用して、ドナーとアクセクターの排出チャネルの両方に対するローカリゼーションアルゴリズムの適切なパラメータを見つけます。サポートされるローカリゼーション アルゴリズムについては、セクション 4 を参照してください。
      注: ランダムに分布した受託者マーカーは、近傍の空間分布によって放出チャネルを越えて識別できます(図 1B)。sdt-Pythonライブラリで選択的平面照明microscopy34のために提案されたアルゴリズムのカスタム実装は、ドナー放出チャネル内の各マーカーの位置をアクセクサ放出チャネル内の位置と自動的に一致させる。ドナー放出チャネルの座標をアクセプタ放出チャネルの座標にマッピングする変換 T は、アフィン変換の線形最小二乗フィットを介してマーカーの位置35に適合する。RANSAC は、前のステップの位置が間違って一致したなどの外れ値を考慮するために使用されます。
    5. すべてのフレームでドナーとアクセプタ励起を個別に FRET プローブにローカライズし、元のフレーム番号、2 次元座標、およびソース イメージ ファイルを参照する識別子を含む 1 つのテーブルに結果をマージします。
      注: この目的のために、ソフトウェアはローカリゼーション アルゴリズムに適切なオプションを見つけるためにユーザー インターフェイスを提供します。
      1. ドナー発光ImDDおよびアクセプターエミッションImDAから得られた画像の合計でドナー励起時にFRETプローブを局地化し、FRET効率にほとんど依存しない。ローカリゼーションアルゴリズムのオプションについては、セクション4を参照してください。
        注: 各合計画像は、以前に画像登録から取得し、ピクセル単位で ImDA に追加された変換 T を使用して ImDD を変換することによって計算されます。
      2. アクセクサ放出チャネル ImAA でアクセクサ励起時にプローブをローカリゼーションします(ローカリゼーションアルゴリズムの詳細については、セクション 4 を参照)。
    6. トラッキングと蛍光強度測定を行います。

Figure 3
図3:単一分子強度測定。 (A) オレンジ色のピクセルに位置するフルオロフォアの場合、その補正されていない強度Iuncorrは、信号の影響を受けるすべてのピクセルをカバーするのに十分な大きさのディスク(黄色とオレンジ色のピクセル)内のすべてのピクセルの強度を合計することによって決定されます。 Equation 9ローカル背景は、円盤の周囲のリング(青いピクセル)のピクセルの平均として計算されます。 Equation 10蛍光強度Iは、補正されていない強度から背景を差し引いた結果であり、I=Iuncorr - b ×ndisk、ndiskはディスク内のピクセル数である。円の半径は、トラッキング方法のfeat_radiusパラメータを使用して指定します。リングの幅は、bg_frameパラメータによって指定されます。ある信号のポイントスプレッド関数が別の(下部パネル)のバックグラウンドリングと重なる場合、影響を受けるピクセル(赤)はローカルバックグラウンド解析から除外されます。2つの点広がり関数が重なっている場合、蛍光強度は確実に計算できないため廃棄されます。(B、C)シミュレーションでは、1ピクセルの標準偏差を持つガウスブラーを適用すると、低蛍光強度(B)で信号対雑音比が2に近い倍数まで向上し、誤差(わずかな推定値1%未満、(C)16)がほとんど発生しないことがわかります。さらに、相対的誤差(すなわち、Itruthが地上真理であり、イメアスが分析の結果である)の相対的誤差(すなわちImeas - Itruth)/Itruthは、全体の強度範囲にわたって一定であり、FRET効率およびストイチオメトリなどの比量のためにキャンセルされる。すべてのプロットは、以前に公開された work16 に基づいています。略語: SNR = 信号対雑音比;FRET = フェルスター共鳴エネルギー伝達この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

