Summary
Este protocolo tiene como objetivo aislar los ARNm ribosómicos de traducción específicos del tipo celular utilizando el modelo de ratón NuTRAP.
Abstract
La heterogeneidad celular plantea desafíos para comprender la función de los tejidos complejos a nivel del transcriptoma. El uso de ARN específicos del tipo de célula evita posibles dificultades causadas por la heterogeneidad de los tejidos y desencadena el poderoso análisis del transcriptoma. El protocolo descrito aquí demuestra cómo utilizar el método de purificación de afinidad ribosómica (TRAP) para aislar ARN unidos a ribosomas de una pequeña cantidad de células que expresan EGFP en un tejido complejo sin clasificación celular. Este protocolo es adecuado para aislar ARN específicos de tipo celular utilizando el modelo de ratón NuTRAP recientemente disponible y también podría usarse para aislar ARN de cualquier célula que exprese EGFP.
Introduction
Los enfoques de alto rendimiento, incluida la secuenciación de ARN (RNA-seq) y el microarray, han permitido interrogar los perfiles de expresión génica a nivel de todo el genoma. Para tejidos complejos como el corazón, el cerebro y los testículos, los datos específicos del tipo de célula proporcionarán más detalles comparando el uso de ARN de todo el tejido 1,2,3. Para superar el impacto de la heterogeneidad celular, el método de purificación de afinidad ribosómica traducida (TRAP) se ha desarrollado desde principios de la década de 20104. TRAP es capaz de aislar ARN unidos a ribosomas de tipos celulares específicos sin disociación tisular. Este método se ha utilizado para el análisis de translatoma (ARNm que están siendo reclutados para el ribosoma para la traducción) en diferentes organismos, incluyendo la orientación a una población extremadamente rara de células musculares en embriones de Drosophila5, el estudio de diferentes células radiculares en la planta modelo Arabidopsis thaliana6, y la realización de análisis del transcriptoma de células endoteliales en mamíferos7.
TRAP requiere una modificación genética para marcar el ribosoma de un organismo modelo. Evan Rosen y sus colegas desarrollaron recientemente un modelo de ratón llamado Nuclear tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP) mouse 8, que ha estado disponible a través del Laboratorio Jackson desde 2017. Al cruzarse con una línea de ratón Cre, los investigadores pueden usar este modelo de ratón NuTRAP para aislar ARN unidos a ribosomas y núcleos celulares de células que expresan Cre sin clasificación celular. En las células que expresan Cre que también portan el alelo NuTRAP , el ribosoma marcado con EGFP / L10a permite el aislamiento de la traducción de ARNm utilizando ensayos de afinidad pulldown. En la misma célula, la membrana nuclear marcada con el péptido de reconocimiento de biotina ligasa (BLRP), que también es mCherry positivo, permite el aislamiento nuclear mediante el uso de purificación basada en afinidad o fluorescencia. El mismo equipo de investigación también generó una línea de ratón similar en la que la membrana nuclear se etiqueta solo con mCherry sin biotina8. Estas dos líneas de ratones modificados genéticamente dan acceso a caracterizar perfiles epigenómicos y transcriptómicos pareados de tipos específicos de células de interés.
La vía de señalización del erizo (Hh) juega un papel crítico en el desarrollo del tejido9. GLI1, un miembro de la familia GLI, actúa como un activador transcripcional y media la señalización de Hh. Las células Gli1+ se pueden encontrar en muchos órganos secretores de hormonas, incluyendo la glándula suprarrenal y los testículos. Para aislar ADN y ARN específicos del tipo de célula de las células Gli1+ utilizando el modelo de ratón NuTRAP, se cruzaron ratones Gli1-CreERT2 con ratones NuTRAP. Los ratones Shh-CreERT2 también se cruzaron con los ratones NuTRAP con el objetivo de aislar las células que expresan erizo sónico (Shh). El siguiente protocolo muestra cómo utilizar Gli1-CreERT2; Ratones NuTRAP para aislar ARN unidos a ribosomas de células Gli1+ en testículos de ratones adultos.
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Protocol
Todos los experimentos con animales realizados siguieron los protocolos aprobados por los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Auburn.
NOTA: El siguiente protocolo utiliza un testículo (aproximadamente 100 mg) en P28 de Gli1-CreERT2; Ratones NuTRAP (Mus musculus). Es posible que sea necesario ajustar los volúmenes de reactivos en función de los tipos de muestras y el número de tejidos.
