Summary
Nous présentons ici un protocole pour détecter les épitopes de neutralisation sur les particules virales (VLP) présentant des antigènes. L’immunoprécipitation des VLP dérivés du virus de l’immunodéficience humaine (VIH) est réalisée à l’aide d’anticorps monoclonaux spécifiques aux glycoprotéines d’enveloppe couplés à des billes magnétiques conjuguées à la protéine G. Les VLP capturés sont ensuite soumis à une analyse SDS-PAGE et Western blot utilisant des anticorps spécifiques de la protéine de base virale Gag.
Abstract
Le test de capture de particules de type viral (VLP) est une méthode d’immunoprécipitation, communément appelée « test de traction » utilisée pour purifier et isoler les VLP présentant des antigènes. Les anticorps spécifiques de l’antigène de surface sont couplés et donc immobilisés sur une matrice solide et insoluble telle que des billes. En raison de leur grande affinité avec l’antigène cible, ces anticorps peuvent capturer des VLP décorés de l’antigène apparenté ancré dans l’enveloppe membranaire des VLP. Ce protocole décrit la liaison d’anticorps spécifiques à l’antigène à des billes magnétiques conjuguées à la protéine A ou G. Dans notre étude, les VLP dérivés du virus de l’immunodéficience humaine (VIH) formés par l’antigène spécifique du groupe (Gag) protéine précurseur du noyau viral p55 Gag et affichant les glycoprotéines d’enveloppe (Env) du VIH sont examinés. Les VLP sont capturés à l’aide d’anticorps largement neutralisants (bNAbs) dirigés contre les épitopes sensibles à la neutralisation dans Env. Le test de capture VLP décrit ici représente une méthode sensible et facile à réaliser pour démontrer que (i) les VLP sont décorés avec l’antigène cible respectif, (ii) l’antigène de surface a conservé son intégrité structurelle comme démontré par la liaison spécifique à l’épitope des bNAbs utilisés dans le test et (iii) l’intégrité structurelle des VLP révélée par la détection des protéines Gag dans une analyse par transfert Western ultérieure. Par conséquent, l’utilisation de bNAbs pour l’immunoprécipitation facilite la prédiction de la capacité des vaccins VLP à provoquer une réponse neutralisante des lymphocytes B chez les humains vaccinés. Nous prévoyons que ce protocole fournira à d’autres chercheurs une approche expérimentale précieuse et simple pour examiner les vaccins potentiels à base de VLP.
Introduction
Les particules de type viral (VLP) ressemblent à la structure native des particules virales tout en manquant du génome viral, offrant ainsi un profil de sécurité élevé1,2. Les VLP représentent une classe individuelle de vaccins de plus en plus développés en raison de leur immunogénicité élevée3,4,5,6,7. C’est particulièrement le cas pour les VLP enveloppés de membrane, permettant l’affichage non seulement d’antigènes de surface viraux homologues, mais aussi d’antigènes hétérologues tels que les antigènes tumoraux8,9,10. La figure 1 donne un aperçu exemplaire de la structure d’un VLP enveloppé décoré d’antigènes. Au cours du processus de développement des vaccins à base de VLP, des tests sont indispensables pour permettre l’analyse de l’antigène cible respectif affiché sur la surface du VLP. De tels essais devraient être essentiels pour élucider la composition d’un vaccin particulaire: (i) Les VLP sont-ils décorés avec l’antigène de surface respectif? (ii) L’antigène de surface a-t-il conservé sa structure native comme l’a démontré la reconnaissance épitopique des anticorps neutralisants (bNAbs) et (iii) l’intégrité structurelle des VLP peut-elle être confirmée en raison de la détection de la protéine virale médiant la formation de VLP?