  1. FRET プローブのローカリゼーションを軌道にリンクするために使用される trackpy36 アルゴリズムに対して適切なオプションを選択します。特に、1つのフレームから次のフレームまでの最大検索距離と、シグナルが検出されない連続フレームの数を設定します。
    注: これらのギャップは、前の位置と後の位置の間の補間によって埋められます。これらの補間された位置はマークされ、後で強度値を読み出すためだけに使用されますが、拡散解析には使用されません。トラックはアクサクタの放出チャネルの座標系で解析されます。蛍光強度解析(ステップ6.1.6.2)では、画像登録を介して得られた逆変換T-1を用いて、さらにトラッキングがドナー放出チャネルの座標系に変換される(ステップ6.1.4参照)。
  2. 蛍光強度計算アルゴリズムのオプションを選択します(詳細は 図3A を参照)。i) 信号の位置を中心にした場合に、その信号の影響を受けるすべてのピクセルを含むディスクの半径を指定し、ii) ローカル背景を決定するために使用する各ディスクの周囲のリングの幅を指定します。
    注: 取得した強度測定でノイズを低減するために、標準偏差が 1 ピクセルのガウス ブラーが画像に適用されます(図 3B、C)。
  1. 解析ソフトウェア機能を使用して、イメージシーケンスからの補助画像データを処理します。
    1. セグメンテーションを容易にするために記録された追加の画像を抽出します(励起 シーケンスの s でマークされたステップ 2.2.1 を参照してください( 補足情報、セクション 1.2、ステップ 3 を参照)。
    2. 密にラベル付けされたサンプルに記録された画像から、視野全体でドナーとアクセクサ励起光プロファイルを決定します(ステップ3.2を参照)。
      注: ピクセル単位の平均値は、画像から計算され、ライト プロファイルが計算されます。カメラのベースラインが減算されます。画像は、サンプル不純物による効果を低減するためにガウスフィルターを使用してぼやけています。最後に、結果の画像は、プロファイル p(x,y) マッピング座標を間隔 [0,1] に取得するために、その最大値でピクセル単位で分割されます。

7. FRET軌道の可視化(オプション)

  1. インスペクターアプリケーションを使用して、生画像データと対応する蛍光強度と明らかなFRET効率とストイチオメトリーに単一分子トラックを表示します。
    注: これは、選択したパラメータの有効性を評価し、個々の時間トレースを手動で受け入れるか拒否する貴重なツールです。スクリーンショットと詳細な使用状況情報については、「 補足情報 」を参照してください。

8. 単一分子データの分析とフィルタリング (02.分析.イピンブ)

  1. を使用する 02. 分析.ipynbジュピター を介して得られた単一分子データの分析およびフィルタリングのためのノート 01. トラッキング.イピンブ ノートパソコン。一般的な分析パイプラインについては、以下の手順を参照してください。
    注: 科学的な質問や実験計画の違いによって、設定の調整が必要になる場合があります。Jupyter ノートブックを使用すると、分析ステップを省略、並べ替え、修正することで、簡単に適応できます。各分析ステップのスクリーンショットと関数呼び出しパラメータの説明については、 補足情報.
    1. 初期フィルタ処理の手順を実行します。
      1. 重なり合うポイントスプレッドを持つ信号は、それらの蛍光強度を確実に決定することが困難であるため、機能を破棄します。
      2. 不均一な照明の場合、良好な信号対雑音比を確保するために、視野内の明照領域に位置する信号のみを受け入れます。
      3. 分子内FRETを研究する場合、画像シーケンスの最初から存在する軌跡に解析を制限して、すべての漂白ステップが記録され、段階的な光漂白解析の後で適切に評価されるようにします。
        注:分子間FRETプローブを用いて実験を行う場合、ドナーとアクセプター蛍光体は、事前形成された複合体の一部ではないが、最初に存在する軌道に分析を制限することは不可能である。
    2. ステップ6.1.7.2で得られた励起光源プロファイルを使用して、不均一な照明に起因する位置依存蛍光強度変動を逆にするフラットフィールド補正を実行します。
      注: 位置(x,y)のプローブの蛍光強度I(x,y)は、図1C,Dを介してEquation 8補正されます。
    3. 見かけのFRET効率効率(すなわち、ドナー蛍光機からアクセプター蛍光関数に伝達されるエネルギーの割合)および見かけのストイチオメトリーSapp(すなわち、ドナー蛍光体の数を回折限スポット内のフルオロフォアの総数で割った値)を計算する。
      注:各データポイントに対してE対Sをプロットすることにより、stoichiometry18の変化による変化によるドナーアクセプトの距離の変化による測定されたFRET効率の変化を区別することが可能です。これにより、アクティブなアクセクターがないため、E = 0 からの仕分けによる E = 0 の間の分化が可能になります。E-S プロットは、品質評価のためのツールとして解析全体を通して使用されます。例として図 4 を参照してください。
    4. 単一分子プローブと凝集体の識別に対する光漂白の段階的分析を行います。次のいずれかのオプションを選択します。
      注:この目的のために、解析ソフトウェアは、ドナー励起(IDD +IDA)およびアクソクサ励起(IAA)時の蛍光強度に、変更点検出アルゴリズムPELT37のカスタム実装32を個別に適用する。
      1. 選択肢1を選択し、受付者が部分的な漂白を示さない間、アクセクサフルオロフォア漂白を一段階で選択します(すなわち、非ゼロ強度への漂白ステップはありません)。
        注:このオプションは、ドナーがアクセクサの前に漂白する軌道を一歩で拒否します。オプション 1 は、アクソクエーターのフォトブリーチングレートが高い場合に推奨される選択肢です。
      2. オプション2を選択し、ドナーは部分的なアクセクサまたは漂白がない間、一歩で漂白する。
        注:このオプションは、ドナーがアクセクサの後に漂白する軌道を一歩で拒否します。オプション 2 は、高いドナーフォトブリーチング率の場合に推奨される選択肢です。
      3. オプション3を選択し、どちらかのフルオロフォア漂白剤を一段階で、もう一方は部分的に漂白しない。
        注: オプション 3 はオプション 1 と 2 よりも高い柔軟性を提供し、データ分析の推奨設定になります。
      4. ドナーとアクセプター蛍光HOREがシングルステップの光漂白または全く光漂白を示さないオプション4を選択してください。
        注: オプション 4 は、フォトブリーチレートが低い場合に推奨されます。
    5. アクサメーサチャネルαへのドナー排出漏出の補正係数、アクソクサ励起δ、検出効率γ、励起効率β 17を計算します。
    6. 補正係数を使用して、見かけの効率からFRET効率効率を計算し、見かけのストイチオメトリーSappからストイチオメトリーSを計算します。
    7. さらにフィルタリング手順を実行します。各軌道の最初の漂白イベントの前のデータポイントのみを選択します。さらに、0.35< S <を満たすデータポイントの少なくとも75%の軌道のみを受け入れ、解析を単一分子プローブに制限します(数値は調整可能)。
      注: 対象の人口と分析から除外される人口の広がりに応じて上限と下限を選択する必要があります (例: ドナーのみおよびアクセクサのみの集団)。経験に基づいて、0.35< S < 0.6は多くの実験状況に適した選択であることが判明しました。
    8. グローバルまたは適応型の閾値処理方法35 を使用して、適切な補助画像(ステップ2.2.1および6.1.7を参照)を使用して画像セグメンテーションを実行し、分析を視野内の異なる領域に制限します。
      注: たとえば、セル SLB インターフェイスまたはパターン構造にあるプローブの排他的な評価が可能です。