1. Recolección de tejidos
- Eutanasia a los ratones usando una cámara deCO2 , desinfecte la superficie del abdomen con etanol al 70%.
- Abra la parte inferior del abdomen con tijeras y retire los testículos. Use nitrógeno líquido (LN2) para congelar los testículos inmediatamente.
- Almacene las muestras en la fase de vapor de LN2 hasta su uso.
2. Preparación de reactivos y perlas
- Preparar la solución madre de homogeneización: Añadir 50 mM Tris (pH 7.4), 12 mM MgCl2, 100 mM KCl, 1% NP-40 y 1 mg/ml de heparina. Conservar la solución a 4 °C hasta su uso (hasta 1 mes).
- Preparar el tampón de trabajo de homogeneización a partir de la solución madre (paso 2.1) antes de su uso: Añadir DTT (concentración final: 1 mM), cicloheximida (concentración final: 100 μg/ml), ribonucleasa recombinante (concentración final: 200 unidades/ml) y cóctel inhibidor de proteasa (concentración final: 1x) a la solución madre de homogeneización para producir la cantidad necesaria del tampón de trabajo de homogeneización. Guarde el tampón de trabajo recién preparado en hielo hasta que lo use.
- Prepare los tampones de lavado bajos en sal y altos en sal:
- Para preparar tampón de lavado bajo en sal, mezcle 50 mM Tris (pH 7.4), 12 mM MgCl2, 100 mM KCl y 1% NP-40. Añadir TDT (concentración final: 1 mM) y cicloheximida (concentración final: 100 μg/ml) antes de usar.
- Para preparar tampón de lavado con alto contenido de sal mezcle 50 mM Tris (pH 7.4), 12 mM MgCl2, 300 mM KCl, 1% NP-40. Añadir TDT (concentración final: 2 mM) y cicloheximida (concentración final: 100 μg/mL) antes de usar.
- Prepare cuentas de proteína G (Tabla de materiales):
- Cada muestra necesitará 50 μL de perlas de proteína G. Coloque la cantidad requerida de perlas en un tubo de centrífuga de 1,5 ml y separe las perlas de la solución utilizando una rejilla magnética dejando el tubo en la rejilla durante 30-60 s.
- Retire el sobrenadante mediante pipeteo. Lave las perlas tres veces con 1 ml de tampón de lavado helado y bajo en sal cada vez.
3. Lisis tisular y homogeneización
- Añadir 2 ml de tampón de trabajo de homogeneización helada (recién preparado a partir del paso 2.2) a un juego de amoladora de papel tisú de vidrio. Coloque rápidamente la muestra congelada en el molinillo y homogeneice el tejido con 30 golpes en hielo con un mortero suelto.
- Transfiera el homogeneizado a un tubo de fondo redondo de 2 ml y centrifugar a 12.000 x g durante 10 min a 4 °C.
- Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de 2 ml. Guarde 100 μL en un tubo de 1,5 ml como "entrada".
- Incubar el sobrenadante en el tubo de 2 ml con el anticuerpo anti-GFP (5 μg/ml; 1:400) a 4 °C en un rotador de extremo a extremo (24 rpm) durante la noche.
4. Inmunoprecipitación
- Transfiera la mezcla de homogeneizado/anticuerpo a un nuevo tubo de fondo redondo de 2 ml que contenga las perlas de proteína G lavadas del paso 2.4. Incubar a 4 °C en un rotador de extremo a extremo (24 rpm) durante 2 h.
- Separe las perlas magnéticas del sobrenadante con una rejilla magnética. Guarde el sobrenadante como la "fracción negativa". La fracción negativa contiene (1) ARN en células negativas para EGFP y (2) ARN en células positivas para EGFP que no están unidas a ribosomas.
- Agregue 1 ml de tampón de lavado con alto contenido de sal a las perlas y voltee brevemente el tubo para lavar las perlas. Coloque el tubo en una rejilla magnética.
- Retire el tampón de lavado. Repita el paso de lavado dos veces más. Las perlas ahora contienen el complejo perlas-ribosoma-ARN de células positivas para EGFP.