Figure 1 : Illustration schématique d’un VLP enveloppé d’une membrane. Les VLP sont formés par des protéines de noyau Gag précurseurs immatures et entourés d’une membrane lipidique dérivée de la cellule hôte. Les antigènes, par exemple les glycoprotéines d’enveloppe, sont incorporés dans la membrane lipidique et affichés à la surface du VLP (à droite). Les anticorps spécifiques de l’antigène reconnaissent l’antigène. Sur la gauche, un VLP chauve sans décoration antigénique est montré. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
En particulier, les VLP formés par la protéine précurseur de base p55 de l’antigène spécifique du groupe viral (Gag) du virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) sont des échafaudages préférés pour l’affichage de l’antigène dans le développement de vaccins, car de nombreux anticorps et des kits ELISA sont disponibles, permettant la quantification de ces VLP11,12. Les glycoprotéines de l’enveloppe DU VIH-1 (Env), à savoir la protéine transmembranaire gp41 (gp41-TM) et l’unité de surface soluble gp120 (gp120-SU) formant des hétérodimères, sont incorporées dans l’enveloppe membranaire des particules et sont des antigènes cibles cruciaux pour le développement de vaccins contre l’infection par le VIH13,14,15 . L’affichage d’épitopes sensibles à la neutralisation dans ces antigènes cibles est une condition préalable pour provoquer une réponse anticorps largement neutralisante chez les vaccinés. Outre une réponse des lymphocytes T dirigée contre les protéines Gag, celle-ci est considérée comme un corrélat important de la protection contre l’infection par le VIH16. Par conséquent, et lors de la conception et de la production de VLP décorés d’antigènes candidats cibles, l’analyse ultérieure de la qualité des antigènes affichés représente une étape critique dans le processus de développement d’un vaccin.
L’immunoprécipitation (IP) est une technique largement utilisée pour la détection des interactions protéine-protéine et la purification de complexes protéiques à petite échelle17. Barret et al. a fait l’objet d’un premier rapport sur le développement de la propriété intellectuelle en 1960, mais cette méthode a été constamment améliorée. L’IP permet la capture et l’isolement d’un antigène cible (proie) d’une solution en utilisant un anticorps spécifique à l’antigène (appât) immobilisé par couplage à des billes18,19. Dans ce protocole, nous démontrons une variante de l’application IP classique en utilisant des VLP p55 formés par bâillon enveloppés de membrane comme proies et des bNAbs qui reconnaissent les épitopes sensibles à la neutralisation dans les protéines d’enveloppe affichées à la surface des VLP comme protéines d’appât. L’application réussie de ce test de capture VLP facilite la prédiction de la capacité des VLP à l’antigène positif testé à provoquer une réponse neutralisante des cellules B chez les personnes vaccinées. De telles propriétés immunogènes des candidats vaccins à base de VLP sont fréquemment démontrées dans de petits modèles animaux20,21,22.
Afin d’évaluer la qualité du nouveau candidat vaccin VLP, les tests de capture VLP ont été utilisés avec succès5,23,24. Cependant, le nombre de méthodes publiées est limité. Le test de capture VLP présenté ici commence par l’immobilisation de bNAbs spécifiques à Env sur des billes conjuguées à la protéine G, qui se lient à la région Fc des anticorps dérivés de mammifères. Les matrices typiques pour l’immobilisation de l’anticorps de choix sont l’agarose ou les billes magnétiques. Cependant, les billes magnétiques sont favorables aux applications à haut débit25. Dans l’étape suivante, les VLP affichant l’antigène cible sont capturés par des billes recouvertes de bNAb. Les complexes immunitaires formés constitués de VLP Env-positifs et de bNAbs immobilisés sont facilement enrichis à l’aide d’un aimant. Les complexes immunitaires isolés sont élués dans la dernière étape. Par la suite, les VLP peuvent être caractérisés biochimiquement. Ici, nous avons effectué une analyse par transfert Western en utilisant des anticorps spécifiques à la protéine de base virale p55 Gag pour démontrer que les antigènes Env cibles précipités abritaient non seulement les épitopes sensibles à la neutralisation, mais étaient également affichés sur les VLP formés par Gag. De plus, la détection des protéines Gag du noyau viral augmente la sensibilité du test de capture puisque les protéines Gag sont plus abondantes que les protéines Env dans un VLP. Dans le VIH-1, les protéines Env ne sont présentes qu’à un nombre à un ou deux chiffres26, alors que plus de 3 500 molécules Gag forment le noyau d’une particule27.
