Summary
Denna artikel beskriver en väletablerad och reproducerbar lectin fläck analys för hela mount retinal preparat och protokoll som krävs för kvantitativ mätning av vaskulär parametrar ofta ändras i proliferative och icke-proliferative retinopathies.
Abstract
Retinopatier är en heterogen grupp av sjukdomar som påverkar ögats neurosensoriska vävnad. De kännetecknas av neurodegeneration, gliosis och en progressiv förändring i vaskulär funktion och struktur. Även om uppkomsten av retinopathies kännetecknas av subtila störningar i visuell uppfattning, är ändringarna i vaskulär plexus de första tecknen som upptäcks av kliniker. Frånvaron eller förekomsten av neovaskularisering avgör om retinopati klassificeras som antingen icke-proliferativ (NPDR) eller proliferativ (PDR). I den meningen försökte flera djurmodeller efterlikna specifika kärlegenskaper i varje steg för att bestämma de underliggande mekanismerna som är involverade i endotelförändringar, neuronal död och andra händelser som äger rum i näthinnan. I den här artikeln kommer vi att ge en fullständig beskrivning av de förfaranden som krävs för mätning av retinala kärlparametrar hos vuxna och tidiga födelsemöss vid postnatal dag (P)17. Vi kommer att beskriva protokollen för att utföra retinal vaskulär färgning med Isolectin GSA-IB4 i hela fästen för senare mikroskopisk visualisering. Viktiga steg för bildbehandling med Image J Fiji programvara tillhandahålls också, därför kommer läsarna att kunna mäta kärltäthet, diameter och tortuositet, vaskulär förgrening, liksom avaskådeliga och neovaskulära områden. Dessa verktyg är till stor hjälp för att utvärdera och kvantifiera vaskulär förändringar i både icke-proliferative och proliferative retinopathies.
Introduction
Ögonen närs av två arterio-venösa system: choroidal vaskulatur, ett externt vaskulär nätverk som bevattnar retinal pigmenterat epitel och fotoreceptorer; och den neuro-retinala vaskulaturen som bevattnar ganglioncellernas lager och näthinnans inre kärnskikt1. Näthinnevaskulaturen är ett organiserat nätverk av kärl som levererar näringsämnen och syre till näthinnecellerna och skördar avfallsprodukter för att säkerställa korrekt visuell signaltransduktion. Denna vaskulatur har några distinkta funktioner, inklusive: bristen på autonom innervation, reglering av vaskulär ton av inneboende retinal mekanismer och innehav av en komplex retinal-blod barriär2. Därför har retinal vaskulatur varit i fokus för många forskare som har studerat inte bara vasculogenes under utvecklingen, men också de förändringar och patologiska angiogenes som dessa fartyg genomgår i sjukdomar3. De vanligaste vaskulär förändringarna som observerats i retinopatier är kärl dilatation, neovaskularisering, förlust av vaskulär arborization och deformation av näthinnan huvudkärl, vilket gör dem mer ziggaggy4,5,6. En eller flera av de beskrivna ändringarna är de tidigaste tecknen som ska upptäckas av kliniker. Vaskulär visualisering ger en snabb, icke-invasiv och billig screeningmetod7. Den omfattande studien av de förändringar som observerats i kärlträdet kommer att avgöra om retinopatin är icke-proliferativ eller proliferativ och den fortsatta behandlingen. De icke-proliferative retinopathies kan manifestera sig med avvikande vaskulär morfologi, minskad vaskulär densitet, acellulära kapillärer, pericytes död, makulade ödem, bland andra. Dessutom utvecklar proliferative retinopathies också ökad vaskulär permeabilitet, extracellulära ombyggnad och bildandet av vaskulär tufts mot glaskropp håligheten som lätt nedbrytning eller inducera retinal detachement8.
När upptäckts kan retinopatin övervakas genom dess kärlförändringar9,10. Patologins progression kan följas genom kärlens strukturella förändringar, som tydligt definierar stadier av sjukdomen11. Kvantifiering av vaskulär förändringar i dessa modeller tillåtet att korrelera fartygsförändringar och neuronal död och att testa farmakologiska terapier för patienter i olika faser av sjukdomen.
Mot bakgrund av ovanstående uttalanden anser vi att erkännande och kvantifiering av vaskulär förändringar är grundläggande i retinopathies studier. I detta arbete kommer vi att visa hur man mäter olika kärlparametrar. För att göra det kommer vi att använda två djurmodeller. En av dem är den syreinducerade retinopatimusen model12, som efterliknar retinopati av råttor och vissa aspekter av proliferativ diabetesretinopati13,14. I denna modell kommer vi att mäta avascular områden, neovaskulära områden och dilatation och tortuositet av huvudfartyg. I vårt laboratorium har en metabolisk syndrom (MetS) musmodell utvecklats, vilket inducerar en icke-proliferative retinopathy15. Här kommer vi att utvärdera kärldensitet och förgrening.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
C57BL/6J möss hanterades enligt riktlinjer i ARVO Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research. Experimentella förfaranden utformades och godkändes av institutional animal care and use committee (CICUAL) vid fakulteten för kemiska vetenskaper, National University of Córdoba (Res. HCD 1216/18).
1. Beredning av buffertlösningar och reagenser
- Beredning av 1x fosfatbuffertsaltlösning (PBS): Tillsätt 8 g natriumklorid (NaCl), 0,2 g kaliumklorid (KCl), 14,4 g disodium-vätefosfatdihydrat (Na2HPO4 2H2O) och 0,24 g kalium-dihydrogenfosfat (KH2PO4) till 800 ml destillerat vatten. Rör om lösningen tills salterna har upplösts helt. Justera pH-värdet till 7,4 med kloridsyra (HCl) och justera volymen till 1 L med ytterligare destillerat vatten. Filtrera lösningen och förvara den vid 4 °C.
- Beredning av 4% paraformaldehyd (PFA): Tillsätt 40 g fast PFA till 800 ml nyberedd PBS. Rör om lösningen i en värmeplatta vid en konstant temperatur på 60 °C. Tillsätt 1 M natriumhydroxid (NaOH) tills PFA är helt upplöst, kontrollera att pH-värdet hålls på ett intervall av 7,2-7,4. Fyll på volymen till 1 000 ml med PBS och blanda. Stäng av värmeplattan och filtrera lösningen när temperaturen är under 35 °C. Förvara lösningen vid 4 °C i upp till 3 dagar.