5. Extracción de ARN
NOTA: Los siguientes pasos están adaptados del kit de aislamiento de ARN (Tabla de materiales). Trate cada fracción (es decir, entrada, positiva y negativa) como una muestra independiente y aísle los ARN de forma independiente.
- Incubar las perlas del paso 4.4 con 50 μL de tampón de extracción (del kit de aislamiento de ARN) en un termomezclador (42 °C, 500 rpm) durante 30 min para liberar ARN de las perlas.
- Separe las perlas con un estante magnético, transfiera el sobrenadante que contiene el complejo perlas-ribosoma-ARN a un tubo de 1,5 ml.
- Centrifugar el tubo a 3000 x g durante 2 min, luego pipetear el sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 ml. Este tubo contiene la "fracción positiva" del paso TRAP.
NOTA: Para las fracciones de entrada y negativas, extraer ARN de 25 μL de muestras utilizando 1 ml de tampón de extracción. Incubar en un termomezclador (42 °C, 500 rpm) durante 30 min. - Preacondicionar la columna de purificación de ARN: pipetear 250 μL de tampón de acondicionamiento en la columna de purificación. Incubar durante 5 min a temperatura ambiente (RT). Centrifugar la columna a 16.000 x g durante 1 min.
- Pipet igual volumen de 70% de EtOH en el sobrenadante desde el paso 5.3 (alrededor de 50 μL de 70% de EtOH para la fracción positiva y 1 mL de 70% de EtOH para la entrada y las fracciones negativas). Mezclar bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
- Pipetear la mezcla en la columna a partir del paso 5.4.
- Centrifugar la columna a 100 x g durante 2 minutos para permitir que el ARN se una a la membrana en la columna, luego continúe la centrifugación a 16,000 x g durante 30 s inmediatamente. Deseche el flujo continuo.
NOTA: Para las fracciones de entrada y negativas, agregue 250 μL de la mezcla a la columna cada vez. Repita los pasos 5.6 y 5.7 hasta que se utilicen todas las mezclas. - Pipetear 100 μL de tampón de lavado 1 (W1) en la columna y centrifugar a 8.000 x g durante 1 min. Deseche el flujo continuo.
- Pipetear 75 μL de solución de DNasa mezclar directamente en la membrana de la columna de purificación. Incubar en RT durante 15 min.
- Pipetear 40 μL de W1 en la columna y centrifugar a 8.000 x g durante 30 s. Deseche el flujo continuo.
- Pipetear 100 μL de tampón de lavado 2 (W2) en la columna y centrifugar a 8.000 x g durante 1 min. Deseche el flujo continuo.
- Pipetear 100 μL de W2 en la columna y centrifugar a 16.000 x g durante 2 min. Deseche el flujo continuo. Vuelva a centrifugar la misma columna a 16.000 x g durante 1 minuto para eliminar todos los restos de tampón de lavado antes de la etapa de elución.
- Transfiera la columna a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
- Pipetear 12 μL de agua libre de RNasa directamente sobre la membrana de la columna de purificación. La punta de la pipeta no debe tocar la membrana. Incubar a RT durante 1 min y centrifugar a 1000 x g durante 1 min. Luego continúe la centrifugación a 16,000 x g durante 1 minuto para eluyir el ARN.
6. Concentración y calidad del ARN
- Utilice un bioanalizador para evaluar la calidad y cantidad del ARN extraído10.
7. Almacenamiento y análisis posterior
- Almacene el ARN a -80 °C (hasta 1 año) hasta un análisis adicional (p. ej., microarray, PCR cuantitativa (qPCR) y RNA-seq, etc.).
NOTA: Para obtener detalles sobre el análisis de qPCR, incluida la síntesis de ADNc, consulte Lyu et al.11. Los cebadores para qPCR se enumeran en la Tabla de materiales.
