Summary
Hier stellen wir ein Protokoll zum Nachweis von Neutralisationsepitopen auf antigenanzeigenden virusähnlichen Partikeln (VLPs) vor. Die Immunpräzipitation der aus dem humanen Immundefizienzvirus (HIV) abgeleiteten VLPs erfolgt unter Verwendung von Hüllglykoproteinen-spezifischen monoklonalen Antikörpern, die an Protein G-konjugierte magnetische Kügelchen gekoppelt sind. Gefangene VLPs werden anschließend einer SDS-PAGE- und Western-Blot-Analyse unter Verwendung viraler Kernprotein-Gag-spezifischer Antikörper unterzogen.
Abstract
Der Virus-Like Particle (VLP) Capture Assay ist eine Immunpräzipitationsmethode, allgemein bekannt als "Pull-Down-Assay", der zur Aufreinigung und Isolierung von Antigen-darstellenden VLPs verwendet wird. Aufgrund ihrer hohen Affinität zum Zielantigen können diese Antikörper VLPs einfangen, die mit dem verwandten Antigen verziert sind, das in der Membranhülle der VLPs verankert ist. Dieses Protokoll beschreibt die Bindung von antigenspezifischen Antikörpern an Protein A- oder G-konjugierte magnetische Kügelchen. In unserer Studie werden humane Immundefizienz-Virus (HIV)-abgeleitete VLPs untersucht, die aus dem gruppenspezifischen Antigen (Gag) viralen Kernvorläuferprotein p55 Gag gebildet werden und die Hüllglykoproteine (Env) von HIV anzeigen. Die VLPs werden unter Verwendung von breit neutralisierenden Antikörpern (bNAbs) erfasst, die gegen neutralisationsempfindliche Epitope in Env gerichtet sind. Der hier skizzierte VLP-Capture-Assay stellt eine sensitive und einfach durchzuführende Methode dar, um zu zeigen, dass (i) die VLPs mit dem jeweiligen Zielantigen dekoriert sind, (ii) das Oberflächenantigen seine strukturelle Integrität beibehielt, wie sie durch die im Assay verwendete epitopspezifische Bindung von bNAbs nachgewiesen wurde, und (iii) die strukturelle Integrität der VLPs, die durch den Nachweis von Gag-Proteinen in einer anschließenden Western-Blot-Analyse aufgedeckt wurde. Folglich erleichtert die Verwendung von bNAbs zur Immunpräzipitation eine Vorhersage, ob VLP-Impfstoffe in der Lage sein werden, eine neutralisierende B-Zell-Antwort bei geimpften Menschen hervorzurufen. Wir gehen davon aus, dass dieses Protokoll anderen Forschern einen wertvollen und unkomplizierten experimentellen Ansatz zur Untersuchung potenzieller VLP-basierter Impfstoffe bieten wird.
Introduction
Virusähnliche Partikel (VLPs) ähneln der nativen Viruspartikelstruktur, während ihnen das virale Genom fehlt, was ein hohes Sicherheitsprofil bietet1,2. VLPs stellen eine individuelle Klasse von Impfstoffen dar, die aufgrund ihrer hohen Immunogenität zunehmend entwickelt werden3,4,5,6,7. Dies gilt insbesondere für membranumhüllte VLPs, die die Anzeige nicht nur homologer viraler Oberflächenantigene, sondern auch heterologer Antigene wie Tumorantigene ermöglichen8,9,10. Abbildung 1 gibt einen beispielhaften Überblick über die Struktur eines umhüllten Antigen-dekorierten VLP. Während des Entwicklungsprozesses von VLP-basierten Impfstoffen sind Assays unverzichtbar, die die Analyse des jeweiligen Zielantigens auf der VLP-Oberfläche ermöglichen. Solche Assays sollten dazu beitragen, die Zusammensetzung eines partikulären Impfstoffs aufzuklären: (i) Sind die VLPs mit dem jeweiligen Oberflächenantigen verziert? (ii) Hat das Oberflächenantigen seine native Struktur beibehalten, wie durch die Epitoperkennung neutralisierender Antikörper (bNAbs) nachgewiesen wurde, und (iii) kann die strukturelle Integrität der VLPs durch den Nachweis des viralen Proteins, das die VLP-Bildung vermittelt, bestätigt werden?