VARNING: PFA är skadligt vid förtäring eller inandning och är förmodligen en mutagen förening. Använd handskar och ansiktsmask under hela processen och arbeta i en säkerhetshytt. - Beredning av 1x Tris-buffrad saltlösning (TBS): Tillsätt 6,1 g tris och 9 g NaCl till 800 ml destillerat vatten. Rör om lösningen tills salterna har upplösts helt. Justera pH till 7,4 med HCl och justera volymen till 1 L med ytterligare destillerat vatten. Filtrera lösningen och förvara den vid 4 °C.
- Beredning av TBS- 0,1% Triton X-100: Tillsätt 0,1 ml TritonX-100 till 100 ml TBS. Blanda försiktigt och förvara det vid 4 °C i upp till 1 vecka.
OBS: Eftersom Triton är ett mycket tätt tvättmedel, skär du något av spetsens terminal för bättre pipettering. - Beredning av TBS-5%-Bovine Serum Albumin (BSA) -0,1% Triton-X-100: Väg 5 g BSA och tillsätt TBS- 0,1% triton X-100 lösning upp till en slutlig volym på 100 ml. Rör försiktigt. Aliquot och förvara vid -20 °C i upp till 2 månader.
- Isolektrin GSA-IB4 Alexa fluor-488 konjugat (Isolectin GSA-IB4): Vikt 36,75 mg kalciumkloriddihydrat (CaCl2·2H2O) och tillsätt den till 500 ml nyberedd PBS. Rör om lösningen med en omrörstång. Pipett 500 μL av lösningen av CaCl2/PBS och tillsätt den i injektionsflaskan som innehåller 500 μg lyofiliserat Isolektin GSA-IB4 pulver. Blanda försiktigt och aliquot lösningen i 0,5 ml rör. Förvara dem vid -20 °C skyddade mot ljus.
- Poly(vinylalkohol) i glycerol/tris: Väg 2,4 g Poly (vinylalkohol), tillsätt 6 g glycerol och rör om försiktigt. Tillsätt sedan 6 ml vatten och fortsätt omröra i flera timmar vid rumstemperatur. Tillsätt 12 ml förvärmd 0,2 M Tris-lösning (pH: 8,5) och värm vid en konstant temperatur på 50 °C i 10 minuter och blanda då och då. Centrifugera slutligen lösningen vid 5 000 x g i 15 minuter för förtydligande.
OBS: Låt lösningen svalna vid rumstemperatur, aliquot den och förvara den vid -20 °C.
2. Fluorescerande lektinfärgning
- Vid mössoffer genom koldioxidinandning (CO2) invecklar du ögonen med sax16. Fixera de enucleated ögonen med nyberedd 4% PFA för 1 h vid rumstemperatur (RT).
OBS: Fixering kan också utföras genom att inkubera ögonen i 4% PFA över natten (ON) vid 4 °C. Möss offrades enligt riktlinjerna i ARVO-uttalandet för användning av djur i oftalmisk och visionsforskning och den institutionella djurvårds- och användningskommittén (CICUAL) vid fakulteten för kemiska vetenskaper, National University of Córdoba (Res. HCD 1216/18). - Under det dissekerande mikroskopet tar du bort hornhinnorna med sax genom att skära längs limbus och dissekera hela näthinnan. Kassera det främre segmentet av ögat och separera sedan näthinnan från RPE-Choroid.
OBS: Se till att ta bort det återstående skräpet och hyaloidkärlen ur näthinnan med tång. - Placera näthinnan i 200 μL-rör. Blockera och permeabilisera sedan näthinnan i 100 μL trisbuffrad saltlösning (TBS) som innehåller 5% Bovine Serum Albumin (BSA) och 0,1% Triton-X-100 under 6 h vid 4 °C med mild omrörning i skakapparaten.
OBS: Detta steg kan utföras i 2 timmar på RT. - Vänd sedan röret för att placera näthinnan i locket och ta bort blockeringslösningen med en pipett.
- Tillsätt 100 μL av lösningen som innehåller 0,01 μg/μL Isolektin GSA-IB4 (GSA-IB4). Linda rören med aluminiumfolie för att skydda proverna från ljus. Inkubera näthinnan med lektinlösningen PÅ vid 4 °C eller i 2 timmar vid RT med mild omrörning i skakapparaten.
- Tvätta näthinnan med 100 μL TBS innehållande 0,1% Triton-X-100 i 20 minuter med mild omrörning i skakapparaten. För korrekt tvättning, placera näthinnan i rörets lock genom att invertera den. Sätt tillbaka röret i sitt stående läge och ta bort det medium som finns kvar i behållaren. Upprepa det här steget tre gånger.
- Placera näthinnan i en bild och lägg till en droppe PBS. Under det dissekerande mikroskopet utför du fyra lika avlägsna snitt från näthinnans kanter mot synnerven.
- För att fälla ut näthinnans kronblad, använd tång eller små bitar filterpapper. Se till att fotoreceptorsidan är vänd nedåt.
- Ta bort den återstående PBS-sidan i bilden med filterpapper. Tillsätt sedan ett monteringsmedium (Poly (vinylalkohol) i glycerol/Tris) och täckslip. Låt det torka i 1 h på RT.
- Förvara rutschkanorna vid 4 °C skyddade mot ljus.
OBS: Näthinnor kan också lagras i PBS vid 4 °C tills konfokal mikroskopivisualisering.
3. Konfokal mikroskopivisualisering och mikrofotografförvärv
- Innan visualisering, inkubera bilderna i 10 min på RT täckt av ljus.
- Placera bilden i plattan med framsidan nedåt vid det konfokala mikroskopet.
- Fokusera retinal vaskulaturens överlägsna plexus och välj ett område för att starta bildförvärvet.
- Ställ in allmänna laserparametrar i programvaran: Våglängd: 488 nm; Laserintensitet; HV; Förskjutning; Vinst.