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Representative Results
El ratón Gli1-CreERT2 (Jackson Lab Stock Number: 007913) se cruzó por primera vez con el ratón reportero NuTRAP (Jackson Lab Stock Number: 029899) para generar ratones de doble mutación. Los ratones portadores de ambos alelos genéticos genéticamente modificados (es decir, Gli1-CreERT2 y NuTRAP) fueron inyectados con tamoxifeno una vez al día, cada dos días, para tres inyecciones. Las muestras de tejido se recogieron el 7º día después del1º día de la inyección. El análisis de inmunofluorescencia mostró que el EGFP se expresó en células intersticiales en testículos (Figura 1). Se sabe que la cápsula de la glándula suprarrenal es otra población celular positiva de Gli112,13. También se encontró EGFP en células capsulares suprarrenales en Gli1-CreERT2; Ratones NuTRAP (Figura 1). Nuestro laboratorio también lleva Shh-CreERT2; Ratones NuTRAP. Tenga en cuenta que en Shh-CreERT2; NuTRAP ratones, la población de células EGFP+ reside en la corteza externa de la glándula suprarrenal debajo de la cápsula (Figura 1), el mismo sitio de expresión de las células EGFP+ en el área Shh+ en la glándula suprarrenal13 confirmando la expresión de EGFP en células que expresan Cre.
Después de la extracción de los ARN específicos del tipo celular, se evaluó la cantidad y calidad de los ARN aislados en cada fracción de dos extracciones independientes (un testículo utilizado en cada extracción) utilizando un bioanalizador (Figura 2). El resultado del bioanalizador indicó que este protocolo es capaz de obtener ARN de alta calidad de las tres fracciones. Todas las fracciones tenían un número de integridad de ARN (RIN) similar.
Para probar más a fondo si el ARN extraído es específico del tipo de célula, el ARN extraído se envió para el análisis de microarrays utilizando un servicio comercial de microarrays (consulte la Tabla de materiales). El resultado del microarray mostró que alrededor de 4.000 genes se enriquecieron en la fracción positiva en comparación con la fracción negativa, mientras que alrededor de 3.000 genes se enriquecieron en la fracción negativa (Figura 3). Entre estos genes expresados diferencialmente, los genes asociados a células de Leydig Hsd11b1 y Hsd3b614,15 se enriquecieron en la fracción positiva. En la fracción negativa, se enriquecieron los genes asociados a células de Sertoli Dhh y Gstm616,17. Solo se identificaron unos pocos genes expresados diferencialmente al comparar la fracción negativa con la entrada.
También se utilizó RT-PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) para confirmar la expresión de genes clave en la fracción positiva y la fracción negativa. Similar a lo que se encontró en el ensayo de microarrays, las enzimas esteroidogénicas 3β-hidroxiesteroide deshidrogenasa (codificada por Hsd3b) y la enzima de escisión de la cadena lateral del colesterol (codificada por Cyp11a1) se enriquecieron en la fracción positiva. Mientras que el marcador celular de Sertoli Sox9 (SRY-box Transcription Factor 9), y el marcador de células germinales Sycp3 (Synaptonemal Complex Protein 3), se enriquecieron en la fracción negativa (Figura 4). Juntos, estos datos demostraron que los transcriptomas en las células Gli1+ fueron retirados y enriquecidos con éxito por el protocolo anterior.
Figura 1: Imágenes de inmunofluorescencia de la expresión de EGFP en modelos de ratón reportero NuTRAP. El Gli1-CreERT2; NuTRAP y el Shh-CreERT2; Los ratones NuTRAP fueron tratados con tamoxifeno para activar la expresión de EGFP. En el testículo, las células Gli1+ estaban en el intersticio, mientras que en la glándula suprarrenal, las células Gli1+ estaban en la cápsula suprarrenal. En la glándula suprarrenal, las células debajo de la cápsula fueron positivas de SHH (células EGFP+ en Shh-CreERT2; Ratones NuTRAP). SHH es el ligando de la vía de señalización SHH que provoca su función en las células capsulares Gli1+ 13. Barras de escala: 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Calidad y cantidad de ARN de la extracción de TRAP. Los ARN de la fracción positiva, la fracción negativa y la entrada se evaluaron utilizando un bioanalizador. La fracción positiva contiene ARN extraídos de perlas de proteína G después de la incubación con el anticuerpo GFP (paso 4.1). La fracción negativa contiene ARN que permanecen en el sobrenadante en el paso 4.2. La entrada contiene ARN del homogeneizado (paso 3.3). En el electroferograma, debido a que se conocen las concentraciones del marcador inferior (mostrado como el primer pico a 20-25 s del tiempo de