Abbildung 1: Schematische Darstellung eines membranumhüllten VLP. VLPs werden von unreifen Vorläufer-Gag-Kernproteinen gebildet und von einer Lipidmembran umgeben, die von der Wirtszelle abgeleitet ist. Die Antigene, z.B. Hüllglykoproteine, werden in die Lipidmembran eingebaut und auf der Oberfläche des VLP (rechts) angezeigt. Antigen-spezifische Antikörper erkennen das Antigen. Auf der linken Seite ist eine glatzköpfige VLP ohne Antigendekoration zu sehen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Insbesondere VLPs, die aus dem viralen gruppenspezifischen Antigen (Gag) Kernvorläuferprotein p55 des humanen Immunschwächevirus Typ 1 (HIV-1) gebildet werden, sind bevorzugte Gerüste für die Antigenanzeige in der Impfstoffentwicklung, da zahlreiche Antikörper und ELISA-Kits verfügbar sind, die die Quantifizierung dieser VLPs ermöglichen11,12. Die HIV-1-Hüllglykoproteine (Env), nämlich das Transmembranprotein gp41 (gp41-TM) und die lösliche Oberflächeneinheit gp120 (gp120-SU), die Heterodimere bilden, werden in die Membranhülle von Partikeln eingebaut und sind entscheidende Zielantigene für die Entwicklung von Impfstoffen gegen HIV-Infektionen13,14,15 . Die Darstellung neutralisationssensitiver Epitope in diesen Zielantigenen ist eine Voraussetzung, um eine breit neutralisierende Antikörperantwort in Impfstoffen auszulösen. Neben einer gegen die Gag-Proteine gerichteten T-Zell-Antwort gilt dies als wichtiges Korrelat des Schutzes vor einer HIV-Infektion16. Folglich stellt die anschließende Analyse der Qualität der angezeigten Antigene nach dem Design und der Produktion von VLPs, die mit Zielantigenkandidaten verziert sind, einen kritischen Schritt im Prozess der Impfstoffentwicklung dar.
Immunpräzipitation (IP) ist eine weit verbreitete Technik zum Nachweis von Protein-Protein-Interaktionen und zur Aufreinigung von Proteinkomplexen in kleinem Maßstab17. Barret et al. erstmals 1960 über die Entwicklung des UZ berichtet, diese Methode wurde jedoch ständig weiter verbessert. IP ermöglicht das Einfangen und Isolieren eines Zielantigens (Beute) aus einer Lösung durch Verwendung eines antigenspezifischen Antikörpers (Köders), der durch Kopplung an Perlen immobilisiert wird18,19. In diesem Protokoll demonstrieren wir eine Variation der klassischen IP-Anwendung unter Verwendung von membranumhüllten p55 Gag-gebildeten VLPs als Beute und bNAbs, die neutralisationsempfindliche Epitope in den auf der Oberfläche der VLPs angezeigten Hüllproteinen als Köderproteine erkennen. Die erfolgreiche Anwendung dieses VLP-Capture-Assays erleichtert die Vorhersage, ob die getesteten Antigen-positiven VLPs in der Lage sein werden, eine neutralisierende B-Zell-Antwort bei geimpften Personen hervorzurufen. Solche immunogenen Eigenschaften von VLP-basierten Impfstoffkandidaten werden häufig in Kleintiermodellen nachgewiesen20,21,22.
Um die Qualität des neu entwickelten VLP-Impfstoffkandidaten zu beurteilen, wurden VLP-Capture-Assays erfolgreich eingesetzt5,23,24. Die Anzahl der veröffentlichten Methoden ist jedoch begrenzt. Der hier vorgestellte VLP-Capture-Assay beginnt mit der Immobilisierung von Env-spezifischen bNAbs auf Protein-G-konjugierten Kügelchen, die an die Fc-Region von Säugetier-abgeleiteten Antikörpern binden. Typische Matrizen für die Immobilisierung des Antikörpers der Wahl sind Agarose oder Magnetperlen. Magnetische Kügelchen sind jedoch für Anwendungen mit hohem Durchsatz geeignet25. Im nächsten Schritt werden VLPs, die das Zielantigen anzeigen, von bNAb-beschichteten Kügelchen erfasst. Die gebildeten Immunkomplexe, bestehend aus Env-positiven VLPs und immobilisierten bNAbs, werden leicht mit einem Magneten angereichert. Die isolierten Immunkomplexe werden im letzten Schritt eluiert. Anschließend können die VLPs biochemisch charakterisiert werden. Hier führten wir eine Western-Blot-Analyse unter Verwendung von p55 Gag viralen Kernprotein-spezifischen Antikörpern durch, um zu zeigen, dass die gefällten Ziel-Env-Antigene nicht nur die neutralisationsempfindlichen Epitope beherbergten, sondern auch auf Gag-gebildeten VLPs angezeigt wurden. Darüber hinaus erhöht der Nachweis der viralen Kern-Gag-Proteine die Empfindlichkeit des Capture-Assays, da Gag-Proteine in einem VLP häufiger vorkommen als Env. In HIV-1 sind Env-Proteine nur mit einer ein- oder zweistelligen Zahl26 vorhanden, während mehr als 3.500 Gag-Moleküle den Kern eines Partikels bilden27.