Comparé à d’autres techniques d’examen des interactions protéine-protéine28,29, le test de capture VLP offre une méthode alternative pour les laboratoires de recherche n’ayant pas accès à des instruments d’analyse coûteux. Par exemple, l’analyse microscopique électronique en transmission (TEM), la spectroscopie par résonance plasmonique de surface (SPR) et l’analyse de suivi des nanoparticules (NTA) peuvent être coûteuses. Le test de capture présenté ici permet également de soumettre ultérieurement des échantillons de VLP à antigène positif capturés pour une caractérisation plus poussée des protéines, par exemple en utilisant l’électrophorèse sur gel, l’immunoblotting, la microscopie électronique et la spectrométrie de masse (SEP), respectivement. Étant donné que la structure native de l’antigène cible est préservée pendant le test de capture VLP, la performance d’un PAGE natif et des techniques d’immunobuvardage ultérieures peut également être utilisée.
Le test de capture VLP représente une méthode facile à utiliser et sensible pour examiner la décoration des VLP avec des antigènes cibles exposant des épitopes sensibles à la neutralisation, et donc leur utilité en tant que futurs candidats vaccins.
Protocol
1. Préparation de l’échantillon
- Ensemencez les lignées cellulaires de suspension productrices de VLP dérivées de cellules 293-F exprimant des gènes structurels du VIH seuls ou de concert avec env 30 à une faible densité cellulaire de 0,5 x 106 cellules par mL dans un milieu d’expression 293-F.
- Laissez-les se dilater pendant 3-4 jours à 37 °C et 8% de CO2 dans une rotation d’incubateur agitateur avec une orbite de 5 cm et 135 tours par minute (tr / min).
- Granulés les cellules productrices par centrifugation à 100 x g pendant 5 min. Filtrer le surnageant clarifié pour éliminer les cellules résiduelles et les débris cellulaires à l’aide de filtres à seringue à membrane de fluorure de polyvinylidène (PVDF) de 0,45 μm pour obtenir un surnageant de culture cellulaire sans cellule (CFSN).
REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici. Le CFSN peut être conservé pendant la nuit à 4 °C. - Utilisez le CFSN directement pour l’expérience ou des VLP à granulés à partir de 35 mL de CFSN en utilisant l’ultracentrifugation (112 700 x g, 4 °C, 1,5 h).
- Lors de l’ultracentrifugation, jeter le surnageant et suspendre les pastilles de VLP dans 200 μL de solution de tréhalose à 15 % (p/v) par tube de centrifugation.
REMARQUE: La pastille VLP n’est souvent pas visible à l’œil nu. Le protocole peut être mis en pause ici. Les VLP peuvent être stockés à -80 °C. - Avant le test de capture VLP, déterminez les concentrations de protéines virales dans les échantillons contenant du VLP à l’aide d’un ELISA. Cette étape est importante pour normaliser l’entrée du test de capture.
2. Test de capture VLP
Remarque : Une vue d’ensemble du flux de travail est illustrée à la figure 2.
- Suspendez les billes magnétiques en pipetant de haut en bas ou en mélangeant sur un rotateur à 50 tr/min pendant au moins 5 min.
- Pendant ce temps, préparez la solution d’anticorps contenant les bNAbs. Utiliser 10 μg de chaque bNAb dans 200 μL de tampon de liaison et de lavage des anticorps (voir tableau des matériaux) par réaction.
REMARQUE: Les quantités d’anticorps peuvent varier en fonction de l’affinité du bNAb et de la densité de décoration de l’antigène sur les VLP utilisés. - Utiliser 50 μL de la solution de billes magnétiques (voir tableau des matériaux) par réaction et transférer les billes dans un tube de réaction de 1,5 mL. Placez les tubes sur le rack de séparation magnétique.