OBS: Laserintensitet, PMT, Offset och förstärkning kan variera beroende på lyktans förhållanden och användning. De optimala inställningarna ger en tydlig bild av kärlen som undviker mättnaden i fotomultiplikplierrörets känslighet för att ha ett linjärt förhållande till fluorescenssignalen. - Ange andra anskaffningsparametrar: Läge; Storlek; Objektiv, utan zoom; Ingen Kalman; Stegstorlek.
OBS: Identiska anskaffningsvillkor måste användas för att avbilda kontroll- och försöksproverna. - Ställ in koordinaterna i x- och y-axel: Skanna näthinnan i fokus 2x. Om området visar fartyg väljer du det genom att klicka två gånger på området för att markera det för senare bildförvärv.
OBS: Det rekommenderas starkt att välja näthinneområde genom att följa den överlägsna vaskulär plexus eftersom fluorescensen hos större kärl är högre. - Flytta i rutnätet till en granne kvadrat, fokusera näthinnan och välj området om det motsvarar. Upprepa detta steg tills det valda området består av hela näthinnan.
- Välj ett område och ställ in koordinaterna i z-axeln för att definiera tjockleksvidgningen som ska skannas. För att göra detta, visualisera näthinnan i fokus 2x; med mikrometern, gå till toppen av näthinnan och klicka på Ställ in vid startpositionen. Flytta sedan till botten av näthinnan och klicka på Ställ in i ändpositionen.
- Upprepa steg 3.8 på varje område som valts i rutnätet.
OBS: Om du vill verifiera det skannade området på djupet trycker du på Gå i startpositionen. Om kärl fortfarande visualiseras justerar du positionen genom att flytta mikrometern och klickar sedan på Ange. Upprepa processen vid slutpositionen. - Initiera automatisk skanning.
- När skanningsprocessen är klar öppnar du bilden.
- Välj serieformatet om du vill spela in bilden som en mosaik och spara den med önskat tillägg. Slutligen kommer den sydda bilden att visas på skärmen.
4. Bildbehandling
- I ImageJ FIJI-programvaran går du till menyraden och klickar på Arkiv > Öppna. Välj den bild som ska bearbetas. I fönstret Importalternativ för bioformat väljer du Visa OME-XML-metadata och klickar på OK.
BILDER med liknande namn ska sparas i separata mappar. - Sök efter pixelstorleksinformationen i fönstret OME-metadata med namnet PhysicalSizeX, PhysicalSizeY och PhysicalSizeZ. Kopiera dessa data.
- Om du vill ha bildkalibrering går du till menyraden och väljer Bild > Egenskaper. Kopiera informationen om bilden i steg 4.2 och klicka på OK. Bilden öppnas som ett fönster med flera foton, där var och en representerar de mikrofotografier som förvärvats vid en z-axel.
- Tilldela en önskad lut till bilden för att förpassa en färg till den fluorescerande etiketten. För att göra det, gå till menyraden och klicka på LUT-ikonen .
- Om du vill visualisera alla staplar i en enda bild går du till menyraden och väljer Bild > staplar > Z-projekt.
- I fönstret Z-projektion som visas markerar du alla staplar där kärl visualiseras. I Projektionstyp väljer du Medelintensitet och klickar på OK.
OBS: Resultatet av summan av staplarna visas i en ny bild med namnet AVG (bildnamn). - Justera ljusstyrkan och kontrasten i den resulterande bilden för att minska bakgrunden och markera kärlen. Gå till menyraden och klicka på Bild> Justera> Ljusstyrka/Kontrast. I B- och C-fönstren flyttar staplarna tills en bättre intensitet observeras. Klicka på Verkställ och spara ändringarna.
- Kopiera parametrarna som valts för Ljusstyrka/kontrast. Dessa måste vara identiska för alla bilder.
- Innan bildkvantifieringen definierar du de parametrar som ska mätas. Gå till Analysera > Ställ in mått i menyraden. I de förfaranden som beskrivs här kommer det att vara nödvändigt att erhålla område och omkrets (detta behövs i slutändan också för att mäta avstånd). Klicka på OK.
- Ladda ner plugin som krävs för kvantifiering av fartygsdensitet17 och följ installationsanvisningarna från plugin.Download the plugin required for vessel density quantification17 and follow the installations instructions provided by the plugin.
- Fortsätt med kvantifieringen av en specifik kärlparameter.
5. Kvantifiering av avascular områden
- Välj trollstavsverktyget i menyraden. Välj näthinnan som saknar kärl.
STÖRRE eller mindre områden kan väljas beroende på toleransen. För att justera toleransen, klicka på trollstavsverktygsikonen två gånger. Använt läge: Äldre. - Tryck på T-bokstaven på tangentbordet för att spela in det markerade området i ROI Manager. Upprepa steg 5.1 och 5.2 med alla avascular områden i näthinnan.
- Klicka på Mät i ROI-hanteraren för att få information om det avascular området. Programmet visar ett nytt fönster med den information som krävs. Kopiera data i ett annat program eller spara filen.
OBS: I vissa bilder kanske man föredrar att välja de avascular områdena manuellt. I det här fallet väljer du verktyget Polygonval, ritar korta avstånd runt det avascular området och klickar på bilden när ett nytt avstånd är på väg att starta. Stäng det markerade området genom att klicka på den första punkten. - Upprepa steg 5.1, 5.2 och 5.3 för att mäta näthinnans totala yta.
- Beräkna näthinnans avascular område som summan av alla avascular områden mätt dividerat med näthinnans totala yta.
6. Kvantifiering av neovaskulära områden
- Välj trollstavsverktyget i menyraden.
- Zooma in bilden för att bättre visualisera neovessels. Välj neovessels en efter en med trollstavsverktyget.
OBS: Justera toleransen högst 20 för att säkerställa valet av en enda neovessel. Denna toleransnivå måste vara konstant under alla bildkvantifieringar. - Tryck på T-bokstaven på tangentbordet för att spela in det markerade området i ROI Manager. Upprepa steg 6.1 och 6.2 med alla neovaskulära områden i näthinnan.