migración de las muestras mostradas en el eje X) y la escalera (no mostrada en estos electroferogramas), se puede calcular la concentración de cada muestra. Los dos picos principales a 40-50 s representan el ARNr 18S y 28S. La relación ribosómica (basada en la intensidad de fluorescencia que se muestra en el eje Y) se utiliza para determinar la integridad de la muestra de ARN. El número de integridad de ARN (RIN) de cada muestra se muestra en la esquina superior derecha de cada gráfico. Cada punto en el diagrama de puntos representa la cantidad de ARN que se extrajo de un solo testículo. La cantidad de ARN de cada muestra en la fracción negativa y la entrada se extrajo de 25 μL de muestras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Análisis de microarrays para muestras TRAP. Se muestran los resultados de dos extracciones (un testículo cada una). El análisis de microarrays identificó un número similar de genes expresados diferencialmente de dos extracciones independientes (testículo A y testículo B). Alrededor de 4.000 genes se enriquecieron (puntos rojos) en la fracción positiva, mientras que ~ 3.000 genes se enriquecieron (puntos verdes) en la fracción negativa. Hsd11b1 y Hsd3b6 se enriquecieron en fracciones positivas. Dhh y Gstm6 se enriquecieron en fracciones negativas. Solo unos pocos genes fueron identificados como genes expresados diferencialmente entre la fracción negativa y la entrada, lo que sugiere que el testículo solo contiene un número muy pequeño de células Gli1+ . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: análisis de qPCR para muestras TRAP. El análisis de qPCR mostró la expresión relativa de genes específicos del tipo celular en la fracción positiva y la fracción negativa. La expresión de cada gen se normalizó primero con Actb. Las expresiones relativas de genes dentro de la fracción positiva se calcularon en función de la expresión de Sox9 (establecido como 10). Para la fracción negativa, se utilizó Cyp11a1 (establecido como 10) para normalizar la expresión relativa. Tenga en cuenta que la expresión relativa de los genes diana solo se puede comparar dentro de cada fracción. Los genes que codifican las enzimas esteroidogénicas (Hsd3b y Cyp11a1) se enriquecieron en la fracción positiva. Mientras que el gen marcador para las células germinales (Scyp3) y las células de Sertoli (Sox9), se enriquecieron en la fracción negativa. Se mostraron tres réplicas biológicas (tres extracciones independientes, un testículo cada una). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La utilidad del análisis del transcriptoma de tejido completo podría amortiguarse, especialmente cuando se estudian tejidos heterogéneos complejos. Cómo obtener ARN específicos de tipo celular se convierte en una necesidad urgente para desatar la poderosa técnica RNA-seq. El aislamiento de ARN específicos del tipo celular generalmente se basa en la recolección de un tipo específico de células mediante micromanipulación, clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) o microdisección por captura láser (LCM)18. También se han desarrollado otros métodos e instrumentos modernos de recolección de células individuales de alto rendimiento19. Estos métodos generalmente emplean las técnicas de microfluídica para codificar células individuales seguidas de RNA-seq de una sola célula. La disociación celular es el paso requerido para obtener la solución de celda suspendida, que luego pasará por un clasificador celular o un dispositivo microfluídico para codificar cada célula. La etapa de disociación celular presenta desafíos a estos métodos para estudios específicos de tipo celular porque el tratamiento enzimático no solo descompone los tejidos, sino que también afecta la viabilidad celular y los perfiles transcripcionales20. Además, el gasto de RNA-seq unicelular suele ser alto y requiere equipo especializado en el sitio.
Recientemente, dos estudios aislaron con éxito ARN/ADN de tipos específicos de células de tejidos enteros utilizando ratones NuTRAP 8,21. Sin utilizar equipos y herramientas específicas, el modelo de ratón NuTRAP permite obtener ARN y ADN de tipos específicos de células. El alelo NuTRAP podría dirigirse a las células que expresan Cre sin el paso de disociación celular, evitando cambiar la viabilidad celular y los perfiles transcripcionales. Rol et al. utilizaron el modelo de ratón NuTRAP para aislar núcleos y traducir ARNm simultáneamente del tejido adiposo. El otro estudio también demostró que el modelo de ratón NuTRAP podría funcionar para las células gliales en el sistema nervioso central8.