REMARQUE: Alternativement, un aimant unique puissant peut être utilisé pour chaque tube pour séparer les perles du surnageant. - Attendez quelques minutes jusqu’à ce que les perles se rassemblent à la paroi du tube pour vous assurer que toutes les perles sont collectées. Retirez le surnageant.
- Retirez l’aimant et suspendez les billes dans 200 μL de la solution de bNAb préparée à l’étape 2.2. Incuber pendant 30 min à 3 h en mélangeant sur un rotateur à 50 tr/min à température ambiante.
- Placez à nouveau les tubes de réaction dans la grille de séparation magnétique, attendez et retirez le surnageant.
- Retirez les tubes de l’aimant et lavez les billes en les remettant en suspension dans 200 μL de tampon de liaison et de lavage des anticorps.
- Répétez l’étape 2.4. Retirez autant de tampon de lavage que possible.
- Ajoutez les échantillons aux bNAbs liés aux billes.
REMARQUE: L’entrée VLP pour le test de capture utilisant des particules dérivées du VIH doit être d’au moins 15 ng de protéine de base virale par réaction. Les quantités de VLP peuvent varier en fonction de l’affinité du bNAb et de la densité de décoration de l’antigène sur les VLP utilisés. - Si le volume d’échantillon ajouté à l’étape 2.9 est inférieur à 1 mL, ajoutez PBS pour ajuster le volume d’échantillon à 1 mL. Suspendez doucement les perles par pipetage.
- Incuber les échantillons et les billes pendant 2,5 h sur un rotateur à température ambiante. Assurez-vous que les perles restent en suspension et que la solution est bien mélangée pendant l’incubation.
- Placez les tubes sur l’aimant et retirez le surnageant.
- Lavez les billes magnétiques en les suspendant dans 200 μL de tampon de lavage (voir Tableau des matériaux). Répétez l’étape de lavage trois fois.
- Suspendez les billes dans 100 μL de tampon de lavage et transférez la suspension dans un tube de réaction propre (résistant à la chaleur).
- Placez le tube sur le rack de séparation magnétique (voir Tableau des matériaux) et retirez complètement le surnageant.
- Préparer des échantillons SDS-PAGE dénaturés en suivant les étapes 2.16.1-2.16.2 ou des échantillons non dénaturés en éluant les VLP des billes magnétiques en suivant les étapes 2.16.3-2.16.5.
- Pour préparer des échantillons SDS-PAGE dénaturés, suspendre les billes dans 20 à 80 μL de tampon Laemmli (0,8 μL de tampon Laemmli pour 1 ng d’entrée de test p55 Gag) et incuber à 95 °C pendant 5 min.
- Procédez directement avec SDS-PAGE ou stockez les échantillons à -20 °C.
ATTENTION : Le tampon Laemmli contient du 2-mercaptoéthanol et du dodécylsulfate de sodium. Portez des gants de protection et une protection oculaire. Évitez tout contact avec la peau, les yeux et les vêtements. N’inhalez pas de vapeurs. Travaillez dans un espace bien ventilé, p. ex. une hotte.
REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici. - Alternativement, effectuez une étape d’élution non dénaturante pour obtenir des VLP avec une structure protéique native préservée.
- Ajouter 25 μL de tampon d’élution (souvent fourni avec les billes) aux billes magnétiques et incuber pendant 2 à 5 min à température ambiante.
- Retirez les billes et transférez l’éluat dans un tube propre. Utilisez l’éluat pour des essais ultérieurs ou conservez-le à 4 °C.
REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici.
3. Analyse des échantillons VLP capturés
REMARQUE : Pour l’analyse des VLP capturés, effectuez une SDS-PAGE et par la suite une analyse par transfert Western31,32.
- Placez les tubes d’échantillonnage sur le rack magnétique pour séparer les billes de la solution.
- Chargez 10 μL de chaque échantillon dans des puits individuels du gel.