Im Vergleich zu anderen Techniken zur Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen28,29 bietet der VLP-Capture-Assay eine alternative Methode für Forschungslaboratorien, die keinen Zugang zu teuren Analyseinstrumenten haben. Beispielsweise können die Transmissionselektronenmikroskopische Analyse (TEM), die Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie (SPR) und die Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) kostenintensiv sein. Der hier vorgestellte Capture-Assay ermöglicht auch die spätere Unterwerfung von gefangenen Antigen-positiven VLP-Proben zur weiteren Proteincharakterisierung, z. B. unter Verwendung von Gelelektrophorese, Immunoblotting, Elektronenmikroskopie bzw. Massenspektrometrie (MS). In Anbetracht der Tatsache, dass die native Struktur des Zielantigens während des VLP-Capture-Assays erhalten bleibt, können auch die Leistung einer nativen PAGE und nachfolgende Immunoblotting-Techniken genutzt werden.
Der VLP-Capture-Assay stellt eine einfach zu bedienende und empfindliche Methode dar, um die Dekoration von VLPs mit Zielantigenen, die neutralisationsempfindliche Epitope freilegen, und damit ihren Nutzen als zukünftige Impfstoffkandidaten zu untersuchen.
Protocol
1. Probenvorbereitung
- Säen Sie die Suspensionszelllinien des VLP-Produzenten, die aus 293-F-Zellen gewonnen wurden, die HIV-Strukturgene exprimieren, allein oder zusammen mit env 30 bei einer niedrigen Zelldichte von 0,5 x 106 Zellen pro ml in 293-F-Expressionsmedium.
- Lassen Sie sie sich für 3-4 Tage bei 37 °C und 8% CO2 in einer Shaker-Inkubator-Rotation mit einer Umlaufbahn von 5 cm und 135 Schuss pro Minute (U/min) ausdehnen.
- Pelletieren Sie die Produzentenzellen durch Zentrifugation bei 100 x g für 5 min. Filtern Sie den geklärten Überstand, um Restzellen und Zelltrümmer mit 0,45 μm Polyvinylidenfluorid (PVDF) Membranspritzenfiltern zu entfernen, um zellfreie Zellkulturüberstände (CFSN) zu erhalten.
HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden. CFSN kann über Nacht bei 4 °C gelagert werden. - Verwenden Sie entweder das CFSN direkt für das Experiment oder Pellet-VLPs ab 35 ml CFSN unter Verwendung von Ultrazentrifugation (112.700 x g, 4 °C, 1,5 h).
- Bei der Ultrazentrifugation den Überstand verwerfen und die VLP-Pellets in 200 μL 15% (w/v) Trehaloselösung pro Zentrifugenröhrchen suspendieren.
HINWEIS: Das VLP-Pellet ist mit bloßem Auge oft nicht sichtbar. Das Protokoll kann hier pausiert werden. VLPs können bei -80 °C gelagert werden. - Bestimmen Sie vor dem VLP-Capture-Assay die viralen Kernproteinkonzentrationen in den VLP-haltigen Proben mit einem ELISA. Dieser Schritt ist wichtig, um die Eingabe des Erfassungsassays zu standardisieren.
2. VLP-Capture-Assay
HINWEIS: Eine Übersicht über den Workflow ist in Abbildung 2 dargestellt.
- Hängen Sie die Magnetperlen auf, indem Sie entweder nach oben und unten pipettieren oder auf einem Rotator mit 50 U / min für mindestens 5 minuten mischen.
- Bereiten Sie in der Zwischenzeit die Antikörperlösung vor, die die bNAbs enthält. Verwenden Sie 10 μg jedes bNAb in 200 μL Antikörperbindung und Waschpuffer (siehe Materialtabelle) pro Reaktion.
HINWEIS: Die Antikörpermengen können je nach Affinität des bNAb und Antigendekorationsdichte auf den verwendeten VLPs variieren. - Verwenden Sie 50 μL der magnetischen Perlenlösung (siehe Materialtabelle) pro Reaktion und übertragen Sie die Kügelchen in ein 1,5 ml Reaktionsröhrchen. Legen Sie die Rohre auf das magnetische Trenngestell.