En nuestro laboratorio, estamos interesados en estudiar las poblaciones de células madre en tejidos esteroidogénicos como las células intersticiales Gli1+ en el testículo22 y las células capsulares Gli1+ en la glándula suprarrenal13. El desafío de estudiar las células Gli1+ en estos dos órganos es que el número de células Gli1+ en el testículo y la glándula suprarrenal es pequeño. Por ejemplo, la proporción de células de Leydig, que son la principal población de células Gli1+ en el testículo, sólo ocupan alrededor del 3,8% del volumen total de testículos en ratones adultos23. Debido a que la técnica TRAP tiene como objetivo reducir específicamente la traducción de ARN unidos a ribosomas en tejido complejo, el modelo de ratón NuTRAP podría ser una herramienta poderosa adecuada para estudiar una población celular rara en un tejido complejo. Los protocolos publicados anteriormente utilizando ratones NuTRAP se dirigen a los adipocitos y las células gliales que son más abundantes en el cerebro y el tejido adiposo en comparación con las células Gli1 + en el testículo y en la glándula suprarrenal. Para garantizar la obtención de los ARN requeridos de un pequeño número de células en un tejido complejo, revisamos los protocolos existentes (1) aumentando el tiempo de incubación con el anticuerpo GFP de 1 h a toda la noche; (2) utilizando otro tipo de kit de extracción de ARN que tiene como objetivo aislar una pequeña cantidad de ARN a nivel de picogramo.
Demostramos que este protocolo podría obtener ARN específicos de tipo celular de alta calidad a partir de un pequeño número de células en un tejido complejo. La calidad y cantidad de ARN extraídos son capaces de qPCR y un servicio comercial de microarrays. Los resultados de microarrays y qPCR confirmaron que los genes asociados a las células de Leydig están enriquecidos en la fracción positiva proveniente de un testículo. El protocolo aquí proporciona un enfoque detallado para aislar los ARNm de ribosomas de traducción específicos del tipo de célula utilizando el modelo de ratón NuTRAP . Este protocolo también se puede utilizar para aislar ARN de cualquier célula que exprese EGFP.
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Disclosures
Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo fue parcialmente apoyado por NIH R00HD082686. Agradecemos la beca de investigación de verano de la Endocrine Society a H.S.Z. También agradecemos al Dr. Yuan Kang por criar y mantener la colonia de ratones.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Actb | eurofins | qPCR primers | ATGGAGGGGAATACAGCCC / TTCTTTGCAGCTCCTTCGTT (forward primer/reverse primer) |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 Bioanalyzer Instrument | |
| cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Millipore | 11836170001 | |
| cycloheximide | Millipore | 239764-100MG | |
| Cyp11a1 | eurofins | qPCR primers | CTGCCTCCAGACTTCTTTCG / TTCTTGAAGGGCAGCTTGTT (forward primer/reverse primer) |
| dNTP | Thermo Fisher Scientific | R0191 | |
| DTT, Dithiothreitol | Thermo Fisher Scientific | P2325 | |
| DynaMag-2 magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| Falcon tubes 15 mL | VWR | 89039-666 | |
| GFP antibody | Abcam | ab290 | |
| Glass grinder set | DWK Life Sciences | 357542 | |
| heparin | BEANTOWN CHEMICAL | 139975-250MG | |
| Hsd3b | eurofins | qPCR primers | GACAGGAGCAGGAGGGTTTGTG / CACTGGGCATCCAGAATGTCTC (forward primer/reverse primer) |
| KCl | Biosciences | R005 | |
| MgCl2 | Biosciences | R004 | |
| Microcentrifuge tubes 2 mL | Thermo Fisher Scientific | 02-707-354 | |
| Mouse Clariom S Assay microarrays | Thermo Fisher Scientific | Microarray service | |
| NP-40 | Millipore | 492018-50 Ml | |
| oligo (dT)20 | Invitrogen | 18418020 | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Thermo Fisher Scientific | KIT0204 | |
| Protein G Dynabead | Thermo Fisher Scientific | 10003D | |
| RNase-free water | growcells | NUPW-0500 | |
| RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 10777019 | |
| Sox9 | eurofins | qPCR primers | TGAAGAACGGACAAGCGGAG / CTGAGATTGCCCAGAGTGCT (forward primer/reverse primer |
| Superscript IV reverse transcriptase | Invitrogen | 18090050 | |
| SYBR Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4309155 | |
| Sycp3 | eurofins | qPCR primers | GAATGTGTTGCAGCAGTGGGA /GAACTGCTCGTGTATCTGTTTGA (forward primer/reverse primer) |
| Tris | Alfa Aesar | J62848 |
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