REMARQUE: Dans ce protocole, les protéines virales p55 Gag ont été détectées en utilisant des anticorps polyclonaux de lapin dirigés contre le VIH Gag et des IgG anti-lapin polyclonales secondaires de poulet couplées à des anticorps de peroxydase de raifort (HRP). Les protéines virales du noyau ont été visualisées à l’aide de la détection par chimiluminescence.
Figure 2 : Illustration schématique des étapes clés du test de capture VLP à l’aide de surnageants sans cellule. (1) Le test de capture VLP commence par la liaison des bNAbs VIH-1 aux billes magnétiques couplées à la protéine G. Pendant ce temps, la solution de VLP avec une concentration définie de p55 est préparée. Le surnageant de culture sans cellule se compose d’un mélange de VLP p55 Gag, de protéines de la cellule hôte et d’acides nucléiques. (2) Les billes magnétiques couplées aux bNAbs et à la solution de VLP sont transférées dans un tube de réaction de 1,5 mL suivi d’une incubation en rotation. (3) Les VLP présentant des antigènes sont capturés par les billes revêtues de bNAbs. La séparation de ces complexes immunitaires des contaminants dérivés des cellules hôtes est effectuée dans un champ magnétique. (4) Le surnageant est éliminé par pipetage et les billes sont lavées trois fois pour éliminer les VLP non liés. (5) Dans l’étape suivante, un tampon de charge protéique réductrice est ajouté aux complexes immunitaires constitués de billes magnétiques recouvertes de bNAbs et de VLP capturés. (6) L’ébullition de l’échantillon dissocie les bNAbs et l’antigène cible des billes magnétiques et lyse les VLP. (7) Les billes magnétiques sont séparées de la solution dans un champ magnétique. (8) Les échantillons de protéines sont soumis à la FDS-PAGE. (9) L’analyse par transfert Western est effectuée afin de détecter les protéines virales du noyau p55 Gag. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Representative Results
La figure 3 montre un résultat représentatif des VLP capturés pour la première fois à partir de pastilles CFSN et VLP, respectivement, à l’aide de bNAbs, puis soumis à une analyse par transfert Western pour détecter les protéines de base virales. Les billes utilisées pour le test de capture ont été recouvertes de trois bNAbs différents dirigés contre les épitopes sensibles à la neutralisation des glycoprotéines Env et des anticorps isotypes servant de témoins négatifs, respectivement. En utilisant des billes recouvertes d’anticorps isotypes, aucune protéine Gag n’était détectable dans les échantillons contenant des VLP Env-négatifs (VLP chauves) ou des VLP Env-display utilisant l’analyse par transfert Western. Cela a démontré que la liaison non spécifique des VLP aux perles recouvertes d’anticorps humains n’a pas médié la capture du VLP. Les VLP chauves n’étaient pas non plus liés par des billes recouvertes de bNAbs et, par conséquent, encore une fois, aucune protéine Gag n’était détectable. En revanche, les trois bNAbs ont capturé des VLP présentant des protéines Env (Env VLP) et, par conséquent, des protéines Gag ont ensuite été facilement détectées. Comme le montre la figure 3, le test de capture peut être utilisé pour analyser l’antigène cible affichant des VLP dans des échantillons cfSN et VLP en granulés, respectivement.