9. 結果のプロットとさらなる分析 (03.プロット.イピンブ)

注: Jupyter ノートブックのスクリーンショットと関数呼び出しパラメーターの説明については、 補足情報を 参照してください。

  1. E-S プロットを作成して、誤ったストイチオメトリーの信号が正しく識別され、削除されたことを確認します。
  2. FRET効率のヒストグラムをプロットして、FRET効率分布の確立された概要を提供します。ヒストグラムをグループ化して、異なる実験の結果を簡単に比較します。
  3. 科学的なPythonライブラリを利用して、ノートブック内のデータをさらに評価する(例えば、拡散解析、FRET効率の変換、分子力センサを用いた実験における力や遷移解析)
    注: データは、他の解析ソフトウェアへの入力として、多くのファイル形式でエクスポートすることもできます。

Representative Results

実験の科学的な問題に応じて、smFRETトラックから様々な低レベルおよび高レベル情報を抽出することができます。ここでは、アナログおよびデジタルプローブを用いた分析パイプラインの例を示す:ペプチドベースの分子力センサ16 とそのコンフォメーション38の確率的切り替えを有するDNAプローブをそれぞれ紹介する。これらのプローブの設計と動作原理については 、図5 を参照してください。

ローカリゼーションとトラッキングアルゴリズムがプロトコルで説明されているように実行された後、パッケージは、初期パラメータとその後のフィルタステップを最適化するための複数のデータ可視化ツールを提供します:(i)個々のsmFRETイベントの視覚化、(ii)関心のある特定の領域のデータを分析するためのオプションの画像セグメンテーション、(iii)FRET効率対ストイチオメトリー(E-S)プロットを介したフィルタステップの監視。単一分子データの視覚化を 図6に示します。

最後に、フィルタされたFRETイベントは、E-SプロットとFRET効率ヒストグラムで表されます(図4)。E-Sプロットは、前述のフィルタリングステップを最適化し、最終結果を調査するのに便利なツールです。部分的に漂白されたまたは不完全に標識されたFRETセンサーは、その量化測定値によって除外することができる。移動度パラメータは、 x-y プロット(図6)または平均二乗変位(MSD)プロット(図4)で個々の軌道パスをプロットすることによって調査できます。最初の方法は、固定化されたイベントからモバイルを識別するのに特に有用であり、後者は拡散係数を計算するために使用されます。