- Klicka på Mät i ROI-hanteraren för att hämta områdesdata. Programmet visar ett nytt fönster med den information som krävs. Kopiera data i ett annat program eller spara filen.
- Upprepa steg 6.1, 6.2 och 6.3 för att kvantifiera näthinnans totala yta.
- Beräkna näthinnans neovaskulära område som summan av alla neovessels områden mätt dividerat med näthinnans totala yta.
7. Kvantifiering av fartygets diameter
- Välj verktyget Linjärt i menyraden.
- Zooma in bilden för att bättre visualisera kärlväggen. Utför tre tvärgående linjer till huvudkärlet före den första grenen. Detta måste göras genom att dra en linje från gränsen för en vägg av fartyget till motsatsen.
OBS: Linjen måste vara helt vinkelrät mot väggkärlet för att undvika kvantifieringsfel. - Tryck på T-bokstaven på tangentbordet för att spela in det markerade området i ROI Manager. Upprepa steg 7.1 och 7.2 i alla kärl som behöver kvantifieras.
- Klicka på Mät i ROI-hanteraren för att få avståndsdata. Programmet visar ett nytt fönster med den information som krävs. Kopiera data i ett annat program eller spara filen.
8. Kvantifiering av fartygs tortuositet
- Klicka på ikonen Direktlinjeverktyg i menyraden med musens högra knapp och välj Segmenterad linje eller Frihandslinje. Rita en linje inuti kärlet från synnerven tills den första kärlförgreningen följer kärlformen.
OBS: Linjen måste följa kärlformen för att undvika kvantifieringsfel. - Tryck på T-bokstaven på tangentbordet för att spela in det markerade området i ROI Manager.
- Välj verktyget Linjärt i menyraden. Dra en linje från synnerven tills det första kärlet förgrens.
- Tryck på T-bokstaven på tangentbordet för att spela in det markerade området i ROI Manager.
- Klicka på Mät i ROI-hanteraren för att få avståndsdata. Programmet visar ett nytt fönster med den information som krävs. Kopiera data i ett annat program eller spara filen.
- Beräkna tortuositetsindexet enligt följande: avstånd som erhålls med segmenterad linje dividerat med avståndet som erhålls med rak linje.
9. Kvantifiering av kärlförgrening
- Med menyradens ovala verktyg definierar du ett område som tillämpas lika på alla experimentella villkor. Det valda området måste vara en koncentrisk cirkel som dras runt synnerven.
- Tryck på T-bokstaven på tangentbordet för att spela in det markerade området i ROI Manager.
OBS: I det här fallet rekommenderas att spara AVKASTNINGEN eftersom kvantifieringen är långsam och samma ROI måste användas i alla bilder. För att göra detta, i ROI Manager klicka på MER > Spara. - Räkna manuellt antalet primära grenar som härrör från huvudfartyg inom urvalsområdet.
- Upprepa steg 9.2 och 9.3 i närliggande områden, upprätthålla de optiska nerv-periferi kriterierna.
10. Kvantifiering av kärltäthet
- Omvandla bilden till 8-bitarsläge.
- Gå till Plugins i menyraden, välj Kärlanalys > kärltäthet.
- Definiera ett område med fyrkantsverktyget i menyraden, där kärltätheten måste mätas. Klicka på OK.
- Programmet visar ett nytt fönster med den information som krävs. Kopiera data i ett annat program eller spara filen.
- Upprepa steg 10.2, 10.3 och 10.4 i de närliggande områdena, behåll AVKASTNINGEN men placera den nio gånger som omfattar periferin och mitten av hela näthinnan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som beskrivs i protokollavsnittet, från en enda fluorescerande färgningsanalys kan du få kärlmorfologin och utvärdera flera parametrar av intresse kvantitativt. Sökningen av en specifik förändring beror på vilken typ av retinopati som studeras. I den här artikeln utvärderades avascular och neovascular områden, tortuositet och dilatation i en mus modell av proliferative retinopathy, medan vaskulär förgrening och densitet analyserades i en MetS mus modell, som inducerar en icke-proliferative retinopathy.
I det första experimentella exemplet användes den syreinducerade retinopati (OIR) musmodellen, som liknar Retinopati av prematuritet och vissa funktioner i det proliferativa stadiet av diabetiker retinopati. I denna modell underhålls kullar med sin ammande mamma i en hyperoxisk kammare från postnatal dag (P)7 till P1218. Intravitreala injektioner utfördes vid P12 för att bestämma effekten av ett läkemedel som ett antiangiogent (tillstånd som kallas behandling). Möss offrades vid P17, tidpunkten för den maximala neovesselsbildningen19. Möss som injicerades med fordonet användes som kontroll. Båda proverna var fasta och färgade med Isolectin GSA-IB4 tillsammans. Efter konfokalt förvärv analyserades bilder med ImageJ FIJI-programvara enligt ovan. Med sömmodulen integrerad i confokalt mikroskop observerades hela fästet som en unik bild (figur 1). Vid P17 är det möjligt att observera hyaloid vaskulaturen, ett övergående kärlsystem som är väsentligt under det intrauterin livet (figur 1, vita pilar)20.
Som en följd av överdriven syretillförsel i hyperoxiska kammaren arresterar OIR-möss den fysiologiska kärlutvecklingen och genererar avascular områden i näthinnan. Sedan definieras de avascular områdena som de zoner som saknar retinala blodkärl (figur 2). Från de förvärvade bilderna kan avascular områden kvantifieras som summan av regionerna utan fartyg dividerat med näthinnans totala yta. Områden med mekaniska skador visar också frånvaro av fartyg. För att identifiera skadade områden, analysera integriteten hos neuronala lager med Hoechst fläck.
De avascular områdena i näthinnan undvika syre leverans och därför, en stark pro-angiogenic svar är inställd, inducera neovascularization16. Neovessels är små kaliber fartyg som härstammar från ett befintligt fartyg av överlägsen vaskulär plexus. Deras struktur är oorganiserad, därför växer neovessels som tufts mot glaskroppen håligheten21. Vi beräknade det område som upptas av neovessels tufts genom att kvantifiera näthinnans neovaskulära område dividerat med näthinnans totala yta (figur 3). Eftersom neovessels form och storlek varierar kan de ibland se ut som skräp och artefakter. För att skilja neovessels, verifiera att tuften växer från ett moget kärl.