Figure 3 : Détection d’épitopes sensibles à la neutralisation dans les glycoprotéines de l’enveloppe du VIH-1 affichées sur les VLP formés par le BPP p55 à l’aide d’anticorps largement neutralisants. Résultats représentatifs de l’analyse par transfert Western à l’aide d’anticorps viraux spécifiques de la protéine Gag après avoir effectué un test de capture VLP utilisant trois anticorps neutralisants largement différents (bNAb 1, bNAb 2 et bnAb 3) ciblant les épitopes dans les glycoprotéines de l’enveloppe du VIH-1 (Env). Les anticorps humains isotypes mis en commun à partir de sérums humains ont servi de témoins négatifs. Les surnageants de culture cellulaire ont été récoltés à partir de cultures cellulaires en suspension produisant des VLP avec des protéines Env (Env VLP) et des VLP chauves (Env-négatif), respectivement, ainsi que de cellules naïves n’exprimant aucune protéine virale (simulacre). Les surnageants de la culture cellulaire productrice de VLP chauve ainsi que de la culture cellulaire simulée ont servi de témoins négatifs. Les surnageants ont été libérés des cellules contaminantes par centrifugation à basse vitesse et filtration subséquente pour obtenir des surnageants sans cellules (CFSN) pour l’analyse. Lors de l’immunoprécipitation, l’analyse par transfert Western a été réalisée à l’aide d’anticorps polyclonaux de lapin dirigés contre Gag et de conjugués IgG-HRP anti-lapin secondaires. Le poids moléculaire apparent en kilodaltons (kDa) tel que visible à partir du marqueur de poids moléculaire (MW) est représenté à gauche. Les flèches indiquent la protéine précurseur détectée p55 Gag. (A) Pour chaque échantillon, du CFSN contenant 100 ng de protéine Gag a été appliqué au test de capture afin de normaliser la quantité d’entrée des VLP. Le CFSN a été directement incubé avec des billes recouvertes d’anticorps. (B) Les pastilles de VLP ont été obtenues par ultracentrifugation de CFSN. Des granulés contenant 100 ng de protéine Gag ont été appliqués au test de capture à l’aide d’anticorps isotypes et de bNAb 3. Les échantillons de bNAb 1 et de bNAb 2 ne contenaient que 25 ng de Gag. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Discussion
Avant le test de capture VLP, évaluer la formation de VLP et l’expression de l’antigène cible dans les lignées cellulaires productrices de VLP. Les méthodes instrumentales sont l’analyse cytométrique en flux de l’expression de la surface cellulaire de l’antigène ainsi que l’ELISA spécifique de la protéine de base de l’antigène et du noyau viral du CFSN et des VLP en granulés.
Les étapes critiques du test de capture VLP sont le revêtement des billes avec des anticorps de capture - ici bNAbs - et la capture ultérieure des VLP antigènes positifs par les billes recouvertes d’anticorps. Le succès de l’enrobage des billes avec des anticorps dépend du choix de la protéine conjuguée de liaison à l’immunoglobuline (Ig). Les espèces donneuses ainsi que la classe Ig des anticorps déterminent si les billes conjuguées à la protéine G ou à la protéine A sont préférables. Pour la plupart des espèces et des classes Ig, la protéine G est le ligand de choix33. Comme alternative aux billes conjuguées à la protéine A / G, des billes de streptavidine pour le revêtement avec des anticorps biotinylés sont disponibles. Les perles peuvent également être couplées de manière covalente avec des anticorps.
La capture des VLP par des billes recouvertes d’anticorps dépend d’un mélange approfondi, d’un temps d’incubation suffisant, de l’abondance de l’antigène et de l’affinité de l’anticorps de capture. D’après notre expérience, le mélange complet des billes recouvertes d’anticorps avec les échantillons VLP est mieux réalisé par l’utilisation de volumes >500 μL dans des tubes de 1,5 mL en rotation pendant au moins 2 h à température ambiante ou 4 °C. Un autre obstacle potentiel est la trop faible quantité de VLP dans l’échantillon. Pour les anticorps qui se lient fortement à l’antigène cible, des apports VLP aussi faibles que 15 ng de protéine Gag permettent généralement des quantités facilement détectables des protéines de base virales à l’aide de l’analyse par transfert Western. Cependant, les anticorps de faible affinité nécessitent des quantités d’entrée plus élevées, par exemple 100 ng de protéine Gag, pour obtenir des résultats concluants (Figure 3, bNAb 3).