Figure 4
図4:例示的な出力。 (A) FRET効率は、ガラス支持脂質二重層を飾り、T細胞で張る分子力センサ(左パネル)の集団に対して、ストイチオメトリー(E-Sプロット)に対してプロットされる。1 つの人口クラウドのみが表示されます。FRET効率のそれぞれのヒストグラムは、細胞の存在と不在における力センサー集団の差を例示する(中間パネル)。T細胞存在下でのセンサ集団のFRET効率低下へのシフトは認められないが、センサモジュールの力依存性の伸張はほとんどない。これらの実験条件のMSDプロットは、T細胞の下の力センサー集団が、非連結の対応物(右パネル)よりもかなり遅く動くということを確認する。(B)同じ分析を、ガラス支持の液体脂質二重層を飾るホリデイ接合DNAセンサーで行った。E-Sプロットは、FRET効率ヒストグラムでも明らかな2つの集団を明確に示しています。MSD プロットは、1 つの高速移動センサーの母集団の存在を示します。略語: FRET = フェルスター共鳴エネルギー伝達;MSD = 平均平方変位。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 5
図5:分子内FRETプローブの設計と動作原理(A)機械的分子力の定量のためのアナログペプチドセンサー。ドナーおよびアクセプター蛍光HOREは、ペプチド骨格の両端に共有結合される。このセンサーモジュールは、特定のリガンドに部位特異的に結合され、これは、目的の細胞内表面受容体(ここでは、T細胞受容体のβ鎖を特異的に認識する抗体断片)に結合する。受容体リガンド結合時に力が発揮され、センサーモジュールが伸び、最終的には結合切断後に反動する。このパネルは16から変更されます。(B) FRET遷移の定量を行うデジタルDNAセンサーFRETセンサーは、ホリデイ接合部を形成する4本のDNA鎖で構成されています。ドナーとアクセクサ蛍光相は2本の鎖に共有結合する。ホリデイジャンクションは、周囲のバッファー条件に応じて、それらの立体構造を頻繁に切り替えます。これらの立体構造の確率的切換えは、個々のプローブのFRET効率を定量することによって監視することができる。略語: TCR = T細胞受容体;FRET = フェルスター共鳴エネルギー伝達この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 6
図6:FRETプローブのローカリゼーションとトラッキングの例 (A)個々の事象のFRET効率および量合体測定は、ドナー励起時のドナー蛍光色素の強度(D→D)、ドナー励起時のアクセクサ蛍光体(D→A)、およびアクセクサ励起時のアクセクターフルオロフォア(A→A)を定量することによって計算される。近傍フィルタは、近接エミッタのポイントスプレッド機能を重ねることでバイアスを防ぎます。画像のセグメンテーションにより、ユーザーは対象領域内にローカライズされた特定のsmFRETイベント(例えば、セルまたはマイクロパターン)を選択できます。画像セグメンテーションの一例として、T細胞をFura-2(左側に表示)で染色し、適応閾値を付けて細胞の縁を特定する(オレンジ色の点線)。スケールバー= 5 μm. (B) 分子力センサーを用いたsmFRET軌道。個々の軌道を x-y 平面にプロットして、拡散の挙動と局在化を視覚化することができます(左パネル)。さらに、各軌道の強度を時間をかけてプロットして、FRETの遷移または漂白ステップを特定することができます(中央のパネルは左パネルからの赤い軌道を示しています)。得られたFRET効率とストイチオメトリーも同様に可視化することができる(右パネル)。(C) ホリデイ接合DNAセンサーを用いた smFRET 軌道。HBSS + 12 mM MgCl2 は測定時にバッファとして使用した。これらの例のシーケンスの終わり近くにある見かけのアクセクサ漂白ステップとは別に、各センサのFRET遷移の頻度を決定することができる。ホリデイ接合は高周波で立体構造を切り替えますが、分子力センサはFRETトランジションを示しません。この情報により、フレーム間の遅延などの実験条件を調整し、観察される遷移の数を増減することができる。略語: FRET = フェルスター共鳴エネルギー伝達;smFRET = 単分子フレット;HBSS = ハンクのバランスの取れた塩溶液。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