HINWEIS: Alternativ kann für jedes Rohr ein starker Einzelmagnet verwendet werden, um die Perlen vom Überstand zu trennen. - Warten Sie einige Minuten, bis sich die Perlen an der Röhrenwand sammeln, um sicherzustellen, dass alle Perlen gesammelt sind. Entfernen Sie den Überstand.
- Entfernen Sie den Magneten und suspendieren Sie die Perlen in 200 μL der in Schritt 2.2 hergestellten bNAb-Lösung. Inkubieren Sie für 30 min bis 3 h Mischen auf einem Rotator bei 50 U / min bei Raumtemperatur.
- Legen Sie die Reaktionsrohre wieder in das magnetische Trenngestell, warten Sie und entfernen Sie den Überstand.
- Entfernen Sie die Röhrchen vom Magneten und waschen Sie die Kügelchen, indem Sie sie in 200 μL Antikörperbindung und Waschpuffer wiederverwenden.
- Wiederholen Sie Schritt 2.4. Entfernen Sie so viel Waschpuffer wie möglich.
- Fügen Sie die Proben zu den perlengebundenen bNAbs hinzu.
HINWEIS: Der VLP-Input für den Capture-Assay mit HIV-abgeleiteten Partikeln sollte mindestens 15 ng virales Kernprotein pro Reaktion betragen. Die VLP-Mengen können je nach Affinität des bNAb und der Antigendekorationsdichte der verwendeten VLPs variieren. - Wenn das in Schritt 2.9 hinzugefügte Probenvolumen unter 1 ml liegt, fügen Sie PBS hinzu, um das Probenvolumen auf 1 ml einzustellen. Hängen Sie die Perlen vorsichtig durch Pipettieren auf.
- Inkubieren Sie die Proben und Kügelchen für 2,5 h auf einem Rotator bei Raumtemperatur. Stellen Sie sicher, dass die Perlen in Suspension bleiben und die Lösung während der Inkubation gründlich gemischt wird.
- Legen Sie die Rohre auf den Magneten und entfernen Sie den Überstand.
- Waschen Sie die Magnetperlen, indem Sie sie in 200 μL Waschpuffer suspendieren (siehe Materialtabelle). Wiederholen Sie den Waschschritt dreimal.
- Suspendieren Sie die Kügelchen in 100 μL Waschpuffer und geben Sie die Suspension in ein sauberes (hitzebeständiges) Reaktionsrohr.
- Legen Sie das Rohr auf das magnetische Trenngestell (siehe Materialtabelle) und entfernen Sie den Überstand vollständig.
- Bereiten Sie denaturierte SDS-PAGE-Proben gemäß den Schritten 2.16.1-2.16.2 oder nicht denaturierte Proben vor, indem Sie die VLPs aus den magnetischen Kügelchen gemäß den Schritten 2.16.3-2.16.5 eluieren.
- Zur Herstellung denaturierter SDS-PAGE-Proben werden die Kügelchen in 20-80 μL Laemmli-Puffer (0,8 μL Laemmli-Puffer pro 1 ng p55 Gag Assay Input) suspendiert und bei 95 °C für 5 min inkubiert.
- Fahren Sie direkt mit SDS-PAGE fort oder lagern Sie die Proben bei -20 °C.
ACHTUNG: Laemmli-Puffer enthält 2-Mercaptoethanol und Natriumdodecylsulfat. Tragen Sie Schutzhandschuhe und Augenschutz. Vermeiden Sie den Kontakt mit Haut, Augen und Kleidung. Dämpfe nicht einatmen. Arbeiten Sie in einem gut belüfteten Raum, z. B. einem Abzug.
HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden. - Alternativ können Sie einen nicht denaturierenden Elutionsschritt durchführen, um VLPs mit konservierter nativer Proteinstruktur zu erhalten.
- 25 μL Elutionspuffer (häufig mit den Kügelchen versehen) zu den Magnetperlen geben und 2-5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Entfernen Sie die Perlen und geben Sie das Eluat in einen sauberen Schlauch. Verwenden Sie das Eluat für nachfolgende Assays oder lagern Sie es bei 4 °C.
HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden.
3. Analyse von erfassten VLP-Proben
HINWEIS: Für die Analyse der erfassten VLPs führen Sie eine SDS-PAGE und anschließend eine Western Blot-Analyse durch31,32.
- Legen Sie die Probenröhrchen auf das Magnetgestell, um die Kügelchen von der Lösung zu trennen.