Vaskulär dilatation och tortuositet är andra två frekventa förändringar, som har negativa effekter på kärlbiologi, eftersom de producerar turbulent blodcirkulation. För analys av dilatationen mätte vi huvudkärlens diameter på tre höjder före den första grenen22,23 (figur 4). Forskare måste definiera ett förutbestämt avstånd för att mäta kärldiameter för att minska variationen mellan resultaten. Helst bör den längsta punkten från synnerven vara cirka 300 μm. Vi föreslår att du utför analysen och senare tar i genomsnitt minst sex möss per tillstånd.
När det gäller tortuositet mäter vi det avstånd som täcks av huvudkärlen efter dess form med avseende på det raka avståndet mellan synnerven och den första förgreningspunkten24 (figur 5). Som vi kan se på bilden finns det heterogenitet i de viktigaste fartygens sinusositet. För att uppnå ett representativt resultat måste minst sex möss per tillstånd kvantifieras.
De senaste parametrarna, vaskulär förgrening och densitet, analyserades i MetS-modellen uppvisar icke-proliferative retinopathy. I MetS är både lipider och kolhydrater derangements associerade med retinal pericyter och endotelceller dysfunktion och död, vilket leder till bildandet av acellulära kapillärer eller en minskad vaskulär förgrening25. I vår modell matades ApoE-KO möss med fruktos som tillsatts dricksvattnet, med en koncentration av 10% w/v. Kontrolldjur fick just kranvatten. Efter 4 månaders kost offrades möss och näthinnan bearbetades som anges tidigare. För mätning av kärlförgrening definierade vi kvantifieringsområdet genom att rita en koncentrisk cirkel, och sedan räknade vi, en efter en, de primära grenarna som härrör från ett huvudcentralkärl (figur 6).
Från de förvärvade bilderna kvantifierades kärltätheten som det område som upptogs av fartyg dividerat med ROI-området (en kvadrat på 0,015 mm2, se platta i figur 7), som var placerad på olika platser i varje mikrofotograf, som det förklarades i protokollavsnittet. Undvik att kvantifiera områden med mekanisk skada (figur 7, vita pilar). Om det finns fler än två områden med punkteringar måste näthinnan kasseras.
Figur 1: Kärlfärgning av näthinnans hela fäste märkt med Isolectin GSA-IB4: Representativa konfokala bilder av P17 OIR-möss näthinnor injicerade med fordon eller behandling vid P12. Fluorescerande färgning utfördes i hela mount näthinnor med Isolectin GSA-IB4 Alexa 488 enligt protokollet. Avascular områden (AV) och neovaskulära områden (NV) anges. Skalstång: 500 μm. Vita pilar visar kvarvarande hyaloid vaskulatur. Gula pilar visar ofullständiga skanningsområden under konfokal bildförvärv. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Kvantifiering av avaskulära områden: (A) Representativa bilder av hela fästhinnan vid P17 som visar GSA-IB4 kärlfärgning i OIR-fordon och OIR-behandlingsmöss. Områden med vaso-utplåning anges i gult. Skalstång: 500 μm. (B) AV-området (%) kvantifierades som förhållandet mellan centralt avascular område och hela näthinnan. Tvåsidigt opared t-test användes för statistisk jämförelse. Uppgifter som presenteras som medelvärde ± SEM. *** p < 0,001. Minst sex djur användes för varje tillstånd under den undersökta överlevnadstiden. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: Kvantifiering av neovaskulära områden: (A) Representativa bilder av hela fästhinnan vid P17 som visar GSA-IB4 kärlfärgning i OIR-fordon och OIR-behandlingsmöss. Områden med neovascularization anges i vitt. Skalstång: 500 μm. (B) NV-området (%) kvantifierades som förhållandet mellan det område som upptas av neovessels och hela näthinnan. Tvåsidigt opared t-test användes för statistisk jämförelse. Uppgifter som presenteras som medelvärde ± SEM. *** p < 0,001. Minst sex djur användes för varje tillstånd under den undersökta överlevnadstiden. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 4: Kvantifiering av kärlspridning: (A) Representativa bilder av hela fästhinnan vid P17 som visar GSA-IB4 kärlfärgning i OIR-fordon och OIR-behandlingsmöss. Vänster paneler: ROI valt för kvantifiering. Höger paneler: zoom av ROI, som visar raka linjer som utförs i ett huvudkärl för att mäta kärldiametern. Tre linjer spårades tvärgående till fartyget och i genomsnitt. Skalstång: 100 μm. (B) Kärldiametern (%) kvantifierades som den genomsnittliga diametern mätt i större kärl i näthinnan. Tvåsidigt opared t-test användes för statistisk jämförelse. Uppgifter som presenteras som medelvärde ± SEM. *p < 0,05. Minst sex djur användes för varje tillstånd under den undersökta överlevnadstiden. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 5: Bestämning av tortuositetsindex: (A) Representativa bilder av hela fästhinnan vid P17 som visar GSA-IB4 kärlfärgning i OIR-fordon och OIR-behandlingsmöss. Vänster paneler: ROI valt för kvantifiering. Mittpaneler: zoom av ROI: erna, som visar segmenterade linjer som spåras i ett huvudkärl från synnerven till den första förgreningspunkten. Höger paneler: zoom av ROI, som visar raka linjer spårade i ett huvudkärl från synnerven till den första förgreningspunkten. Skalstång: 100 μm. (B) Tortuositetsindexet erhölls genom att dividera avståndet för den segmenterade linjen till avståndet för den raka linjen. Tvåsidigt opared t-test användes för statistisk jämförelse. Data som presenteras som medelvärde ± SEM. ns, icke-signifikanta. Minst sex djur användes för varje tillstånd under den undersökta överlevnadstiden. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 6: Kvantifiering av kärlförgrening: (A) Representativa bilder av hela fästhinnan som visar Isolektin GSA-IB4 kärlfärgning i ApoE-KO och ApoE-KO + fruktosmatade möss. Cirkulära kvantifieringsområden definierades i gult. Skalstång: 100 μm, 100x förstoring. B) Antalet filialer kvantifierades som antalet primära grenar från ett huvudkärl, eftersom synnerven till periferin. Tvåsidigt opared t-test användes för statistisk jämförelse. Data som presenteras som medelvärde ± SEM. ns, icke-signifikanta. Minst sex djur användes för varje tillstånd. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 7: Kvantifiering av kärltäthet: (A) Representativa bilder av hela fästhinnan som visar Isolektin GSA-IB4 kärlfärgning i ApoE-KO och ApoE-KO + fruktosmatade möss. Kvadrat av 0,015 mm2 kvantifieringsområde definierades i gult. Skalstång: 100 μm, 100x förstoring. B) Kärltätheten kvantifierades som förhållandet mellan kärlområdet och den totala ROI-arealen, som placerades nio gånger på olika platser i varje mikrofotograf. Vita pilar visar områden med mekanisk skada. Tvåsidigt opared t-test användes för statistisk jämförelse. Data som presenteras som medelvärde ± SEM. ns, icke-signifikanta. Minst sex djur användes för varje tillstånd. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Djurmodeller av retinopatier är kraftfulla verktyg för att studera kärlutveckling, ombyggnad eller patologisk angiogenes. Framgången för dessa studier inom området beror på enkel tillgång till vävnaden som gör det möjligt att utföra en mängd olika tekniker, vilket ger data från in vivo- och postmortemmöss26,27. Dessutom har stor korrelation hittats mellan in vivo-studier och klinisk analys, vilket ger solid spårbarhet och tillförlitlighet till dessa modeller28. I den här artikeln presenterar vi en enkel och robust beskrivning av stegen för att karakterisera kärlnätverket i musmodeller av retinala kärlsjukdomar. I litteraturen hittar läsarna andra möjliga parametrar för att mäta och parallella metoder för att kvantifiera de som valts här. De sammanställda protokollen har många fördelar jämfört med andra eftersom de är reproducerbara, och de kräver bara en gratis programvara för att utföra analysen (Bild J Fiji).
Dessutom är dessa protokoll lätta att utföra av studenter som inte har omfattande kunskaper om programmet och de flesta mätningarna behöver inte ytterligare plugins (förutom från kärltäthet).
Provextraktion och fluorescensfärgningsteknik är enkla och korta29. Det är mycket viktigt att arbeta med färska näthinnor, även om de kan lagras vid 4 °C i PBS med hämmare av bakterietillväxt. Eftersom vävnaden är tunn och mjuk bryts gamla prover ofta ner under inkubationen eller när provet fälls ut före montering. Dessutom gör överdriven fixering med 4% PFA näthinnan alltför styv och spröd, men detta påverkar inte lektinfärgningen. Isolektin GSA-IB4 färgning gör det möjligt att visualisera det kompletta vaskulär nätverket vid varje lager, inklusive neovessels och prolifererande endotelceller. Andra markörer, som CD 31, kräver inkubation av provet med koncentrerade antikroppar och de har mer bakgrund. Å andra sidan tenderar det fluorescerande färgämnet i angiografi att sprida sig ut ur kärlen, vilket ökar variationen i kärlkalibreringen och tortuositetskvantifieringen. En nackdel med Isolectin GSA-IB4 är att det också kan märka mikrogliaceller30. Försiktighet bör iakttas vid utförande av intravitreala injektioner eller andra experimentella förfaranden som inducerar överdriven infiltration eftersom mikrogliacellerna kan bilda agglomerater.
Bildförvärv kan utföras med vilket konfokalmikroskop som helst. Användningen av ett motoriserat plåtpar till en programvara som innehåller Stitching-modulen kommer att ge fullständig visualisering av hela den monterade näthinnan i en enda bild. När du väljer näthinnan, se till att alla ytterligheter i provet ingår, annars blir fotot ofullständigt (bild 1, gula pilar). Detta är inte särskilt relevant i musmodellen av OIR, som ett exempel, eftersom kärlförändringar ligger nära synnerven. Medan i råttmodellen av OIR kan detta misstag leda till felaktig kvantifiering, eftersom de avascular och neovaskulära områdena ligger bredvid limbus. En annan möjlighet är att ta enskilda retinal mikrofotografier. Användaren kan senare organisera dem som ett pussel med en korrekt programvara. Det rekommenderas inte att använda epifluorescensmikroskop, särskilt när man analyserar förgrening, eftersom kärl spirar genom hela tjockleken på näthinnan och vissa kärl inte kommer att upptäckas i en enbart z-stack.
Under bildbehandling med ImageJ FIJI rekommenderas att inte uppdatera programvaran förrän alla bilder har kvantifierats, för att hålla identiska förhållanden i programvaran. Kalibreringen av bilderna (tilldelning av pixelstorlek i mikron) är ett kritiskt steg eftersom dessa protokoll innebär kvantifiering av avstånd och områden. När användaren är bekant med programmet kan den utforska andra verktyg för att välja det neovaskulära och avascular området förutom trollstavsverktyget. Polygonvalsverktyget är särskilt användbart för att mäta avasulära områden som har skurits i två delar vid monteringssteget. Andra forskare har skapat specifika plugins för att automatisera valet av neovessels baserat på fluorescensintensiteten hos dessa strukturer. Dessa metoder är snabbare och mindre mödosamma, även om det rekommenderas att kontrollera att små mindre glänsande neovessels har valts före kvantifiering31. Neovessels områden kommer att fluorescera mer intensivt än de omgivande normala kärlen. Trollstavsverktyget väljer områden som är lika färgade och toleransen avgör hur lika färg är pixlarna markerade. Om en neovessel är av liknande intensitet som normala kärl, kan toleransen justeras nedåt för att öka känsligheten för subtila intensitetsskillnader. Även om neovessel urval i varje prov kommer att utföras med en identisk tröskel, vissa neovessels kännetecknas av en mindre fluorescens intensitet. I detta fall krävs en lägre tolerans för korrekt val.