Certains antigènes de surface sont sujets à la dégradation de la protéase. Ici, nous recommandons l’ajout d’inhibiteurs de protéase aux échantillons VLP et l’incubation à 4 °C. L’adhésion non spécifique des protéines de la cellule hôte et des VLP aux anticorps liés aux billes est rarement observée et doit être exclue en utilisant des témoins négatifs appropriés, comme nous l’avons démontré ici en utilisant des échantillons VLP simulés et chauves et des anticorps de contrôle isotype. Les stratégies visant à réduire la liaison non spécifique comprennent des étapes de lavage prolongées et l’ajout de caséine dans le tampon de lavage34. En outre, le test de capture peut également être amélioré en déterminant le rapport optimal entre la quantité d’anticorps et la quantité de VLP affichant un antigène.
Dans la dernière étape du test de capture VLP, nous décrivons l’élution des complexes immunitaires des perles en les faisant bouillir en réduisant le tampon de Laemmli. Au cours de cette étape, les VLP sont désassemblés et les anticorps de capture et les antigènes cibles sont séparés des billes. Notamment, l’espèce donneuse de l’anticorps primaire utilisé dans l’analyse par transfert Western ultérieure doit différer du donneur de l’anticorps de capture pour éviter la détection involontaire de l’anticorps de capture par les anticorps conjugués IgG HRP anti-donneurs secondaires.
Le test de capture VLP présenté ici fournit une méthode facile à utiliser et sensible pour détecter les épitopes sensibles à la neutralisation dans les antigènes cibles structurels intacts affichés sur les surfaces VLP. Cependant, le test de capture ne permet pas la quantification directe de l’épitope. Les tests ELISA réalisés avec des bNAbs sont essentiels à cette fin et doivent être menés en parallèle, en particulier si les VLP examinés sont destinés à être utilisés dans des études précliniques utilisant des modèles animaux35. Ceci est essentiel, car la quantité d’antigène peut être directement corrélée à l’obtention d’une réponse d’anticorps neutralisants chez les animaux immunisés, comme le montrent les vaccins à circovirus porcin de type 2 (PCV2)36.
Un vaccin idéal devrait entraîner l’obtention de bNAbs ciblant les épitopes sensibles à la neutralisation à la surface du virion. L’analyse de ces épitopes, en particulier en ce qui concerne leur intégrité structurelle complète à la surface du vaccin particulaire, est cruciale pour identifier les candidats vaccins potentiels. Ce n’est pas seulement le cas pour les VLP dérivés du VIH, mais aussi pour de nombreux autres vaccins VLP en cours de développement37. Les principaux vaccins à base de VLP sont, par exemple, dérivés de virus parentaux non enveloppés ou de capside tels que le virus du papillome humain (VPH). Contrairement aux particules du VIH-1, qui sont formées par une seule protéine structurelle du noyau, à savoir p55 Gag, et enveloppées par la membrane provenant de la cellule productrice du VLP, les particules du VPH ne sont constituées que d’une ou deux protéines structurelles du noyau38,39. De même, et comme présenté ici pour les VLP enveloppés, le test de capture VLP peut également être applicable à la détection d’épitopes sensibles à la neutralisation des VLP non enveloppés.
Comme alternative au test de capture, les échantillons VLP peuvent être directement soumis à une PAGE native suivie d’une analyse par transfert Western à l’aide de bNAbs et d’anticorps secondaires appropriés couplés au HRP40. Cependant, et pour l’analyse des VLP décorés par env du VIH, ce test est moins sensible car seul un faible nombre de protéines antigéniques par VLP peut être attendu. En revanche, le test de capture facilite la détection des protéines de base abondantes en grandes quantités par VLP, dans le cas des VLP dérivés du VIH, plus de 3 500 protéines Gag forment un VLP27. Cela permet la détection indirecte très sensible des épitopes dans Env affichés même à de faibles densités sur les VLP.