- Laden Sie 10 μL jeder Probe in einzelne Vertiefungen des Gels.
HINWEIS: In diesem Protokoll wurden virale p55 Gag-Kernproteine unter Verwendung von polyklonalen Kaninchenantikörpern gegen HIV Gag und sekundärem polyklonaler Hühner-Anti-Kaninchen-IgG, gekoppelt an Meerrettichperoxidase (HRP) -Antikörper, nachgewiesen. Virale Kernproteine wurden mittels Chemilumineszenz-Detektion visualisiert.
Abbildung 2: Schematische Darstellung der wichtigsten Schritte des VLP-Capture-Assays unter Verwendung zellfreier Überstände. (1) Der VLP-Capture-Assay beginnt mit der Bindung der HIV-1 bNAbs an das Protein G-gekoppelte magnetische Kügelchen. Inzwischen wird die VLP-Lösung mit einer definierten p55-Konzentration hergestellt. Der zellfreie Kulturüberstand besteht aus einer Mischung von p55 Gag VLPs, Wirtszellproteinen und Nukleinsäuren. (2) Die an bNAbs und die VLP-Lösung gekoppelten magnetischen Kügelchen werden in ein 1,5 ml Reaktionsröhrchen überführt, gefolgt von einer Inkubation unter Rotation. (3) Antigen-anzeigende VLPs werden von den bNAbs-beschichteten Kügelchen eingefangen. Die Trennung dieser Immunkomplexe von aus Wirtszellen stammenden Kontaminanten erfolgt in einem Magnetfeld. (4) Der Überstand wird durch Pipettieren entfernt, und die Kügelchen werden dreimal gewaschen, um ungebundene VLPs zu entfernen. (5) Im nächsten Schritt wird den Immunkomplexen, die aus mit bNAbs beschichteten Magnetperlen und gefangenen VLPs bestehen, ein reduzierender Proteinbeladungspuffer zugesetzt. (6) Durch das Kochen der Probe werden bNAbs und das Zielantigen von den magnetischen Kügelchen dissoziiert und die VLPs lysiert. (7) Magnetische Kügelchen werden in einem Magnetfeld von der Lösung getrennt. (8) Die Proteinproben werden der SDB-SEITE unterzogen. (9) Die Western-Blot-Analyse wird durchgeführt, um virale p55-Gag-Kernproteine nachzuweisen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Representative Results
Abbildung 3 zeigt ein repräsentatives Ergebnis von VLPs, die zuerst aus CFSN- bzw. VLP-Pellets mit bNAbs gefangen und anschließend einer Western-Blot-Analyse unterzogen wurden, um virale Kernproteine nachzuweisen. Die für den Capture-Assay verwendeten Kügelchen wurden mit drei verschiedenen bNAbs beschichtet, die gegen neutralisationsempfindliche Epitope der Env-Glykoproteine bzw. Isotyp-Antikörper gerichtet sind, die als Negativkontrollen dienen. Unter Verwendung von Isotyp-Antikörper-beschichteten Kügelchen konnten keine Gag-Proteine in Proben nachgewiesen werden, die Env-negative (kahle VLPs) oder Env-anzeigende VLPs mit Western-Blot-Analyse enthielten. Dies zeigte, dass die unspezifische Bindung von VLPs an Perlen, die mit menschlichen Antikörpern beschichtet waren, keine VLP-Erfassung vermittelte. Kahle VLPs waren auch nicht an bNAbs-beschichtete Kügelchen gebunden, und folglich waren wiederum keine Gag-Proteine nachweisbar. Im Gegensatz dazu fingen alle drei bNAbs VLPs ein, die Env-Proteine (Env-VLPs) zeigten, und daher konnten Gag-Proteine anschließend leicht nachgewiesen werden. Wie in Abbildung 3 dargestellt, kann der Capture-Assay verwendet werden, um das Zielantigen mit VLPs in CFSN- bzw. pelletierten VLP-Proben zu analysieren.