補足情報:単一分子の局在化と追跡(01.Tracking.ipynb) こちらをクリックしてこのファイルをダウンロードしてください。

Discussion

この記事では、モバイルでありながら表面につながれたプローブ分子から生じるsmFRETデータの自動記録および定量分析のためのパイプラインについて詳しく説明します。これは、表面固定化プローブまたは共焦点励起ボリューム17に出入りする溶液中で拡散するプローブのいずれかを含む、smFRET実験に対する2つの主要なアプローチを補完する。それは時間の機能として正しいFRET効率および分子位置を提供する。したがって、遷移キネティクス1、FRETヒストグラム39、または2次元拡散22を定量化する特殊な分析プログラムの入力として使用することができる。

ソフトウェアは、ユーザーに無料の使用、変更、再配布の永久権利を付与するオープンソースイニシアチブによって承認された無料のオープンソースライセンスの下でリリースされます。Github は、ソフトウェアを入手し、バグを報告したり、code40 を提供することで開発プロセスに参加することを可能な限り簡単にする開発と配布プラットフォームとして選ばれました。Pythonで書かれたソフトウェアは、独自のコンポーネントに依存しません。Jupyter ノートブックをユーザー インターフェイスとして選択することで、解析の各ステップでデータの検査が容易になり、実験システム専用のパイプラインの調整と拡張が可能になります。 sdt-python library32 は、単一分子局在化、拡散解析、蛍光強度解析、カラーチャネル登録、共局在分析、ROI処理などの蛍光顕微鏡データを評価する機能を実装します。

原則として、単一粒子追跡は、1次元、2次元、または3次元システムで実行できます。ここでは、単分子分析パイプラインを2Dモバイルシステムの研究に合わせて調整しました。この選択は、平面で支持される脂質二重層(SLB)のような単純なシステムの利用可能性を反映して、移動式蛍光プローブを提示する。このような脂質二重層系は、典型的には、2つ以上のリン脂質部分から構成され、バルク分率はSLBの主要な物理化学的パラメータ(位相および粘度など)を決定し、マイナーな分画は生体分子の付着部位を提供する。これらの付着部位は、アビジンまたはストレプトアビジンベースのタンパク質プラットフォームまたはヒスチジンタグ41を有するタンパク質プラットフォーム用のニッケルNTA共役リン脂質に対するリン脂質をビオチン化することができる。SLBにタンパク質をリンクするための適切なプラットフォームの選択は、科学的な質問に依存します。読者は、成功した戦略の例については、文献16,38,42を参照することができます。サンプル内のプローブの密度は、ポイントスプレッド関数の重複を避けるために十分に低くする必要があります。通常、μm2当たり0.1分子未満が推奨されます。適切なプローブ密度を示す例については、代表的な結果セクション(特に図6)を参照してください。この分析方法は、生細胞の細胞膜に拡散する単一の蛍光標識タンパク質分子にも適用可能である。

smFRET実験の重要な側面の1つは、FRETプローブ自体の生産と特性化です。FRET ペアのフルオロフォアを選択する場合、フェルスター半径は、予想される色間距離43 と一致する必要があります。フォトブリーチに耐性のある染料は、長い時間の痕跡をもたらすので好ましい。しかし、漂白率が上昇した場合、1種のフルオロフォア種を利用して、段階的な光漂白分析を介して共局化分子から発生する多元化事象を認識することができる。プロトコルのセクションのステップ8.1.4を参照してください。フルオロフォア対は、部位特異的に、そして関心のある分子に共有結合し、分子内または分子間FRETペアを形成するべきである。

smFRETを他の容易に利用できる技術と組み合わせることで、(STED44経由で)回折限界を超えてその空間解像度を高めることができます。ここで示すsmFRETの追跡アルゴリズムは、新しい実験設定とモデルシステムへのアプローチの適用性を広げます。これには、(i)移動生体分子の化学量論における運動学的変化、(ii)移動生体分子の動的関連、(iii)自由に拡散反応物の酵素反応の速度、および(iv)移動体生体分子の立体構造変化の運動論の研究が含まれる。最初の2つの例では、分子間FRET、すなわちドナーとアクセクターが関心のある生体分子エンティティを分離するために共役していることを示すモデルシステムが必要です。後者の例は、同一分子体の中でドナーとアクセクサを運ぶバイオセンサー(分子内FRET)を利用することができる。