Le nombre de méthodes bien établies pour examiner les épitopes sensibles à la neutralisation dans les antigènes de surface des VLP est limité. Le marquage des antigènes affichés sur les VLP est possible avec des conjugués anticorps-fluorophore spécifiques à l’épitope et une détection ultérieure par analyse de suivi des nanoparticules (NTA), permettant la détection et la quantification des VLP. Cette méthode a également été développée et optimisée avec succès pour les exosomes présentant des marqueurs de surface cellulaire41. En outre, la spectroscopie par résonance plasmonique de surface (SPR) permet d’analyser les interactions entre les anticorps neutralisants non conjugués et les épitopes apparentés présentés sur les VLP. Bien qu’ils ne conviennent pas à l’analyse à haut débit, les VLP peuvent également être étiquetés avec des bNAbs couplés à des particules d’or et à un examen microscopique électronique à transmission (TEM) ultérieur42.
En conclusion, le test de capture VLP offre des avantages considérables: (i) évaluation de l’intégrité structurelle des épitopes sensibles à la neutralisation à la surface des VLP, (ii) détection sensible et indirecte des antigènes même lorsqu’ils sont affichés à de faibles densités sur les VLP, et (iii) la méthode ne nécessite pas d’équipement analytique coûteux.
Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas de conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par une subvention du ministère fédéral allemand de l’Éducation et de la Recherche, le programme de financement Forschung an Fachhochschulen, les numéros de contrat 13FH767IA6 et 13FH242PX6 à JS. Les figures 1 et 2 ont été créées avec BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL reaction tubes | Eppendorf | ||
| 10x PBS | gibco | 70011044 | |
| 4%–15% Mini-PROTEAN TGX stain-free protein gels | BioRad | 4568085 | |
| Antibodies (bnAbs) | Polymun Scientic | ||
| Isotype control antibody | invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | 02-7102 | |
| Chemidoc XRS+ imaging system | BioRad | 1708265 | |
| Chicken anti-rabbit IgG HRP-coupled | Life technologies | A15987 | 1:5000 in TBS-T + 2 % (w/v) powdered milk |
| Dynabeads Protein G Immunoprecipitation Kit | invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | 10007D | includes buffers and washing solutions |
| FreeStyle 293-F cells | invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | R790-07 | |
| FreeStyle 293 Expression Medium | invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | 12338026 | |
| Gel blotting papers | Whatman | GB005 | |
| Glycine | Carl Roth | 0079 | blotting buffer |
| Magnetic separation rack | New England Biolabs | S1509S | for 12 x 1.5 mL or 6 x 1.5 mL tubes |
| Methanol | Carl Roth | 4627 | blotting buffer |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell electrophoresis system | BioRad | ||
| Optima XE-90 ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| PageRuler prestained protein ladder | Thermo Scientific | 26616 | |
| Polyvinylidene fluoride (PVDF) syringe filters, 0.45 µm | Carl Roth | KC89.1 | |
| Powdered milk | Carl Roth | T145 | blocking buffer |
| PVDF transfermembrane, 0.45 µm | Carl Roth | T830.1 | |
| QuickTiter HIV p24 ELISA | Cell Biolabs | VPK-108-H | |
| Rabbit polyclonal to HIV1 p55 + p24 + p17 | abcam | ab63917 | 1:2000 in TBS-T + 2 % (w/v) powdered milk |
| Rotator | Heidolph | REAX2 | |
| ROTI Load 1 (laemmli buffer) | Carl Roth | K929.1 | 4x concentrated reducing protein gel loading buffer |
| ROTIPHORESE 10x SDS-PAGE | Carl Roth | 3060 | |
| Sodium chloride | Carl Roth | 3957 | TBS-T buffer |
| SuperSignal West Pico PLUS chemiluminescent substrate | Thermo Scientific | 34579 | |
| SW28 rotor | Beckman Coulter | ||
| Thermomixer | Cel Media | basic | |
| Trans-Blot Turbo | BioRad | ||
| Trehalose dihydrate | Carl Roth | 8897.2 | |
| TRIS | Carl Roth | 5429 | blotting buffer |
| TRIS hydrochloride | Carl Roth | 9090 | TBS-T buffer |
| Tween-20 | Carl Roth | 9127 | TBS-T buffer |
| Ultra Clear centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344058 |
References
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