Abbildung 3: Nachweis von neutralisationsempfindlichen Epitopen in HIV-1-Hüllglykoproteinen, dargestellt auf p55 Gag-gebildeten VLPs unter Verwendung breit neutralisierender Antikörper. Repräsentative Ergebnisse der Western-Blot-Analyse mit viralen Gag-Core-Protein-spezifischen Antikörpern nach Durchführung eines VLP-Capture-Assays mit drei verschiedenen breit neutralisierenden Antikörpern (bNAb 1, bNAb 2 und bnAb 3), die auf Epitope innerhalb der HIV-1-Hüllglykoproteine (Env) abzielen. Menschliche Antikörper vom Isotyp, die aus menschlichen Seren gepoolt wurden, dienten als Negativkontrollen. Zellkulturüberstände wurden aus Suspensionszellkulturen geerntet, die VLPs mit Env-Proteinen (Env-VLPs) bzw. kahlen VLPs (Env-negativ) produzierten, sowie aus naiven Zellen, die keine viralen Proteine exprimierten (Mock). Sowohl die Überstände aus der kahlen VLP-Produzentenzellkultur als auch aus der Scheinzellkultur dienten als Negativkontrollen. Überstände wurden durch Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit und anschließender Filtration von kontaminierenden Zellen befreit, um zellfreie Überstände (CFSN) für die Analyse zu erhalten. Nach der Immunpräzipitation wurde die Western Blot-Analyse mit polyklonalen Kaninchenantikörpern durchgeführt, die gegen Gag und sekundäre Anti-Kaninchen-IgG-HRP-Konjugate gerichtet waren. Das scheinbare Molekulargewicht in Kilodaltonen (kDa), wie es vom Molekulargewichtsmarker (MW) aus sichtbar ist, ist links dargestellt. Die Pfeile zeigen das nachgewiesene Vorläuferprotein p55 Gag an. (A) Für jede Probe wurde CFSN, das 100 ng Gag-Protein enthielt, auf den Capture-Assay aufgetragen, um die Eingangsmenge an VLPs zu standardisieren. CFSN wurde direkt mit Antikörper-beschichteten Kügelchen inkubiert. (B) VLP-Pellets wurden durch Ultrazentrifugation von CFSN gewonnen. Pellets, die 100 ng Gag-Protein enthielten, wurden unter Verwendung von Isotyp-Antikörpern und bNAb 3 auf den Capture-Assay aufgetragen. Proben für bNAb 1 und bNAb 2 enthielten nur 25 ng Gag. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Discussion
Bewerten Sie vor dem VLP-Capture-Assay die Bildung von VLPs und die Expression des Zielantigens in den VLP-Produzentenzelllinien. Instrumentelle Methoden sind die durchflusszytometrische Analyse der Zelloberflächenexpression des Antigens sowie der antigen- und virale Kernprotein-spezifische ELISA von CFSN und pelletierten VLPs.
Kritische Schritte des VLP-Capture-Assays sind die Beschichtung der Kügelchen mit Capture-Antikörpern - hier bNAbs - und das anschließende Einfangen der Antigen-positiven VLPs durch die Antikörper-beschichteten Kügelchen. Die erfolgreiche Beschichtung der Kügelchen mit Antikörpern hängt von der Wahl des konjugierten Immunglobulin (Ig)-bindenden Proteins ab. Die Donorspezies sowie die Ig-Klasse der Antikörper bestimmen, ob Protein G- oder Protein A-konjugierte Kügelchen bevorzugt sind. Für die meisten Spezies und Ig-Klassen ist Protein G der Ligand der Wahl33. Als Alternative zu Protein A/G-konjugierten Kügelchen stehen Streptavidinkügelchen für die Beschichtung mit biotinylierten Antikörpern zur Verfügung. Kügelchen können auch kovalent mit Antikörpern gekoppelt sein.
Das Einfangen der VLPs durch Antikörper-beschichtete Kügelchen hängt von einer gründlichen Durchmischung, ausreichender Inkubationszeit, Antigenhäufigkeit und Affinität des Einfangantikörpers ab. Nach unserer Erfahrung wird eine gründliche Vermischung der antikörperbeschichteten Kügelchen mit den VLP-Proben am besten durch die Nutzung von Volumina >500 μL in 1,5 ml Röhrchen unter Rotation für mindestens 2 h bei Raumtemperatur oder 4 °C erreicht. Eine weitere potenzielle Hürde ist die zu geringe Menge an VLPs in der Stichprobe. Für Antikörper, die das Zielantigen stark binden, ermöglichen VLP-Einträge von nur 15 ng Gag-Protein in der Regel leicht nachweisbare Mengen der viralen Kernproteine unter Verwendung der Western Blot-Analyse. Antikörper mit geringer Affinität erfordern jedoch höhere Inputmengen, z. B. 100 ng Gag-Protein, um schlüssige Ergebnisse zu erhalten (Abbildung 3, bNAb 3).