分子内FRETベースのセンサは、生体分子の固有の立体構造変化、内在性または外力負荷(分子力センサ16)、またはカルシウムm45やpH46などのナノ環境におけるイオン濃度に関する洞察を提供できる。.モデルシステムと好ましいアンカープラットフォームに応じて、このようなsmFRETイベントは2Dまたは3Dのいずれかで追跡することができます:(i)SmFRETイベントの平面追跡は、形質膜内の受容体リガンド相互作用時間の定量化、膜固定シグナル増幅カスケードの関連、および表面のストイチオメトリー変化に使用することができます。(ii) smFRETイベントの体積追跡は、生細胞またはインビトロ再構成システム内の任意の分子内または分子間FRETプローブに使用することができる。

SmFRETの追跡方法は、主に分子内FRETプローブを念頭に置いて開発されました。これらのプローブは、固定された既知の数の蛍光標識、凝集および誤って合成された(例えば、不完全に標識された)分子からのデータを拒絶するために利用された事実、ならびに蛍光HOREの1つが光漂白されたプローブからも利用された事実である。しかし、フィルタリングステップを調整することにより、分子間FRETプローブにも適用できる。例えば、単一のドナーと単一のアクセプターフルオロフォアを特徴とする分子のみを受け入れる代わりに、ドナーとアクセプター色素の空間的軌道を調べ、例えばドナーアクセプター軌道を共同拡散させる方法を選択することができます。

3D-DAOSTORMアルゴリズムは、放射ビーム経路の円筒レンズによる乱視による光軸に沿った信号位置を決定するサポートを持つため、3D実験を解析パイプラインに簡単に統合することができます。この場合、アクセクサ励起時のアクセクサシグナルは、索体測定と軸位置を決定するのに役立つであろう。また、解析ソフトウェアを用いて、その大規模な自動化とフィルタリング方式を利用して、固定化プローブを用いた実験データを評価することもできます。実際、ゲル相bilayer38 に固定化されたホリデイ接合部からのsmFRET効率データセットを、初期バージョンのソフトウェアを用いて解析した。

Disclosures

著者らは利益相反を宣言しない。

Acknowledgments

この研究は、オーストリア科学基金(FWF)プロジェクトP30214-N36、P32307-B、ウィーン科学技術基金(WWTF)LS13-030によって支援されました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt) (Ni-NTA-DOGS) Avanti Polar Lipids 790404P
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) Avanti Polar Lipids 850375P
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) Avanti Polar Lipids 850457P
α Plan-FLUAR 100x/1.45 oil objective Zeiss 000000-1084-514
Axio Observer microscope body Zeiss
Bandpass filter Chroma Technology Corp ET570/60m donor emission filter
Bandpass filter Chroma Technology Corp ET675/50m acceptor emission filter
conda-forge conda-forge community community-maintaned Python package repository for Anaconda/miniconda
Coverslips 60 mm x 24 mm #1.5 MENZEL
Dichroic mirror Semrock Inc FF640-FDi01-25×36 separation of donor and acceptor emission
Dichroic mirror (quad band) Semrock Inc Di01-R405/488/532/635-25×36 separation of excitation and emission light
DPBS Sigma-Aldrich D8537
FCS Sigma-Aldrich F7524 for imaging buffer
fret-analysis Schütz group at TU Wien Python package for smFRET data analysis; version 3
Fura-2 AM Thermo Fisher Scientific 11524766
HBSS Sigma-Aldrich H8264 for imaging buffer
iBeam Smart 405-S 405 nm laser Toptica Photonics AG
iXon Ultra 897 EMCCD camera Andor Technology Ltd
Lab-Tek chambers (8 wells) Thermo Fisher Scientific 177402PK for sample preparation and imaging
Millenia Prime 532 nm laser Spectra Physics
miniconda Anaconda Inc. Python 3 distribution. Min. version: 3.7
Monovalent streptavidin (plasmids for bacterial expression) Addgene 20860 & 20859
OBIS 640 nm laser Coherent Inc 1185055
Optosplit II Cairn Research
Ovalbumin Sigma-Aldrich A5253 for imaging buffer
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-002
sdt-python Schütz group at TU Wien Python library for data analysis; version 17
TetraSpek bead size kit Thermo Fisher Scientific T14792 Randomly distributed, immobilized fiducial markers for image registration
USC500TH Ultrasound bath VWR for SUV formation

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バイオエンジニアリング、問題177、
モバイル1分子フレットプローブの自動二次元時空間解析
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Schrangl, L., Göhring, J., Kellner, F., Huppa, J. B., Schütz, G. J. Automated Two-dimensional Spatiotemporal Analysis of Mobile Single-molecule FRET Probes. J. Vis. Exp. (177), e63124, doi:10.3791/63124 (2021).

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