Tortuositet och utvidgning är mätningar av avstånd. En omfattande studie av kärlträdet är till hjälp för att välja kärl av samma typ (artärer eller vener) och kaliber. Vi mäter vidgningen i fartyg på tre höjder enligt figur 4. Vinkeln på det raka urvalets respekt för fartygsväggen är en annan relevant punkt att ta hänsyn till. Detta bör vara så nära 90° som möjligt för att undvika eventuella fel. När du ritar den raka linjen kan användarna använda zoomverktyget för att närma sig det intressanta kärlet.
Kärlförgrening kan också mätas i två eller flera kvantifieringsområden av olika höjder, om så önskas. I detta fall bör forskare bevara den analyserade näthinnans region (central, medel eller perifer sida av synnerven). Även om förgrening ändras i flera djurmodeller av retinopati, visar tidiga stadier av retinopatin i samband med MetS som presenteras här fortfarande inte sådana förändringar15. För omfattande studier i retinal kapillärer av mellanliggande och djupa plexus och fartyg groddar, 3D beräkningsmetoder ger värdefulla data om subtila variationer i vaskulär morfologi och nätverk32. Slutligen bestäms kärltätheten av det område som upptas av fartyg med avseende på den totala arealen för en vald avkastning. Mätningen av den här parametern kräver användning av ett plugin och en aktualiserad version av ImageJ FIJI, där autotröskel och geometri till avståndskartaverktyg måste vara tillgängliga. Trots dessa ytterligare steg är pluginet lätt att använda, reproducerbart och pålitligt. För mätning av vaskulär densitet valdes en ROI på 0,015 mm2 , för att göra tio mätningar av fluorescensintensiteten i olika regioner i näthinnan. Denna storlek gjorde det möjligt för oss att täcka hela fotot, vilket fick ett mer representativt medelvärde och dess avvikelse i varje näthinna.
Sammantaget, trots att dessa samlingar av metoder inte är automatiserade och kräver manuellt urval av parametrarna, kan de tillhandahålla kvantitativa och rigorösa data om näthinnan. Den huvudsakliga begränsningen när det gäller ovanstående protokoll för kärlmätningar beror på inter-examinator variabiliteten när man analyserar samma bild. För att minimera denna partiskhet är det viktigt att fördefiniera den allmänna inställningen som fartygsvägggränser, identifiering av avascular områden och neovessels, och även uteslutningskriterier för skadade vävnader. När det gäller kärl tortuositet krävs en överenskommen startpunkt bredvid synnerven. För nybörjare rekommenderas det starkt att i genomsnitt beräkna de data som samlas in av två eller flera granskare. Hos utbildade användare har inga betydande skillnader konstaterats vid mätningen av olika parametrar, så länge som överenskommelsen i kvantifieringskriterierna förblir konstant. På samma sätt kan ytterligare parametrar läggas till de listade protokollen, beroende på de kärlförändringar som detekteras i retinopatin. I icke-proliferative retinopathies är mätningen av acellulär kapillär nummer, migrerande pericyter, förhållandet mellan pericyter / endotelceller nummer och blod retinal barriär permeabilitet de tidigaste parametrarna ändras i retinal vasculature33,34,35. För kroniska modeller och milda retinopatier är det lämpligt att inkludera dessa ytterligare mätningar. Ett stort antal parametrar som mäts kommer att ge ett mer troget landskap av de händelser som äger rum i vaskulaturen. Sammanfattningsvis har vi i denna artikel visat klassiska, väletablerade och reproducerbara tekniker för att kvantifiera några av de mest relevanta parametrarna som beaktas i klinisk praxis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att forskningen utfördes i avsaknad av kommersiella eller finansiella relationer som kan tolkas som en potentiell intressekonflikt.
Acknowledgments
Vi tackar Carlos Mas, María Pilar Crespo och Cecilia Sampedro från CEMINCO (Centro de Micro y Nanoscopía Córdoba, CONICET-UNC, Córdoba, Argentina) för hjälp med konfokal mikroskopi, till Soledad Miró och Victoria Blanco för särskild djurvård och Laura Gatica för histologisk hjälp. Vi tackar också Victor Diaz (pro-sekreterare för institutionell kommunikation i FCQ) för videoproduktion och utgåva och Paul Hobson för hans kritiska läsning och språkrevision av manuskriptet.
Denna artikel finansierades genom bidrag från Secretaría de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Córdoba (SECyT-UNC) Consolidar 2018-2021, Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica (FONCyT), Proyecto de Investigación en Ciencia y Tecnología (PICT) 2015 N° 1314 (alla till M.C.S.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminuim foil | |||
| Bovine Serum Albumin | Merck | A4503 | quality |
| Calcium chloride dihydrate | Merck | C3306 | |
| Hydrochloric acid | Biopack | 9632.08 | |
| Confocal Microscope FV1200 | Olympus | FV1200 | with motorized plate |
| Covers | Paul Marienfeld GmnH & Co. | 111520 | |
| Dissecting Microscope | NIKON | SMZ645 | |
| Disodium-hydrogen-phosphate dihydrate | Merck | 119753 | |
| 200 µL tube | Merck | Z316121 | |
| Filter paper | Merck | WHA5201090 | |
| Incubator shaker GyroMini | LabNet International | S0500 | |
| Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugate | Invitrogen | I21411 | |
| Poly(vinyl alcohol) (Mowiol 4-88) | Merck | 475904 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 158127 | |
| pHmeter | SANXIN | PHS-3D-03 | |
| Potassium chloride | Merck | P9541 | |
| Potassium-dihydrogen phosphate | Merck | 1,04,873 | |
| Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Sodium chloride | Merck | S3014 | |
| Sodium hydroxide | Merck | S5881 | |
| Tris | Merck | GE17-1321-01 | |
| Triton X-100 | Merck | X100-1GA | |
| Vessel Analysis Fiji software | Mai Elfarnawany | https://imagej.net/Vessel_Analysis |
References
- Kur, J., Newman, E. A., Chan-Ling, T. Cellular and physiological mechanisms underlying blood flow regulation in the retina and choroid in health and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (5), 377-406 (2012).
- McDougal, D. H., Gamlin, P. D.