Einige Oberflächenantigene sind anfällig für den Abbau von Protease. Hier empfehlen wir die Zugabe von Proteaseinhibitoren zu den VLP-Proben und die Inkubation bei 4 °C. Eine unspezifische Adhäsion von Wirtszellproteinen und VLPs an den perlengebundenen Antikörpern wird selten beobachtet und sollte durch geeignete Negativkontrollen ausgeschlossen werden, wie wir hier anhand von Mock- und Kahlen-VLP-Proben und Isotyp-Kontrollantikörpern gezeigt haben. Strategien zur Reduzierung unspezifischer Bindungen umfassen erweiterte Waschschritte und die Zugabe von Kasein im Waschpuffer34. Darüber hinaus kann der Capture-Assay auch verbessert werden, indem das optimale Verhältnis von Antikörper zu Antigen-anzeigender VLP-Menge bestimmt wird.
Im letzten Schritt des VLP-Capture-Assays beschreiben wir die Elution der Immunkomplexe aus den Kügelchen durch Sieden in reduzierendem Laemmli-Puffer. Während dieses Schritts werden die VLPs zerlegt und die Capture-Antikörper und Zielantigene von den Kügelchen getrennt. Insbesondere muss sich die Spenderspezies des primären Antikörpers, die in der anschließenden Western-Blot-Analyse verwendet wird, vom Spender des Capture-Antikörpers unterscheiden, um den unbeabsichtigten Nachweis des Capture-Antikörpers durch die sekundären Anti-Donor-IgG-HRP-konjugierten Antikörper zu vermeiden.
Der hier vorgestellte VLP-Capture-Assay bietet eine einfach zu bedienende und empfindliche Methode zum Nachweis neutralisationsempfindlicher Epitope in strukturell intakten Zielantigenen, die auf VLP-Oberflächen angezeigt werden. Der Capture-Assay ermöglicht jedoch keine direkte Epitopquantifizierung. Elisa, die mit bNAbs durchgeführt werden, sind für diesen Zweck von entscheidender Bedeutung und sollten parallel durchgeführt werden, insbesondere wenn untersuchte VLPs in präklinischen Studien mit Tiermodellen verwendet werden sollen35. Dies ist von entscheidender Bedeutung, da die Menge des Antigens direkt mit der Auslösung einer neutralisierenden Antikörperantwort bei immunisierten Tieren korrelieren kann, wie für porcine Circovirus Typ 2 (PCV2)-Impfstoffe gezeigt wurde36.
Ein idealer Impfstoff sollte zur Auslösung von bNAbs führen, die auf die neutralisationsempfindlichen Epitope auf der Virionoberfläche abzielen. Die Analyse dieser Epitope, insbesondere unter Bezugnahme auf ihre volle strukturelle Integrität auf der partikulären Impfstoffoberfläche, ist entscheidend für die Identifizierung potenzieller Impfstoffkandidaten. Dies gilt nicht nur für HIV-abgeleitete VLPs, sondern auch für viele andere VLP-Impfstoffe in der Entwicklung37. Prominente VLP-basierte Impfstoffe werden beispielsweise von unbehüllten oder Kapsid-Elternviren wie dem humanen Papillomavirus (HPV) abgeleitet. Im Gegensatz zu HIV-1-Partikeln, die nur aus einem strukturellen Kernprotein, nämlich p55 Gag, bestehen und von der Membran der VLP-Produzentenzelle umhüllt sind, bestehen HPV-Partikel nur aus einem oder zwei strukturellen Kernproteinen38,39. Ebenso und wie hier für umhüllte VLPs dargestellt, kann der VLP-Capture-Assay auch auf den Nachweis von neutralisationsempfindlichen Epitopen von nicht umhüllten VLPs anwendbar sein.
Als Alternative zum Capture-Assay können VLP-Proben direkt einer nativen PAGE unterzogen werden, gefolgt von einer Western-Blot-Analyse mit bNAbs und geeigneten sekundären Antikörpern, die an HRP40 gekoppelt sind. Für die Analyse von HIV Env-dekorierten VLPs ist dieser Assay jedoch weniger empfindlich, da nur eine geringe Anzahl von Antigenproteinen pro VLP zu erwarten ist. Im Gegensatz dazu ermöglicht der Capture-Assay den Nachweis der Kernproteine, die bei großen Mengen pro VLP reichlich vorhanden sind, bei HIV-abgeleiteten VLPs bilden mehr als 3.500 Gag-Proteine ein VLP27. Dies ermöglicht den sehr empfindlichen indirekten Nachweis von Epitopen in Env, die auch bei niedrigen Dichten auf VLPs angezeigt werden.
Die Anzahl der etablierten Methoden zur Untersuchung neutralisationsempfindlicher Epitope in Oberflächenantigenen von VLPs ist begrenzt. Die Markierung der auf den VLPs angezeigten Antigene ist mit epitopspezifischen Antikörper-Fluorophor-Konjugaten und dem anschließenden Nachweis durch Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) möglich, was den Nachweis und die Quantifizierung von VLPs ermöglicht. Diese Methode wurde auch erfolgreich für Exosomen mit Zelloberflächenmarkern entwickelt und optimiert41. Die Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie (SPR) ermöglicht auch die Analyse von Wechselwirkungen zwischen unkonjugierten neutralisierenden Antikörpern und verwandten Epitopen, die auf VLPs präsentiert werden. Obwohl sie nicht für Analysen mit höherem Durchsatz geeignet sind, können VLPs auch mit bNAbs markiert werden, die an Goldpartikel gekoppelt sind, und einer anschließenden Transmissionselektronenmikroskopischen (TEM)-Untersuchung42.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der VLP-Capture-Assay einige erhebliche Vorteile bietet: (i) Bewertung der strukturellen Integrität von neutralisationsempfindlichen Epitopen auf der Oberfläche von VLPs, (ii) sensitiver und indirekter Nachweis von Antigenen auch bei geringer Dichte auf VLPs und (iii) die Methode erfordert keine kostenintensive Analyseausrüstung.
Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keinen Interessenkonflikt haben.
Acknowledgments
Unterstützt wurde diese Arbeit durch ein Stipendium des Bundesministeriums für Bildung und Forschung, Förderprogramm Forschung an Fachhochschulen, Auftragsnummern 13FH767IA6 und 13FH242PX6 an JS. Die Abbildungen 1 und 2 wurden mit BioRender.com erstellt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL reaction tubes | Eppendorf | ||
| 10x PBS | gibco | 70011044 | |
| 4%–15% Mini-PROTEAN TGX stain-free protein gels | BioRad | 4568085 | |
| Antibodies (bnAbs) | Polymun Scientic | ||
| Isotype control antibody | invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | 02-7102 | |
| Chemidoc XRS+ imaging system | BioRad | 1708265 | |
| Chicken anti-rabbit IgG HRP-coupled | Life technologies | A15987 | 1:5000 in TBS-T + 2 % (w/v) powdered milk |
| Dynabeads Protein G Immunoprecipitation Kit | invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | 10007D | includes buffers and washing solutions |
| FreeStyle 293-F cells | invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | R790-07 | |
| FreeStyle 293 Expression Medium | invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | 12338026 | |
| Gel blotting papers | Whatman | GB005 | |
| Glycine | Carl Roth | 0079 | blotting buffer |
| Magnetic separation rack | New England Biolabs | S1509S | for 12 x 1.5 mL or 6 x 1.5 mL tubes |
| Methanol | Carl Roth | 4627 | blotting buffer |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell electrophoresis system | BioRad | ||
| Optima XE-90 ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| PageRuler prestained protein ladder | Thermo Scientific | 26616 | |
| Polyvinylidene fluoride (PVDF) syringe filters, 0.45 µm | Carl Roth | KC89.1 | |
| Powdered milk | Carl Roth | T145 | blocking buffer |
| PVDF transfermembrane, 0.45 µm | Carl Roth | T830.1 | |
| QuickTiter HIV p24 ELISA | Cell Biolabs | VPK-108-H | |
| Rabbit polyclonal to HIV1 p55 + p24 + p17 | abcam | ab63917 | 1:2000 in TBS-T + 2 % (w/v) powdered milk |
| Rotator | Heidolph | REAX2 | |
| ROTI Load 1 (laemmli buffer) | Carl Roth | K929.1 | 4x concentrated reducing protein gel loading buffer |
| ROTIPHORESE 10x SDS-PAGE | Carl Roth | 3060 | |
| Sodium chloride | Carl Roth | 3957 | TBS-T buffer |
| SuperSignal West Pico PLUS chemiluminescent substrate | Thermo Scientific | 34579 | |
| SW28 rotor | Beckman Coulter | ||
| Thermomixer | Cel Media | basic | |
| Trans-Blot Turbo | BioRad | ||
| Trehalose dihydrate | Carl Roth | 8897.2 | |
| TRIS | Carl Roth | 5429 | blotting buffer |
| TRIS hydrochloride | Carl Roth | 9090 | TBS-T buffer |
| Tween-20 | Carl Roth | 9127 | TBS-T buffer |
| Ultra Clear centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344058 |
References
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