- Selvam, S., Kumar, T., Fruttiger, M. Retinal vasculature development in health and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 63, 1-19 (2018).
- Wei, Y., et al. Age-related alterations in the retinal microvasculature, microcirculation, and microstructure. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (9), 3804-3817 (2017).
- Lavia, C., et al. Reduced vessel density in the superficial and deep plexuses in diabetic retinopathy is associated with structural changes in corresponding retinal layers. PLoS One. 14 (7), 0219164 (2019).
- Rosenblatt, T. R., et al. Key factors in a rigorous longitudinal image-based assessment of retinopathy of prematurity. Scientific Reports. 11 (1), 5369 (2021).
- Edwards, A. L. Funduscopic examination of patients with diabetes who are admitted to hospital. Canadian Medical Association Journal. 134 (11), 1263-1265 (1986).
- Lechner, J., O'Leary, O. E., Stitt, A. W. The pathology associated with diabetic retinopathy. Vision Research. 139, 7-14 (2017).
- Sun, Z., et al. angiography metrics predict progression of diabetic retinopathy and development of diabetic macular edema: A prospective study. Ophthalmology. 126 (12), 1675-1684 (2019).
- Jia, Y., et al. Quantitative optical coherence tomography angiography of vascular abnormalities in the living human eye. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 2395-2402 (2015).
- Pauleikhoff, D., Gunnemann, F., Book, M., Rothaus, K. Progression of vascular changes in macular telangiectasia type 2: comparison between SD-OCT and OCT angiography. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 257 (7), 1381-1392 (2019).
- Gammons, M. V., Bates, D. O. Models of oxygen induced retinopathy in rodents. Methods in Molecular Biology. 1430, 317-332 (2016).
- Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. Animal models of choroidal and retinal neovascularization. Progress in Retinal and Eye Research. 29 (6), 500-519 (2010).
- Han, N., Xu, H., Yu, N., Wu, Y., Yu, L. MiR-203a-3p inhibits retinal angiogenesis and alleviates proliferative diabetic retinopathy in oxygen-induced retinopathy (OIR) rat model via targeting VEGFA and HIF-1α. Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 47 (1), 85-94 (2020).
- Paz, M. C., et al. Metabolic syndrome triggered by fructose diet impairs neuronal function and vascular integrity in ApoE-KO mouse retinas: Implications of autophagy deficient activation. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 573987 (2020).
- Connor, K. M., et al. Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis. Nature Protocols. 4 (11), 1565-1573 (2009).
- Zarb, Y., et al. Ossified blood vessels in primary familial brain calcification elicit a neurotoxic astrocyte response. Brain. 142 (4), 885-902 (2019).
- Smith, L. E., et al.
- Subirada, P. V., et al. Effect of autophagy modulators on vascular, glial, and neuronal alterations in the oxygen-induced retinopathy mouse model. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 279 (2019).
- Lutty, G. A., McLeod, D. S. Development of the hyaloid, choroidal and retinal vasculatures in the fetal human eye. Progress in Retinal and Eye Research. 62, 58-76 (2018).
- Kim, C. B., D'Amore, P. A., Connor, K. M. Revisiting the mouse model of oxygen-induced retinopathy. Eye and Brain. 8, 67-79 (2016).
- Guaiquil, V. H., et al. A murine model for retinopathy of prematurity identifies endothelial cell proliferation as a potential mechanism for plus disease. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (8), 5294-5302 (2013).
- Mezu-Ndubuisi, O. J. In vivo angiography quantifies oxygen-induced retinopathy vascular recovery. Optometry and Vision Science: Official Publication of the American Academy of Optometry. 93 (10), 1268-1279 (2016).
- Scott, A., Powner, M. B., Fruttiger, M. Quantification of vascular tortuosity as an early outcome measure in oxygen induced retinopathy (OIR). Experimental Eye Research. 120, 55-60 (2014).
- Kim, A. Y., et al. Quantifying microvascular density and morphology in diabetic retinopathy using spectral-domain optical coherence tomography angiography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (9), 362 (2016).
- Liu, C. H., Wang, Z., Sun, Y., Chen, J. Animal models of ocular angiogenesis: from development to pathologies. FASEB Journal. 31 (11), 4665-4681 (2017).
- Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. Animal models of choroidal and retinal neovascularization. Progress in Retinal and Eye Research. 29 (6), 500-519 (2010).
- Kern, T. S., Antonetti, D. A., Smith, L. E. H. Pathophysiology of diabetic retinopathy: Contribution and limitations of laboratory research. Ophthalmic Research. 62 (4), 196-202 (2019).
- Lorenc, V. E., et al. IGF-1R regulates the extracellular level of active MMP-2, pathological neovascularization, and functionality in retinas of OIR mouse model. Molecular Neurobiology. 55 (2), 1123-1135 (2018).
- Ma, N., Streilein, J. W. Contribution of microglia as passenger leukocytes to the fate of intraocular neuronal retinal grafts. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 39 (12), 2384-2393 (1998).
- Mazzaferri, J., Larrivée, B., Cakir, B., Sapieha, P., Costantino, S. A machine learning approach for automated assessment of retinal vasculature in the oxygen induced retinopathy model. Scientific Reports. 8 (1), 3916 (2018).
- Milde, F., Lauw, S., Koumoutsakos, P., Iruela-Arispe, M. L. The mouse retina in 3D: quantification of vascular growth and remodeling. Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro (Camb). 5 (12), 1426-1438 (2013).
- Yang, T., et al. Pericytes of indirect contact coculture decrease integrity of inner blood-retina barrier model in vitro by upgrading MMP-2/9 activity. Disease Markers. 2021, 7124835 (2021).
- Huang, Q., Wang, S., Sorenson, C. M., Sheibani, N. PEDF-deficient mice exhibit an enhanced rate of retinal vascular expansion and are more sensitive to hyperoxia-mediated vessel obliteration. Experimental Eye Research. 87 (3), 226-241 (2008).
- Jiang, H., Zhang, H., Jiang, X., Wu, S. Overexpression of D-amino acid oxidase prevents retinal neurovascular pathologies in diabetic rats. Diabetologia. 64 (3), 693-706 (2021).
